Ketrampilan Dasar Laboratorium Program Studi Ilmu Biomedik 2011 2011
Kuliah 5: Oktober 10 Masalah regresi linear dari praktikum minggu yang lalu Sentrifugasi Pemurnian makromolekul DNA protein Teknik PCR Praktikum 5: Isolasi DNA dan PCR
Grafik dan Regresi Linear Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada Panjang Gelombang sama dengan 600nm 4.0 Group meja 1
3.5
Group meja 3
Serapan
3.0 2.5 2.0
1.5 1.0 0.5 0.0
0
100
200
300
400
Konsentrasi Urea (mg/dl)
500
600
Grafik dan Regresi Linear Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada Panjang Gelombang sama dengan 600nm
y = 0.0025x + 1.9355 R² = 0.0843
4.0 3.5
Serapan
3.0 2.5 2.0
Group meja 1
1.5 1.0
Group meja 3
0.5
Linear (Group meja 1)
0.0
0
100
200
300
400
Konsentrasi Urea (mg/dl)
Bagian data yang berbanding lurus
500
600
Grafik dan Regresi Linear Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada Panjang Gelombang sama dengan 600nm 4.0 3.5
y = 0.0825x - 0.0593 R² = 0.9902
Serapan
3.0
2.5 2.0
Group meja 1
1.5
Group meja 3
1.0
meja 1 dibawa konsentrasi 60mg/dl
0.5
Linear (meja 1 dibawa konsentrasi 60mg/dl)
0.0
0
100
200
300
400
Konsentrasi Urea (mg/dl)
500
600
Grafik dan Regresi Linear Caranya dalam Excel….. 1. Tabel data sudah terisa (X,Y1,Y2 dll) 2. Pilih data yang mau digambarkan 3. Gambarkan sebagai grafik “scatter” 4. Dari grafik yg muncul lihat bagian data yg berbanding lurus 5. Klik “select data” 6. Isilah tabel yang muncul dgn subset data 7. Klik “layout” dan pilih “trendline/ more trendline options” 8. Pilih rumus dan nilai r2 muncul pada grafiknya dan “close”
Sentrifugasi
partikel preparat yang berat dan besar turun lebih cepat
= 2rm(1-) f Faktor2 yang mempengaruhi kecepatan partikel turun: ukuran dan beratnya (m,) densitas larutan () radias/jarak dari pusat rotasi (r) angular velocity (kecepatan alat sentrifus) () frictional coefficient larutan (f)
= 2rm(1-)
f
LEBIH CEPAT KALAU... yang diatas semakin besar atau yang dibawah semakin kecil ukuran dan beratnya (m,) lebih besar densitas larutan () lebih kecil radias (r) lebih besar kecepatan alat sentrifus () lebih besar frictional coefficient larutan (f) lebih kecil
Pemurnian DNA 1.
pengumpulan/panen sel-sel
2.
pemecahan sel-sel
3.
pencernaan protein agar asam nucleat dilepaskan
4.
pengendapan DNA
Pengumpulan//panen sel Pengumpulan sel--sel DNA dapat diisolasi/dimurnikan dari sumber sel apapun (yaitu sel-sel yang berisi inti sel!)
SEL-SEL PERLU DIPANEN “cell harvesting” dari: jaringan langsung (contoh daging buah, sel-sel epitelial mulut, sel-sel kulit, dll), darah, sperma, dll
Pemecahan sel sel--sel Ikatan antara sel-sel jaringan serta membran sel, membran inti sel harus dihancurkan biar molekul DNA dapat dikeluarkannya TEKNIK-TEKNIK: homogenisasi dgn detergen membran
detergen Konsekuensi: membran dipecah
Pencernaan protein agar DNA lepas dari kompleksnya
DNA kromatin
DNA terbungkus dalam protein histon serta protein kromosom yang non-histon
kromosom
nukleosom
Pengendapan Protein dan DNA Protein serta asam nukleik merupakan makromolekul yang bersifat polar - akibatnya keduaduanya larut dalam larutan yang berdasarkan akuades.
KONSENTRASI GARAM YANG TINGGI: berperan untuk menetralisasi muatan positif dan negatif pada makromolekul dengan akibatnya sifat polar makromolekul tsb semakin lemah tidak melarut lagi dalam buffernya.
Pengendapan DNA dalam etanol etanol:: Etanol mempunyai dielektrik konstan yang tidak sekuat dielektrik konstan akuades. Akibatnya bagian makromolekul yang bermuatan positif dan negatif dapat berinteraksi satu dengan yang lain dan sifat polar (hidrofilik) pada makromolekul tersebut dikurangi tidak melarut lagi dalam buffernya
Pengendapan DNA dengan etanol PENGARUH TEMPERATUR: Menurut pendapat orang banyak, semakin dingin temperatur suatu larutan, semakin kurang jumlah pelarut yang dapat dilarutkan dalamnya.
???? Dasarnya secara kimiawi kurang kuat, tapi kita akan ikut yang berpengalaman itu dan menggunakan etanol yang dingin untuk pengendapan sempel DNA kita
Pemurnian Protein
(praktikum 6 - minggu depan) Tujuan jelas...yaitu “Why?” sudah dijawab (misalnya mau meneliti struktur protein tertentu supaya mengerti fungsinya atau dapat mendesain obat, dll; mau pakai dalam assay diagnostik; mau buat antibodi; dll) Caranya yg dipakai berdasarkan sifat protein yang ingin diisolasi Pakai assay yang sesuai dengan tujuan, dan yang memungkinkan/feasible untuk mengetahui preparat semakin murni
Pemurnian Protein… Molekul protein sangat beragam dibanding dengan asam nukleat (DNA atau RNA)
Kenapa?? Kenapa ?? Sifat protein yang boleh dipakai untuk memisahkan satu tipe protein dari yang lain Solubility Binding interactions Surface-exposed hydrophobic residues Charged surface residues Isoelectric Point Size and shape
Basic scheme of protein purification
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
Guidelines for protein purification
Define objectives
Define properties of target protein
Identify critical contaminants
Minimize the number of steps
Use a different technique at each step
Develop analytical assays Adapted from: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
How pure should my protein be? Application Therapeutic use, in vivo studies Biochemical assays, X-ray crystallography N-terminal sequencing, antigen for antibody production, NMR
Required Purity Extremely high > 99%
High 95-99%
Moderately high < 95%
Adapted from: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
Basic scheme of protein purification Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
Reversible precipitation with salt or organic molecules
Liquid chromatography (lower resolution, lower cost)
Liquid chromatography (higher resolution, higher cost)
PRAKTIKUM 6: ISOLASI PROTEIN DARI DARAH DARAH UTUH sentrifugasi
SEL-SEL DARAH
PLASMA
Lisis Sel (buffer hemolisis)
“salting out”
ethanol precipitation
sentrifugasi
sentrifugasi
Protein dlm supernatan Gs
Protein dlm supernatan Es
sentrifugasi
Protein membran M
Protein sitoplasmik S
Protein dlm endapan Gp
Protein dlm endapan Ep
PCR: polymerase chain reaction http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerasechain-reaction/
PCR 3 langkah per siklus Denaturasi Annealing (penempelan) Ekstensi (penambahan)
Praktikum 5: Praktikum Isolasi DNA dan PCR Isolasi DNA dari buah dan sel2 epitelial (protokol untuk isolasi DNA dari darah termasuk dalam bahan penuntun, tapi tidak akan dilaksanakan)
** tolonglah bawa buah** (~50 g per macam buah yang ingin diperiksa) 2-3 kelompok mulai dengan isolasi dari buah dan kelompok lain mulai dgn isolasi dari sel-sel epitelial mulut
References:: References Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell (5th ed), Garland Science, Taylor & Francis Group, New York. Holme, D. J. & Peck, H. 1998. Analytical Biochemistry (3rd ed), Addison Wesley Longman Inc., New York. http://sciencebiotech.net/mengenal-pcrpolymerase-chain-reaction/ Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
