Köszönetnyilvánítás Hálás vagyok témavezetőmnek, Dr. Gyurcsányi E. Róbertnek, hogy a témaválasztástól kezdve mindvégig támogatta haladásomat és minden segítséget megadott. Bármikor fordulhattam hozzá szakmai vagy akár személyes tanácsért. Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Pokol György dékán úrnak, valamint Dr. Horvai György és Dr. Nyulászi László tanszékvezető uraknak, hogy lehetővé tették, hogy a Budapest Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszékén végezzem munkámat. Köszönetet szeretnék mondani a publikációinkban való közreműködésért kollégáimnak. Külön köszönöm Dr. Mészáros Tamásnak, aki lehetővé tette az együttműködést a növényi vírus aptamerekkel kapcsolatban a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézetében. Kutatócsoportjából köszönöm Dr. Bardóczy Violának a növényi vírus fehérje aptamerek szelekcióját, Dr. Balogh Zsófiának és Gyurkovics Annának a növényi vírus fehérjék előállítását. Köszönöm az Intézet munkatársainak, hogy befogadtak és otthon érezhettem magam az ott végzett munkám során. Köszönöm a Tallini Műszaki Egyetem Anyagtudományi Tanszékéről Dr. Vitali Syritskinek a felületi lenyomatú polimerek előállításában nyújtott segítségét. Köszönöm a Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék minden jelenlegi és volt munkatársának a kellemes, baráti légkört. Köszönet illeti Szűcs Júliát, Dr. Höfler Lajost és Jágerszki Gyulát, hogy az elmúlt években bármikor fordulhattam hozzájuk kérdéssel. Hálás vagyok barátaimnak, akiktől támogatást és bíztatást kaptam. Végül, de nem utolsó sorban rendkívül hálás vagyok Családomnak. Köszönöm feleségemnek, Orsinak, aki nem csak az Otthont biztosította számomra, de szakmai kérdésekben is bátran fordulhattam hozzá. Köszönöm Szüleimnek, akik mindvégig feltétel nélkül támogattak és bíztattak. Köszönöm a munka elvégzéséhez nyújtott anyagi támogatást: OTKA NF69262 és K68161, ENIAC CAJAL4EU, TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002 és 0001. Budapest, 2012. július I
1 Tartalom KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
I
2 RÖVIDÍTÉSEK ÉS JELÖLÉSEK JEGYZÉKE
1
3 INTRODUCTION
4
4 BEVEZETÉS
7
5 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
10
5.1 APTAMEREK
10
5.1.1 AZ APTAMEREK SZELEKCIÓJA
12
5.1.2 APTAMER-FEHÉRJE KÖLCSÖNHATÁSOK JELLEMZÉSE
19
5.1.3 APTAMER ALAPÚ ASSAY FORMÁTUMOK
22
5.1.4 APTAMEREN ALAPULÓ SZENZOROK
24
5.2 FELÜLETI LENYOMATÚ POLIMEREK
31
5.2.1 FEHÉRJE LENYOMATÚ MIP-EK
32
5.2.2 MIP-EK ELŐÁLLÍTÁSA
33
5.2.3 MIP-EK ALKALMAZÁSA ÉRZÉKELÉSRE
34
5.3 KÉPALKOTÓ FELÜLETI PLAZMON REZONANCIA
35
5.3.1 SPR MÉRÉSEK KIÉRTÉKELÉSE
40
5.4 NAGY JELERŐSÍTÉSŰ HOMOGÉN TÁVOLSÁG MODULÁLT LUMINESZCENCIA ASSAY
42
5.5 ALMA TÖRZSGÖNDÖRÖDÉS VÍRUS (APPLE STEM PITTING VIRUS – ASPV)
44
6 KÍSÉRLETI RÉSZ
46
6.1 SZINTETIKUS RECEPTOROKKAL MÓDOSÍTOTT ÉRZÉKELŐK ELŐÁLLÍTÁSA
46
6.1.1 APTAMER SZELEKCIÓ
46
6.1.2 FELÜLETI LENYOMATÚ POLIMEREK ELŐÁLLÍTÁSA
49
6.2 MÉRÉSI MÓDSZEREK
51
6.2.1 KÉPALKOTÓ FELÜLETI PLAZMON REZONANCIÁS MÉRÉSI ELJÁRÁS
52
6.2.2 SPR MÉRÉSEK KIÉRTÉKELÉSE
56
6.2.3 SPR SZENZORCHIPEK FELÜLETI MÓDOSÍTÁSA
56
6.2.4 DNS FELÜLETI BORÍTOTTSÁGÁNAK MEGHATÁROZÁSA ELEKTROKÉMIAI ELJÁRÁSSAL
58
6.2.5 NAGY JELERŐSÍTÉSŰ HOMOGÉN TÁVOLSÁG MODULÁLT LUMINESZCENS ASSAY-K (ALPHA)
59
6.2.6 SZENZORFELÜLET JELLEMZÉSE ÉS NÖVÉNYI VÍRUSOK MÉRÉSE PÁSZTÁZÓ ELEKTRONMIKROSZKÓPIÁVAL (SEM) 60 6.2.7 EPIFLUORESZCENCIÁS MIKROSZKÓPIA
60
6.3 NÖVÉNYI KIVONATOK ELŐÁLLÍTÁSA
61
6.4 ÖSSZES FEHÉRJE KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA
61
6.5 ALKALMAZOTT VEGYSZEREK
61
7 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
63
7.1 DNS APTAMER ALAPÚ SPR SZENZOR NÖVÉNYI VÍRUS FEHÉRJÉK MEGHATÁROZÁSÁRA
63
7.1.1 DNS APTAMEREK SZELEKCIÓJA VÍRUS KAPSZID FEHÉRJÉKRE
63
7.1.2 APTAMER ALAPÚ SPR SZENZOROK FEJLESZTÉSE
64
7.1.3 APTAMER – NÖVÉNYI VÍRUS KAPSZIDFEHÉRJÉK KÖZÖTTI KÖLCSÖNHATÁS JELLEMZÉSE
69
7.1.4 VÍRUS KAPSZIDFEHÉRJÉK MEGHATÁROZÁSA NÖVÉNYI KIVONATBÓL
72
7.1.5 VÍRUS FERTŐZÖTT NÖVÉNYI MINTÁK MÉRÉSE
75
7.2 ERŐSÍTETT LUMINESZCENCIÁS TÁVOLSÁGMODULÁLT HOMOGÉN ASSAY (ALPHA) APTAMER-FEHÉRJE KÖLCSÖNHATÁSOK JELLEMZÉSÉRE
78
7.3 FEHÉRJÉK SZELEKTÍV, JELÖLÉSMENTES DETEKTÁLÁSA MIKROMINTÁZOTT, FELÜLETI LENYOMATOT TARTALMAZÓ MESTERSÉGES RECEPTOROKKAL
84
7.3.1 A FELÜLETI LENYOMATÚ POLIMEREK KÖTŐDÉSI TULAJDONSÁGAINAK VIZSGÁLATA SPR TECHNIKÁVAL
88
8 ÖSSZEFOGLALÁS
94
9 TÉZISEK
96
10 NOVEL SCIENTIFIC RESULTS
97
11 SAJÁT TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA
98
12 FELHASZNÁLT IRODALOM
99
2 Rövidítések és jelölések jegyzéke Rövidítés Jelentés ACLSV
Apple Chlorotic Leaf Spot trichovirus – alma klorotikus levélfoltosság vírus
ALPHA
Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay – nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens assay
AP
Alkaline Phosphatase – alkalikus foszfatáz enzim
APMV
Apple Mosaic Virus - alma mozaik vírus
ASPV
Apple Stem Pitting Virus - alma törzsgöndörödés vírus
ATP
adenozin-5’-trifoszfát
Av
avidin
BSA
Bovine Serum Albumin - szarvasmarha szérum albumin fehérje
CCD
Charged Coupled Device – töltés-csatolt eszköz
cDNS
komplementer DNS
CE
capillary electrophoresis – kapilláris elektroforézis
dIdC
dezoxiinozitolból és dezoxicitozinból álló, véletlenszerű sorrendű DNS szál
DNS
dezoxiribonukleinsav
dNTP
dezoxiribonukleotid-trifoszfát
EA
ExtrAvidin® avidin származék
EDTA
etilén-diamin-tetraecetsav
ELSIA
Enzyme-Linked
Immunosorbent
Assay
–
enzim-kapcsolt
immunoszorbens meghatározás FA
Fluoreszcencia Anizotrópia
FC
Flow Cytometry – áramlási citometria
FET
Field-Effect Transistor – térvezérlésű tranzisztor
FI
fluoreszcencia intenzitás
FITC
fluoreszcein-izotiocianát
FP
Fluoreszcencia Polarizáció
FRET
Fluorescence Resonance Energy Transfer - fluoreszcencia rezonancia energiaátadás
1
GE
Gél Elektroforézis
GSH
glutation
GST
glutation transzferáz enzim
HCV
Hepatitis C vírus
His
hisztidin aminosav
HMDS
bisz(trimetilszilil)-amin
HPLC
High Performance Liquid Chromatography – nagy teljesítményű folyadékkromatográfia
HRFESEM
High-Resolution Field Emission Scanning Electron Microscopy - nagy felbontású téremissziós pásztázó elektronmikoszkóp
HRP
horseradish peroxidase - tormaperoxidáz enzim
HR-SEM
High-Resolution Scanning Electron Microscopy – nagy felbontású pásztázó elektronmikroszkópia
IgG
Immunoglobulin G
IPTG
izopropil--D-tiogalaktopiranozid
iSPR
imaging
Surface
Plasmon
Resonance
–
képalkotó
felületi
plazmonrezonancia ITC
Isothermal Titration Calorimetry - izotermikus titrációs kalorimetria
LB
Luria Broth vagy Lysogeny Broth, táptalaj
LIF
Laser Induced Fluorescence detector - lézer indukált fluoreszcenciás detektor
Lys
lizozim
M
molaritás (mol/L)
MB
Methylene Blue - metilénkék
MIP
Molecularly Imprinted Polymer – molekuláris lenyomatú polimer
NA
NeutrAvidin® avidin származék
Ni-NTA
nikkel-nitrilotriecetsav
NIP
non-imprinted polymer – molekuláris lenyomatot nem tartalmazó polimer
PBS
phosphate buffer saline, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 127 mM NaCl, pH = 7,4 puffer
PBS-T
PBS + 0.05% Tween 20
PBS-TE
PBS-T + 1 mM EDTA 2
PBS-TPO
PBS-T + 2% polivinil-pirrolidon
PC
polikarbonát
PCR
Polymerase Chain Reaction - polimeráz láncreakció
PEDOT
poli(3,4-etilénedioxitiofén)
PEG
polietilénglikol
pI
izoelektromos pont
PSS
polisztirolszulfonsav
PtNPs
Platina NanoParticles - platina nanorészecskék
PVP
polivinil-pirrolidon
QCM
Quartz Crystal Microbalance – kvarckristály mikromérleg
RNS
ribonukleinsav
RT-PCR
Reverse Transcripcion - Polymerase Chain Reaction – reverz transzkripciós polimeráz láncreakció
SD
Standard Deviation – szórás
SDS
nátrium-dodecilszulfát, anionos felületaktív anyag
SDS-
SDS poli-akrilamid gélelektroforézis
PAGE SELEX
Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
SELF
SELEX Forward primer
SELR
SELEX Reverse primer
SIP
Surface Imprinted Polymer – felületi lenyomatú polimer
SPR
Surface Plasmon Resonance – felületi plazmon rezonancia
ssDNS
egyszálú DNS
ST
Streptavidin avidin származék
SWCNT
Single-Wall Carbon Nanotube – egyfalú szén nanocső
TE
Tris-EDTA puffer
TEG
tetraetilénglikol
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor – vaszkuláris endotél növekedési faktor
3
3 Introduction The analytical use of highly selective biological receptors and biochemical reactions, such as antibody-antigen, enzyme-substrate or the hybridization of complementary nucleic acids, has revolutionized the field of bioanalysis. In this thesis we use the term “receptor” to refer to molecular recognition agents able to recognize their complementary target compound through non-covalent interactions. The exquisite selectivity of biological origin receptors led on one hand to the development of biosensors that are able to measure directly the target compound in complex samples and on the other hand to biochips and high-throughput bioanalyzers to detect multiple components and interactions in a highly parallel manner. Despite of all their advantages, biological receptors have also some limitations. Thus, in many cases their application is restricted to experimental conditions closely resembling their natural environment and they are very susceptible to various chemicals and temperature changes. In many cases further difficulties are encountered in terms of cost-effective, large scale and reproducible production as well as long term storage. Therefore, the development of synthetic receptors having appropriate custom tailored physical-chemical properties would represent a significant progress. With this motivation in mind my doctoral research focused on the development and application of robust synthetic receptors designed explicitly for analytical purposes. Two, conceptually different kind of receptors were developed and evaluated for protein targets: DNA aptamers and molecularly imprinted polymers. Aptamers are 40-80 mer oligonucleotides able to bind selectively a given target molecule. Although nucleic acid – protein interactions are well known in nature, the sequences of nucleic acid aptamers for a given target compound are determined by a synthetic, in-vitro procedure referred to as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). This involves screening an oligonucleotide library consisting of a large number of random sequences against a target compound and ultimately identifying through a series of washing, separation and amplification steps those sequences, aptamers, exhibiting the highest affinity for the target. Consequently, their applicability is wider compared to antibodies, since aptamers can be selected also for
4
small or toxic molecules, and the establishment of physiological conditions is not mandatory during their application. Since the first publication of the SELEX procedure in 19901,2 a large number of aptamers have been selected for an impressive range of target molecules. 3 However, still most of analytically aimed studies are performed in “ideal conditions” on a relatively limited number of well characterized model aptamers, which were not intended originally for analytical application. This means that in the majority of the reports the analytical method development uses aptamers that have not been optimized for the analytical task and consequently, analytical applications that start from the selection of aptamers custom tailored for the intended analytical task are scarce. The importance of such an integrated approaches reside in the possibility of including counter selection steps during the SELEX process to remove from the selection process oligonucleotides binding to critical interfering species present in the sample. Such a procedure has the potential to dramatically enhance the selectivity of the selected aptamers. Therefore, a major goal of my research was to implement an integrated approach to develop an aptamer-based label-free sensor. As the fast generation of highly discriminating receptors makes aptamers one of the most prospective candidates for the detection of various virus strains and their mutants, we attempted for the first time, the development of an aptamer-based assay against the coat proteins of a plant virus, Apple Stem Pitting Virus (ASPV).
To evaluate the effectiveness of the counter-selection
process we have developed aptamers to discriminate between two closely homologous virus coat proteins, PSA-H and MT32, with amino acid sequences identical in 81%. The label-free detection of ASPV was ensured by developing surface plasmon resonance sensor chips based on original aptamer sequences, which also allowed the kinetic analysis of aptamer-target interactions. The second part of my thesis focused on the development of molecularly imprinted polymers for protein recognition. Molecularly imprinted polymers (MIPs) are selective, synthetic sorbents prepared from a mixture of functional monomers in the presence of a target molecule. During polymerization, the target molecule acts as a template inducing binding sites in the polymer matrix, which are capable of selectively recognizing (rebinding) the target molecule. Although the universal concept of molecular imprinting proved to be very successful for small molecule imprinting, its application for 5
biomacromolecules is still a major challenge. The bulk synthesis method, with excellent results in generating MIPs for recognition of low-molecular-weight compounds, is hardly applicable to macromolecules due to their hindered mobility in the highly reticulated polymeric networks.4,5 Thus, in the worst case the macromolecules become entrapped in the polymeric material with both their removal and rebinding prohibited. Therefore, the essential prerequisite of generating macromolecular imprints should be clearly to create accessible binding sites amenable for free exchange of the target between the MIP and the sample phase, i.e. to have them confined to the surface of the MIPs. To address this fundamental limitation we have developed a novel method for the synthesis
of
surface
imprinted
polymers
compatible
with
conventional
photolithographic technology directly onto the surface of surface plasmon resonance (SPR) sensorchips. Apart from the overwhelming majority of the MIPs prepared by chemical synthesis, we used electrochemical oxidation to form surface-imprinted poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) doped with poly(styrenesulfonate) (PSS). To characterize the synthetic receptors prepared, i.e., DNA aptamers and surface imprinted polymers, in terms of their interaction strength with target proteins I have mainly used imaging surface plasmon resonance (iSPR). This technique enabled besides real-time and label-free monitoring of the relevant interactions also to perform multiplexed measurements aiding the effective optimization of the receptor-modified surfaces. Given the advantages of methods providing high-throughputs but involving simple assay methodology such homogeneous assays I have also developed an Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (ALPHA) based method for characterizing aptamer-protein interactions. This method has the prospect to significantly simplify the selection of the best aptamer candidates during the SELEX process.
6
4 Bevezetés A bioanalitikát forradalmasították a biológiai rendszerekből ismert rendkívül szelektív kölcsönhatások, mint például antitest-antigén, enzim-szubsztrát, és komplementer nukleinsavak hibridizációjának analitikai célú alkalmazása. Az analitikai eljárás során az egyik reakciópartner a meghatározandó komponens, amelynek komplementerét általában szilárd hordozó felületre rögzítik és az analitikai eszköz/rendszer részét képezi. A rendkívül szelektív, esetenként specifikus, biomolekuláris kölcsönhatások alkalmazása vezetett a bioszenzorok, illetve a biochip technológia és a nagy áteresztő képességű bioanalizátorok kifejlesztéséhez. Az értekezésem címében is szereplő receptor szó alatt, tágabb értelemben, azt a felismerésért felelős molekuláris struktúrát értem, ami affinitás jellegű, nem kovalens kölcsönhatásokon keresztül biztosítja a meghatározni
kívánt
molekula felismerését,
megkötését. A biológiai
eredetű
receptoroknak minden előnyük mellett jelentős hátrányaik is vannak. Így alkalmazásuk sok esetben csak a természetes közegüknek megfelelő körülményekre korlátozódik. Emellett sok esetben a költséghatékony, reprodukálható és nagy mennyiségben történő előállításuk sem megoldott. További problémát jelent a bioreceptorok stabilitása különböző kémiai és hőmérséklet viszonyok között. Ennek megfelelően jelentős előrelépést
jelenthet
a
tetszőleges
fizikai-kémiai
tulajdonságokkal
rendelkező
szintetikus receptorok kifejlesztése. Doktori munkám célkitűzése ilyen, kifejezetten analitikai feladatokra tervezett robusztus szintetikus receptorok fejlesztése és alkalmazása volt. Két
alapvetően
alkalmazásával
különböző foglalkoztam:
szintetikus DNS
receptor
aptamerekkel
fejlesztésével és
és
molekuláris
analitikai lenyomatú
polimerekkel. Az aptamerek 40-80 bázisból álló oligonukleotid molekulák, melyek szelektíven képesek kötődni egy adott célmolekulához. Bár nukleinsav – fehérje kölcsönhatások a természetben is ismertek, az aptamerek bázissorrendjének megállapítása és előállításuk tisztán szintetikus úton, in-vitro eljárással történik. Ennek megfelelően alkalmazási körük is kiterjedtebb lehet a természetes eredetű antitestekhez képest, hiszen az aptamerek akár kismolekulákra, toxikus anyagokra is előállíthatók és alkalmazásuk 7
során nem kell fiziológiás körülményeket biztosítani. Az aptamerek szelekcióját lehetővé tevő SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) eljárás 1990es kifejlesztése óta1,2 rendkívül nagyszámú célmolekulára szelektáltak aptamereket3, azonban ezek legnagyobb része nem kifejezetten analitikai, inkább molekuláris biológiai, vagy éppen terápiás célra, biológusok által fejlesztett aptamer. Az irodalomban kimondottan kevés a szelekciótól az analitikai alkalmazásig végigvezetett, következetes munka található. Ezért célom originális aptamer szekvenciák felhasználásával egy olyan felületi plazmon rezonanciás
szenzorchip
fejlesztése
volt,
mellyel
specifikusan
detektálhatók
vírusfehérjék. Modellként egy patogén növényi vírust, az alma törzsgöndörödés vírust (Apple Stem Pitting Virus – ASPV) választottam, amelynek gyakorlati jelentősége is van. Munkám másik iránya olyan molekuláris lenyomatot tartalmazó polimerek fejlesztése volt, melyek alkalmasak fehérjék meghatározására és integrálhatók felületi plazmon rezonanciás (Surface Plasmon Resonance -SPR) szenzorchipre. A molekuláris lenyomatú polimerek (Molecularly Imprinted Polymer – MIP) előállítása megfelelő funkcionális monomer egységekből, polimerizációval történik a célmolekula jelenlétében. A célmolekula eltávolítása után a polimerben visszamarad a célmolekula negatív lenyomata, ahova a célmolekula képes visszakötődni. Ez a módszer, amely kimondottan sikeresnek bizonyult kis molekulatömegű komponensekre szelektív polimerek szintézise esetén, a makromolekuláknál nem alkalmazható, ugyanis ezek mozgása gátolt a klasszikus molekuláris lenyomatot tartalmazó tömbpolimerekben. Így a polimerizáció után a makromolekulák eltávolítása a polimerből nem lehetséges. A probléma megoldásához felületi lenyomatú polimerek előállítására és alkalmazására dolgoztam ki módszert. Ennek segítségével a fehérje felismerésére alkalmas felületi lenyomatú polimert közvetlenül a felületi plazmon rezonanciás (SPR) szenzorchipen állítottam elő. A munka sarkalatos pontja volt a receptorok és a fehérjék közötti kölcsönhatás jellemzése, amelyhez az esetek többségében a kölcsönhatások kinetikájának valós idejű, jelölés
nélküli
nyomonkövetését
lehetővé
tevő
felületi
plazmon
rezonanciát
alkalmaztam. Az aptamer-fehérje kölcsönhatások mérésére kidolgoztam egy nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens módszert (Amplified Luminescent 8
Proximity Homogeneous Assay - ALPHA), ami lehetővé teszi a komplex mátrixokban történő mérést is. Ez jelentősen megkönnyítheti a későbbiekben az aptamer szelekció során a megfelelő analitikai tulajdonságokkal rendelkező aptamer kiválasztását.
9
5 Irodalmi áttekintés 5.1 Aptamerek Az aptamer elnevezés a latin aptus szóból származik, ami „illeszkedőt” jelent. Az aptamerek
olyan
DNS
vagy
RNS
oligonukleotid
molekulák,
melyek
térbeli
szerkezetüknek köszönhetően, nem kovalens jellegű kölcsönhatásokon keresztül egy adott célvegyület szelektív felismerésére, megkötésére alkalmasak. A célvegyületek lehetnek makromolekulák (pl. fehérjék), de kis molekulatömegű vegyületek is (pl. metabolitok, toxinok). A tény, hogy DNS vagy RNS molekulák a komplementer szekvenciájú nukleinsavakon kívül egyéb molekulákhoz is kötődhetnek korábban is ismert volt, azonban egy 40 bázis hosszúságú
oligonukleotid
esetén,
mely
kb.
1024 különböző
bázissorrenddel
rendelkezhet, pusztán elméleti úton ma még nem lehet kiválasztani azt a bázissorrendet, amelyik képes nagy affinitással, szelektíven kötni egy adott célmolekulát. Ezt az alapvető problémát oldotta meg az 1990-ben bevezetett SELEX módszer (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment), azaz ligandumok exponenciális kinyerése in-vitro evolúcióval, amit néhány hónap eltéréssel egymástól függetlenül közölt G.F. Joyce (La Jolla, USA), J.W. Szostak (Boston, USA)2 és L. Gold (Bolder, USA)1 laboratóriuma.
1. ábra
Az aptamerek működésének sematikus ábrája
Az antitestek és az aptamerek közötti párhuzam nyilvánvaló, azonban az aptamerek alkalmazása az alábbi előnyökkel jár6:
in-vitro előállítás, nem igényel aktív immunizációt
magas hőmérsékleten stabilabbak a fehérjéknél, denaturálás után könnyen regenerálhatók 10
irányított kémiai szintézissel a molekula kémiai stabilitása és affinitása tovább javítható7
kisebb molekulatömegükből kifolyólag nagyobb receptor sűrűséget lehet biztosítani szilárd hordozókon
elvileg bármilyen molekulára szelektálható aptamer
a kölcsönhatás környezeti paraméterei (pH, ionerősség, komplexképző) szabadon megválaszthatók
Az aptamerek rendkívül nagy affinitást mutatnak a célmolekuláikkal szemben. Az aptamer-fehérje kölcsönhatások disszociációs állandója tipikusan mikromolárispikomoláris tartományba esik, így számos esetben az adott fehérjére specifikus monoklonális antitestekkel összemérhető a kölcsönhatás erőssége.8 Az aptamerek egyedi másodlagos- és harmadlagos szerkezete biztosítja a célmolekula specifikus felismerését. A legtöbb publikált aptamer szekvencia guanin bázisban gazdag. Ez valószínűleg azért van így, mert azt találták, hogy a guaninban gazdag oligonukleotidok úgynevezett G-kvadruplex szerkezetet vehetnek fel.9 A G-kavdruplex szerkezet az oligonukleotidoknak egy olyan speciális harmadlagos szerkezete, amit 4 guanin bázis tud kialakítani Hoogsteen-féle10 hidrogén kötések révén (2. ábra). Ezt a szerkezetet egyértékű kationok (általában K+)11 tovább stabilizálják. Egy molekulán belül akkor alakulhat ki stabil intramolekuláris G-kvadruplex szerkezet, ha legalább 4 darab 4 guaninból álló szakasz található a szekvenciában.12
2. ábra
Guanin bázisokból kialakuló G-kvadruplex szerkezet
Aptamerekkel rendkívül nagy specifikusság érhető el, amit jól szemléltet az anti-teofilin aptamer, amely 10 000-szeres szelektivitást mutat a koffeinnel szemben13, miközben a
11
két molekula csupán egyetlen metil csoportban különbözik. Az anti-L-arginin RNS aptamer pedig 12 000-szeres szelektivitást mutat a D-argininnel szemben14. Az
aptamerek
az
előbb
említett
tulajdonságaiknak
köszönhetően
kiválóan
alkalmazhatók érzékeny és specifikus analitikai, diagnosztika módszerekben. Széleskörű alkalmazásukat az aptamerekkel kapcsolatos publikációk számának exponenciális növekedése is bizonyítja (3. ábra).
3. ábra Aptamerekkel („aptamer”) és antitestekkel („antibody”) foglalkozó tudományos közlemények számának változása az adott keresőszóra kapott összes találat százalékában kifejezve (forrás: Web of Science®) 5.1.1 Az aptamerek szelekciója Oligonukleotid könyvtár Az aptamerek szelekciója egy olyan oligonukleotid könyvtárból történik, amely 10131015 különböző, véletlenszerű szekvenciájú oligonukleotidot tartalmaz. Egy ilyen könyvtár előállításához kombinatorikus kémiai szintézis szükséges,15 amivel viszonylag olcsón és könnyen állíthatók elő véletlenszerű oligonukleotid szekvenciák. A viszonylag egyszerű könyvtár szintézis ellenére azonban néhány kérdést tisztázni kell az aptamer szelekciója előtt. Az egyik tisztázandó kérdés a kiindulási könyvtárban található oligonukleotidok hossza. Számos munkában vizsgálták a kiindulási szekvenciák hosszának jelentőségét.16-18 Feltételezték, hogy a hosszabb szekvenciákat tartalmazó könyvtárakból jobb kiindulni a szelekció során, mivel a hosszabb oligonukleotidok sokkal többféle harmadlagos 12
szerkezetet vehetnek fel, mint a rövidek, és a szelektív felismerésért felelős szerkezeti motívumok kialakulásának valószínűsége is nagyobb. A hosszú oligonukleotidokat tartalmazó könyvtárak ellen szól azonban, hogy hajlamosak aggregálódni16, és a felesleges nukleotidok hatására olyan harmadlagos szerkezet alakul ki az egyébként funkcionális szerkezeti motívumokból, amik már nem alkalmasak a szelektív felismerésre17. Emiatt 70-80 bázisnál hosszabb oligonukleotidból álló könyvtártból csak abban az esetben célszerű kiindulni, ha rendkívül nagy és bonyolult a célmolekula. A másik fontos jellemzője a kiindulási oligonukleotid könyvtárnak a komplexitása. A kiindulási oligonukleotid könyvtár komplexitása arra utal, hogy hányféle szekvenciát tartalmaz. Nyilvánvaló, hogy minél többféle oligonukleotid szekvencia közül válogatunk, annál nagyobb a valószínűsége, hogy találunk egy olyat, ami képes szelektíven kötődni egy adott molekulához. Feltétezve, hogy valóban véletlenszerű a könyvtárban található szekvenciák bázissorendje, viszonylag könnyen kiszámítható a könyvtár komplexitása. Például, ha egy könyvtár N bázis hosszú szekvenciákat tartalmaz, amik y különböző bázisból épülnek fel, a komplexitás yN. Ennek megfelelően például az N=40 bázis hosszúságú oligonukleotidokból álló könyvtár esetén, ahol y=4-féle bázis fordulhat elő, elméletileg 440 = 1,2×1024 a lehetséges szekvenciák száma, azonban gyakorlati okok miatt maximum 1013-1015 féle szekvencia közül lehet kiválasztani az aptamereket19. A lehetséges bázisok száma ráadásul nem korlátozódik kizárólag a természetes WatsonCrick bázisokra. A Watson-Crick bázisokat utánzó mesterséges bázisokkal jelentősen növelhető a komplexitás. A bázisokon a hidrogénkötés kialakításában résztvevő donor és akceptor csoportok felcserélésével (papíron) akár nyolc további szintetikus bázishoz juthatunk (4. ábra).20 A mesterséges bázisok tervezésénél azonban figyelembe kell venni néhány szabályt, szintézisüknek megvalósíthatónak kell lennie, és kompatibilisnek kell maradniuk a polimeráz enzimekkel. Azonban bizonyos módosításokkal, esetenként a heterociklusok helyettesítésével a mesterséges bázisok teljesítik ezeket a kritériumokat 21-23,
és módosított polimeráz enzimeket alkalmazva polimeráz láncreakcióval
(polymerase chain reaction - PCR) erősíthetők.24
13
4. ábra
Természetes és szintetikus bázisok
Az aptamert alkotó nukleotidok kémiai természetének a hidrogén-hidakon, és az elektrosztatikus, aromás kölcsönhatásokon keresztül szintén rendkívüli jelentősége van a lehetséges három-dimenziós struktúrák kialakulásában. Az alkalmazott bázisok befolyásolják az aptamerek ellenállóképességét az enzimatikus és kémiai degradációval szemben, amire az egyszálú, természetes nukleotidokból felépülő oligonukleotidok esetén különös figyelmet kell fordítani a biológiai mintákban mindig előforduló enzimek miatt. Az RNS-ek a természetben is egyszálúak és rendkívül komplex harmadlagos szerkezetet vehetnek fel, így kiválóan alkalmasak aptamernek, azonban nagyon érzékenyek a különböző degradációs hatásokra. Lúgos pH-n a ribóz 2’ helyzetben található hidroxil csoportja hidrolizál, különösen endonukleázok, pl. RNáz enzimek jelenlétében, amelyek szinte minden biológiai mintában előfordulnak. A hidrolízis során felhasad a foszfodiészter váz (5. ábra), aminek hatására az 5’ terminálison egy ciklikus 2’,3’ foszfát, míg a 3’ terminálison egy szabad hidroxil csoport jön létre. A nukleáz rezisztencia növelésére leggyakrabban az RNS 2’ amino-, és 2’ fluoro-pirimidin módosításait alkalmazzák.25
14
5. ábra
Az RNS aptamerek hidrolízise. A 2’ hidroxil csoport kicserélésével növelhető az aptamer stabilitása.
A DNS aptamerek sokkal stabilabbak, azonban szintén nem védettek a biológiai mintákban előforduló nukleázok hatásaival szemben. Stabilitásuk a nukleotid bázisok26, vagy
a
foszfodiészter
váz
módosításával27,28,
illetve
enantiomer
aptamerek
(spiegelmerek)29 alkalmazásával növelhető. Alapvető azonban, hogy módosításoknak kompatibilisnek kell lenniük a polimeráz, illetve transzkriptáz enzimekkel. A spiegelmerek olyan oligonukleotidok
mesterséges oligonukleotidok,
tükörképei.
Mivel
ezek
a
amelyek
természetben
nem
a
természetes előforduló
L
konfigurációjú nukleotidokból épülnek fel, rezisztensek a nukleázok hatásaival szemben. A spiegelmerek szelekciójához először D-aminosavakból megszintetizálják az L-peptid tükörképét. Ezután a tükörképi D-peptidet alkalmazva elvégzik a SELEX eljárást a természetes konfigurációjú D-oligonukleotid könyvtáron. A tükörképi D-peptidet kötő D-aptamert, a SELEX eljárással történő kiválasztását, majd szekvenálását követően, a bázissorrend
ismeretében,
a
természetben
nem
előforduló
L-konfigurációban
szintetizálják meg. Végül az L konfigurációjú aptamer, azaz a spiegelmer kötődni fog a természetes konfigurációjú L-peptidhez. 29 Az aptamer szelekció során alkalmazott oligonukleotid könyvtárakban a véletlenszerűen változó szekvenciájú oligonukleotidokat két állandó szekvenciájú, úgynevezett primer régió fogja közre, amire a polimeráz láncreakcióval (PCR) történő sokszorosításnál van szükség (6. ábra). A véletlenszerű rész állhat valóban véletlen sorrendű nukleotidokból, vagy lehetőség van az egyes bázisok valószínűségének beállítására 0-100% között. Az állandó szekvenciájú primer régió megtervezése különös figyelmet igényel, hiszen egy 10 körös SELEX esetén, ahol körönként 20 PCR ciklus történik, a legkisebb artifaktum is felerősödik.
15
6. ábra Egy DNS aptamer szelekciója során alkalmazott könyvtárban található oligonukleotidok tipikus felépítése. Ebben az esetben a 40 bázisból álló, véletlenszerű oligonukleotid szekvenciát az 5’ és 3’ terminálison a PCR sokszorosításhoz szükséges primer régiók fogják közre SELEX eljárás A SELEX (Systematic Evolution of Ligands By Exponential Enrichment) egy iteratív, darwini típusú in-vitro evolúciós eljárás, mely során egy kémiai úton szintetizált, rendkívül
nagyszámú
különböző
bázissorrendű
oligonukleotidot
tartalmazó
könyvtárból, szelekciós nyomás hatására, viszonylag kis számú, a célmolekulához nagy affinitással és szelektíven kötődő szekvenciához lehet jutni.30 Az oligonukleotid könyvtárból kiindulva először elválasztják a célmolekulához affinitással rendelkező oligonukleotidokat a nem kötődő szekvenciáktól, majd felsokszorosítják őket. Így egy olyan oligonukleotid könyvtárhoz jutnak, melyben feldúsultak a célmolekulához kötődő szekvenciák. Az így kapott könyvtárral többször megismétlik a szelekciós és erősítési lépéseket, így az iteratív eljárás eredményeként leegyszerűsödik a könyvtár a célmolekulát szelektíven és nagy affinitással kötődő szekvenciákra. A SELEX eljárás alapvető lépéseit az 7. ábra mutatja. Az eljárás előtt kritikus lépés a célmolekula megfelelő tisztaságban és koncentrációban történő előállítása, mivel csak tiszta célvegyülettel érhető el megfelelő szelektivitás. Kismolekulák esetében ez általában nem jelent problémát, azonban fehérjék esetében ez kritikus lehet, mivel könnyen denaturálódhatnak és kitapadhatnak a tisztítási lépések során. Kezdetben a célvegyületet egy szilárd hordozóhoz immobilizálták, hogy a szelekció során a célmolekulához kötődő és a célmolekulához nem kötődő szekvenciák megfelelően elválaszthatók legyenek. Erre fehérjék esetén az egyik lehetséges módszer az agaróz, vagy szefaróz oszlop alkalmazása31,32, azonban ehhez nagymennyiségű, tiszta fehérjének kell rendelkezésre állnia. Affinitási kölcsönhatáson (pl. biotin - avidin, hexahisztidin - Ni2+, glutation - glutation-S-transzferáz kölcsönhatáson) keresztül mágneses gyöngyhöz is immobilizálható a célmolekula33-36, amiből így csak rendkívül kis mennyiségre van szükség. 16
7. ábra A SELEX eljárás sematikus ábrája. Az eljárás során nagyszámú különböző bázissorrendű oligonukleotidot tartalmazó könyvtárat (A) hozzáadják a szilárd hordozóhoz rögzített célmolekulához (B), majd szelektív mosással elkülönítik a célmolekulához kötődő és nem kötődő szekvenciákat (C). A célmolekulához kötődő oligonukleotidokat PCR eljárással felsokszorozzák (D), egyszálúsítják (E) és hozzáadják az eredeti könyvtárhoz. Ezzel a nagyobb affinitású oligonukleotidokra nézve dúsított könyvtárral megismétlik a SELEX kört (A-E). Többszöri ismétlést követően a feldúsult, célmolekulához nagy affinitással bíró szekvenciákat klónozással elkülönítik és szekvenálással megállapítják a bázissorrendjüket (F). Az utóbbi években számos olyan módszert is leírtak, amivel a célmolekula immobilizálása nélkül elválaszthatók a célmolekulához kötődő és nem kötődő szekvenciák, például kapilláris elektroforézissel (Capillary Electrophoresis – CE)37-39. Mivel CE-SELEX technikánál a célmolekula nincs immobilizálva, kizárható az immobilizáció miatt fellépő szerkezetváltozás. A célmolekulát összekeverik az oligonukleotid
könyvtárral,
majd
egy
kapillárisban
elektromos
feszültséggel
szétválasztják a nem kötődő szekvenciákat az aptamer-célmolekula komplextől. Az elválasztás alapja, hogy a negatív töltésű aptamer a pozitív töltésű anód fele áramlik a kapillárisban, miközben a szabad aptamer és az aptamer-célmolekula komplex mobilitása eltér. Így a kapilláris végén mérve az oligonukleotidok UV abszorpcióját, vagy fluoreszcensen jelölt aptamerek esetén fluoreszcenciás detektálást alkalmazva külön frakciókba gyűjthetők a különböző affinitással kötődő szekvenciák. Ezzel a módszerrel jelentősen lerövidíthető a szelekcióhoz szükséges idő. A SELEX eljárás nyomonkövetése a célmolekulához kötött és a nem kötődött oligonukleotidok arányának ciklusonkénti meghatározásával történhet. Ez radioaktív 17
jelölés alkalmazásával lehetséges, ami rendkívül érzékeny, hátránya viszont, hogy különleges feltételek szükségesek hozzá és költséges.2,40,41 A fluoreszcens jelölés megfelelően érzékeny és különleges óvintézkedés nélkül alkalmazható. 33,42,43 A nem kötődött oligonukleotidok eltávolítását általában a kötődött szekvenciák elúciója követi a célmolekuláról. Az elúció történhet hőkezelés mellett33, karbamiddal, SDS-sel, EDTA-val történő denaturálással44-46, a célmolekulát felhasználva14,47, vagy a célmolekula kötőhelyéhez kötődő kompetitív molekulával48 történő leszorítással. Az irodalomban található néhány olyan példa is, amikor az aptamer-célmolekula komplexet nem választják szét a PCR lépés előtt.49,50 A SELEX eljárás egyik legnagyobb előnye, hogy már a szelekciós eljárás során figyelembe lehet venni, hogy később milyen körülmények között és milyen közegben szeretnénk alkalmazni az aptamert. Ennek köszönhetően nagyon sokféle SELEX eljárást dolgoztak ki az eredeti SELEX eljárásból kiindulva. Ezeknek a változtatásoknak a célja részben az eljárás egyszerűsítése, optimalizálása, részben a szelektivitás növelése volt.51 Mivel a kiindulási oligonukleotid könyvtár rendkívül komplex, nem várható, hogy néhány kötődő oligonukleotid molekulánál többet kapjunk az első szelekciós lépés során. Ezért ezt a kisszámú oligonukleotidot fel sokszorosítani kell. A PCR eljárással történő sokszorosítás során a DNS aptamereket módosítani lehet különböző speciális polimeráz enzim felismerő szakaszokkal (primerekkel), amik olyan jelölő molekulát (pl. fluoreszcein), funkciós csoportot (pl. biotin) tartalmaznak, amik később segítik a detektálást vagy az immobilizációt.33,52 Ez az a pont ahol a DNS és RNS aptamerek esetében eltér a SELEX eljárás, mivel az RNS oligonukleotidokat először reverz transzkripciós PCR (reverse transcription PCR – RT PCR) segítségével át kell írni DNS molekulákká, amelynek eredménye cDNS lesz, ami PCR eljárással sokszorosítható. Mivel a felerősített aptamer könyvtár kettősszálú DNS-eket tartalmaz, a következő SELEX ciklus előtt egyszálúsítani kell a DNS-eket. RNS aptamerek esetén a következő lépés a T7 RNS polimerázzal történő transzkripció. Az így kapott RNS molekulákkal lehet indítani a következő SELEX ciklust. Egyszálú DNS aptamer szelekciójakor a komplementer szálak elválasztásához általában avidin-biotin rendszert használnak. Ehhez biotinnal módosítják, majd a méretkülönbség alapján, gél elektroforézissel különítik el a szálakat53, vagy streptavidinnel módosított felülethez kötik a kettősszálú 18
DNS-t. Mivel csak az egyik szál módosított biotinnal, denaturálást követően elválaszthatók egymástól a szálak.54 Egy másik lehetőség az aszimmetrikus PCR alkalmazása, ami csak egy primert használ, vagy az egyiket sokkal nagyobb mértékben, így egyszálú DNS-t eredményez.55 A SELEX eljárás során a szelekciós, amplifikációs és kondicionálási lépéseket ciklikusan végrehajtva a kezdeti oligonukleotid könyvtár komplexitása lecsökken és feldúsulnak benne a célmolekulához kötődő aptamer jelölt oligonukleotidok. Az aptamerek szelektivitásának növelése érdekében a SELEX ciklusok közé beiktathatók kontraszelekciós (Counter SELEX) lépések. Kontraszelekció alkalmazásával kizárhatók a könyvtárból bizonyos vegyületekhez kötődő szekvenciák. Ilyenkor a célmolekulát a későbbi alkalmazást zavaró molekulára cserélik egy szelekciós ciklus idejére, és a következő ciklus végrehajtása előtt eltávolítják az ahhoz kötődő szekvenciákat. Ilyen kontraszelekció elvégezhető a későbbi alkalmazásnál jelenlévő kritikus zavaró molekulákra, és arra az ágyra is, amelyhez a SELEX eljárás során a célmolekula rögzítve lett, csökkentve a nem specifikusan kötődő szekvenciák számát.56 Általában 6-20 ciklus után már nem növelhető tovább a könyvtár affinitása a célmolekulához. Ezután következik a kötődő szekvenciák azonosítása. Ehhez a végső könyvtárat egy bakteriális vektorba kell klónozni és az egyedi kolóniákat szekvenálni. A szelekció eredményéül kapott aptamerek száma akár 1 és 1 millió között is változhat a célmolekulától, illetve a szelekciótól függően.57 Jellemzően 30-50 aptamer klónt szoktak szekvenálni. Szekvencia illesztéssel megkereshetők azok a konzervált szakaszok az aptamer klónokban amik a specifikus felismerésben szerepet játszó szerkezeti motívumokat alakítják ki, és így becsülhető, hogy egy ilyen konzervált szakasz hány klónban szerepel. Felhasználás szempontjából rendkívül előnyös, hogy a szelekciós eljárást elegendő egyszer elvégezni. A szekvenálással megkapott bázissorrend alapján az aptamer később bármikor megszintetizáltatható, nincs szükség ismételt szelekciós eljárásra. 5.1.2 Aptamer-fehérje kölcsönhatások jellemzése Az aptamer szelekció eredményeként kapott nagyszámú aptamer molekula közül ki kell választani az adott analitikai feladatra legalkalmasabb, megfelelő affinitással bíró 19
szekvenciákat. Ehhez szekvenciánként külön-külön vizsgálni kell az aptamer–fehérje kölcsönhatást, azaz meghatározni az aptamer-fehérje komplex disszociációs állandóját (Kd). Az aptamerek és célmolekuláik közötti kölcsönhatás mechanizmusának jobb megértése pedig segítséget ad az aptamereken alapuló detektálási technikák tervezéséhez. Nagyszámú aptamer szekvencia esetében ez rendkívül nagy feladat a jelenleg alkalmazott technikákkal. Az alábbiakban az aptamer-fehérje kölcsönhatások jellemzésére alkalmas fontosabb analitikai technikákat mutatom be.58 Ezeknek a technikáknak az egyik része elválasztáson alapul (dialízis, ultraszűrés, gél elektroforézis, kapilláris elektroforézis, nagy teljesítményű folyadék kromatográfia), másik részük elválasztást nem igénylő módszer (fluoreszcencia intenzitás és anizotrópia, izotermikus titrálási kalorimetria és felületi plazmon rezonancia). Az elválasztásos technikák a szabad aptamer és az aptamer-protein komplex szétválasztásán alapulnak a méret-, tömegkülönbség alapján. Az egyensúlyi dialízis akkor használható, ha jelentős méretkülönbség van az aptamer és a célmolekula között. Ennél a technikánál egy méretkizárásos membrán felel az elválasztásért, ami a szabad aptamert átengedi, de a nagyobb méretű célmolekulát, illetve a fehérje-aptamer komplexet már nem. Az elválasztás után különböző célfehérje koncentrációknál szcintillációs méréstechnikával megmérik a membrán másik oldalára átjutott radioaktív izotóppal (például tríciummal, vagy 32-es tömegszámú foszforral) jelölt szabad aptamer mennyiségét.14. Ennél a módszernél figyelni kell a pH, a membránon fellépő nem specifikus adszorpció és az ozmózisnyomás hatására. Az ultraszűréses annyiban tér el a dialízistől, hogy itt az aptamert és a célfehérjét tartalmazó oldatot nyomással, vákuummal vagy centrifugális erővel kényszerítik át a membránon. Az aptamer-protein komplexet visszatartja a membrán, így különböző célmolekula koncentrációknál meghatározhatók az egyensúlyi koncentrációk például radioaktív,
vagy
kemilumineszcens59
méréstechnikával.
Kemilumineszcenciás
detektálásnál a membrán által visszatartott, komplexben található, biotinnal módosított aptamerhez streptavidin-enzim konjugátumot adnak, ami olyan reakciót katalizál, aminek hatására fénykibocsátás lép fel. Ez a módszer rendkívül kis, akár egészen pM-os Kd értékek meghatározására is alkalmas60, azonban a nem specifikus adszorpció a membránon itt is problémát jelenthet. 20
Kapilláris elektroforézissel (Capillary Electrophoresis - CE) méret és töltés alapján választhatók szét molekulák. Az elválasztás 20-100 µm átmérőjű kapillárisban történik, ami jelentősen lecsökkenti a szükséges mintatérfogatot. A protein és az aptamer-protein komplex mobilitása általában kisebb, mint a szabad aptameré, így fluoreszcensen jelzett aptamer esetén az elektroferogramon egy-egy csúcs felel meg a szabad és a komplexben lévő aptamernek. A fehérje koncentrációt növelve, a szabad aptamernek megfelelő csúcs csökkenéséből számíthatók az egyensúlyi koncentrációk. Kézenfekvő ennek a technikának az alkalmazása CE-SELEX szelekció során, amivel már a szelekció közben kiválaszthatók a megfelelő affinitással kötődő oligonukleotidok.61-63 Nagy
hatékonyságú
folyadék
kromatográfiával
(High
Performance
Liquid
Chromatography – HPLC), pl. méretkizárást alkalmazva elválasztható a szabad aptamer, a célfehérje és az aptamer-fehérje komplex, és jellemezhető az aptamer-fehérje kölcsönhatás.43 Frontális kromatográfiával a kolonnában immobilizált aptamerek affinitása is meghatározható.64-69 A szabad aptamer és az aptamer-fehérje komplex elválasztását nem igénylő módszerekkel általában a tényleges egyensúlyi állandók mérhetők meg, egyszerűbben kivitelezhetők és nagyobb párhuzamosságot tesznek lehetővé. A fluoreszcencia intenzitás (FI) mérésnek számos előnye van. Nagyszámú fluoreszcens festék áll rendelkezésre különböző gerjesztési/emissziós hullámhosszokkal, eltérő fluoreszcencia élettartamokkal, és az oligonukleotidok fluoreszcens jelölésének is széles az irodalma.70 Gyakran az aptamer fluoreszcenciájának megváltozását okozza a célproteinhez kötődés, ilyenkor ez a változás közvetlenül alkalmas lehet a kötődés mérésére. Ennek oka, hogy az aptamer-fehérje komplex mikrokörnyezete jelentősen eltérhet az oldat által biztosítottól, ami a fluoreszcencia kvantumhatásfokát befolyásolja. Fluoreszcencia
polarizáció
(FP),
illetve
fluoreszcencia
anizotrópia
(FA)
alkalmazásakor a mintaoldatot polarizált gerjesztő fénnyel világítják meg. Ha a fluoreszcens molekula forgási sebessége összemérhető a fluoreszcencia élettartamával, az emittált fény polarizációja megváltozik. Amikor a fluoreszcensen jelölt aptamer a célfehérjéhez kötődik, jelentősen megváltozik a mérete, így a forgási sebessége és a polarizációja is.71
21
Az izotermikus titrálási kalorimetria (ITC) azon alapul, hogy az aptamer-fehérje komplex kialakulása exoterm folyamat. A módszer során az elektromos energia mennyiségét mérik, ami ahhoz szükséges, hogy az aptamert tartalmazó edényt ugyanolyan hőmérsékleten tartsák, mint az ugyanolyan térfogatú, csak puffert tartalmazó edényt, miközben az aptamer oldatot a fehérje oldattal titrálják. A módszer hátránya, hogy viszonylag nagy koncentráció kell a méréshez.72 A felületi plazmon rezonancia (Surface Plasmon Resonance – SPR) a biomolekuláris kölcsönhatások Kd értékének meghatározásának egyik legelfogadottabb módja73,74. Ennek a méréstechnikának az elvét később kifejtem dolgozatomban. Röviden ezzel a technikával a szenzor felületének közvetlen közelében történő törésmutató változás mérhető. Így a szenzor felületére immobilizált aptamerhez kötődő fehérje mennyisége jelölés nélkül, valós időben mérhető. Ezzel a technikával nem csak egyensúlyi információk kaphatók, hanem az asszociációs és disszociációs sebességi állandók is meghatározhatók. A szenzor felületének módosítása azonban optimalizálást igényel, valamint még képalkotó SPR használata esetén is, ami nagy párhuzamosságot tesz lehetővé, viszonylag kis áteresztőképességűnek számít. 5.1.3 Aptamer alapú assay formátumok Napjainkban a diagnosztikai vizsgálatok döntő részét immunoassay-k alkalmazásával végzik, és már több mint ötven éve az antitestek a legnépszerűbb receptorok ezekben az assay-kben75. A SELEX eljárás kifejlesztésével76, majd a módosított, aminosavakkal összemérhető funkcionalitású nukleobázisok bevezetésével77 az aptamerek már felveszik a versenyt az antitestekkel. Bár az aptamerek
jelentősen
különböznek az antitestektől,
a
diagnosztikai
módszerekben hasonló szerepet tölthetnek be. A leggyakrabban alkalmazott diagnosztikai assay formátumok többsége az egy kötőhelyen, vagy a két kötőhelyen (sandwich módszer) történő felismerésen alapul. Mivel kismolekulák esetén az aptamer gyakran gátolja további receptor bekötődését a célmolekulához78, általában csak egy kötőhelyen keresztül történő felismerés lehetséges. Fehérjék esetén ezzel szemben lehetséges az egy kötőhelyen, vagy akár a két kötőhelyen keresztül történő felismerés is (8. ábra). Természetesen a két kötőhelyen keresztül, sandwich módszerben történő
22
kimutatáshoz szükség van két olyan aptamerre, amely a fehérje két különböző epitópjához kötődik79.
8. ábra Aptamer alapú assay formátumok. A) kismolekula, amit teljesen elfed az aptamer; B) egy kötőhelyes assay, C) két-kötőhelyes, sandwich assay két aptamerrel, D) sandwich assay egy aptamerrel és egy antitesttel Manapság a legelterjedtebben alkalmazott diagnosztikai assay formátum, ahol a célmolekula két különböző kötőhelyéhez egy-egy receptor kötődik. Az egyik receptor a célmolekula oldatból történő megkötéséért (capture), a másik pedig, általában valamilyen jelölőmolekulán keresztül, a detektálásért felelős. Ez a sandwich assay elrendezés növeli a szelektivitást és az érzékenységet. Aptamer és antitest vegyesen is alkalmazható. A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF)80 szérumból történő kimutatásánál olyan aptamer sandwich assay-t találtak a legérzékenyebbnek, ahol a megkötésért felelős receptor egy antitest volt, míg a detektálás fluoreszcein festékkel módosított aptamerrel történt. A véralvadás faktor trombin fehérjére két különböző epitópot kötő aptamert is szelektáltak81,82, melyek akár egyszerre is alkalmazhatók sandwich módszerben83. Néhány fehérje (pl. dimerek) két azonos kötőhelyet is tartalmazhat. Ilyenkor a sandwich módszer kialakításához egy aptamer is elegendő. Ugyanazt az aptamer szekvenciát lehet használni immobilizálva a célmolekula megkötéséhez és jelölve (pl. fluoreszcensen, enzimmel) a detektáláshoz. Az ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) típusú immunoassay-k esetében enzimmel, például alkalikus-foszfatáz (AP) vagy torma-peroxidáz (HRP) enzimekkel konjugált másodlagos antitesteket alkalmaznak a detektáláshoz. Az enzimek olyan reakciót katalizálnak, ami mérhető jelet generál. Mivel az aptamerek szelekciójához alkalmazott technikával olyan aptamerek is előállíthatók, amik új reakciókat 23
katalizálnak („aptazyme” vagy „riboswitch”)84, később akár az is lehetségessé válhat, hogy diagnosztikai assay-kben, az aptamerek nem csak a specifikus felismerésben vesznek részt, de felváltják a jelenleg alkalmazott enzimeket is. 5.1.4 Aptameren alapuló szenzorok A nukelinsav szerkezete által biztosított speciális assay-ek olyan detektálási eljárásokra adnak lehetőséget, ami az antitestek esetében nem lehetséges. Bizonyos esetekben
a
célmolekula
gyors detektálása
szükséges.
Ilyenkor
a
mikrotitertálcában végzett immunoassay helyett egy olyan miniatürizált, hordozható eszköz az ideális, ami minimális mintaelőkészítést igényel, egyszerűen alkalmazható és gyors
választ
ad.
Ezeknek
a
követelményeknek
próbálnak
megfelelni
az
immunoszenzorok, amik a molekuláris felismeréshez specifikus és megfelelő érzékenységet biztosító, affinitáson alapuló receptorokat alkalmaznak, és általában integrálva tartalmazzák a jelátalakító egységet, ami a kémiai információból közvetlen mérhető fizikai jelet állít elő. 85 Az immunoszenzorok egyik gyenge pontja az antitesttel módosított felület regenerálása, ami lehetővé tenné a szenzor ismételt alkalmazását. Mivel az antitestek esetén a funkcionalitásuk megőrzése érdekében nem alkalmazhatók a hidrogén hidak bontáshoz szükséges erősen lúgos vagy savas oldatok, ezért regenerálásuk gyakran nem lehetséges. Az
aptamerek
azonban
nukleinsav
természetüknek
köszönhetően
többször
regenerálhatók, ami történhet a hőmérséklet, a só koncentráció, a pH változtatásával, illetve komplexképzők hozzáadásával. Ezek közül kizárólag szélsőséges pH értékek alkalmazásával kell óvatosan bánni, ami károsíthatja a nukleinsavakat. Az aptamerek receptorként történő alkalmazásakor rendkívül előnyös, hogy az oligonukleotidok jól kontrollálható, reprodukálható módon immobilizálhatók a szenzor felületre86-88, és mivel könnyen jelölhetők különböző molekulákkal, így alkalmazásuk számos detektálási módszert tesz lehetővé. Aptamereken alapuló elektrokémiai szenzorok A legtöbb elektrokémiai aptamer szenzor működése azon alapul, hogy az aptamert egy elektródfelületre immobilizálják és a másik végére egy elektroaktív molekulát kötnek. Ez a molekula reverzibilisen oxidálható-redukálható, ha a felület közelében van, de az 24
elektronátlépés gátolttá válik, ha a távolság megnő a szenzorfelülettől. Azt használják ki, hogy a célmolekula bekötődése az aptamer konformációján keresztül a távolságot és ezáltal az elektrontranszfert modulálja.89-95 Ezen az elven alapul egy véralvadási faktor, a trombin fehérje mérésére alkalmas szenzor működése, amelynél elektroaktív metilénkékkel (MB) módosított anti-trombin aptamert immobilizáltak az elektród felszínére (9. ábra, A).91 Az aptamer flexibilis szerkezete lehetővé teszi, hogy a metilénkék az elektródfelülettel érintkezzen, azonban a trombin jelenlétében az aptamer G-kvadruplex struktúrát vesz fel és annyira eltávolítja a metilénkék molekulát a felülettő, hogy az elektron átadás gátolt lesz. Ennek a detektálási eljárásnak a legfőbb hátránya, hogy a mérendő trombin koncentrációjával fordítottan arányos jelet ad, ezért úgy módosították az aptamert, hogy annak szerkezete csak a célfehérje jelenlétében tegye lehetővé az elektroaktív csoport hozzáférését az elektródfelülethez. Ehhez az aptamer egyik végét tiol csoporttal, a másik végét ferrocén redox aktív csoporttal módosították (9. ábra, B)89,96,97, és azt a jelenséget használták ki, hogy a hosszú, flexibilis aptamer megakadályozza a ferrocén és az elektród érintkezését. A trombin jelenlétében kialakuló G-kvadruplex szerkezet hatására a ferrocén az elektródfelület közelébe kerül, lehetővé téve az elektron átmenetet az elektroaktív ferrocén és az elektród között. Így a trombin koncentrációjával arányos áramjelet kaptak. Mivel ennél a struktúráknál az aptamer viszonylag szabad konformációt vehet fel, nagy a háttér jel. Egy módosított megközelítés, amikor egy komplementer DNS szál teszi merevvé az elektroaktív csoporttal módosított ATP aptamert, távoltartva az elektroaktív csoportot az elektródfelülettől (9. ábra, C). Az ATP leszorítja az aptamerről a komplementer DNS-t és lehetővé válik, hogy az aptamer felvegye a G-kvadruplex szerkezetet, aminek hatására az elektroaktív csoport közel kerül az elektródfelülethez.98
25
9. ábra Néhány példa az aptamer alapú bioszenzoroknál alkalmazott elektrokémiai detektálásra89: A) A trombin bekötődését követően a metilénkékkel (MB) módosított aptamer G-kvadruplex szerkezetet vesz fel, így gátolttá válik az elektronátmenet a metilénkék és az elektródfelület között. Ennél a szenzortípusnál a fehérje koncentrációjával fordítottan arányos a jel.91 B) A trombin-aptamer szerkezet kialakulásakor az aptamer G-kvadruplex szerkezete stabilizálódik és az elektroaktív ferrocén az elektród felületéhez közel kerül, ami pozitív jelet eredményez. C) Az ATP hatására felbomlik a DNS duplex és kialakul az aptamer G-kvadruplex szerkezete. Ennek hatására a szenzorfelület közvetlen közelébe kerül az aptameren található ferrocén, pozitív jelet eredményezve. Az elektrokémiai bioszenzorok esetében a jelölésmentes, gyors válaszjelet adó technikák kedveltek. Ilyen jelölésmentes detektálást tesz lehetővé interkalációs metilénkék alkalmazása, ahol a metilénkék molekulákat anti-trombin aptamer hajtű szerkezetének kettősszálú DNS része komplexálja. A trombinnal történő kölcsönhatás során a hajtű szerkezet felnyílik, és kiszabadulnak a metilénkék molekulák, amiknek a mennyisége voltammetriávala mérhető. Így a metilénkék molekulákat redukálva, voltammetriásan detektálható a trombin94 (10. ábra, A). Más megközelítésekben kationos elektroaktív jelzőmolekulákat
(ferrocén
funkcionalizált
polielektrolitot,
vagy
[Ru(NH3)6]3+)
használnak, amik elektrosztatikusan kölcsönhatnak a negatívan töltött DNS aptamerrel 99,100.
A redox jelzőmolekulák és az immobilizált aptamerek közötti kölcsönhatás
jelentős
voltammetriás
választ
ad.
A
trombin,
illetve
lizozim
bekötődése
megakadályozza a jelzőmolekulák kötődését az aptamerekhez és csökkenti az elektrokémiai jelet. Ennek a módszernek a hátránya a viszonylag magas kimutatási határ, ami trombin esetében 1 µM-nak bizonyult. (10. ábra, B). Egyfalú szén nanocső térvezérelt tranzisztor (Single-Wall Carbon Nanotube – Field-Effect Transistor - SWCNTFET)
alkalmazásával
valóban
jelölésmentesen
detektáltak
aptamer-fehérje
kölcsönhatást.101 Ezek a FET szenzorok nem alkalmasak fehérje-fehérje kölcsönhatások mérésére, mivel a célmolekula felismerése általában a két elektród között folyó áramot szabályzó kapu elektromos kettősrétegén kívül történik. Az aptamerek azonban A voltammetria során az elektroaktív molekula redukciójához/oxidációjához szükséges áramot mérjük, ami arányos az oldatbeli koncentrációval. a
26
megfelelően kis méretűek ahhoz, hogy a felismerés a kettős réteg Debye-távolságánb belül történjen, így befolyásolva a kapufeszültséget (10. ábra, C).102
10. ábra Jelölésmentes elektrokémiai szenzorok. A) A célmolekulával történő kölcsönhatás hatására felnyílik a hajtű struktúra és elengedi a komplexált metilénkék (MB) molekulákat, így csökken az elektromos jel94. B) A célmolekula megakadályozza a kationos jelzőmolekulák (Ru3+) kötődését a negatívan töltött aptamerhez 99,100. C) Az egyfalú szén nanocső - térvezérelt tranzisztor (Single-Wall Carbon Nanotube – Field-Effect Transistor - SWCNT-FET) esetében a célmolekulát kötő aptamer megváltoztatja az eszköz vezetését101,102 A specifikusság és az érzékenység növelése érdekében gyakran alkalmaznak sandwich assay-t. Általában enzimek biokatalitikus tulajdonságát használják fel az aptamer és a célmolekula kölcsönhatásának erősítéséhez. Glükóz-dehidrogenáz103 vagy tormaperoxidáz (HRP) enzimet89 használtak trombin amperometriásc detektálásához (11. ábra, A). Egy másik megközelítésben az enzim helyett platina nanorészecskékkel módosították az aptamert.
104
A platina nanorészecskék katalizálták a H2O2
elektrokémiai redukcióját, ami erősítette a voltammetriás válaszjelet. Ezzel a módszerrel 1 nM-ra csökkentették a trombin kimutatási határát (11. ábra, B). Nanorészecske nemcsak katalizátorként alkalmazható. Az úgynevezett „bio-vonalkód” (bio barcode) assay-ben arany nanorészecskéket poli-adenin (poli-A) szekvenciákat is tartalmazó antitrombin
aptamerrel
módosítottak.105
Ezek
az
aptamerrel
módosított
arany
nanorészecskék hozzákötődtek az immobilizált anti-trombin antitestekkel kikötött trombin fehérjékhez. Az aptamer savas, vagy nukleázos degradációját követően az adenin
bázisok
anódos
árammal
oxdálhatók,
amelynek
mértéke
arányos
a
koncentrációval. Mivel a nanorészecskére nagyszámú aptamert immobilizáltak, rendkívül nagy erősítést értek el. Ezzel a technikával a trombin fehérje kimutatási határa pM-os volt. (11. ábra, C). A Debye-távolság az a távolság, ahol még számottevő töltésszeparáció alakulhat ki. A Debye-távolságnál messzebb már semleges töltésű a közeg. c Olyan voltammetriás méréstechnika, amikor állandó feszültség hatására végbemenő redoxireakció szolgáltatta áramerősséget mérjük. b
27
11. ábra Sandwich típusú elektrokémiai aptamer szenzorok jelerősítéssel. (A) Enzimmel89 vagy (B) platina nanorészecskével104 módosítva a másodlagos aptamert, redukálható az oldatban található H2O2, és lehetővé teszi a célmolekula érzékeny detektálását. C) Poli-A szakaszt tartalmazó aptamerrel módosított arany nanorészecskét alkalmaztak a detektáláshoz.105 A szabaddá váló adenin bázisok közvetlenül detektálhatók. Aptameren alapuló optikai szenzorok Aptamerek esetén alkalmazható a „molekuláris villogó” (molecular beacon, vagy aptabeacon) méréstechnika106-108, ami antitestek esetében nem lehetséges. Itt egy hajtű szerkezetet vesz fel az aptamer, aminek az egyik végét egy fluorofórral, a másik végét pedig egy kioltó molekulával módosították (12. ábra, A). A célmolekula bekötődésekor szétnyílik a hajtű szára, így távol kerül egymástól a fluorofór és a kioltó molekula, ami fluoreszcens jelet eredményez. Egy másik, szintén gyakran alkalmazott megoldás, amikor a fluorofórral módosított aptamer kettős csavar szerkezetet vesz fel egy komplementer DNS szállal, amit egy kioltó molekulával módosítottak(12. ábra, B). A célmolekula leszorítja a komplementer szálat az aptamerről, melynek hatására megnő a fluoreszcencia.
109-111
Aptamer kölcsönhatások mérésére fluoreszcencia rezonancia
energiaátadási (Fluorescence resonance energy transfer – FRET) assay-t is kidolgoztak, ami két fluoreszcens molekula, egy donor és egy akceptor közötti energiaátadáson alapul.109 Ezeknek a módszereknek az előnye, hogy az aptamerek viszonylag könnyen módosíthatók fluoreszcens festékekkel, számos fluorofór és kioltó (quencher) molekula áll rendelkezésre, valamint ez a technika lehetővé teszi a kölcsönhatások valós idejű detektálását. Egyre több figyelem irányul a nanorészecskéket alkalmazó egyszerű színváltozáson alapuló, kolorimetriás assay-kre (12. ábra, C). Ilyen például, amikor az aptamerek 28
hatására aggregálódott arany nanorészecskék a célmolekula jelenlétében szétválnak, és a kezdeti liláról pirosra változik az oldat színe.112,113
12. ábra Aptamer alapú molekuláris villogók. A) A hajtű alakzatot felvevő aptamer egyik vége egy fluorofórral (F), a másik pedig egy kioltó molekulával (Q) jelölt. A célmolekula bekötődésekor olyan térszerkezetet vesz fel az aptamer, hogy az addig térközelben található fluorofór és kioltó molekula egymástól távol kerül, így létrejön a fluoreszcencia. 106-108 B) A fluorofórral módosított aptamer kettős hélixet alkot a kioltó molekulával módosított komplementer DNS-sel. A célmolekula jelenlétében felhasad a kettős hélix és távol kerül a kioltó molekula, így erősödik a fluoreszcencia. 109-111 C) A célmolekula jelenlétében a DNS aptamerrel módosított lila arany nanorészecske aggregátumok szétválnak és pirossá válik a színük.112,113 Aptameren alapuló jelölés nélküli szenzorok A legjelentősebb jelölés nélküli szenzorok a felületi plazmon rezonanciás (SPR) szenzorok, a kvarckristály mikromérlegek (QCM) és a mikromechanikus konzol (cantilever) típusú érzékelők. SPR technikáról már korábban volt néhány szó. Alkalmazásával kiválaszthatók a megfelelő affinitású aptamerek a SELEX folyamat után, de alkalmazható aptamer alapú, valós idejű, jelölésmentes detektálásra is, mivel az SPR jel és a bekötődő molekula tömege között lineáris az összefüggés114. Sok esetben a jelölés nélküli eljárások nem tudnak vetekedni a jelöléses eljárások által biztosított érzékenységgel. De két kötőhelyes felismerés alkalmazásával azonban lehetőség van rendkívül érzékeny és specifikus sandwich assay-k kialakítására a jelölés nélküli módszerek esetében is. Az SPR szenzor felületére immobilizált aptamer receptorral mérték a vaszkuláris endotél növekedési faktor (VEGF) mennyiségét, és a jelet HRP enzim konjugált antitesttel erősítették, egyfajta sandwich assay-t kialakítva.115 A szenzorfelületre juttatott HRP szubsztrátból, az enzim hatására egy kék színű csapadék keletkezett a szenzor felületén. Ezzel a képalkotó felületi plazmon rezonanciás, csapadékos jelerősítést alkalmazó technikával a VEGF kimutatási határa 1 pM-ra csökkent.
29
A kvarckristály mikromérleg (QCM) egy érzékeny, piezoelektromos effektus alapján működő tömegmérő rendszer. A QCM szenzor egy mindkét oldalán arannyal bevont kvarckristály, ami váltóárammal magas frekvenciájú rezgésbe hozható. A kvarckristály rezonanciafrekvenciája a kristály tömegétől függ, sok esetben a Saurbrey-egyenlet szerint ([1] egyenlet). [1]
√ , ahol
a rezonancia frekvencia (Hz),
tömegváltozás (g), (2,648 g/cm3),
a frekvencia eltolódás (Hz),
a piezolektromosan aktív kristály felület (cm2),
a
a kvarc sűrűsége
a kvarc nyírási rugalmassági modulusa (g/cm.s2).
A szenzor felületét aptamerrel módosítva, a rezonanciafrekvencia változásával valós időben nyomonkövethető az aptamer-célmolekula komplex kialakulása a felületen. A szenzorfelületre
immobilizált
aptamerhez
kötődő
célmolekula
által
okozott
tömegnövekedés a kristály rezonanciafrekvenciájának csökkenését okozza. Ezzel a technikával vizsgálták HIV-1 Tar RNS kölcsönhatását Tat fehérjével, ami a HIV-1 RNS vírus fertőzésért felelős. A biotinnal módosított Tar RNS-t NeutrAvidinen keresztül immobilizálták a szenzorra. A HIV-1 Tat fehérje kimutatási határa 1 nM-nak bizonyult.116 A mikromechanikai konzolok (cantilever) esetén az aptamereket csak az egyik végén felfüggesztett mikrokonzol felületére immobilizálják. A célmolekula bekötődésekor, a tömegváltozás hatására a mikrokonzol elhajlik. Ez az elhajlás elektronikusan, vagy optikailag mérhető. Ilyen DNS aptamerrel módosított szenzorral mértek Taq DNS polimerázt117. Vibrációs üzemmódban hepatitis C virus (HCV) detektálására is alkalmaztak RNS aptamerrel módosított mikrokonzolt. A kimutatási határ 100 pg/mL HCV helikáz volt.118
30
13. ábra Aptameren alapuló jelölés nélküli szenzorok. A) Felületi plazmon rezonanciás (SPR) aptamer szenzor. B) Kvarckristály mikromérleg (QCM) aptamer szenzor. C) Mikrokonzol (cantilever) aptamer szenzor
5.2 Felületi lenyomatú polimerek A teljesen szintetikus felismerésen alapuló molekuláris felismerés egy másik ígéretes megközelítése a molekuláris lenyomatú polimerek (Molecularly Imprinted Polymers – MIP) alkalmazása. A MIP-ek olyan szintetikusan előállított, szelektív felismerést biztosító polimerek, amiket funkcionális monomerekből a templátként szolgáló célmolekula jelenlétében polimerizálnak.119,120 A polimerizáció során olyan kötőhelyek jönnek létre a polimer szerkezetében, melyek képesek a célmolekula szelektív felismerésére. Szintetikus mivoltuknak köszönhetően a MIP-ek számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek: kiváló kémiai- és hő stabilitással bírnak, valamint reprodukálható és költséghatékony az előállításuk.
14. ábra
Molekuláris lenyomatképzés sematikus ábrája
31
Tisztán kémiai úton előállítható receptorként ezen előnyös tulajdonságoknak köszönhetően kerültek az érdeklődés középpontjába. Számos területen megkísérelték alkalmazásukat, így az elválasztástechnika121-123, az érzékelés124-127, a katalízis128,129 és a célzott gyógyszerleadás130 területén. 5.2.1 Fehérje lenyomatú MIP-ek A kismolekulák felismerésére alkalmas molekuláris lenyomatú polimereket már rutinszerűen állítanak elő, azonban proteinek és biomakromolekulák (>1500 Da) lenyomatképzése még mindig kihívást jelent.4 Bár a természetes eredetű felismerő ágensekkel, például antitestekkel összehasonlítva a MIP-ek számos előnnyel rendelkeznek, a MIP-ek területén publikált közleményeknek csak kb. 2%-a használ fehérje templát molekulát.5 A protein-MIP közötti lehetséges kölcsönhatások száma és komplexitása rendkívül nagy. Ezek közül a nem kovalens jellegű kölcsönhatások előnyösek a templát molekula polimerből történő eltávolításakor, hiszen így nem sérül a kavitás három dimenziós szerkezete. Azonban a legtöbb nem kovalens kölcsönhatás viszonylag gyenge, ami kedvez a nem specifikus adszorpciónak.131 Affinitásukat tekintve a MIP-ek gyakran elmaradnak a természetes antitestektől, de nem ez a legfőbb akadálya elterjedésüknek. Biomakromolekulák esetén már a lenyomatképzés során is számos probléma felmerül. A proteinek szerkezete jelentősen megváltozhat a környezeti tényezők, a pH, a sókoncentráció és a hőmérséklet hatására, ami befolyásolja a lenyomatképzés minőségét. BSA, lizozim és szarvasmarha hemoglobin fehérje templátokat használva lenyomatképzésre
a
leggyakrabban
alkalmazott
monomerekkel
(akrilamid,
metakrilamid, akrilsav, aminofenil-bórsav, N-izopropilakrilamid) és keresztkötőkkel (N,N′ metilén-biszakrilamid és glikol-dimetakrilát) azt találták, hogy ezek a reagensek már az irodalomban alkalmazottnál sokkal kisebb koncentrációk esetén is jelentős változást okoztak mindhárom fehérje szerkezetében.132,133 Kismolekuláknál főként aprotikus oldószereket használnak a lenyomatképzésre, hogy elkerüljék a víz kompetícióját a hidrogénhidak kialakulásánál. A proteinek azonban gyakran oldhatatlanok és/vagy instabilak aprotikus szerves oldószerekben. A vizes, fiziológiás közegben történő lenyomatképzés azonban nem magától értetődő.
32
Különösen tömbpolimerizációnál problémát jelent a biomakromolekulák eltávolítása a protein lenyomatképzést követően. Ehhez gyakran valamilyen felületaktív anyagot használnak, ami később artifaktumokat okozhat a visszakötődés során. Biomakromolekulák esetén a legnagyobb problémát a csökkent mobilitás jelenti a nagymértékben keresztkötött polimerhálózaton belül, így az ismételt bekötődés hatásfoka nagyon alacsony lesz. Többféle eljárással próbálták megoldani ezt a problémát. Például a proteinek méretével összemérhető vastagságú filmeket, makropórusos MIP anyagokat134,135, valamint kisebb mértékben keresztkötött polimereket136 állítottak elő, ami lehetővé tette a fehérjék hozzáférését a kötőhelyekhez. Bár mindegyik megközelítésre találhatók sikeres példák, inkább a vékony MIP filmek használata került előtérbe, főként szenzorként történő alkalmazások esetén, mivel a kevésbé keresztkötött polimerek felismerő képessége idővel csökkenhet a polimer flexibilitása miatt.137 5.2.2 MIP-ek előállítása A kismolekulák esetében a MIP-ek előállításának leggyakrabban és sikeresen alkalmazott módja a tömbpolimerizáció, ahol a polimerizációs elegyet egy edényben, tömbként polimerizálják. Az így kapott tömböt porítva, szitálva jutnak a megfelelő mérettartományba eső, molekuláris lenyomatot tartalmazó szemcsékhez, melyek például az elválasztástechnikában alkalmazhatók.138 Ezzel a módszerrel csak korlátozottan lehet biomakromolekulák felismerésére alkalmas molekuláris lenyomatú polimert, majd abból szenzort előállítani. A tömbpolimerizáció során alkalmazott őrlés szabálytalan alakú és polidiszperz részecskéket eredményez, ráadásul károsítja a kötőhelyeket139. Ezért számos munkában közvetlenül mikro-140 és nanorészecskék felületén141 kísérelték meg a polimerizációt.136,142-144 A legelegánsabb módszer azonban a felületi lenyomatok képzése (Surface Imprinting – SI), amit nyomtatással vagy áldozati anyag alkalmazásával lehet elérni. Ilyenkor egy olyan polimer struktúrát hoznak létre, amely kizárólag a felületen tartalmaz kötőhelyeket145, azaz felületi lenyomatokat. Így ezek a kötőhelyek könnyebben hozzáférhetők és a célmolekula anyagtranszportja, valamint bekötődési kinetikája gyorsabb lesz. Az SI módszerek esetében a fehérje templát molekulákat egy szilárd hordozóra immobilizálják, amit hordozó anyagként alkalmaznak146-148 később „áldozati 33
anyagként” eltávolítanak149. A proteinek oldatban történő termodinamikus mozgása befolyásolja a lenyomatképzés minőségét150, ezért célszerű a templát molekulákat immobilizálni. Számos próbálkozás található az irodalomban kizárólag a polimer felszínének a mintázására, többek között mikrokontakt nyomtatással151,152, illetve mikro- és nanopórusos membránok153 pórusaiba immobilizált fehérjékkel történő lenyomatképzéssel.
15. ábra Molekuláris lenyomatképzés mikrokontakt nyomtatással151,152. A) A protein és a funkcionális monomer abszorpciója az üveglemezre, majd az üveglemez illesztése a keresztkötővel és iniciátorral borított felületre. B) Besugárzás UV fénnyel, polimerizáció. C) Az üveglemez eltávolítása. D) A templát fehérje eltávolítása mosással. E) A templát fehérje visszakötődése. 5.2.3 MIP-ek alkalmazása érzékelésre Az antitestek MIP-pel történő helyettesítése rengeteg lehetőséget rejt az érzékelés területén a nagyobb stabilitásnak, az egyszerű és olcsó előállításnak köszönhetően. A MIP alapú szenzorok esetében azonban kulcsfontosságú a felismerést biztosító molekuláris lenyomatot tartalmazó polimer és a jelátalakító közötti kapcsolat kialakítása.
16. ábra
MIP alapú szenzor sematikus ábrája
Ennek érdekében vagy egy már korábban előállított MIP-et visznek fel a szenzorra154-157, vagy a MIP-et in-situ polimerizálják a szenzor felületére154,158. Fotopolimerizációval jól 34
kontrollálható a filmvastagság és a belső morfológia. Standard mikrofabrikációs technikákkal, például spin-coatinggal felvihetők a szenzorfelületre a polimerizációhoz szükséges reagensek, amiből polimerizáció után pórusos molekuláris lenyomatú vékonyfilm lesz158,159. Másik példa nanostruktúrált film kialakítására a fotopolimerizált MIP nanomintázása (nanomolding) pórusos alumínium szubsztráton. Ezzel a technikával 50-200 nm átmérőjű és 0.5-5 µm magas párhuzamos nanoszálak hozhatók létre.160 Vezető polimerek alkalmazásával nagy érzékenységű, valós idejű detektálást lehetővé tevő MIP szenzorokat alakítottak ki kismolekulák, pl. atrazin kimutatására. 161 Poli-ofeniléndiamin filmet használtak glükóz detektálására162, poli-pirrol alapú MIP-et glutaminsav
kimutatására163,164.
Amperometriás
morfin
szenzort
poli-3,4-
etiléndioxitiofén (PEDOT) vezető polimer alapú MIP felhasználásával fejlesztettek.165 Többféle módszert publikáltak elektropolimerizált molekuláris lenyomatú rétegekkel megkötött analátok detektálására. A felismerő réteg elektromos vezetőképessége lehetővé teszi a redox aktív analátok elektrokémiai detektálását. Ezt alkalmazva detektáltak paracetamolt poli-pirrol filmen.166 Konduktometriás167, QCM168 és SPR alkalmazásokra169 is találni példát az irodalomban. A MIP-célmolekula kölcsönhatást SPR technikával vizsgáló első közleménytől kezdve nagy hangsúlyt fektettek arra, hogy ennek a filmrétegnek a vastagságát 50 nm alatt tartsák.170 Különböző stratégiákat alkalmaztak a vékony MIP filmrétegek kialakításához, például fotoiniciátorokat171, atomtranszfer gyökös polimerizációt172 és újabban kontrollált elektrokémiai leválasztást173, amivel 5 nm vastagságú filmet hoztak létre. Érdekes módon kevés közlemény található az irodalomban fehérjék MIP filmekkel, SPR technikával történő detektálásával kapcsolatban174, annak ellenére, hogy az SPR technika
sokkal
érzékenyebb
makromolekulák
detektálásánál175,
mint
kis
molekulatömegű vegyületeknél, amelyek általában további erősítési lépéseket tesznek szükségessé kis koncentrációk mérése érdekében176,177.
5.3 Képalkotó felületi plazmon rezonancia Korábban, az aptamerek kötődési tulajdonságainak jellemzésére alkalmas technikák között már említettem a felületi plazmon rezonanciás méréstechnikát (Surface Plasmon Resonance – SPR). A felületi plazmon rezonanciát 1902-ben figyelték meg először178, de 35
csak 1968-ban értették meg mélyebben magát a fizikai jelenséget179,180. Érzékelésre az 1980-as
években
alkalmazták
először181,182,
később
pedig
a
biomolekuláris
kölcsönhatások jelölésmentes és valós idejű detektálását lehetővé tevő módszerként terjedt el183-185. Amikor a fényforrásból származó, a beesési síkkal párhuzamosan (p) polarizált fény áthalad egy prizmán, a prizma/levegő határfelületén - a nagyobb optikai sűrűségű közegből a kisebb optikai sűrűségű közegbe lépve - a fény elhajlik a határfelület síkja felé. A fény beesési szögét változtatva elérjük azt a kritikus beesési szöget, ahol az összes beeső fény visszaverődik a prizmában. Ezt nevezzük teljes belső visszaverődésnek (17. ábra, A).
A 17. ábra
B Teljes belső visszaverődés (A) és az evaneszcens tér (B)
Ekkor ugyan a fény nem halad át a prizmán, de a fotonok elektromos tere bejut a visszaverő felület mögé is. Ezt, a fény hullámhosszának körülbelül a felével megegyező távolságra behatoló elektromos teret, evaneszcens térnek nevezzük, mivel amplitúdója exponenciálisan csökken a felülettől távolodva (17. ábra, B). 182 Az SPR mérőrendszereknél a prizma visszaverő felületére egy vékony nemesfém réteget visznek fel, vagy egy, a prizmáéval megegyező törésmutatójú olajat közbeiktatva, nemesfém réteggel bevont üveglemezt helyeznek rá. A legtöbbször aranyat használnak erre a célra, mivel az arany könnyen kezelhető beesési szög és hullámhossz kombinációk esetén is megfelelő SPR jelet ad, valamint kémiailag megfelelően inert. Amikor a foton elektromos terének energiája éppen megfelelő, kölcsönhatásba lép az arany felület szabad elektronjaival. A beeső fotonok ekkor elnyelődnek és az energiájuk átadódik az elektronoknak, amik ekkor átalakulnak felületi plazmonokká. A kvantumelméletben a fotonok és az elektronok hullám- és részecsketermészettel is rendelkeznek. A 36
kvantumelméletben a plazmon az elektronsűrűség hullám részecsketermészete. Teljes visszaverődés esetén, amikor a foton kvantum energiája megfelelő, a fotonok plazmonokká alakulnak és a visszavert fény intenzitása lecsökken.
18. ábra A plazmon rezonancia egyszerűsített ábrája. A beeső fény momentuma a felületre merőleges és a felülettel párhuzamos komponensekre bontható fel. Amikor a felülettel párhuzamos komponens nagysága megegyezik az arany film felületi plazmonjainak momentumával, gerjeszti azokat. A foton – plazmon átalakulás során természetesen a momentum- és energia megmaradásnak teljesülnie kell. A plazmonok karakterisztikus momentuma a vezető film és az azt közrefogó két közeg tulajdonságaitól függ. Akkor következik be a rezonancia, amikor a beeső fény momentuma megegyezik a plazmonok momentumával (18. ábra). A fotonok és a plazmonok momentuma egy vektor függvénnyel, tehát egy nagysággal és egy iránnyal írható le. A felületre egy adott szögben beeső fénysugár esetén a momentum vektor matematikailag felbontható egy felülettel párhuzamos és egy felületre merőleges komponensre. A beeső fény beesési szögének, vagy hullámhosszának megváltozásakor a komponensek relatív nagysága megváltozik, azonban mivel a plazmonok kizárólag az arany felületén fordulnak elő, így az SPR szempontjából csak a felülettel párhuzamos komponens számít. Tehát egy adott beesési szögnél akkor jön létre plazmon rezonancia, ha a foton felülettel párhuzamos vektor komponense megegyezik a plazmon momentummal.
37
Az evaneszcens tér az arany réteg mindkét oldalán létrejön, ami a felülettől távolodva körülbelül 300 nm-ig alkalmas mérésre. Az evaneszcens hullám hullámhossza megegyezik a gerjesztő fény hullámhosszával, energiája pedig hőként disszipálodik. Ha a közeg összetétele, így törésmutatója megváltozik, a plazmonok sebessége (és ezért momentuma is) megváltozik. A momentum megváltozása miatt megváltozik a fénysugár beesési szöge is, amivel gerjeszteni lehet a plazmonokat. Ez a szögváltozás rendkívül precízen mérhető. Ezt a jelenséget használják ki a leggyakrabban alkalmazott SPR mérési elrendezések esetén. A rezonancia szög a fémréteg tulajdonságaitól, a beeső fény hullámhosszától és a fémréteg két oldalán elhelyezkedő közeg törésmutatójától függ. A gerjesztő szenzoron a fémréteg vastagságát, a fény hullámhosszát és a hőmérsékletet állandó értéken tartva az SPR jel kizárólag a szenzorral érintkező közeg törésmutatójától függ. Egy másik megközelítés, amikor a beesési szöget állandó értéken tartva a beeső fény hullámhosszát változtatják úgy, hogy bekövetkezzen a rezonancia. A molekulák bekötődésekor a szenzor felületen megváltozik a törésmutató, ami miatt megváltozik a rezonancia szög, vagy a rezonancia hullámhossz (19. ábra). Fehérjék esetén a törésmutató változás lineáris a szenzor felülethez kötődő molekulák tömegével.186 122 m° rezonanciaszög eltolódás 1 ng/mm2 tömegváltozásnak felel meg 25°C-on. Bizonyos esetekben, például nukleinsavak, szénhidrátok és lipidek esetében előfordulhatnak eltérések, ami miatt szükségessé válhat a rendszer kalibrálása. Ezen kívül a határfelületen végbemenő egyéb változások, pl. elektrosztatikus vonzás, vagy konformációs változások szintén okozhatnak rezonancia szög eltolódást.187-190
19. ábra Biomolekuláris kölcsönhatások detektálása SPR-rel. A) szenzor felület a kölcsönhatás előtt, B) szenzorfelület a kölcsönhatás után, C) a visszavert fény intenzitás minimumának eltolódása a kölcsönhatás során A felületi plazmon rezonanciás kölcsönhatás vizsgálathoz az egyik molekulát (pl. receptor molekulát) a szenzor felületére immobilizálják, a másik molekulát pedig 38
oldatban juttatják a szenzor felületére. Oligonukleotidok esetében kézenfekvő a tiol – arany kölcsönhatás alkalmazása a receptor immobilizációjára. A
szenzorhoz
kötődő
biomolekulák,
illetve
a
szenzor
felületén
végbemenő
biomolekuláris (például antitest-antigén) kölcsönhatások megváltoztatják a szenzorral érintkező közeg törésmutatóját, ezért eltolódik az SPR szög, illetve a hullámhossz. Ez az eltolódás arányos a felülethez kötődő molekulák tömegével188, illetve oldatban lévő koncentrációjával. A szögeltolódás időfüggéséből következtetni lehet a kölcsönhatás asszociációs (illetve disszociációs) kinetikájára.
20. ábra
Egy tipikus SPR mérés során az SPR szög változása az idő függvényében
A legtöbb kereskedelmi SPR gyártó felismerte a sokcsatornás, nagy áteresztőképességű SPR rendszerek előnyét a kezdeti egycsatornás rendszerekkel szemben. A teljesség igénye nélkül említek néhány fontosabb, kereskedelmi forgalomban kapható készüléket. A Biacore készülékei egy négy csatornás mikrofluidikai rendszerre épülnek. Automatizált, nagy áteresztő képességű rendszerük, a Biacore 4000, 60 óra felügyelet nélküli működést tesz lehetővé, mely során 24 óránként akár 16 célmolekula vagy 4800 kölcsönhatás elemzését tudja elvégezni. A Genoptics (Horiba Scientific, Franciaország), az IBIS Technologies (Hollandia), a K-Mac (Korea Materials and Analysis Corp., Korea), a GWC Technologies (USA) és a Toyobo (Japán) képalkotó SPR rendszereket fejlesztett, melyek esetén szabadon kijelölhetők a 39
szenzor felületén a vizsgálandó területek. A szenzor felületének helyszelektív módosítását követően így rendkívül nagyszámú kölcsönhatás követhető nyomon egy időben. A Biorad ProteOn rendszere egy speciális 6×6-os mikrofluidikai csatorna rendszert használ, mellyel 6 ligandum és 6 analát kölcsönhatása, tehát 36 kölcsönhatás vizsgálható egyszerre, egy szenzoron. 5.3.1 SPR mérések kiértékelése Az SPR mérések során kapott rezonancia szög eltolódás - idő válaszgörbék nem csak egy „igen – nem” jellegű választ adnak egy kölcsönhatásra vonatkozóan, hanem következtetni lehet belőlük a koncentrációra, specificitásra és affinitásra is. Egy SPR kinetikai görbe (szenzorgram) több szakaszból áll: az alapvonalból; a reagens mérőcellába juttatását követő bekötődési, asszociációs szakaszból; a friss pufferrel történő mosás közben felvett disszociációs szakaszból; és a regenerálási szakaszból, amit követően visszakapjuk a kezdeti alapvonalat (21. ábra).
21. ábra
Az SPR szenzorgram sematikus megjelenítése és a jel - koncentráció összefüggés interpretálása
Az SPR szög változása az alapvonalhoz képest a szenzorfelületre kötődő molekulák mennyiségét jelenti. A megfelelő válaszjel eléréséhez szükséges idő mind az aptamer, mind a fehérje koncentrációjától függ, továbbá azt is jelzi, hogy milyen gyors egy kölcsönhatás.
Különböző
hőmérsékleteken
végezve
a
méréseket
értékes
termodinamikai információk is nyerhetők.191,192 Az asszociációs szakasz alakja a ka asszociációs sebességi állandótól [s-1] és az oldatban lévő fehérje koncentrációjától függ, míg a disszociációs szakasz kizárólag a molekulák kölcsönhatásának erősségét jelző kd
40
disszociációs
sebességi
állandótól
[M-1s-1].
Az
asszociációs
és
disszociációs
tulajdonságokat is tartalmazzák a Ka és Kd egyensúlyi állandók: [2] [3] A szenzor felületére immobilizált aptamer (A) és a protein (P) közötti kölcsönhatás általában 1:1 kölcsönhatási modellel írható le. Az asszociációs szakaszban az aptamerprotein komplex (PA) koncentrációja folyamatosan nő a szenzor felületén az idő függvényében. A sebességi egyenlet írja le a koncentrációk közötti összefüggést: [ ] [
]
[ ]→⃖ [ [ ] [ ]
[4]
] [
]
[5]
Ezt az aptamer – fehérje kölcsönhatást befolyásolhatja még a szenzor felületén fellépő anyagtranszport. Az 1:1-es kölcsönhatást a Langmuir izoterma193 írja le: [6] , ahol
a kölcsönhatásban résztvevő és a maximális kötőhelyek aránya,
disszociációs egyensúlyi állandó és
a
az analát koncentrációja.
Amennyiben az adatok az 1:1 modellel illeszthetők, egyszerű biomolekuláris kölcsönhatás történik, amiben egyetlen kötődés szükséges a komplex kialakulásához. Azonban konformáció változások, anyagtranszport limitáció és felületi heterogenitás miatt gyakran nem illeszkedik megfelelően ez a modell. Ebben az esetben a Hill egyenlet alkalmazható az adatok illesztésére, ami figyelembe veszi ezeket a hatásokat: [ ] [ ] , ahol
[7]
a kölcsönhatásban résztvevő és a maximális kötőhelyek aránya,
disszociációs egyensúlyi állandó,
az analát koncentrációja és
a
a Hill-együttható.
41
5.4 Nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcencia assay Az ALPHAScreen® néven elterjedt méréstechnika biológiai kölcsönhatások mérésére alkalmas, rendkívül érzékeny, homogén módszer, amit Ullmann írt le először 1994ben194,195. Az ALPHAScreen® elnevezés a nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens módszer angol megfelelőjének (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) rövidítéséből származik. Ez az assay egy 250 nm átmérőjű, reagenssel bevont polisztirol donor- és akceptor mikrogyöngy párból áll, melyek a felületükre
immobilizált
biomolekulák
kölcsönhatása
következtében
kerülnek
egymáshoz közel. Nagy intenzitású, 680 nm hullámhosszúságú lézerfény hatására a donor gyöngy felületén található fényérzékenyítő ftalocianin származék (22. ábra) hatására a környezeti oxigén molekulákból gerjesztett állapotú, szingulett oxigén molekulák jönnek létre.
22. ábra
Ftalocianin származék
Ezek a szingulett oxigén molekulák (O2(a1Δg)) körülbelül 3-6 s-os élettartamuk során akár 200 nm-t is megtehetnek diffúzióval az oldatban.196 Ha ezalatt az idő alatt találkoznak egy akceptor gyönggyel, reagálnak az abban található oxatiin származékkal, miközben 370 nm-es kemilumineszcencia jön létre (23. ábra), ami aktiválja az akceptor gyöngyben található többi fluorofórt (antracén származékok).
42
23. ábra Kemilumineszcenciás kaszkád reakció. Az akceptor gyöngyben található 1,4oxatiin származék reagál a szingulett állapotú oxigén molekulával és 370 nm-es kemilumineszcenciát okoz (A), ami tovább aktiválja az ugyanabban a gyöngyben található antracén származék fluorofórt (B). A fluorofór 520-620 nm hullámhosszúságú fényt bocsát ki A fluorofórok, a gerjesztő fénynél rövidebb hullámhosszú, 520-620 nm közötti fényt emittálnak. A donor gyöngy körülbelül 60 000 szingulett oxigént hoz létre, ami jelentős mértékben erősíti a jelet. Amennyiben nincs térközelben található akceptor gyöngy, a szingulett állapotú oxigén molekulák visszatérnek alapállapotba és nem keletkezik jel.197 A jel rendkívül hosszú élettartamú (a felezési idő másodperces tartományban van), ez lehetővé teszi az időfelbontásos detektálást. Tipikusan 20-100 ms-ot várva a besugárzás és a detektálás között, a rövid élettartamú háttér fluoreszcencia hatása teljesen kizárható. A gerjesztő fény hullámhossza nagyobb (680 nm), mint a detektálási hullámhossz (520620 nm), ami tovább csökkenti az esetlegesen fellépő fluoreszcencia interferenciát. A módszer az alacsony háttérfluoreszcenciának köszönhetően rendkívül érzékeny.194 Az oxigén molekulák szingulett állapotuk élettartama alatt akár 200 nm-t is megtehetnek diffúzióval. Ez sokkal nagyobb távolságot tesz lehetővé a kölcsönható biomolekulák számára, mint például a TR-FRET technika, ahol 9 nm-es távolságnál már csak 50%-os hatékonysággal történik meg az energiaátadás. 198
43
24. ábra Az ALPHA assay működési elve. :streptavidinnel módosított felületű donor gyöngy (d), Ni2+ kelát akceptor gyöngy (e), biotinnal konjugált anittest (a), 6×His jelöléssel ellátott antitest (b), antigén (c) Az ALPHA méréstechnikát (24. ábra) eredetileg antitest-antigén kölcsönhatások mérésére fejlesztették ki194,195, azonban ma már az immunoassay-ken, DNS assay-ken túl gyors hatóanyagvizsgálatra (screening) is alkalmazzák199,200 a gyógyszerkutatásban. Tudomásom
szerint
ALPHAscreen
technikával
kimondottan
aptamer-fehérje
kölcsönhatás erősségének mérésre nincs példa az irodalomban, holott rendkívül megkönnyítené a SELEX eljárás után a megfelelő aptamer szekvenciák kiválasztását.
5.5 Alma törzsgöndörödés vírus (Apple Stem Pitting Virus – ASPV) Az 1954-ben felfedezett ASPV vírus a Foveavirus nemzetségbe, a Flexiviridae családba tartozik.201 A vírus jelentős gazdasági károkat okoz elsősorban alma és körte ültetvényeken, ahol feltételezhetően átoltás útján terjed.202 A fertőzött növények szára és törzse gödrösödik, leveleik felpöndörödnek. A vírus egyik törzse a körte érsárgulás (Pear Vein Yellows Virus – PVYV) vírus, ami a levelek ereinek sárgulását és vörös foltosodását okozza.203 A vírus tanulmányozásához Nicotiana occidentalis-ba oltották, felszaporították és gradiens centrifugálással tisztították a vírusokat. A vírus formája helikális, hosszúkás, hajlékony pálca, hossza 800 nm, szélessége 15-20 nm és hosszanti irányban hajlamos az aggregációra.202 A virionok pozitív egyszálú RNS-t tartalmaznak, amit 48 kDa molekulatömegű kapszidfehérjék vesznek körül. Az ASPV törzsek
44
burokfehérjéinek homológiája 64,8%-89,6% közötti, míg az aminosavszám 396-415 között változik.204 Az ASPV kimutatását sokáig kizárólag indikátor növényekre történő átoltással végezték. Ez azonban költséges és időigényes módszer, ezért RT-PCR205-207 és fluoreszcens hibridizációs assay-t208 is kidolgoztak. Ma már kapható kereskedelmi forgalomban ASPV specifikus monoklonális antitest.209 Ezt ELISA módszerben alkalmazva általában kimutathatók az ASPV vírus fertőzött növényi kivonatokból, de gyakran félrevezető eredményeket ad210. A kontraszelekciós lépéseket is tartalmazó SELEX eljárással szelektált MT32 és PSA-H aptamerek alkalmazásával olyan SPR szenzor és mérési eljárás fejlesztése volt a célom, melyekkel az MT32 és PSA-H ASPV kapszidfehérjék akár szelektíven is kimutathatók.
45
6 Kísérleti rész 6.1 Szintetikus receptorokkal módosított érzékelők előállítása Ez a fejezet a szintetikus receptorként alkalmazott aptamerek és felületi lenyomatú polimerek előállítását, a szenzor chipek ezekkel történő módosítását, jellemzésüket és analitikai felhasználásukat tartalmazza. 6.1.1 Aptamer szelekció Az analitikai, diagnosztikai célra receptorként alkalmazható aptamer előállításának első lépése a megfelelő mennyiségű és tisztaságú célmolekula, célfehérje előállítása, aminek birtokában már elvégezhető a hozzá nagy affinitással kötődő DNS szekvenciák kiválasztása. A célfehérjék előállítása, valamint az aptamerek szelekciója Dr. Mészáros Tamás vezetésével a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszékén, illetve a Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézetében történt. Célfehérjék előállítása Az alma törzsgöndörödés vírus (ASPV – Apple Stem Pitting Virus) MT32 és PSAH kapszidproteinjeinek előállítása klónozással, protein expresszióval és tisztítással történt az alábbiak szerint. A pDEST17::MT32 és pDEST17::PSA-H vektorokkal (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) transzformált BL21(DE3)pLysS bakteriális sejteket (Novagen, EMD Biosciences, Gibbstown, NJ, USA) 100 mg/mL ampicillint és 35 mg/mL klóramfenikolt tartalmazó Luria Broth (LB) táptalajba (500 mL) oltottuk, és 37 °C-on addig növesztettük, míg szuszpenziók 600 nm hullámhosszon mért abszorbanciája elérte a 0,5 értéket. Ezután 0,4 mM-os izopropil--D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) indukáltuk 5 órán keresztül, majd a szuszpenziót lecentrifugáltuk (5 000 rpm, 20 min). A baktérium sejteket felszuszpendáltuk 5 mL PBS-ben (500 mM NaCl, 10 mM imidazol, 0,1% Triton-X 100, Sigma proteáz inhibitor koktél), majd ultrahanggal feltártuk. A feltárt szuszpenziót újra centrifugáltuk (13 000 rpm, 30 min), és a felülúszóból hisztidin (His) kötő nikkel ionkromatográfiás gyantával (250 mL, Novagen) tisztítottuk 30 percen keresztül, 4 °C-on a 46
6×His jelölt rekombináns burokfehérjéket. A nem-specifikus fehérjék eltávolításához a gyantát ötször mostuk 100 mM imidazolt tartalmazó LB-vel és a gyantát 4°C-on PBS-ben tároltuk. Az ágyról 500 mM imidazolt tartalmazó PBS pufferrel mostuk le (5 min) az MT32, illetve PSA-H proteineket. A tisztítás lépéseit SDS-PAGE módszerrel ellenőriztük a molekulaméret alapján. 1. táblázat
A célfehérjék főbb jellemző tulajdonsága (http://www.uniprot.org)
MT32
Azonosítószám
pI
Molekulatömeg (kDa)
AF438522.1
6,71
42,6
6,95
43,7
6,51
43,7
6,75
44,5
MT32-6×His PSAH
Q84399
PSAH-6×His
MT32 és PSA-H aptamer szelekció A vírus kapszidprotein aptamerek szelekciójához a SELEX36 eljárást alkalmaztuk kisebb módosításokkal. A szelekció során 15 SELEX ciklust végeztünk. Az aptamer szelekcióhoz az oligonukleotid könyvtárat a Metabion-tól (Németország) rendeltük, 1 mol kiindulási mennyiséggel, HPLC tisztítással. A 1014-féle DNS szekvenciából álló könyvtárban található szekvenciák két 18 nukleotid hosszúságú primer kötő részt (flank) és egy 40 bázisból álló, véletlenszerű sorrendű oligonukleotid szakaszt tartalmaztak: 5’ AGC CTC GTC TGT TCT CCC - 40N - GGG AAG ACA AGC AGA CGT 3’. 1 nmol SELEX DNS könyvtárat denaturáltunk 95 °C-on 2 percig, majd rögtön lehűtöttük jeges vízben. Ezután a könyvtárhoz hozzáadtunk dIdC-t (dezoxiinozinból és dezoxicitidinből álló, véletlenszerű sorrendű DNS szál, 0,1 g/mL), bovin szérum albumint (BSA), valamint 30 L (kb. 300 pM) ágyhoz kötött PSA-H, vagy MT32 proteint tartalmazó PBS-T puffert (9,9 mL). 30 percen keresztül, szobahőmérsékleten történő inkubálást, majd a nem-specifikusan kötődött egyszálú DNS-ek eltávolítása érdekében, 47
PBS-T-vel végzett alapos mosást követően a protein-oligonukleotid komplexet (kb. 300 pmol) 500 mM imidazolt tartalmazó 20 mM pH 8,0 Tris pufferrel (20 L) eluáltuk és a PCR elegybe vittük. A PCR elegy (100 L) tartalma: 10 L 10× reakció puffer, 1,5 U Taq polimeráz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 M SELF és biotinilált SELR primer, 0,8 mM dNTPs és 1,5 mM MgCl2. A PCR erősítés lépései: 2 percig 95 °C; majd 18 cikluson keresztül 30 másodpercig 95 °C; 30 másodpercig 56 °C; 30 másodpercig 68 °C, végül 2 percig 68 °C. A keletkezett PCR terméket agaróz gélelektroforézissel ellenőriztük. 23 L 5 M NaCl-ot adtunk a PCR elegyhez (90 L). Ezt az oldatot kétfelé osztottuk, majd ReactiBind streptavidinnel módosított, nagy kötőképességű mikrotiter tálca (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) 1-1 cellájában inkubáltuk és alaposan mostuk PBS-T pufferrel. A biotint nem tartalmazó DNS szálakat ezután 100 mM-os (30 L/cella) oldattal eluáltuk, és az oldat pH-ját azonnal visszaállítottuk 1,5 L 1 M NaH2PO4-ot tartalmazó 1 mL PBS-T pufferrel. Végül az oldatot 95 °C-ra melegítettük (5 perc), majd azonnal jeges vízbe helyeztük és 4 °C-on tartottuk a következő SELEX ciklusig. A következő szelekciós körben a protein mennyiségét csökkentettük 150 pmol-ra (2.-9. kör), majd ezután 100 pmol-ra (11.-14. kör). A szelekció többi körülménye változatlan maradt a teljes SELEX eljárás során. Az aptamerek specifikusságának növeléséhez a 3., 6., 9. és 12. szelekciós körben kontraszelekciós lépést iktattunk be. Ágyhoz kötött PSA-H ill. MT32 fehérjét (15 L) adtunk a PBS-T-ben oldott MT32 ill. PSA-H ssDNS-hez (1 mL), majd 30 percig rázattuk és a felülúszóval mentünk tovább a következő körben. A SELEX utolsó PCR-ét SELF és nem biotinilált
SELR
primerekkel
végeztük.
Az
oligonukleotidok
szekvenciájának
meghatározásához a PCR terméket pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, USA) vektorba inszertáltuk és DHT5 kompetens Escherichia coli sejtekbe (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) transzformáltuk. A felnőtt telepekből 20-20 darabot kolónia PCR-rel ellenőriztünk és a pozitív kolóniák nukleinsav szekvenciáját meghatároztuk. Az analitikai mérésekhez az aptamereket a Sigma-Aldrich-tól (St. Louis, MO, USA) rendeltük 0,2 mol kiindulási mennyiséggel és HPLC tisztítással az adott analitikai alkalmazásnak megfelelő módosítással (tiol, biotin) vagy módosítás nélkül (2. táblázat).
48
2. táblázat
Alkalmazott DNS szekvenciák
DNS neve
Szekvencia
MT32 aptamer
5’-ggg gtg gtg ggt tct ttt tgt ggt att ggt gtg ggg ggc a-tttt-C6-SH-3’
PSA-H aptamer
5’-agc aag gtt tgg tgt tgg ttg gtt gct ggt ttt ggt ttg gc-tttt-C6-SH-3’
PSA-H Flank
5’-agc ctc gtc tgt tct ccc agc aag gtt tgg tgt tgg ttg gtt gct ggt ttt
aptamer
ggt ttg gcg gga aga caa gca gac gt-tttt-C6-SH-3’
Random 45
Random 81
5’-HS-C6-ttt tta aag aga cat ctc ttc tcc gag ccg gtc gaa ata gtg agt3’ 5’-HS-C6-ttg acc aag cgc tgg ata acg aca tta ctt cta ttt tta ttt ggg ggt tga cga aca agc ttt att ttt atc ttc att-3’
6.1.2 Felületi lenyomatú polimerek előállítása A felületi lenyomatú PEDOT/PSS mikromintázatokat planáris, módosítatlan arany SPR szenzor chipeken (Xantec Bioanalytics GmbH, Düsseldorf, Németország, illetve IBIS Technologies b.v., Enschede, Hollandia) hoztuk létre. Az SPR szenzor chipeken a fotolakk mintázat fotolitográfiával történő kialakítása a Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie GmbH, Institut für SiPhotovoltaik intézetében (Kekuléstrasse 5, 12489 Berlin, Németország) történt. Az arany bevonatú üveg hordozót 90°C-ra melegítettük, majd bisz(trimetilszilil)-amint (HMDS, MicroChemicals GmbH) tartalmazó edénybe helyeztük 3 percig. A HMDS az ezután következő, AZ 1518 (MicroChemicals GmbH) fotolakk réteg adhézióját biztosítja. A fotolakkot „spin-coating” eljárással, a szenzorchipet 4000 min-1-es fordulatszámmal forgatva, vittük fel a szenzorra, hogy az megfelelően szétterüljön és vékony réteget hozzon létre a felületen (25. ábra, A). Majd 90°C-on temperáltuk 30 percig és egy 5 mes sávos maszkon keresztül 9 másodpercig UV fénnyel világítottuk meg egy MA45 (SUSS MicroTec, Garching, Germany) maszkillesztő és egy HBO 350 W-os fényforrás (350450 nm, 18 mW cm-1, 365 nm-en kalibrálva) segítségével (25. ábra, B). Végül a mintázatot 10 másodpercig alkalmazott 0,6%-os NaOH oldattal hívtuk elő (25. ábra, C).
49
25. ábra Felületi lenyomatú polimer előállításának lépései. A fotolakkal bevont szenzoron (A) fotolitográfia alkalmazásával (B) mikrobarázdákat hozunk létre (C), majd a mikrobarázdák közötti teret polikarbonáttal (PC) töltjük fel (D), amihez a fotolakk mintázat eltávolítása után (E) adszorbeáltatjuk a célfehérjét (F) a lenyomatképzéshez. A PC mikrobarázdák közé PEDOT/PSS vezető polimert elektropolimerizálunk (G), ami a PC és a célfehérje eltávolítása után tartalmazza a célfehérje komplementer lenyomatát (H). Mivel a fotolakkon rendkívül alacsony a fehérje adszorpció mértéke, kénytelenek voltunk közbeiktatni plusz egy lépést, amiben nagyobb fehérje adszorpciót mutató polikarbonátból (PC) alakítottuk ki a mikrobarázdákat. A PC mikrobarázdák kialakításához 6 mg/mL koncentrációjú polikarbonát (PC) oldatot készítettünk. Ehhez 8 m átmérőjű pórusokat tartalmazó és 105 pórus/cm2 pórussűrűségű PVP nedvesítést elősegítő
bevonat
nélküli
Nucleopore
nyommaratott
polikarbonát
(PC)
membránkorongokat (Whatman) használtunk, amiket klórbenzolban oldottunk fel. Ezt az oldatot „spin-coating” technikával, a szenzorchipet 60 s-ig, 2000 min-1 fordulattal forgatva, juttattuk a fotolakk mintázattal ellátott arany hordozóra (25. ábra, D). A fotolakk mikrobarázdák eltávolítását követően (25. ábra, E) a lenyomatképző protein oldatot (általában 1 mg/mL koncentrációjú Avidin) rácseppentettük a PC mintázott hordozóra és egy üveg fedőlemez ráhelyezésével egyenletesen eloszlattuk a felületen (25. ábra, F). Az üveg fedőlemez megakadályozta az oldat elpárolgását a 15 perces inkubációs idő alatt. A lenyomatképzéshez az avidin (Av, 66 kDa, pI = 10,5), ExtrAvidin (EA, pI = 6,5), lizozim (Lys, 14,3 kDa, pI = 11,35), bovin szérum albumin (BSA, 66,4 kDa, pI = 4,7) és streptavidin (ST, 60 kDa, pI = 5,5) fehérjéket a Sigma-Aldrich-tól, a NeutrAvidin (NA, 60 kDa, pI = 6,3) fehérjét a Thermo Fisher Scientific-től (Rockford, IL, USA) rendeltük. A felületről a protein felesleget TE (pH = 8, 10 mM Tris, 1 mM EDTA) puffer oldattal lemostuk, és a proteinnel módosított PC mintázattal ellátott arany szenzor chipet egy speciális elektrokémiai cellába helyeztük. A 8 mL oldattérfogatú elektrokémiai cella 50
három elektródot tartalmazott: a munkaelektród a mintázattal ellátott szenzor, melynek felülete 0,38 cm2, egy platina lemez segédelektród és egy Ag/AgCl pszeudo-referencia elektród. Mindhárom elektródot egy Reference 600 típusú potenciosztát/galvanosztát készülékhez (Gamry Instruments, Inc., Warminster, Pa, USA) csatlakoztattuk. A PC mikromintázatok közé a PEDOT/PSS elektrokémiai leválasztása 0,01 M EDOT és 0,025 M
NaPSS
oxigénmentesített
vizes
oldatából történt
állandó potenciálú
elektropolimerizációval, 0,75 V-on 25 másodpercig. Így a PC sávok között PEDOT/PSS polimer sávokat hoztunk létre (25. ábra, G). Ezután a PC sávokat 30 perces CH2Cl2 fürdővel távolítottuk el. A PC oldódásának gyorsításához lassú keverést (kb. 120 min-1) alkalmaztunk, valamint a 30 perc alatt háromszor cseréltük ki frissre a CH2Cl2 fürdőt. A feláldozandó PC mintázat eltávolításával olyan PEDOT/PSS polimer mikrobarázdákhoz jutottunk a szenzorfelületen, amelyek csak az oldalsó felületükön rendelkeznek a lenyomatképző protein negatív lenyomatával (25. ábra, H). Ezután a szabaddá váló arany felületet 30 percen keresztül 1 mM TEG-SH oldattal blokkoltuk, ami a szenzor alkalmazása során megakadályozza a fehérjék nem specifikus adszorpcióját az aranyon.
6.2 Mérési módszerek Az aptamer-fehérje kölcsönhatások jellemzésére, a vírusfehérjék, valamint a teljes vírus komplex növényi mintából történő kimutatására és a felületi lenyomatú polimer – fehérje kölcsönhatások jellemzésére felületi plazmon rezonanciás méréstechnikát használtam. A felület plazmon rezonancia (SPR) ma már alaptechnikának számít biomolekuláris kölcsönhatások mérésekor, annak köszönhetően, hogy alkalmazásával jelölésmentesen, valós időben és érzékenyen mérhetők kölcsönhatások. A képalkotó SPR technika emellett nagy párhuzamosságban teszi lehetővé különböző receptorokkal módosított felületeken a kölcsönhatások vizsgálatát. A teljes növényi vírus kimutatásának igazolásához pásztázó elektronmikroszkópiát (SEM) is alkalmaztam. Az SPR szenzor chipek előállítása során a DNS aptamerrel módosított szenzorchipeket voltammetriás módszerrel, a felületi lenyomatú polimerrel módosított szenzorokat fluoreszcenciás képalkotással karakterizáltam.
51
Az aptamer-fehérje kölcsönhatásokat jellemző Kd értékek meghatározására kidolgoztam egy független, lumineszcencián alapuló ALPHA eljárást, amivel megerősítettem a felületi plazmon rezonanciás mérések során kapott affinitás értékeket. 6.2.1 Képalkotó felületi plazmon rezonanciás mérési eljárás A képalkotó felületi plazmon rezonanciás mérésekhez IBIS iSPR (IBIS technologies b.v., Enschede, Hollandia) műszert használtam 4.2 verziószámú vezérlőszoftverrel (26. ábra). A műszer két alapvető egységből, magából az optikai mérőrendszerből és a mintakezelést végző mikrofluidikai rendszerből áll.
26. ábra
IBIS iSPR képalkotó felületi plazmon rezonanciás mérőrendszer
Az optikai egység Kretschmann elrendezésű (27. ábra). A fényforrás fehér fénye először egy sávszűrőn halad keresztül, ami csak a 840 nm hullámhosszúságú fényt engedi keresztül, majd egy p-polarizáló szűrőn megy át. A beeső fénysugarat egy, 8°-os szögtartományon belül állítható tükör veri vissza, majd egy lencse rendszer fókuszálja a félgömb alakú prizmára, melynek törésmutatója 1,518, sugara 13 mm. A mérés során egy motorizált goniométer változtatja a fény beesési szögét 3°-os tartományon belül. Ha a törésmutató változás olyan mértékű (pl. nagyon eltérő törésmutatójú oldatok, vagy más felületi kémia alkalmazása miatt), hogy már kívül esik ezen az automatikusan követhető tartományon, egy optikai kiegyenlítő csavarral 66°és 78° beesési szög között manuálisan eltolható a 3°-os dinamikus méréstartomány.211
52
27. ábra
IBIS iSPR optikai rendszer sematikus ábrája és SPR minimum görbe
A szenzortartóval együtt kiszerelhető prizmát (28. ábra) minden szenzor behelyezés előtt etanollal és szöszmentes, optikai törlőpapírral tisztítottam meg. Mielőtt az arany szenzort a prizmára helyeztem, a prizmával megegyező törésmutatójú (n = 1,518) immerziós olajat cseppentettem a prizmára. Ez biztosítja, hogy ne kerüljön levegő a prizma és a szenzor közé. A szenzortartó visszahelyezése után a manuális optikai kiegyenlítő csavart úgy állítottam be, hogy az SPR minimum a pásztázott tartomány közepére essen. szenzor
prizma 28. ábra
szenzortartó
A szenzorbefogóba helyezett szenzor chip
A pásztázott szögtartományt általában -1500 m° és 1500 m° közé állítottam. A pásztázási frekvencia jellemzően 10 Hz volt, a lépésköz 200 m°. Annak érdekében, hogy a zaj minél kisebb legyen, jellemzően háromszoros ismétlést alkalmaztam, így körülbelül 4,5 s-ig tartott egy intenzitás vs. beesési szög minimumos SPR görbe felvétele. Az SPR felbontása <1 m° (mért terület: 30 × 30 pixel), amit 200 m°-os lépésekkel nyilván nem lehetne biztosítani, ugyanakkor a mérési idő elfogadhatatlan meghosszabbítását 53
jelentené, ha nagyobb szögfelbontással pásztáznánk. Ezért az a megoldás, hogy a fenti paraméterekkel mért, 15 mérési pontból álló görbére a szoftver egy elméleti görbét illeszt, amiből kiszámolja a minimum intenzitáshoz tartozó szöget, és ezt a minimumhoz tartozó SPR szöget ábrázolja az idő függvényében. A műszerrel a szenzor chip több szabadon kijelölt területén párhuzamosan mérhető az SPR minimum. A folyadékkezelésért egy automata fluidikai egység felelős. A mintaoldatokat egy rozsdamentes acél tűn keresztül szívja fel a műszer. A tű egy programozható, 3 irányban mozgatható robotkarra van erősítve. A mintaadagolás történhet termosztált mintatartó asztalon elhelyezett 3 db 10 mL-es üveg edényből, 12 db 0,5 mL-es centrifuga csőből, illetve egy 96 lyukú, vagy egy 384 lyukú mikrotitertálcából.
29. ábra
IBIS iSPR fluidikai rendszer
A műszerben a folyadékok (puffer oldatok, minta oldat, regeneráló oldat) mozgatásáért egy dugattyús pumpa felel, ami Teflon® csöveken keresztül juttatja el a mintát a 25,00°C-ra termosztált, 10 mm hosszú, 3 mm széles és 0,1 mm magas, ~3 L térfogatú átfolyó cellába (30. ábra). Mivel az SPR jelenség rendkívül hőmérséklet függő, a szenzorchipet is 0,01 °C pontossággal, jellemzően 25,00 °C-on termosztáljuk a műszerben.
54
30. ábra
IBIS iSPR átfolyócella a tőmítőgyűrűvel
Egy felületi plazmon rezonanciás mérés jellemzően az alábbi folyadékmozgatási műveletekből áll: 1. A dugattyús pumpa a puffer oldatot tartalmazó edényből feltölti puffer oldattal a csöveket és az átfolyó cellát, miközben kimossa a tűt. 2. A tűn keresztül levegőbuborékot (kb. 10 L) szív a csőbe, majd a mintatartó edényből felszív 75 L mintaoldatot, majd ismét egy levegőbuborékot (kb. 10 L). 3. Az alapvonal felvétele során a csőben és az átfolyó cellában található oldatot előre-hátra mozgatja a pumpa 30 L/s sebességgel. 4. Az alapvonal felvételét követően a pumpa a levegőbuborékok közé zárt mintaoldatot bejuttatja az átfolyó cellába, és a kölcsönhatás (asszociációs szakasz) mérése közben, általában 15 percig 30 L/s sebességgel előre-hátra mozgatja. 5. A lemosási lépésben (disszociációs szakasz) a puffer oldatot tartalmazó edényből felszívott, friss puffer oldattal mossa át a pumpa az átfolyó cellát 15 percen keresztül, több szakaszban. Az egyes szakaszok alatt, az alapvonal felvétele során alkalmazott sebességgel, előre-hátra mozgatja a mosópuffer oldatot a dugattyús pumpa. 6. Ezután következhet a regenerálási lépés, mely során a regeneráló oldatot a mintaoldathoz hasonlóan juttatja a dugattyús pumpa az átfolyó cellába, azonban ilyenkor a regeneráló oldat tartózkodási ideje lényegesen rövidebb, általában 45 s. 55
A kisméretű átfolyó cellára és a mérés közben a mintaoldat előre-hátra mozgatására azért van szükség, hogy viszonylag nagy lineáris áramlási sebesség alakuljon ki a cellában, ami biztosítja, hogy a kötődési kinetika legyen a jelváltozást meghatározó tényező és ne a vizsgált molekulák szenzorfelületre kerülésének anyagtranszportja. Azaz elkerüljük az anyagtranszport kontrollált körülményeket. 6.2.2 SPR mérések kiértékelése Az „SPR szög eltolódás”–„idő” összefüggésre az 1:1 sztöchiometrián alapuló sebességi egyenletet,
illetve
a
„SPR
szög
eltolódás”–„koncentráció”
összefüggésre
az
eredményeknél megadott összefüggést nem-lineáris regresszióval illesztettem Origin (OriginLabs Co., Northampton, MA USA) és Scrubber2 (BiaLogic Ltd, Campbell, Ausztrália) szoftverek segítségével. Az illesztések jóságát a
módszerrel ellenőriztem. ∑
Ahol a
a súlyt,
(
̂)
[8]
a kísérleti adatpontokat, ̂ az elméleti adatpontokat jelenti.
Iterációval határoztam meg azokat a „legjobb” paramétereket, amelyekkel a khi-négyzet minimalizálható. 6.2.3 SPR szenzorchipek felületi módosítása Az SPR mérésekhez általában planáris, módosítatlan arany SPR szenzorokat (IBIS Technologies
BV,
Hengelo,
Hollandia)
használtam.
A
szenzorchip
egy
16 mm×16 mm×1 mm-es, a BK7-es prizmával megegyező törésmutatójú üveglemez, amire egy titán adhéziós rétegen keresztül kb. 40 nm vastagságú polikristályos aranyréteget vittek fel fizikai gőzfázisú leválasztással (PVD). Ez a szenzor chip általában egy műanyag lemezre van ragasztva (32. ábra), ami a műszerbe helyezéskor a pozícionálást biztosítja.
56
31. ábra
Az SPR szenzor chip méretrajza az IBIS iSPR műszerrel mérhető területtel és az áramlási cellát kialakító O-gyűrűvel
Első lépésként mindig megtisztítottam a planáris, módosítatlan arany SPR szenzor chipet 30%-os H2O2, 25%-os NH4OH és ioncserélt víz 1:1:5 térfogatarányú keverékével212, amit 20 percen keresztül tartottam a szenzoron, majd ioncserélt vízzel mostam és N2 áramban szárítottam. Annak érdekében, hogy a képalkotó felületi plazmon rezonanciás rendszerrel több kölcsönhatást is mérhessek párhuzamosan, mintáztam a szenzor chip felületét (32. ábra). A planáris arany chipeken az oligonukleotid mintázatokat mikrocseppentéssel hoztam létre. Ehhez egy mikrocseppentő robotot (Calligrapher Microarrayer, Bio-Rad, Hercules, CA) használtam. A mikrocseppentőben egy 350 m átmérőjű tömör tű segítségével juttattam a tiollal módosított oligonukleotidokat a szenzor felületére. A cseppentés egy szabályozható hőmérsékletű tárgyasztalon és kontrollálható páratartalmú kamrában történt. Általában a kamra páratartalmat 65%-os relatív értéken tartottam, miközben a tárgyasztal hőmérsékletét a 10°C-ra állítottam. Két cseppentés között a cseppentő tűt először 10% etanol, 0,01% Tween 20 oldattal, majd ioncserélt vízzel mostam egy előre beprogramozott automatizmus szerint.
57
32. ábra
A szenzor tartóba helyezett cseppentett szenzor felülete
A cseppentést követően a cseppentett felületet 10°C-on, 65%-os relatív páratartalom mellett inkubáltam 30 percen keresztül. Ezt követően a cseppentőből áttettem a szenzorchipet (32. ábra) az SPR készülékbe és annak átfolyó cellájában TEG-SH oldattal kezeltem a felületet 1 órán keresztül a módosítatlan arany felületek levédése érdekében. Amennyiben nem volt szükség a szenzorchipek mintázására, az iSPR egy csatornás rendszerként is használható. Ennek az az előnye, hogy az alap rétegek bekötődése is insitu nyomonkövethető. Ekkor a szenzor chipet az SPR átfolyó cellájában módosítottam tiol csoporttal ellátott oligonukleotidokkal, ami önrendeződő monoréteget hoznak létre az arany felületen. Jellemzően először 1,0 M KH2PO4-ban oldott 1 M koncentrációjú tiol módosított aptamer oldatot inkubáltam a szenzor felületén. Az aptamer felesleget 3 egymást követő lépésben 1 mL PBS oldattal mostam le a felületről. Ezután a nemspecifikus adszorpció elkerülése érdekében 1 órán keresztül 0,1 mM TEG-SH (PBS) oldattal kezeltem a felületet, amit ismét 3-szor 1 mL PBS oldattal történő mosás követett. 6.2.4 DNS felületi borítottságának meghatározása elektrokémiai eljárással Az aptamerek felületi sűrűségét az arany szenzoron voltammetriával, az immobilizált DNS szálak negatív töltését kompenzáló Ru3+ mennyiségének mérésével határoztam meg.213,214 Ez azért lehetséges, mert az arany elektromos vezető, így az SPR szenzor munkaelektródként használható. Ez a módszer a Steel et al. által kidolgozott kronocoulombmetriás módszerrel megegyező eredményt adott.215 A voltammetriás görbék felvétele során az elektródpotenciált 0,1 V és -0,6 V (vs. Ag/AgCl/3 M KCl referencia) között változtattam 0,1 V/s sebességgel. Először 58
oxigénmentesített 10 mM Tris pufferben (pH = 7,4) mértem, majd az elektródot 50 M [Ru(NH3)6]Cl3-ot tartalmazó oxigénmentesített 10 mM Tris pufferbe (pH = 7,4) helyeztem 1 percre. Ezután visszahelyeztem az elektródot az oxigénmentesített 10 mM Tris pufferbe (pH = 7,4) és ismét felvettem a görbét, amiből levontam a [Ru(NH3)6]Cl3 oldatban történő inkubálás előtt mért görbét. Az így kapott katódos áramcsúcs integrálásából származó töltés (
) a felületre immobilizált DNS szálak által
elektrosztatikusan adszorbeált Ru3+-tól származik.214 A felületi borítottságot (
) az alábbi képlettel számítottam ki: [9]
, ahol
az elektród felülete,
a Faraday állandó és
a redox reakcióban résztvevő
elektronok száma. Végül a DNS felületi borítottság a DNS = zNARu/m képlettel számítható, ahol a z a redox molekula töltése (z = 3), NA az Avogadro szám és m a DNS molekula nukleotidjainak száma. 6.2.5 Nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens assay-k (ALPHA) Az aptamer-fehérje kölcsönhatások jellemzéséhez alkalmazott nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens assay (ALPHA) mérésekhez Perkin-Elmer fehér színű, nem átlátszó 384-es mikrotitertálcát használtam, amit az inkubációs idő és a mérés alatt öntapadós fóliával zártam le, hogy megakadályozzam az oldatok párolgását. A reagensek összemérését, inkubációját és a mérést sötétszobában, vagy maximum 40 lux erősségű zöld fénynél végeztem. Az assay-k méréséhez Perkin Elmer EnSpire 2300 Multimode mikrotitertálca olvasót használtam. A mikrotitertálca hőmérsékletét 27 °C-on tartottam, miközben a mikrotitertálca feletti részt 2 °C-kal magasabb hőmérsékletre temperáltam, hogy megelőzzem a páralecsapódást a zárófóliára. A gerjesztési időt 35 ms-ra, az emissziós időt 65 ms-ra állítottam. A lumineszcencia háttér vizsgálatok során donor és akceptor gyöngyöket 1 mg/mL BSA tartalmú PBS pufferben és BSA-t nem tartalmazó PBS pufferben kevertem össze az aptamer, illetve fehérje oldatokkal. A biotinilált aptamer végső koncentrációja 12,5 nM, a 6×His módosított fehérje végső koncentrációja pedig 100 nM volt. Pozitív kontrollként 59
0,5 µL biotinilált-6×His konjugátumot használtam. A lumineszcencia jelet egy órás 27°Con történő inkubálást követően mértem. A kölcsönhatás méréséhez összemértem az aptamert és a proteint, majd a PBS, vagy 1 mg/mL BSA tartalmú PBS pufferben inkubáltam 1 órán keresztül 27°C-on. Ezután hozzáadtam a streptavidin kötőhelyeket tartalmazó donor és Ni2+ kelát akceptor gyöngyöket, melyeknek a végső koncentrációja egyenként 20 g/mL, és 1 órán keresztül inkubáltam 27°C-on. Az assay-k végső térfogata 25 l volt. 6.2.6 Szenzorfelület jellemzése és elektronmikroszkópiával (SEM)
növényi
vírusok
mérése
pásztázó
A szenzorchiphez kikötődött növényi vírusokat Zeiss-SMT LEO 1540XB térvezérlésű pásztázó
elektronmikroszkóppal
mikromintázatokat
Zeiss
Ultra
(FESEM), 55
nagy
a
felületi
felbontású
lenyomatú
polimer
téremissziós
pásztázó
elektronmikoszkóppal (HR-SEM) (Carl Zeiss SMT GmbH, Németország) vizsgáltuk. A növényi vírus elektronmikroszkóppal történő mérése előtt a szenzorchip felületét 5% glutáraldehiddel mostam 15 percen keresztül, hogy rögzítsem a vírust a felületen. Ezt követően 1 percig 1% cink-uranil-acetáttal negatív festést végeztem. A cink-uranilacetát kölcsönhatásba lép az elektronnyalábbal és elhajlítja azt. Mivel a vírust nem fedi be a cink-uranil-acetát festék, a vírusnál kisebb lesz az elektronnyaláb elhajlása, mint a festékben gazdag környezetében, ami megnöveli a FESEM kép kontrasztját. A molekuláris lenyomatú polimerrel módosított mintákat 0,5 nm vastagságú Pt-val fedtük be katódporlasztással a SEM mérés előtt. 6.2.7 Epifluoreszcenciás mikroszkópia A felületi lenyomatú polimer mikromintázatokat és azok protein visszakötő képességét fluoreszcenciás képalkotó módszerrel is vizsgáltuk. Ehhez egy Nikon LV100 mikroszkópra felépített, fém-halogén gerjesztő fényforrással (Prior Lumen 200, Prior Scientific Instruments Ltd., Cambridge, UK) és szélessávű szűrővel (Nikon, B-1A) ellátott epifluoreszcens mikroszkóp elrendezést használtunk. A fluoreszcens képeket egy Peltier-elemmel hűtött CCD kamera (Nikon DS-5Mc) készítette és a NIS Elements szoftver (Nikon) dolgozta fel. A vizsgált területek, azaz a PEDOT/PSS mikrobarázdák
60
szélein (kb 0,7 m) mért fluoreszcencia intenzitásokat átlagoltuk és korrigáltuk a kamera erősítésével, hogy összehasonlítható értékeket kapjunk.
6.3 Növényi kivonatok előállítása A növényi kivonatokat 0,2 g levélből (dohány, alma vagy körte) készítettük. A leveleket összezúztuk 4 mL PBS-TPO pufferben. A kivonatot 0,5 mL-es részekre osztottuk szét, majd liofilizáltuk és ebből készítettük a negatív kontroll növényi mintákat. Az ASPV pozitív, APMV pozitív, és ACLSV pozitív, illetve negatív kontroll növényi mintákat a Bioreba AG-tól (CH-4153 Reinach, Svájc) rendeltük.
6.4 Összes fehérje koncentráció meghatározása A fehérje oldatok és növényi kivonatok összes fehérje koncentrációját Bradford reagenssel (Coomassie G-250 brillantkék, Pierce) festékkel határoztuk meg. Alacsony pH-n a pozitívan töltött fehérjékhez (pH
6.5 Alkalmazott vegyszerek Ha a szövegben másként nem jelöltem, a mérésekhez használt oligonukleotidokat, fehérjéket, tiolokat, szervetlen sókat, puffer összetevőket és felületaktív anyagokat a Sigma-Aldrich-tól (St. Louis, MO, USA) rendeltük a legnagyobb analitikai vagy bioanalitikai tisztaságban. Az oldatokat ioncserélt vízből készítettem (18.2 MΩ-os ellenállású, Millipore, Merck, Billerica, MA, USA). Ha a szövegben máshogy nem jelöltem, a puffer oldatok összetétele a következő: PBS - pH 7.4, 0,01 M foszfát puffer, 2,7 mM KCl és 137 mM NaCl; PBS-T – PBS 0,05% Tween 20 felületaktív anyaggal PBS-TE – PBS-T 1 mM EDTA-val PBS-TPO – PBS-T 2% polivinil-pirrolidonnal TE – pH 8.0, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. 61
Az SPR mérésekhez a módosítatlan arany SPR szenzorokat az IBIS Technologies B.V.-tól (Enschede, Hollandia) rendeltük. Az ALPHA mérésekhez a donor és akceptor gyöngyöket a Perkin-Elmer Co.-tól (Waltham, MA, USA) szereztük be.
62
7 Eredmények és értékelésük 7.1 DNS
aptamer
alapú
SPR
szenzor
növényi
vírus
fehérjék
meghatározására 7.1.1 DNS aptamerek szelekciója vírus kapszid fehérjékre A 1014-féle szekvenciát tartalmazó oligonukleotid könyvtárból a vírus kapszid fehérjékhez specifikusan kötődő egyszálú DNS aptamerek kiválasztáshoz 6×His módosítással ellátott fehérjéket immobilizáltunk Ni-NTA (nikkel-nitriloecetsav) ágyhoz. A specifikus DNS szálak kiválasztását az alábbi faktorok biztosították: 1. a szelekciós pufferbe feleslegben tettünk dIdC-t és BSA-t, ami megakadályozta a nem-specifikus fehérjekötő szekvenciák kötődését 2. intenzíven mostuk az oligonukleotid-fehérje komplexet kötő ágyat, hogy eltávolítsuk a gyengén kötődő szekvenciákat 3. az egymást követő szelekciós ciklusokban fokozatosan csökkentettük a protein koncentrációt, hogy a nagyobb affinitást mutató szekvenciák maradjanak bent 4. annak érdekében, hogy nagyon hasonló célmolekulák megkülönböztetésére is képes szekvenciákat nyerjünk, kontraszelekciós lépéseket is közbeiktattunk a szelekció során A 15 ciklusból álló SELEX eljárás végén célmolekulánként 20-20 kolóniát izoláltunk, és szekvenáltunk meg. Ebből az MT32 célfehérje esetében 10 kolónia, a PSA-H célfehérje esetében 9 kolónia rendelkezett ugyanazzal a szekvenciával. Azonban ez a két szekvencia nem tartalmazott hasonló részeket. A kapott szekvenciákban megvizsgáltuk a G-kvadruplexek jelenlétét a QGRS Mapper216 internetes programmal, ami mindkét szekvenciában jelezte a G-kvadruplexek jelenlétét, azonban az előrejelzett szerkezetek eltérőek voltak. A szekvencia elemzés sikeres aptamer szelekcióra utalt. Mindkét fehérje esetében a leggyakrabban előforduló szekvenciát választottuk ki és szintetizáltattuk nagyobb mennyiségben a további vizsgálatokhoz (2. táblázat, 49. oldal).
63
7.1.2 Aptamer alapú SPR szenzorok fejlesztése Az aptamerek és a vírus kapszidfehérjék közötti kölcsönhatást SPR technikával ellenőriztem. Mivel az SPR jel a szenzorfelülethez kötődő molekula tömegével arányos, a kölcsönhatás méréséhez a kisebb tömegű oligonukleotidokat immobilizáltam a szenzor felületére, és a nagyobb tömegű fehérje bekötődését vizsgáltam. Az aptamerek immobilizációjához „HS-(CH2)6-TTTT” szakaszt terveztünk az aptamerek 3’ végére (33. ábra). Mivel a tiolok közel kovalens erősséggel (~45 kcal/mol217) kötődnek az aranyhoz, a tiol csoport biztosítja az aptamerek immobilizációját az arany szenzoron, a „(CH2)6-TTTT” távtartó szakasz pedig az önrendeződésért és a megfelelő térköz kialakításáért felelős a szenzorchip felülete és a kötődésben résztvevő DNS szekvencia között.218
33. ábra
Az aptamer alapú biochip felületi módosításának sematikus ábrája
Mivel az aptamerek nagymértékű konformációs flexibilitásuknak köszönhetően adaptív felismerési mechanizmussal kötődnek a ligandumaikhoz219, SPR rendszerben történő alkalmazásuk az antitestekhez képest a felületi borítottság és a szenzorchip alaposabb optimalizálását igénylik. Túl nagy sűrűségben a három dimenziós szerkezet kialakulása sztérikusan gátolt lehet, ugyanakkor a szenzorfelület blokkoláshoz használt más tiolok is befolyásolhatják a három dimenziós térszerkezet kialakulását. Immobilizálásuk általában biotin-avidin kölcsönhatáson220, vagy a tiol csoport aranyhoz történő spontán kemiszorpcióján alapul. Munkám során tiol módosítással ellátott aptamerek közvetlen immobilizációját vizsgáltam arany szenzorchipeken. Egy korábbi tanulmány221 rámutatott, hogy az aptamer-ligandum kölcsönhatás rendkívül érzékeny az aptamer felületi borítottságára, 64
az aptamert a tiol funkciós csoporttól elválasztó távtartó szakasz hosszára, valamint a felületen található egyéb tiol származékokra, melyek az aptamerek közötti térrészeket töltik ki. Ezek a tiol származékok biztosítják a nukleinsav szálak deszorpcióját az arany felületről, és csökkentik a nem-specifikus adszorpciót a szenzorfelületen. Prime és Whitesides publikációja222 óta gyakran alkalmaznak különböző, tiollal módosított oligoetilénglikol molekulákat monomolekuláris felületek kialakítására, mivel az oligoetilénglikolok alacsony nem-specifikus adszorpciót mutatnak biológiai mintákból származó komponensekkel szemben. Ezeknek a tanulmányoknak a célja többnyire szérum proteinek adszorpciójának vizsgálata volt, míg - ismereteink szerint - növényi kivonatok nem-specifikus adszorpcióját még nem vizsgálták ilyen felületeken. Ezért megvizsgáltam a kereskedelmi forgalomban elérhető 5 és 20 kDa moláris tömegű tiol terminális csoportot tartalmazó polietilénglikolok és négy, illetve hat etilénglikolból álló 11-merkapto-undecil-tetraetilénglikol
(TEG-SH),
illetve
11-merkapto-undecil-
hexaetilénglikol (HEG-SH) alkalmazhatóságát növényi mátrixok esetén. Korábbi tanulmányok rámutattak, hogy a hosszabb etilénglikol molekulák jobban ellenállnak a proteinek nem-specifikus adszorpciójának. Az etilénglikol származékok valóban nagyon alacsony nem-specifikus adszorpciót mutattak többféle növényi kivonat esetében is, azonban a kevert aptamer/polietilénglikol monorétegeknél a specifikus kötődés is rendkívül alacsonynak bizonyult (34. ábra).
34. ábra Az etilénglikol molekulák hosszának hatása az aptamer molekula specifikus felismerésére. (a) referencia DNS szál (HS-T44), (b) specifikus felismerést biztosító HSMT32 aptamer. Az MT32 fehérje koncentrációja 500 nM. 65
Ez ismét rámutat a kitöltő tiol és a megfelelően optimalizált felületi réteg jelentőségére az aptamer monorétegek érzékenysége tekintetében. Mivel a kevert aptamer-SH/TEGSH monorétegek kiváló specifikus felismerést mutattak (35. ábra), feltételeztük, hogy az aptamer
szekvencia
immobilizálásához
használt
távtartónál
hosszabb
kitöltő
polietilénglikol láncok sztérikusan gátolhatják a specifikus kölcsönhatást.
35. ábra Tipikus szenzorgram, ami a tiol módosítással ellátott aptamer (1 M PSA-H aptamer 1 M KH2PO4 oldatban) és a TEG-SH (0,1 mM, PBS-T oldatban) kétlépéses immobilizációját, valamint a növekvő koncentrációjú PSA-H fehérje bekötődését mutatja a regenerálási lépésekkel A kötési affinitás és bekötődési kinetika mérésénél döntő, hogy a kinetikai jel kizárólag az aptamer és a fehérje kölcsönhatásából származzon, tehát elhanyagolhatónak kell lennie a nem specifikus felületi adszorpciónak. SPR-rel vizsgáltam a kitöltő molekulaként
alkalmazott
TEG-SH
monorétegen
különböző
fehérje
oldatok
adszorpcióját. Az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. A tisztított fehérje oldatok nem-specifikus adszorpciója mérési hibán belüli volt, míg a különböző növényi kivonatok, a legnagyobb koncentráció esetén is, maximum 7 m° eltolódást okoztak.
66
3. táblázat
Felületi plazmon rezonancia szög eltolódások TEG-SH módosított felületeken különböző protein mátrixok esetén Összes protein
Rezonancia szög
koncentráció
eltolódás
(g/mL)
(m° ± SD)
Körte levél kivonat
145
0,9 ± 0,3
Alma levél kivonat
223
1,8 ± 0,3
Dohánylevél kivonat
800
7,0 ± 3,0
MT32
50
3,1 ± 0,7
PSA-H
50
-0,7 ± 0,4
BSA
100
-0,5 ± 0,4
Avidin
100
0,5 ± 0,1
Bioreba ASPV pozitív kontroll
100
5,0 ± 2,1
Bioreba ASPV negatív kontroll
200
4,2 ± 0,3
Ezt követően a TEG-SH/tiol módosított aptamer kevert monoréteg optimalizálását végeztem el. Az optimális specifikus kötőképesség elérése érdekében az aptamer/TEG monoréteg optimalizálását három alapvető paraméter változtatásával végeztem. Korábbi mérésekkel már azonosítottam az önrendeződő nukleinsavak felületi borítottságát befolyásoló három fő paramétert, amik a két tiol csoporttal ellátott vegyület (TEG-SH és aptamer-SH) koncentrációja és a felületmódosításhoz használt oldat ionerőssége. Ezeknek a paramétereknek a hatását egy Taguchi-féle 33 kísérleti tervvel határoztam meg. Különböző ionerősségű, az aptamert és a TEG-SH-t különböző arányban
tartalmazó
oldatokat
készítettem
és
véletlenszerű
sorrendben
felcseppentettem egy planáris arany SPR szenzorra. Az aptamer koncentrációját 0 és 10 M, a TEG-SH koncentrációját 1 és 100 M között változtattam. Az alkalmazott pufferoldat ionerősségét 0,1 és 1 M közé állítottam be. A centrális pontot háromszor ismételtem a szórás meghatározása érdekében. Az így kapott felületeken (36. ábra) valós időben vizsgáltam a kölcsönhatásokat, először 1% BSA oldattal a nem-specifikus adszorpció szintjének meghatározása érdekében, majd rövid regenerálást követően 3 különböző koncentrációban mértem az ASPV fertőzött növényi mintát. 67
36. ábra
A felület optimalizálásához alkalmazott, 33 kísérleti terv alapján készített cseppentett szenzor chip valós idejű SPR képe
Az eredmények azt mutatták, hogy az optimális aptamer-ligandum kölcsönhatás, azaz a legalacsonyabb nem-specifikus adszorpció és a legmagasabb specifikus válasz érdekében
legalább
5 M
aptamer
koncentráció
szükséges,
míg
a
TEG-SH
koncentrációját a legnagyobb vizsgált koncentráción, azaz 100 M-on kell tartani (37. ábra). Az ionerősség hatása nem volt szignifikáns ebben a viszonylag magas koncentráció tartományban, amit szándékosan használtam, hiszen korábban már rámutattak, hogy a DNS váz negatív töltésének elektrosztatikus hatását árnyékolni kell a megfelelően kompakt nukleinsav monoréteg kialakításához.86
37. ábra A specifikus aptamer – ASPV fertőzött növényi kivonat (10x hígítás) kölcsönhatás (A) és az 1% BSA nem-specifikus adszorpció (B) kétdimenziós ábrázolása a tiol módosított aptamer és a TEG-SH koncentrációjának függvényében. Az egyes szintvonalak a két tiol keverési arányának megfeleltethető rezonancia szög eltolódások Hasonlóan optimális érzékenységet és specifikus választ adó réteg kétlépéses felületmódosítással is kialakítható, mely során egymás után inkubáljuk a felületen a tiollal módosított aptamer és a TEG-SH vizes oldatát (35. ábra). Mivel ebben az esetben a 68
két tiol nem „verseng” egymással, más koncentráció alkalmazásával, (1 M aptamer 1 M KH2PO4-ban oldva) érthető el optimális eredmény. Ez megfelel annak a várakozásnak, hogy a kétlépéses felületmódosítás első, aptamer immobilizációs lépésében alacsonyabb aptamer-SH koncentráció szükséges, mint az egy lépéses módosítás esetén. A PSA-H aptamer felületi borítottsága 1,9×1012 molekula/cm2-nek adódott, ami 100 nm2 területen 2 darab aptamer molekulának felel meg. Ezeket az eredményeket 45mer egyszálú DNS aptamerekre kaptam, ami nagyjából megfelel a legáltalánosabban alkalmazott aptamer szelekciós könyvtárakban található DNS hosszúságnak. Néhány esetben csak az aptamerek konzervált, rövid szakaszait használják fel szenzorokhoz (13 bázis hosszúságú aptamert is közöltek már223). Ezért munkám során vizsgáltam a 81 bázisból álló, a flank régiókat is tartalmazó aptamer szálakat is. 81 bázis hosszúságú (PSA-H Flank) és 20 bázis hosszúságú (trombin) aptamerek felületi borítottságát meghatározva az eredmények azt mutatták, hogy a hosszabb aptamerek esetében a felületi borítottság csak 25%-kal csökken (1,3×1012 molekula/cm2), míg a rövidebb, 20mer aptamerek esetén több mint 3-szor nagyobb a felületi borítottság (6,2×1012 molekula/cm2) a 45mer aptamerekéhez képest. A munkám során használt aptamerek (45mer és 81mer) esetén kapott közel azonos felületi borítottság miatt nem volt szükség külön optimalizálásra. Azonban rövid aptamer szálak esetén az optimális felületi borítottság eléréséhez az itt leírttól jelentősen eltérhet a szükséges felületmódosítási protokoll. 7.1.3 Aptamer – növényi vírus kapszidfehérjék közötti kölcsönhatás jellemzése Az SPR jel koncentráció függését először PBS-ben oldott, baktérium lizátumból tisztított MT32 és PSA-H vírus fehérjékkel vizsgáltam. Az MT32 és a PSA-H aptamereket planáris arany chipre immobilizáltam az optimalizált protokoll szerint. Míg az aptamer szelekció során a variábilis szakaszt közrefogó két primer régiót is tartalmazó nukleinsavakat használnak, az aptamerek affinitását vizsgáló tanulmányok nagy részében csak a variábilis szakaszt vizsgálják. Ez azon a feltételezésen alapul, hogy a primer régió nem befolyásolja az aptamer-ligandum kölcsönhatást. Ennek a feltételezésnek az ellenőrzéséhez a két primer szakaszt is tartalmazó HS-PSA-H aptamert (PSA-H Flank) is vizsgáltam. Az aptamerek minden esetben arra a fehérjére mutattak jobb szelektivitást, amelyre szelektáltuk azokat (38. ábra). 69
38. ábra MT32 (A) és PSA-H (B) proteinek SPR kalibrációs görbéi MT32 (a), PSA-H (b) és PSA-H-Flank (c) aptamerrel módosított biochipek alkalmazásával. A mérési adatok illesztése a specifikus kötődés elsőrendű kinetikáját leíró hiperbolikus egyenlettel történt ([7] egyenlet). Érdemes megfigyelni, hogy specifikusságot csak a PSA-H-Flank aptamer mutatott, amihez egyáltalán nem kötődött az MT32 fehérje. Azonban a PSA-H-Flank aptamer érzékenysége kisebb volt a PSA-H fehérjére, mint a rövidebb PSA-H aptamernek. A kisebb érzékenység magyarázható azzal, hogy a hosszabb aptamer esetén a felületi borítottság (kötőkapacitás) kb. 25%-kal kisebb, mint a rövidebb aptamer esetén. Az mfold szoftveres224 előrejelzés erősebb másodlagos szerkezetet mutatott a PSA-HFlank aptamer esetén. Legalább eggyel több kettős szálú szakasz jelent meg benne, valamint a PSA-H aptamerben található egyetlen kettős szálú, belső komplementer szakasz is kettővel több bázispárból épül fel.224 A flank régió hatására a PSA-H aptamer legvalószínűbb másodlagos szerkezetének kialakulásával kapcsolatos minimális szabad entalpia lecsökken (4. táblázat).
70
4. táblázat
aptamer
MT32, PSA-H és PSA-H Flank aptamerek mfold szoftverrel előrejelzett másodlagos szerkezete224 (T = 25°C, 150 mM Na+) Másodlagos szerkezet
dG (kcal/mol)
MT32
0,38
PSA-H
-2,40
PSA-H-Flank
-9,75
-9.35
-9.09
71
G kvadruplexek keresésére alkalmas QGRS eszközzel216 vizsgálva az aptamereket azt kapjuk, hogy a flank régiók nem járulnak hozzá kiterjedtebb G kvadruplexek kialakulásához, de a lehetséges G síkok száma növekszik. 5. táblázat PSA-H és PSA-H-Flank aptamerek G kvadruplex elemzése QGRS eszközzel216 (minél magasabb a G érték, annál nagyobb a valószínűsége a G kvadruplex kialakulásának)
Pozíció 6 21
Pozíció 24 39 39 46
Hossz 17 20
Hossz 17 20 23 17
PSA-H aptamer QGRS GGTTTGGTGTTGGTTGG GGTTGCTGGTTTTGGTTTGG
PSA-H-Flank aptamer QGRS GGTTTGGTGTTGGTTGG GGTTGCTGGTTTTGGTTTGG GGTTGCTGGTTTTGGTTTGGCGG GGTTTTGGTTTGGCGGG
G érték 19 19
G érték 19 19 19 19
A szelektivitási sorrend összhangban van az SPR tranziensek kinetikai kiértékeléséből származó aptamer-fehérje kölcsönhatások disszociációs állandóival (Kd). MT32 fehérje esetén a HS-MT32 aptamer Kd értéke kb. 1 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a HS-PSAH aptamer Kd értéke, azaz 5,5×10-8 M a 2,9×10-7 M-rel szemben. A PSA-H fehérjeaptamer disszociációs állandó értéke az alábbiak szerint növekszik: PSA-H aptamer (8,0×10-9 M), PSA-H-Flank aptamer (2,6×10-8 M) és MT32 aptamer (8,3×10-8 M), ami megfelel a megfigyelt szelektivitásoknak. 7.1.4 Vírus kapszidfehérjék meghatározása növényi kivonatból Míg a TEG-SH háttér rendkívül ellenálló a nem-specifikus adszorpcióval szemben, az aptamer-SH-t és TEG-SH-t is tartalmazó kevert önrendeződő monoréteg esetén további SPR vizsgálatokra van szükség annak tudatában, hogy az aptamer réteg jelentős negatív töltéssűrűséggel rendelkezik. Ez az alkalmazott puffer pH értékénél magasabb izoelektromos ponttal (pI) rendelkező fehérjék nem-specifikus adszorpcióját okozhatja. A növényi minták komplexitását jól jellemzi az Arabidopsis thaliana proteomikai analízisét bemutató tanulmány, amelyben 13 000 növényi fehérjét írnak le.225 A vírust
72
nem tartalmazó növényből származó, koncentrált fehérje kivonat valóban jelentős nemspecifikus adszorpciót okozott az aptamer módosított felületeken (6. táblázat). 6. táblázat Azonos sarzsból származó növényi kivonatok esetén mért nem-specifikus adszorpció mértéke a rezonancia szög eltolódásában kifejezve különböző aptamer/TEGSH felületeken. Az azonos növényből származó, de különböző kivonatok nem-specifikus adszorpciójának SD értéke 23,2 m° volt. Rezonancia szög változás (m° ± SD) HS-MT32
HS-PSA-H
HS-PSA-H-Flank
Alma levél kivonat
33,8 ± 1,4
34,5 ± 1,6
21,0 ± 1,6
Körte levél kivonat
13,5 ± 0,5
15,1 ± 0,4
10,0 ± 1,0
Az azonos sarzsból származó növényi kivonatok esetén a nem-specifikus adszorpció mértéke gyakorlatilag megegyezett a HS-MT32 és HS-PSA-H felületeken, de jelentősen alacsonyabb volt a hosszabb HS-PSA-H-Flank aptamer esetében. Ez a mikrocseppentett aptamer felületek rendkívül jó reprodukálhatóságára utal. Azonban jóval jelentősebb mértékben szórt a nem-specifkus adszorpció mértéke a különböző növényekből készített növényi kivonatok, illetve az azonos növényből készített, de különböző sarzsok esetén (6. táblázat). Annak ellenőrzésére, hogy a nem-specifikus kölcsönhatás valóban elektrosztatikus
okokra
vezethető
vissza,
két
tisztított
fehérjét
használtam:
tojásfehérjéből származó avidint és annak származékát, NeutrAvidint, melyeknek pI értéke rendre 10,5 és 6,3. A PSA-H aptamerrel módosított szenzorchipeken ezeknek a fehérjéknek a 250 nM koncentrációjú oldatait vizsgáltam. A várakozásnak megfelelően az avidin, ami 7,4 pH értéken pozitívan töltött 220,5 (±3) m° rezonancia szög változást adott, míg a NeutrAvidin, amely enyhén negatívan töltött ezen a pH-n, csak 8,5 (± 0,5) m° változást okozott. Mivel a két fehérje mérete közel azonos, az avidin esetében fellépő nagy rezonancia szög változást nehéz lenne mással magyarázni, mint elektrosztatikus kölcsönhatással. A pozitívan töltött makromolekula és a negatívan töltött felület közötti kölcsönhatás valójában a polielektrolit multirétegek kialakulásához hasonlítható.226 A TEG-SH felületek nem mutattak szignifikáns nem-specifikus adszorpciót a vizsgált mintákkal, ami ideálissá teszi alkalmazásukat az oldatok törésmutató változásai miatt bekövetkező rezonancia szög eltolódások kompenzálására, de nem alkalmazhatók a vírus
kapszidfehérjék
koncentrációjának
növényi
kivonatokból
történő
meghatározásánál referencia felületként. Mivel a nem-specifikus kölcsönhatás rendkívül 73
nehezen reprodukálható még ugyanolyan fajtából származó növényi kivonatok esetében is, nem alkalmazható a klasszikus különbségképzési megközelítés, azaz, hogy a vírus fertőzött növényi kivonat jeléből kivonjuk a referencia növényi kivonatjelét. A minták jelentős mértékű kihígítása, illetve az intenzív mosási lépések szintén nem megfelelőek, mivel jelentősen csökkentik az érzékenységet. Ezért egy másik megközelítést alkalmaztam, ami azon alapul, hogy az elektrosztatikus kölcsönhatás a fő okozója a nemspecifikus adszorpciónak. Véletlenszerű bázissorrendű DNS szálakból kialakított referencia felületeket alkalmaztam, melyeknek a hossza és felületi borítottsága megegyezik az aptamerekével. Az így kialakított szenzorchip alkalmazásával elvileg nincs szükség standardizált negatív növényi kivonatokra és jelentősen egyszerűsödik az assay. A feltételezés igazolásához a három aptamer szálat és egy véletlenszerű bázissorrendű DNS szálat cseppentettem egy planáris arany SPR szenzorra és vizsgáltam a felületre immobilizált oligonukleotidok és MT32 vírus kapszidfehérjével adalékolt alma levél kivonat közötti kölcsönhatást (39. ábra).
39. ábra MT32 fehérje kalibrációs görbéi alma levél kivonat háttér mellett, három különböző aptamerrel. A görbék korrekciója a referencia DNS felületen mért rezonancia eltolódások kivonásával történt. A mérési adatokat a specifikus kötődés elsőrendű kinetikáját leíró hiperbolikus egyenlettel illesztettem. Az így kapott adatok jó egyezést mutatnak az puffer oldatban végzett mérésekkel. A hosszabb PSA-H-Flank és a rövidebb PSA-H aptamerek válasza alacsony volt, míg az MT32 aptamer a
növekvő MT32
koncentrációval
közel
lineárisan
növekvő
rezonanciaszög eltolódást mutatott. A csökkenő érzékenység a konkurens nem74
specifikus adszorpció hatásának tulajdonítható, ami nyilvánvalóan csökkenti az immobilizált aptamerek kötő kapacitását. 7.1.5 Vírus fertőzött növényi minták mérése A vírus kapszidfehérjék növényi kivonatból történő meghatározására alkalmazott módszert a Bioreba AG-tól származó, kereskedelmi forgalomban kapható ASPV pozitív növényi kivonatokon teszteltem. A három aptamer válaszjelét 500 g/mL összes protein koncentrációjú ASPV fertőzött növényi kivonatok és a negatív kontroll esetén a 7. ábra mutatja. Az aptamer válaszjelekből minden esetben kivontam a véletlenszerű szekvenciával módosított felületen mért jelet. Az eredményekből egyértelműen látszik, hogy HS-PSA-H és HS-MT32 aptamerek alkalmazásával, jelölésmentes detektáláson alapuló módszerrel megkülönböztethető a pozitív és negatív kontroll minta. Mivel a HS-PSA-H-Flank aptamer egyáltalán nem adott válaszjelet, és a legnagyobb rezonancia szög eltolódást az MT32 aptamerrel mértem, feltételezhető, hogy a növényi kivonat csak MT32 proteint tartalmazott, ami a gyártó specifikációjának megfelelően az ASPV jelenlétére utal.
40. ábra
500 g/mL összes protein koncentrációjú, ASPV fertőzött növényi kivonat válaszjele: (a) MT32, (b) HS-PSA-H, (c) HS-PSA-H-Flank aptamerek
Tovább vizsgáltam a jelek koncentráció függését, hogy az eredeti növényi kivonat mekkora hígításáig mérhető az ASPV fertőzöttség. 75
41. ábra (A) HS-MT32 aptamer SPR chip háttér korrigált válaszgörbéje különböző ASPV fertőzött növényi kivonat hígítások esetén. (B) Koncentrációfüggés a három különböző aptamer esetében: (a) HS-MT32, (b) HS-PSA-H, (c) HS-PSA-H-Flank. A 41. ábra tipikus válaszgörbét mutat ASPV fertőzött mintákra, valamint a negatív kontrollra. A várakozásnak megfelelően a minta hígításával az SPR válaszjel csökken, és rendkívül jól megkülönböztethető a negatív kontroll. Míg a PSA-H-Flank aptamer nem adott választ a vizsgált koncentrációtartományban, a HS-MT32 és a HS-PSA-H aptamerek jól elkülöníthető válaszjelet adtak, ami ismét mutatja az APSV fertőzések detektálhatóságát még jelentősen kihígított növényi kivonatokban is. Az SPR jel nagyságát jelentősen befolyásolhatja az, hogy a vírus proteinek különböző formában lehetnek jelen a mintákban. Az ASPV fertőzött növényi kivonatok tartalmazhatnak teljes vírusokat, vírus töredékeket és vírus kapszidfehérjéket. Mivel az SPR érzékenysége függ a felülethez kötődő anyagok formájától, az ASPV kvantitatív meghatározása és standardizálása aligha lehetséges a valós minták megfelelő mintaelőkészítése nélkül, amivel megfelelő tisztaságban és visszanyeréssel kinyerhető a vírus. Ugyanakkor a mintaelőkészítés rendkívül fáradságos és hosszadalmas202, ezért nem tesz eleget a gyors rutin vizsgálatok követelményeinek. Ezért fontos kideríteni, hogy az aptamerek képesek-e felismerni a vírusproteineket akkor is, ha azok egy teljes vírus vagy egy vírus fragmens részei. A viszonylag nagy SPR jel arra utal, hogy esetleg vírus fragmensek is kötődhetnek a felületre immobilizált aptamerekhez. Ennek a feltételezésnek a megerősítéséhez a szenzor felületét téremissziós pásztázó elektron mikroszkóppal (FESEM) vizsgáltuk. Ehhez az MT32 aptamerrel módosított SPR szenzoron ASPV fertőzött mintát inkubáltam (összes protein koncentrációja 693 g/mL) miközben mértem az SPR válaszjelet. A kölcsönhatás után a felületet 5% 76
glutáraldehiddel kezeltem 15 percig, így a fehérjéken található primer amin csoportok összekötésével rögzítettem a vírust a felületen. Ezután kivettem az SPR műszerből a szenzort és SEM kontraszt növelése érdekében 1% cink-uranil-acetát oldatot helyeztem rá 1 percig.
42. ábra Tipikus pásztázó elektronmikroszkópiás felvételek: (A) aptamer nélküli referencia felület és (B) HS-MT32 aptamer módosított felület ASPV fertőzött növényi kivonattal történő inkubálást követően. Glutáraldehiddel történő rögzítést és negatív festést alkalmaztam a felülethez kötődő vírus részek megjelenítéséhez. A méretvonalak 500 nm-esek. A 42. ábra egy aptamerrel módosított és egy TEG-SH védett felületet mutat. A hosszúkás vírustöredékek202 (2,2×107 db/cm2) tisztán láthatók az aptamerrel módosított felületeken, míg az aptamerrel nem módosított felületről készített felvételeken nem voltak láthatók. Annak ellenőrzésére, hogy az MT32 aptamer különbséget tud-e tenni különböző vírusok által fertőzött növényi minták között, ASPV-vel, alma mozaik vírussal (apple mosaic ilarvirus – APMV) és alma klorotikus levélfoltosság vírussal (apple chlorotic leaf spot trichovirus – ACLSV) fertőzött növényi mintákat vizsgáltam HS-MT32 aptamerrel módosított
SPR
szenzor
chipen.
Referencia
oligonukleotidként
a
felismerő
oligonukleotid szállal megegyező hosszúságú, 3’ végén „tiol-(CH2)6-” módosítással ellátott 44mer poli-T (HS-T44) szálakat alkalmaztam, mellyel nyomon követhető a nemspecifikus kötődés. A kétmintás t-próba nem mutatott ki szignifikáns különbséget az MT32 aptamer és az HS-T44 referencia oligonukleotidon mért rezonanciaszög eltolódások között (p = 0,05 szignifikancia szint mellett) az APMV és az ACLSV vírussal fertőzött minták esetében. Ezzel szemben az ASPV fertőzött mintánál kb. ötször nagyobb rezonanciaszög eltolódást mértünk az aptamerrel módosított felületen az HS-T44-vel 77
módosított felülethez képest. (43. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az MT32 aptamer képes különbséget tenni különböző vírusok között.
43. ábra Felületi plazmon rezonanciás válaszok ASPV, APMV és ACLSV fertőzött növényi kivonatokra. A rezonancia szög eltolódást MT32 aptameren (a) és HS-T44 referencia felületen (b) mértem 100 g/mL összprotein koncentrációnál
7.2 Erősített lumineszcenciás távolságmodulált homogén assay (ALPHA) aptamer-fehérje kölcsönhatások jellemzésére A vírus fehérje-aptamer kölcsönhatások jellemzésére kidolgoztam egy erősített lumineszcenciás távolságmodulált homogén mérési módszert, amivel megerősítettem az iSPR-rel
mért
KD értékeket.
Ennek
a
módszernek
az
alkalmazása
később
leegyszerűsítheti a megfelelő tulajdonságokkal rendelkező aptamer kiválasztását az aptamerjelölt szekvenciák közül a szelekciót követően. Az aptamer-fehérje kölcsönhatások jellemzéséhez a vírus kapszid fehérjéket 6×His módosítással állítottuk elő, mivel ez kevésbé befolyásolja a fehérje tulajdonságait. Ugyanebből a megfontolásból az aptamereket biotin módosítással szintetizáltattuk, ami tetraetilén-glikol távtartón kapcsolódik a DNS szálak 3’ végéhez. Ennek megfelelően az assay-hez streptavidin donor és Ni2+ kelát akceptor ágyakat választottunk (44. ábra).
78
f 44. ábra Aptamer-fehérje kölcsönhatás jellemzése ALPHA módszerrel. A rekombináns PSA-H fehérjét (c) 6×His jelöléssel állítottuk elő, a fehérje specifikus aptamert pedig biotinnal jelöltük, így ezek hozzákötődhetnek a Ni2+ kelát akceptor (e), illetve streptavidin donor (d) gyöngyökre. Az aptamer-fehérje kölcsönhatás hatására a két gyöngy közel kerül egymáshoz és a donor által, a gerjesztő fénnyel történő besugárzáskor kibocsátott szingulett állapotú oxigén az akceptor gyöngyön lumineszcenciát okoz. (A) Telítési assay során a Kd érték meghatározásához az aptamer koncentrációját állandó értéken tartottam, miközben a fehérje koncentrációját változtattam. (B) Kompetitív assay esetében a rekombináns protein és a jelölt aptamer koncentrációját állandó értéken tartottam, és a jelöletlen aptamer (a) mennyiségét módosítottam. Az aptamerek egyik előnye az antitestekkel szemben, hogy szinte tetszőleges puffer környezetben szelektálhatók, azonban affinitásuk megőrzéséhez mindenképpen a szelekciós puffert célszerű alkalmazni. Az ALPHA assay ebből a szempontból jól alkalmazható aptamerek jellemzésére, mivel általában nem befolyásolja működését a puffer összetétele, amiben számos ion jelen lehet és a működési pH tartomány is megfelelően széles (pH 2,5-9). Az ALPHA assay méréseket az MT32 és PSA-H aptamerek szelekciós pufferében (PBS, pH 7.4) végeztem. Az assay alkalmazása során meglepően magasnak bizonyult a háttérjel. Ezt a háttérjelet nem magyarázza a gyöngyök koncentrációja, hiszen túl kicsi ahhoz, hogy az átlagos távolság közöttük akár megközelítse a 400 nm-t. Ezért a gyöngyök közötti nem specifikus kölcsönhatást tartottuk valószínűnek, amit általában a felületek blokkolásával lehet csökkenteni. Protein kölcsönhatások tanulmányozásakor gyakran alkalmaznak proteineket (pl. BSA-t) és polimereket (pl. PEG-et) a háttérjel csökkentéséhez. Ezért vizsgáltam a BSA hatását a reakcióelegy háttér lumineszcenciájára: aptamerrel borított 79
donor és nem módosított Ni2+ akceptor gyöngyök, nem módosított donor és fehérjével borított Ni2+ akceptor gyöngyök, valamint módosítatlan donor és akceptor gyöngyök esetén. Az eredmények azt mutatják, hogy a pufferben található BSA hatására a háttér lumineszcencia drámaian csökkent minden esetben (45. ábra).
45. ábra Háttér lumineszcencia értékek különböző assay konfigurációk esetében. Az akceptor és donor ágyakat biotinilált aptamerrel, illetve 6×His jelölt proteinnel, vagy ezek nélkül inkubáltuk. A háttér jel drámaian csökkent a pufferben található 1 mg/mL koncentrációjú BSA hatására. A BSA optimális koncentrációjának meghatározását követően (46. ábra) a méréseket 1 mg/mL BSA tartalmú pufferben végeztem, amely tulajdonképpen az általunk alkalmazott legnagyobb BSA koncentrációnak felelt meg. Ezzel a háttér kielégítően kicsi volt, így a BSA koncentrációját nem érte meg tovább növelni.
80
46. ábra A háttér puffer optimális BSA tartalmának meghatározása. Az akceptor és donor gyöngyöket biotinilált aptamerrel inkubáltam különböző BSA koncentrációjú pufferben. Az ábrán látszik, hogy 1 mg/mL koncentrációjú BSA oldat hatására a háttér lumineszcencia drámaian lecsökken. Minden ALPHA gyöngy karakterisztikus kötőkapacitással rendelkezik, ami azt mutatja meg, hogy milyen koncentrációjú célmolekula hatására telítődik a gyöngy felülete. A maximális jelet akkor kapjuk, ha mindkét gyöngy telített a célmolekulával. A célmolekula koncentrációjának további növelése csökkenti a lumineszcencia jelet („hook” effektus), mivel ekkor már a feleslegben lévő, szabad célmolekulák versengenek a gyöngyhöz kötött célmolekulákkal (47. ábra).
47. ábra (A) alacsony analát koncentráció, a háttérnél magasabb jel (B) optimális analát koncentráció, maximális jel, (C) „hook” effektus: a feleslegben lévő, szabad analát verseng a gyöngyhöz kötött analáttal, csökkenő jel. A 25 µL-es reakciótérfogatban a donor és akceptor gyöngyök koncentrációja 2020 µg/mL volt. A streptavidin donor gyöngy egyensúlyi kötőkapacitása 30 nM, míg a Ni2+ 81
kelát akceptor gyöngyé 300 nM-1 µM. Az akceptor gyöngy kötőkapacitása sokkal nagyobb, mint a különböző ASPV kapszid fehérjére szelektív aptamerek esetén SPR technikával meghatározott Kd értékek (8-83 nM), ezért csak a streptavidin donor gyöngy kötőkapacitását ellenőriztük, hogy elkerüljük a „hook” effektust. Ehhez a telítési assay-t változó biotinilált aptamer- és állandó PSA-H koncentráció mellett végeztem. Az aptamert és a fehérjét az optimalizált pufferben inkubáltam, majd egyszerre hozzáadtam a
donor és
akceptor
gyöngyöket.
Ismételt
inkubációt követően
mértem a
lumineszcenciát. A legnagyobb jelet 12,5 nM-os aptamer koncentrációnál mértem (48. ábra).
48. ábra Streptavidin donor gyöngy telítési assay. Különböző koncentrációjú biotinilált aptamert inkubáltam állandó koncentrációjú proteint tartalmazó pufferben. Ezután a keverékhez megegyező mennyiségű donor és akceptor gyöngyöt adtam és ismét inkubáltam. A maximális lumineszcenciát 12,5 nM-os biotinilált aptamer koncentrációnál kaptam, ami a 25 µL reakcióelegyben található 20 µg/mL koncentrációjú donor gyöngy kötőkapacitására utal. A puffer optimalizálása, majd a donor gyöngy kötőkapacitásának meghatározása után vizsgáltam az ASPV kapszid fehérje specifikus aptamerek Kd értékeit. Először telítési assay-vel határoztam meg a Kd értékeket, amikor állandó aptamer és változó fehérje koncentráció mellett mértem a lumineszcenciát (49. ábra). A kísérleti adatokra a [10] egyenletet illesztettem, ami az 1:1-es sztöchiometriából adódik, és számításba veszi, hogy a kisebb koncentrációk esetén a szabad célmolekula egyensúlyi koncentrációja jelentősen eltérhet a bemérési célmolekula koncentrációtól.58,227
82
(
)
√(
)
[10]
, ahol B és Bmax a kötött célmolekulával arányos jel és a maximális jel, CA és CT az összes aptamer és célfehérje koncentrációja. A PSA-H aptamer esetében az így kapott Kd érték 5,3±3,9 nM, az MT32 aptamer esetében pedig 70,5±28,0 nM. Ezek az eredmények jó egyezést mutatnak az SPR-rel megállapított adatokkal: 8 nM (PSA-H aptamer) és 83 nM (MT32 aptamer).
49. ábra PSA-H fehérje kölcsönhatás telítési görbéje MT32 (▪ ) és PSA-H (•) aptamerekkel. A mérési adatokra a [10] egyenletet illesztettem, ami a PSA-H aptamer esetében 5,3±3,9 nM, az MT32 aptamer esetében 70,5±28,0 nM Kd értéket adott Az ALPHA és az SPR technikával kapott eredmények annak ellenére hasonlóak, hogy az SPR esetében a fehérje szabadon, oldatban található, az ALPHA technikánál azonban gyöngyhöz van rögzítve. Ez logikusnak tűnik abból a szempontból, hogy az aptamer mindkét esetben 3’ végén található tiolon keresztül van immobilizálva, a fehérje pedig a 6×His jelölésen keresztül, orientáltan van a gyöngyhöz kötve az ALPHA technikánál. Kompetitív assay-vel is ellenőriztem az aptamer-fehérje kölcsönhatás Kd értékét. A kompetitív assay esetében a fehérje és a biotinnal módosított aptamer mennyiségét állandó értéken tartva (rendre 3 nM és 15 nM) változtattam a biotinnal nem módosított aptamer mennyiségét (50. ábra). A kompetitív assay kísérleti adataira az alábbi homológ kompetitív modellt illesztettem. Ez a modell feltételezi, hogy a biotinnal módosított és a módosítás nélküli aptamerek affinitása megegyezik a célfehérjéhez:
(
)
[11]
83
, ahol a B és Bmax a kötött célmolekulával arányos jel és a maximális jel, CA és CAL a módosítás nélküli aptamer és biotinnal módosított aptamer koncentrációja, NS pedig a nem-specifikus kötődés mértéke. A kompetitív assay-vel meghatározott 28,4±16,6 nM Kd érték kissé nagyobb, mint az SPR mérések során meghatározott érték, azonban kétmintás
t-próbát
alkalmazva
95%-os
konfidenciaszinten
nem
különböznek
szignifikánsan az értékek.
50. ábra Kompetitív assay PSA-H aptamerrel. A kísérleti adatok homológ kompetitív modellel ([10] egyenlet) történő illesztéséből a Kd érték 28,4±16.6 nM-nak adódott Bár mind telítési, mind kompetitív assay-vel visszakaptuk az SPR-el megállapított affinitás értékeket, a kompetitív assay elsősorban jelentősen kisebb affinitású kölcsönhatások mérésére alkalmas.
7.3 Fehérjék szelektív, jelölésmentes detektálása mikromintázott, felületi lenyomatot tartalmazó mesterséges receptorokkal Mivel az SPR egy felületérzékeny analitikai módszer, a molekuláris lenyomatú polimer (MIP) kötőhelyeinek az evaneszcens hullám behatolási mélységében kell lenniük,
azaz
az
alkalmazott
fényforrás
hullámhosszától
és
a
dielektrikum
tulajdonságaitól függően néhány száz nanométeren belül a szenzor felületétől. Kis molekulatömegű anyagok esetén a MIP filmek alkalmazása az SPR technikában kevésbé kritikus, hiszen ezek a molekulák be tudnak jutni diffúzióval a MIP rétegbe és akkor is adnak jelet, ha a réteg vastagsága meghaladja az SPR érzékelési zónáját. Azonban a biomakromolekulák diffúziója gátolt a polimerben. Annak érdekében, hogy a biomakromolekulák számára elérhetőek legyenek a felületi lenyomatú polimer (SIP) mikromintázat SPR érzékelési zónájába eső kötőhelyei, az általános vékonyfilm stratégiával szemben egy újszerű megközelítést alkalmaztunk. 84
51. ábra A molekuláris lenyomatú polimer mikrobarázdák létrehozása során a felületi lenyomatképzés folyamatának sematikus ábrája (a-f, felül), és a megfelelő mikrostruktúrák optikai mikroszkópos képei (a-c, e,f, alul). A (d) ábrán a PC mikrobarázdákon a protein abszorpciót fluoreszcensen jelölt proteinnel (avidinfluoreszcein izotiocianát – Av-FITC) és epifluoreszcens képalkotással jelenítettük meg. A 51. ábra mutatja a molekuláris lenyomatképzés sematikus ábráját, ami fotolitográfiás eljárással létrehozott mintázatképzésen alapul, és csak a PEDOT/PSS barázdák függőleges falain, azaz a szenzor chip felületére merőlegesen elhelyezkedő kötőhelyeket hoz létre. Mivel az avidin nagyon kis mértékben adszorbeálódott közvetlenül a fotolakkon, egy kiegészítő lépést iktattunk közbe, mely során egy olyan áldozati anyagot választottunk le a felületre, amelyen nagymértékű a protein adszorpciója. A polikarbonát (PC) megfelelőnek bizonyult az avidin adszorpciójához228, aminek a telítés esetén a felületi borítottsága 8,8 pmol/cm2. A felületi borítottság megállapításához kvarckristály mikromérleget (QCM) alkalmaztunk. A QCM szenzor felületére „spin coating” eljárással ugyanúgy PC bevonatot képeztünk, mint a felületi lenyomatú polimerrel módosított SPR chip esetén. 85
52. ábra Az avidin adszorpciós izotermája polikarbonát felületen. A felületre adszorbeálódott protein mennyiségét a Sauerbrey egyenlettel ([1]) számítottuk ki egy polikarbontáttal borított kvarckristályon az avidin adszorpciója során, kvarckristály mikromérleggel (QCM) mért rezonancia frekvencia eltolódásból. Ez közel megegyezik az avidin 20 nm2-es elméleti molekula keresztmetszetéből229 számított szorosan rendezett avidin rétegnek megfelelő 8,3 pmol/cm2-es értéknek. Immunoglobulinok (IgG) esetében is hasonlóan nagy adszorpciót mértünk, ami azt sugallja, hogy a polikarbonát általánosan használható nagymennyiségű templát fehérje adszorpciójához. A polikarbonát barázdák leválasztását és az AZ-fotolakk eltávolítását követően, avidint adszorbeáltattunk 1 mg/mL koncentrációjú oldatból a felületre. Az adszorpciós izoterma szerint (52. ábra) ebben a koncentrációban a felületi borítottság eléri a telítési értékét, ami előnyös az ezután létrehozandó PEDOT/PSS barázdákban kialakuló kötőhelyek mennyiségének maximalizálása szempontjából. Felületi plazmon rezonanciánál, 840 nm hullámhosszúságú gerjesztő fénysugár esetén az evaneszcens hullám behatolási mélysége kevesebb, mint 400 nm. Ezért a polimer barázdák arany felülettől számítva 200-300 nm-nél távolabbi részeinek szerepe a jelképzésben minimális (53. ábra), különösen annak fényében, hogy az SPR reflexiós görbék szélesedése és a rezonancia szög eltolódása arra utal, hogy a PEDOT/PSS egy nagymértékben adszorbeáló dielektrikum.230 Így az SPR elsősorban a felületi lenyomatú polimer függőleges falain bekövetkező kötődést fogja mérni az SPR. Annak érdekében, hogy az SPR jel kizárólag a protein felületi lenyomatú polimerhez történő bekötődéséből származzon, az arany felületet a polikarbonát réteg eltávolítását követően TEG-SH tiollal módosítottam, ami rendkívül jól ellenáll a proteinek nem specifikus adszorpciójának.
86
53. ábra Keresztmetszeti elektronmikroszkópiás felvételek. (A) polikarbonát (PC) és PEDOT/PSS barázdák, (B) felületi lenyomatú PEDOT/PSS barázdák a PC eltávolítását követően. A nyíl a PC és a PEDOT/PSS közötti határfelületre mutat, ahol a lenyomatképzés történik. Az avidin felületi lenyomatú PEDOT/PSS barázdákon az avidin kötőhelyek jelenlétének ellenőrzéséhez avidin-fluoreszcein izotiocianáttal (Av-FITC) végeztünk el egy kötődési assay-t, majd epifluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk a felületet. A felületi lenyomatú mikrostruktúrával (SIP) ellátott chipeket különböző koncentrációjú Av-FITC oldattal inkubáltuk 15 percen keresztül, majd alaposan leöblítettük 0,05% Tween 20 tartalmú foszfát pufferrel (0,05 M, pH 7,0). Negatív kontrolként a polimerizáció során a célfehérje nélkül polimerizált, a felületi lenyomatot nem tartalmazó mikrostruktúrával (NIP) ellátott chipet használtunk. A NIP felülettel szemben a SIP mikromintázaton fluoreszcenciás vonalak láthatók (54. ábra), melyek egybeesnek felületi lenyomatot tartalmazó PEDOT/PSS barázdák függőleges falaival.
54. ábra Felületi lenyomatot tartalmazó (SIP) és felületi lenyomatot nem tartalmazó (NIP) PEDOT/PSS mikrostruktúrák különböző avidin-FITC koncentrációknál készített epifluoreszceciás felvételei A szelektív avidin-FITC bekötődésből származó karakterisztikus fluoreszcenciás csíkok a 10-4 mg/mL
koncentrációtól
láthatók.
0,1 mg/mL-t
meghaladó
avidin-FITC
koncentrációk esetén mind a NIP, mind a SIP felületeken jól látható a nem-specifikus 87
adszorpció jele, ami a polimer barázdák tetejéhez nem specifikusan kötődő avidin-FITCtől származik (55. ábra). A nem-specifikus adszorpció jól megfigyelhető, mivel a polimer barázdák teljes felületén egyenletesen jelentkezik.
55. ábra A felületi lenyomatot tartalmazó (a) és a felületi lenyomatot nem tartalmazó (b) PEDOt/PSS mikromintázat fluoreszcencia intenzitása az avidin-FITC koncentrációjának függvényében, 1-5 mg/mL és 1 mg/mL koncentrációtartományban. 7.3.1 A felületi lenyomatú polimerek kötődési tulajdonságainak vizsgálata SPR technikával A mikromintázott polimer chipekkel az SPR méréseket általában az 56. ábra szerinti elrendezésben végeztem. A szenzorchipen SIP és NIP struktúrákat is kialakítottunk, hogy egyszerre lehessen nyomonkövetni a kétféle felületen a kötődéseket. A chipek közötti reprodukálhatóság a telítési rezonancia szög változások (1 mg/mL) relatív szórása alapján 11% volt. A SIP barázdák nagy sűrűsége miatt az SPR szög változását egyszerűen egy 210 m × 210 m-es területen mértem, ami az adott területre vonatkoztatott átlag rezonancia szög eltolódást adja. Ez pont az ellenkezője a fluoreszcencia méréseknek, ahol az egyes SIP területeket ki kellett választani a nagyfelbontású képeken a megfelelő érzékenység és a nem specifikus hatások minimalizálása miatt.
88
56. ábra A mikromintázott chip SPR képe. Az (A) és (B) területek különböző tulajdonságú felületeket jelölnek, jellemzően a felületi lenyomatot tartalmazó és a felületi lenyomatot nem tartalmazó polimer mikromintázatokat. A kisebb, piros négyzetek az SPR mérési területeket jelzik. A szenzor regenerálása nélkül, egyre nagyobb fehérje koncentrációkkal mért, additív kalibrációs görbe (57. ábra) egyértelműen mutatja a felületi lenyomatképzés hatását avidinnal történő kötődéskor a NIP felülethez képest. A legnagyobb vizsgált avidin koncentrációban a NIP mikrostruktúrák válaszjele megközelítőleg egy nagyságrenddel alacsonyabb volt, mint a SIP felületek esetében, ami azt jelenti, hogy a lenyomatképzési faktor az egyik legmagasabb a publikált protein-MIP-ek között. A fluoreszcens mérések során csak kétszeres volt ez a tényező a SIP és NIP felületek között. Ennek a legvalószínűbb oka a nem-specifikus kölcsönhatás sokkal kisebb részvétele a teljes SPR jelben a fluoreszcens mérésekhez képest. Itt a polimer nem imprintelt, felső felületére adszorbeált avidin nem detektálható, és ezáltal nem növeli a háttérjelet mint ahogy azt a fluoreszcens mérés során tapasztaltuk. Az adatokat az alábbi, specifikus kölcsönhatást leíró hiperbolikus függvénnyel illesztettem ([12] egyenlet). [12] , ahol a
az avidin koncentrációja az oldatban,
és
a bekötött protein
mennyiséghez és a telítési protein mennyiséghez tartozó jel aránya. Ahogy korábbi tanulmányokban145,174, az egyszerű egykötőhelyes modell most is jól illeszkedik a kísérleti adatokra (R2 = 0.94, Bmax = 392,0). A számításokból a
értéke 125 nM, ami
valamivel jobb, mint egy korábbi munkában, felületi lenyomatú PEDOT/PSS mikrorudak 89
esetén közölt érték (394 nM)228 és a NIP felületre számított értéknél is több mint tízszer kisebb (1,4 M).
57. ábra (A) avidin-SIP (a) és NIP (b) felületeken mért SPR szenzorgramok egymást követő, növekvő avidin koncentrációk esetén; (B) a kumulatív kalibrációs görbe 4 paraméteres logisztikus függvénnyel illesztve A SIP szelektivitását avidin származékokkal, streptavidinnal (ST), NeutrAvidinnal (NA) és ExtrAvidinnal (EA) vizsgáltam, valamint olyan fehérjékkel, melyek szintén magas izoelektromos ponttal (pI) rendelkeznek, például a lizozimmal (Lys, pI 11,35) (58. ábra). Egy jelentősen kisebb pI értékű (4,7), de közel azonos molekulatömegű fehérjét, BSA-t is vizsgáltam. A NIP felületek alacsonyabb válaszjelet adtak a vizsgált fehérjék esetén, mint az avidin-SIP felületek, ami a natív PEDOT/PSS felületek alacsonyabb fehérje adszorpciója miatt volt. A vártnak megfelelően a SIP felületen a legnagyobb válaszjelet az avidin adta, majd az ExtrAvidin, NeutrAvidin és streptavidin következett (58. ábra). Úgy tűnik, hogy az avidin homológokon belül az SPR válaszjel nagysága az avidinnal való szerkezeti hasonlósággal van összefüggésben, mivel sem a pI értékük, sem a molekulatömegük nem tér el jelentősen egymástól. Az ExtrAvidin és NautrAvidin közel semleges töltésűek, az avidin deglikozilált formái. A NetrAvidin ráadásul módosított argininekkel rendelkezik. A streptavidin a Streptomyces avidinii baktérumból származik, enyhén savas pI értékkel rendelkezik és csak 33%-os aminosav egyezést mutat az avidinnal. Ennek megfelelően az SPR jel az avidin, ExtrAvidin, NeutrAvidin sorrendben csökken, míg a streptavidin és BSA gyakorlatilag nem ad jelet. Ez alátámasztani látszik a több, kis erősségű kötést, ami a fehérjék és MIP-ek között kialakulnak.
90
58. ábra
Avidin-SIP (a) és NIP (b) felületek válaszjelei különböző proteinek 102 mg/mL koncentrációjú oldata esetén
Azonban a lizozimra (Lys) adott válaszjel megegyezett az ExtrAvidinre adott válaszjellel a SIP felületeken. Ez valószínűleg a lizozim jelentős nettó pozitív töltésének (+7, pH = 8) köszönhető, ami arra utal, hogy a SIP-fehérje kölcsönhatásban - hasonlóan az aptamerfehérje kölcsönhatáshoz - jelentős szerepet játszik az elektrosztatikus kölcsönhatás. Fontos megjegyezni, hogy a lizozim nagyobb mértékben kötődik a NIP felületekre, mint az ExtrAvidin, ami arra utal, hogy a PEDOT/PSS anyagon eredendően nagyobb a nem specifikus adszorpciója. Míg általában keveset tudunk a MIP-ek és a célproteinjeik közötti pontos kölcsönhatásokról, a regenerálási kísérletekből következtetni lehet ezeknek a kölcsönhatásoknak a természetére. Ezért az avidin bekötődést követően a felületet olyan anyagokkal kezeltük, melyek képesek megbontani a H-kötéseket (1 mM NaOH, 10 mM gicin-HCl puffer (pH 2,0)), elektrosztatikus kölcsönhatásokat (nagy ionerősségű oldatok, 1 M NaCl) és hidrofób kölcsönhatásokat (1% nátrium-dodecilszulfát). Az SDS-sel és a nagy ionerősségű oldattal történő regenerálás bizonyult hatásosnak, ami arra utal, hogy hidrofób és elektrosztatikus kölcsönhatások játszhatnak szerepet a fehérje-MIP kölcsönhatásban. Azonban itt már figyelembe kell venni, hogy nemcsak a kialakult kötésekre lehet hatással a regeneráló oldat, hanem a polimer film szerkezetére is. A nagy töltéssűrűségű PEDOT/PSS filmek szintén morfológiai átalakuláson mehetnek keresztül nagy ionerősségű oldatokkal való érintkezéskor, ami szintén magyarázná a nagy ionerősségű oldatokkal
történő
regenerálás
hatékonyságát.
Bár elektrokémiai
polimerizációval előállított PEDOT/PSS filmek esetében nem állnak rendelkezésre adatok, nagy ionerősségű oldattal érintkező kémiailag előállított PEDOT/PSS filmek 91
felülete érdesedik, amit atomierő mikroszkópiával (AFM) tanulmányoztak, valamint a PSS kivándorlását és a kismolekulákkal történő kölcsönhatásba lépést UV-Vis-NIR spektroszkópiai adatok bizonyítják.231 Hosszabb távon az SDS oldat befolyásolta a kölcsönhatásokat, ezért 1 M-os NaCl oldatot választottunk a felületregeneráláshoz. A regenerált felület válaszjele (59. ábra, A) ugyan elhanyagolható alapvonal eltolódást mutat, de ebben az esetben valamivel kisebb a lenyomatképzési tényező. Ez arra utal, hogy a koncentrált NaCl oldat befolyásolja a SIP kötőhelyeit. Korábban, lizozim molekuláris lenyomatú polimerekkel kapcsolatban publikálták, hogy a polimerizáció és az visszakötődés
során
a
NaCl koncentráció nagymértékben
befolyásolta
a
szelektivitást.175
59. ábra (A) Az avidin-SIP nem-specifikus adszorpcióval korrigált SPR válaszjele különböző avidin koncentrációk esetén, az egyes koncentrációk között regenerálva a felületet. (B) 4 paraméteres logisztikus függvénnyel illesztett kalibrációs görbe. Az asszociációt növekvő NaCl koncentrációjú pufferben végezve a SIP felülethez kötődő avidin mennyisége jelentősen csökken (60. ábra).
60. ábra
A puffer NaCl tartalmának hatása az avidin asszociációjára avidin-SIP felületeken (a) és NIP felületeken (b) 92
Ez ismét az avidin és a SIP közötti kölcsönhatás elektrosztatikus jellegére utal, szemben az avidin – NIP kölcsönhatással, amit nem befolyásol az ionerősség. Valószínűleg a lenyomatképzés
során
feldúsul a
PSS
a
PEDOT/PSS
polimerben
kialakított
kötőhelyekben. Ez a jelenség megmagyarázná a SIP felületek nagyobb affinitását a nagyobb pI-vel rendelkező fehérjékhez, valamint lizozim nagyobb adszorpcióját a SIP felületekhez, mint a NIP felületekhez. Az avidin és a SIP közötti kölcsönhatás azonban nem tisztán elektrosztatikus jellegű, amire az utal, hogy az avidin és a semleges töltésű extravidin esetén nagyobb válaszjelet kapunk, mint a lizozim estében.
93
8 Összefoglalás Munkám során szintetikus receptorokat, DNS aptamereket és felületi lenyomatú polimereket alkalmaztam fehérjék detektálására. Növényi vírusfehérjék kimutatására olyan originális aptamereket alkalmaztam, amelyeknek már a szelekciója, szintézise során is tudatosan az analitikai célú felhasználásukat tartottuk szem előtt. Megmutattam, hogy kontraszelekcióval lehetőség van olyan aptamerek előállítására, melyek különbséget tudnak tenni növényi vírus fehérjék közeli homológjai között, így specifikusan detektálhatók ASPV vírusfehérjék, sőt maga a növényi vírus is. Képalkotó SPR technikával optimalizáltam a kevert aptamer/TEG-SH önrendeződő monoréteget az optimális kötődési tulajdonságok elérése és a növényi vírussal fertőzött növényi kivonatok elemzése érdekében. Megállapítottam különböző paraméterek: az aptamer flank régiójának, az aptamerek felületi borítottságának és a térkitöltő molekulák hatását az aptamer-fehérje kölcsönhatásra. Rávilágítottam, hogy míg az etilén-glikollal módosított felületek kiváló ellenállást mutatnak proteinek nemspecifikus adszorpciójával szemben akár koncentrált növényi kivonatok esetén is, keverésük aptamerekkel növeli a nem-specifikus adszorpció mértékét. Ezt a negatívan töltött aptamerek és a magas pI értékkel rendelkező proteinek közötti fellépő, az irodalomban korábban nem említett elektrosztatikus kölcsönhatások okozzák. Ezeket a kölcsönhatásokat szem előtt kell tartani az aptamer alapú szenzor chipek alkalmazásánál összetett, például növényi minták esetében. A nem-specifikus kölcsönhatás által okozott SPR jel eliminálásához bevezettem egy, az aptamerrel megegyező hosszúságú, de véletlenszerű szekvenciájú referencia DNS-t alkalmazó módszert. A növényi vírusfehérje aptamerek és a növényi vírusfehérjék közötti kölcsönhatás jellemzésére először alkalmaztam nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens méréstechnikát (ALPHA). Ez a módszer később leegyszerűsítheti a megfelelő tulajdonságokkal rendelkező aptamer kiválasztását az aptamer jelölt szekvenciák közül az aptamer szelekciót követően.
94
Egy új megközelítést alkalmaztam fehérjék felismerésére alkalmas felületi lenyomatú polimerek (SIP) előállítására. A technológia fő előnye, hogy a felületi lenyomatú polimerek fotólitográfiás eljárással hozhatók létre közvetlenül SPR szenzor felületén, ami lehetővé teszi a visszakötődés jelölésmentes detektálását és előrevetíti a rutinszerű tömeggyártás lehetőségét. A PEDOT/PSS mikromintázat strukturális komplexitása ellenére a fehérjékkel történő kölcsönhatás a képalkotó SPR-rel a fluoreszcenciás képalkotásnál nagyobb érzékenységgel volt mérhető. A lenyomatképzési faktor körülbelül 10-szeres volt, a disszociációs egyensúlyi állandó pedig szubmikromoláros tartományba esett, így a fehérje molekuláris lenyomatot tartalmazó PEDOT/PSS az egyik legjobb az eddig publikált felületi lenyomatú polimerek között. Az avidin lenyomatot tartalmazó PEDOT/PSS mikrostruktúra különbséget tudott tenni még közeli avidin homológok között is. A SIP avidinkötő képességének ionerősség függéséből és a lizozimmal szemben mutatott kisebb szelektivitásból arra lehet következtetni, hogy a kölcsönhatás főként elektrosztatikus erőkre vezethető vissza, de nem kizárólag ez felelős az avidin szelektív felismeréséért.
95
9 Tézisek 1.
Originális DNS aptamereken alapuló felületi plazmon rezonanciás (SPR) chipeket fejlesztettem ki alma törzsgöndörödés vírus (Apple Stem Pitting Virus - ASPV) kapszidfehérjék szelektív meghatározására. Képalkotó felületi plazmon rezonanciás (SPRi) méréstechnikával meghatároztam az aptamerek optimális immobilizálási paramétereit planáris arany szenzorchipen. Azonosítottam és meghatároztam több olyan tényező hatását, amely az aptamer érzékelők szelektivitását befolyásolja: (a) az aptamer variábilis részét közrefogó primer régiók jelenléte, (b) az aptamerek felületi borítottsága, (c) térkitöltő molekulák, és (d) az aptamerek elektrosztatikus kölcsönhatása a mintamátrixszal.P1
2.
Megmutattam, hogy originális, kontraszelektált aptamereket felhasználva, optimalizált SPRi szenzorchipekkel szelektíven detektálható az alma törzsgöndörödés vírus (Apple Stem Pitting Virus - ASPV) két módosulatának kapszidfehérjéje. Megfelelő referencia felületet alkalmazva jelölésmentesen kimutattam ASPV fertőzött növényi kivonatban a vírus jelenlétét. A módszer szelektívnek bizonyult alma mozaik vírussal (Apple Mosaic Virus – APMV) és alma klorotikus levélfoltosság vírussal (Apple chlorotic leaf spot virus - ACLSV) szemben is. P1, P2
3.
Fehérje-DNS aptamer közötti kölcsönhatás jellemzésére először alkalmaztam az ALPHA (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens módszert és bizonyítottam a módszer alkalmasságát az ilyen jellegű kölcsönhatások disszociációs egyensúlyi állandóinak meghatározására.P4
4.
Fotolitográfiás eljáráson alapuló módszert dolgoztam ki fehérjék felismerésére alkalmas mikromintázott molekuláris lenyomatú polimerek előállítására közvetlenül SPR chipek felületén. A kiválasztott avidin modellfehérje alkalmazásával bizonyítottam, hogy ez a módszer kiválóan használható szelektív fehérje meghatározására alkalmas felületi lenyomatú polimerek előállítására és az így előállított SPR érzékelők lehetőséget nyújtanak a fehérje bekötődés valós idejű, jelölésmentes nyomonkövetésére.P3
96
10 Novel scientific results 1. I have developed surface plasmon resonance (SPR) sensor chips based on original DNA aptamers for selective detection of apple stem pitting virus (ASPV) coat proteins. Using surface plasmon resonance imaging (SPRi) technique I have optimized the immobilization parameters of aptamers on planar gold sensor chips. I have identified and determined the effect of several parameters influencing the selectivity of aptamer based SPR sensors: (a) the presence of primer regions, (b) the aptamer surface density, (c) the spacer molecules, (d) the electrostatic interaction of aptamers with the sample matrix.P1 2. I have shown that by using original counter-selected aptamers the two forms of apple stem pitting virus (ASPV) coat protein can be selectively detected. Using an appropriate reference surface I have developed a label-free method to detect the ASPV virus in infected plant extracts. This method proved to be selective against other plant viruses (apple mosaic virus - APMV, apple chlorotic leafspot virus - ACLSV). P1, P2 3. I have reported the first application of ALPHA (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) for the characterization of DNA aptamerprotein interactions and demonstrated its suitability for determining the equilibrium dissociation constants of the interactions. P4 4. I have developed a novel method based on standard photolitographic technology for in-situ preparation of micropatterned surface imprinted polymer based SPR sensors. Using avidin as model protein target I have shown that this method provides excellent means for the preparation of selective surface imprinted polymers (SIPs) for proteins and that the respective SIPbased SPR chips are suitable for label-free real time monitoring of protein binding interactions.P3
97
11 Saját tudományos közlemények listája P1
Lautner, G., Balogh, Z., Bardóczy, V., Mészáros, T., Gyurcsányi, R. E. Aptamerbased biochips for label-free detection of plant virus coat proteins by SPR imaging. Analyst 135, 918-926, (2010). IF: 3,913, idézettség: 16
P2
Balogh, Z., Lautner, G., Bardóczy, V., Komorowska, B., Gyurcsányi, R. E., Mészáros, T., Selection and versatile application of virus-specific aptamers. Faseb Journal 24, (11) 4187-4195, (2010) IF: 6,721, idézettség: 4
P3
Lautner, G., Kaev, J., Reut, J.; Opik, A., Rappich, J., Syritski, V., Gyurcsanyi, R. E. Selective Artificial Receptors Based on Micropatterned Surface-Imprinted Polymers for Label-Free Detection of Proteins by SPR Imaging. Advanced Functional Materials 21, 591-597, (2011). IF: 10,179, idézettség: 7
P4
Lautner, G., Balogh, Z., Gyurkovics, A., Gyurcsányi, R. E., Mészáros, T. Homogeneous assay for evaluation of aptamer-protein interaction. Analyst 137, 3929-3931, (2012), IF(2011): 4,23
98
12 Felhasznált irodalom 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25.
Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990;249:505-10. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 1990;346:818-22. Lee JF, Hesselberth JR, Meyers LA, Ellington AD. Aptamer Database. Nucleic Acids Research 2004;32:D95-D100. Glad M, Norrlöw O, Sellergren B, Siegbahn N, Mosbach K. Use of silane monomers for molecular imprinting and enzyme entrapment in polysiloxane-coated porous silica. Journal of Chromatography A 1985;347:11-23. Kryscio DR, Peppas NA. Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers. Acta Biomaterialia 2012;8:461-73. Stadtherr K, Wolf H, Lindner P. An Aptamer-Based Protein Biochip. Analytical Chemistry 2005;77:3437-43. You M, Chen Y, Peng L, et al. Engineering DNA aptamers for novel analytical and biomedical applications. Chemical Science 2011;2:1003-10. Tombelli S, Minunni M, Mascini M. Analytical applications of aptamers. Biosensors and Bioelectronics 2005;20:2424-34. Montesarchio D. G-quadruplex forming oligonucleotides as finely tunable aptamers: towards better DNA mimics. Nucleic Acids Symposium Series 2008;52:9-10. Hoogsteen K. The crystal and molecular structure of a hydrogen-bonded complex between 1methylthymine and 9-methyladenine. Acta Crystallographica 1963;16:907-16. Campbell NH, Neidle S. G-Quadruplexes and Metal Ions Interplay between Metal Ions and Nucleic Acids. In: Sigel A, Sigel H, Sigel RKO, eds.: Springer Netherlands; 2012:119-34. Simonsson T. G-Quadruplex DNA Structures Variations on a Theme. Biological Chemistry2001:621. Jenison RD, Gill SC, Pardi A, Polisky B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science 1994;263:1425-9. Geiger A, Burgstaller P, Von der Eltz H, Roeder A, Famulok M. RNA aptamers that bind L-arginine with sub-micromolar dissociation constants and high enantioselectivity. Nucleic Acids Research 1996;24:1029-36. Gallop MA, Barrett RW, Dower WJ, Fodor SPA, Gordon EM. Applications of Combinatorial Technologies to Drug Discovery. 1. Background and Peptide Combinatorial Libraries. Journal of Medicinal Chemistry 1994;37:1233-51. Bartel DP, Szostak JW. Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences [see comment]. Science 1993;261:1411-8. Sabeti PC, Unrau PJ, Bartel DP. Accessing rare activities from random RNA sequences: the importance of the length of molecules in the starting pool. Chemistry & Biology 1997;4:76774. Davis JH, Szostak JW. Isolation of high-affinity GTP aptamers from partially structured RNA libraries. Proceedings of the National Academy of Sciences 2002;99:11616-21. Vant-Hull B, Payano-Baez A, Davis RH, Gold L. The mathematics of SELEX against complex targets. Journal of Molecular Biology 1998;278:579-97. Benner SA, Sismour AM. Synthetic biology. Nat Rev Genet 2005;6:533-43. Geyer CR, Battersby TR, Benner SA. Nucleobase Pairing in Expanded Watson-Crick-like Genetic Information Systems. Structure 2003;11:1485-98. Yang Z, Hutter D, Sheng P, Sismour AM, Benner SA. Artificially expanded genetic information system: a new base pair with an alternative hydrogen bonding pattern. Nucleic Acids Research 2006;34:6095-101. Benner SA. Understanding Nucleic Acids Using Synthetic Chemistry. Accounts of Chemical Research 2004;37:784-97. Sismour AM, Lutz S, Park JH, et al. PCR amplification of DNA containing non‐standard base pairs by variants of reverse transcriptase from Human Immunodeficiency Virus‐1. Nucleic Acids Research 2004;32:728-35. Lin Y, Qiu Q, Gill SC, Jayasena SD. Modified RNA sequence pools for in vitro selection. Nucleic Acids Research 1994;22:5229-34.
99
26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51.
Keefe AD, Cload ST. SELEX with modified nucleotides. Current Opinion in Chemical Biology 2008;12:448-56. Sampson T. Aptamers and SELEX: the technology. World Patent Information 2003;25:123-9. Kusser W. Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution. Reviews in Molecular Biotechnology 2000;74:27-38. Eulberg D, Klussmann S. Spiegelmers: Biostable Aptamers. ChemBioChem 2003;4:979-83. Göringer HU, Homann M, Lorger M. In vitro selection of high-affinity nucleic acid ligands to parasite target molecules. International Journal for Parasitology 2003;33:1309-17. Liu J, Stormo GD. Combining SELEX with quantitative assays to rapidly obtain accurate models of protein–DNA interactions. Nucleic Acids Research;33:e141-e. Tombelli S, Minunni M, Luzi E, Mascini M. Aptamer-based biosensors for the detection of HIV-1 Tat protein. Bioelectrochemistry 2005;67:135-41. Stoltenburg R, Reinemann C, Strehlitz B. FluMag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2005;383:83-91. Kikuchi K, Umehara T, Fukuda K, et al. RNA aptamers targeted to domain II of hepatitis C virus IRES that bind to its apical loop region. Journal of Biochemistry 2003;133:263-70. Lupold S, Hicke B, Lin Y, Coffey D. Identification and characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen. Cancer Research 2002;62:4029-33. Murphy MB, Fuller ST, Richardson PM, Doyle SA. An improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detection and purification. Nucleic Acids Research 2003;31:e110-e. Mendonsa S, Bowser M. In vitro selection of high-affinity DNA ligands for human IgE using capillary electrophoresis. Analytical Chemistry 2004;76:5387-92. Mosing RK, Mendonsa SD, Bowser MT. Capillary Electrophoresis-SELEX Selection of Aptamers with Affinity for HIV-1 Reverse Transcriptase. Analytical Chemistry 2005;77:6107-12. Tang J, Xie J, Shao N, Yan Y. The DNA aptamers that specifically recognize ricin toxin are selected by two in vitro selection methods. Electrophoresis 2006;27:1303-11. Beinoravičiūtė-Kellner R, Lipps G, Krauss G. In vitro selection of DNA binding sites for ABF1 protein from Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters 2005;579:4535-40. Shi H, Fan X, Ni Z, Lis JT. Evolutionary dynamics and population control during in vitro selection and amplification with multiple targets. RNA 2002;8:1461-70. Davis K, Abrams B, Lin Y, Jayasena S. Use of a high affinity DNA ligand in flow cytometry (Reprinted from Nucleic Acids Research). Journal of Clinical Ligand Assay 1997;20:90-7. Rhie A, Kirby L, Sayer N, et al. Characterization of 2′-Fluoro-RNA Aptamers That Bind Preferentially to Disease-associated Conformations of Prion Protein and Inhibit Conversion. Journal of Biological Chemistry 2003;278:39697-705. Weiss S, Proske D, Neumann M, et al. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. Journal of Virology 1997;71:8790-7. Bianchini M, Radrizzani M, Brocardo M, Reyes G, Solveyra C, Santa-Coloma T. Specific oligobodies against ERK-2 that recognize both the native and the denatured state of the protein. Journal of Immunological Methods 2001;252:191-7. Theis M, Knorre A, Kellersch B, et al. Discriminatory aptamer reveals serum response element transcription regulated by cytohesin-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004;101:11221-6. FAMULOK M. Molecular recognition of amino-acids by RNA-aptamers - an L-citrulline binding RNA motif and its evolution into an L-arginine binder. Journal of the American Chemical Society 1994;116:1698-706. Bridonneau P, Chang Y, Buvoli V, O'Connell D, Parma D. Site-directed selection of oligonucleotide antagonists by competitive elution. Antisense & Nucleic Acid Drug Development 1999;9:1-11. Bruno JG. In VitroSelection of DNA to Chloroaromatics Using Magnetic Microbead-Based Affinity Separation and Fluorescence Detection. Biochemical and Biophysical Research Communications 1997;234:117-20. Missailidis S, Thomaidou D, Borbas KE, Price MR. Selection of aptamers with high affinity and high specificity against C595, an anti-MUC1 IgG3 monoclonal antibody, for antibody targeting. Journal of Immunological Methods 2005;296:45-62. Stoltenburg R, Reinemann C, Strehlitz B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate highaffinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering 2007;24:381-403.
100
52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79.
Bruno JG, Kiel JL. In vitro selection of DNA aptamers to anthrax spores with electrochemiluminescence detection. Biosensors and Bioelectronics 1999;14:457-64. Fitzwater T, Polisky B. [17] A SELEX primer. In: John NA, ed. Methods in Enzymology: Academic Press; 1996:275-301. Naimuddin M, Kitamura K, Kinoshita Y, et al. Selection-by-function: efficient enrichment of cathepsin E inhibitors from a DNA library. Journal of Molecular Recognition 2007;20:58-68. Wu L, Curran JF. An allosteric synthetic DNA. Nucleic Acids Research 1999;27:1512-6. Hamula CLA, Guthrie JW, Zhang H, Li X-F, Le XC. Selection and analytical applications of aptamers. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2006;25:681-91. Conrad R, Baskerville S, Ellington A. In vitro selection methodologies to probe RNA function and structure. Molecular Diversity 1995;1:69-78. Jing M, Bowser MT. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: A review. Analytica Chimica Acta 2011;686:9-18. Czerwinski JD, Hovan SC, Mascotti DP. Quantitative nonisotopic nitrocellulose filter binding assays: Bacterial manganese superoxide dismutase-DNA interactions. Analytical Biochemistry 2005;336:300-4. Carey J, Cameron V, De Haseth PL, Uhlenbeck OC. Sequence-specific interaction of R17 coat protein with its ribonucleic acid binding site. Biochemistry 1983;22:2601-10. Mendonsa SD, Bowser MT. In Vitro Evolution of Functional DNA Using Capillary Electrophoresis. Journal of the American Chemical Society 2004;126:20-1. Mendonsa SD, Bowser MT. In vitro selection of high-affinity DNA ligands for human IgE using capillary electrophoresis. Analytical Chemistry 2004;76:5387-92. Mendonsa SD, Bowser MT. In vitro selection of aptamers with affinity for neuropeptide Y using capillary electrophoresis. Journal of the American Chemical Society 2005;127:9382-3. Deng Q, German I, Buchanan D, Kennedy RT. Retention and separation of adenosine and analogues by affinity chromatography with an aptamer stationary phase. Analytical Chemistry 2001;73:5415-21. Deng Q, Watson CJ, Kennedy RT. Aptamer affinity chromatography for rapid assay of adenosine in microdialysis samples collected in vivo. Journal of Chromatography A 2003;1005:123-30. Michaud M, Jourdan E, Villet A, Ravel A, Grosset C, Peyrin E. A DNA aptamer as a new targetspecific chiral selector for HPLC. Journal of the American Chemical Society 2003;125:8672-9. Kotia RB, Li L, McGown LB. Separation of nontarget compounds by DNA aptamers. Analytical Chemistry 2000;72:827-31. Connor AC, McGown LB. Aptamer stationary phase for protein capture in affinity capillary chromatography. Journal of Chromatography A 2006;1111:115-9. Zhao Q, Li XF, Le XC. Aptamer-modified monolithic capillary chromatography for protein separation and detection. Analytical Chemistry 2008;80:3915-20. Proudnikov D, Mirzabekov A. Chemical Methods of DNA and RNA Fluorescent Labeling. Nucleic Acids Research 1996;24:4535-42. Gokulrangan G, Unruh JR, Holub DF, Ingram B, Johnson CK, Wilson GS. DNA aptamer-based bioanalysis of IgE by fluorescence anisotropy. Analytical Chemistry 2005;77:1963-70. Müller M, Weigand JE, Weichenrieder O, Suess B. Thermodynamic characterization of an engineered tetracycline-binding riboswitch. Nucleic Acids Research;34:2607-17. Kaur H, Yung LY. Probing High Affinity Sequences of DNA Aptamer against VEGF(165). PLoS One 2012;7:e31196. Navratilova I, Myszka DG. Investigating Biomolecular Interactions and Binding Properties Using SPR Biosensors Surface Plasmon Resonance Based Sensors. In: Homola J, ed.: Springer Berlin Heidelberg; 2006:155-76. Yalow RS, Berson SA. Assay of Plasma Insulin in Human Subjects by Immunological Methods. Nature 1959;184:1648-9. Jayasena SD. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clinical Chemistry 1999;45:1628-50. Gold L, Ayers D, Bertino J, et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS ONE 2010;5:e15004. Tereshko V, Skripkin E, Patel DJ. Encapsulating Streptomycin within a Small 40-mer RNA. Chemistry & biology 2003;10:175-87. Song S, Wang L, Li J, Fan C, Zhao J. Aptamer-based biosensors. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2008;27:108-17.
101
80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105.
Drolet DW, MoonMcDermott L, Romig TS. An enzyme-linked oligonucleotide assay. Nature Biotechnology 1996;14:1021-5. Bock LC, Griffin LC, Latham JA, Vermaas EH, Toole JJ. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 1992;355:564-6. Tasset DM, Kubik MF, Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. Journal of Molecular Biology 1997;272:688-98. Edwards K, Wang Y, Baeumner A. Aptamer sandwich assays: human α-thrombin detection using liposome enhancement. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2010;398:2645-54. Wilson DS, Szostak JW. In vitro selection of functional nucleic acids. Annual Review of Biochemistry 1999;68:611-47. Morgan CL, Newman DJ, Price CP. Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine. Clinical Chemistry 1996;42:193-209. Herne TM, Tarlov MJ. Characterization of DNA Probes Immobilized on Gold Surfaces. Journal of the American Chemical Society 1997;119:8916-20. Maskos U, Southern EM. Oligonucleotide hybridisations on glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridisation properties of oligonucleotides synthesised in situ. Nucleic Acids Research 1992;20:1679-84. Timofeev EN, Kochetkova SV, Mirzabekov AD, Florentiev VL. Regioselective Immobilization of Short Oligonucleotides to Acrylic Copolymer Gels. Nucleic Acids Research 1996;24:3142-8. Mir M, Vreeke M, Katakis I. Different strategies to develop an electrochemical thrombin aptasensor. Electrochemistry Communications 2006;8:505-11. Ikebukuro K, Kiyohara C, Sode K. Electrochemical Detection of Protein Using a Double Aptamer Sandwich. Analytical Letters 2004;37:2901-9. Xiao Y, Lubin AA, Heeger AJ, Plaxco KW. Label-Free Electronic Detection of Thrombin in Blood Serum by Using an Aptamer-Based Sensor. Angewandte Chemie 2005;117:5592-5. Xiao Y, Piorek BD, Plaxco KW, Heeger AJ. A Reagentless Signal-On Architecture for Electronic, Aptamer-Based Sensors via Target-Induced Strand Displacement. Journal of the American Chemical Society 2005;127:17990-1. Sánchez JLA, Baldrich E, Radi AE-G, et al. Electronic ‘Off-On’ Molecular Switch for Rapid Detection of Thrombin. Electroanalysis 2006;18:1957-62. Bang GS, Cho S, Kim B-G. A novel electrochemical detection method for aptamer biosensors. Biosensors and Bioelectronics 2005;21:863-70. Lai RY, Plaxco KW, Heeger AJ. Aptamer-Based Electrochemical Detection of Picomolar PlateletDerived Growth Factor Directly in Blood Serum. Analytical Chemistry 2006;79:229-33. Radi A-E, Acero Sánchez JL, Baldrich E, O'Sullivan CK. Reagentless, Reusable, Ultrasensitive Electrochemical Molecular Beacon Aptasensor. Journal of the American Chemical Society 2005;128:117-24. Radi A-E, O'Sullivan CK. Aptamer conformational switch as sensitive electrochemical biosensor for potassium ion recognition. Chemical Communications 2006:3432-4. Zuo X, Song S, Zhang J, Pan D, Wang L, Fan C. A Target-Responsive Electrochemical Aptamer Switch (TREAS) for Reagentless Detection of Nanomolar ATP. Journal of the American Chemical Society 2007;129:1042-3. Le Floch F, Ho HA, Leclerc M. Label-Free Electrochemical Detection of Protein Based on a Ferrocene-Bearing Cationic Polythiophene and Aptamer. Analytical Chemistry 2006;78:4727-31. Cheng AKH, Ge B, Yu H-Z. Aptamer-Based Biosensors for Label-Free Voltammetric Detection of Lysozyme. Analytical Chemistry 2007;79:5158-64. So H-M, Won K, Kim YH, et al. Single-Walled Carbon Nanotube Biosensors Using Aptamers as Molecular Recognition Elements. Journal of the American Chemical Society 2005;127:11906-7. Maehashi K, Katsura T, Kerman K, Takamura Y, Matsumoto K, Tamiya E. Label-Free Protein Biosensor Based on Aptamer-Modified Carbon Nanotube Field-Effect Transistors. Analytical Chemistry 2006;79:782-7. Ikebukuro K, Kiyohara C, Sode K. Novel electrochemical sensor system for protein using the aptamers in sandwich manner. Biosensors and Bioelectronics 2005;20:2168-72. Polsky R, Gill R, Kaganovsky L, Willner I. Nucleic Acid-Functionalized Pt Nanoparticles: Catalytic Labels for the Amplified Electrochemical Detection of Biomolecules. Analytical Chemistry 2006;78:2268-71. He P, Shen L, Cao Y, Li D. Ultrasensitive Electrochemical Detection of Proteins by Amplification of Aptamer−Nanoparticle Bio Bar Codes. Analytical Chemistry 2007;79:8024-9.
102
106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. 132.
Li JJ, Fang X, Tan W. Molecular Aptamer Beacons for Real-Time Protein Recognition. Biochemical and Biophysical Research Communications 2002;292:31-40. Yamamoto R, Kumar PKR. Molecular beacon aptamer fluoresces in the presence of Tat protein of HIV-1. Genes to Cells 2000;5:389-96. Hamaguchi N, Ellington A, Stanton M. Aptamer Beacons for the Direct Detection of Proteins. Analytical Biochemistry 2001;294:126-31. Nutiu R, Li Y. Structure-Switching Signaling Aptamers. Journal of the American Chemical Society 2003;125:4771-8. Nutiu R, Li Y. Structure-Switching Signaling Aptamers: Transducing Molecular Recognition into Fluorescence Signaling. Chemistry – A European Journal 2004;10:1868-76. Nutiu R, Li Y. In Vitro Selection of Structure-Switching Signaling Aptamers. Angewandte Chemie 2005;117:1085-9. Liu J, Lu Y. Fast Colorimetric Sensing of Adenosine and Cocaine Based on a General Sensor Design Involving Aptamers and Nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition 2006;45:90-4. Liu J, Lu Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat Protocols 2006;1:246-52. Luzi E, Minunni M, Tombelli S, Mascini M. New trends in affinity sensing: aptamers for ligand binding. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2003;22:810-8. Li Y, Lee HJ, Corn RM. Detection of Protein Biomarkers Using RNA Aptamer Microarrays and Enzymatically Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging. Analytical Chemistry 2007;79:1082-8. Furtado LM, Su H, Thompson M, Mack DP, Hayward GL. Interactions of HIV-1 TAR RNA with TatDerived Peptides Discriminated by On-Line Acoustic Wave Detector. Analytical Chemistry 1999;71:1167-75. Savran CA, Knudsen SM, Ellington AD, Manalis SR. Micromechanical Detection of Proteins Using Aptamer-Based Receptor Molecules. Analytical Chemistry 2004;76:3194-8. Hwang KS, Lee S-M, Eom K, et al. Nanomechanical microcantilever operated in vibration modes with use of RNA aptamer as receptor molecules for label-free detection of HCV helicase. Biosensors and Bioelectronics 2007;23:459-65. Arshady R, Mosbach K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Die Makromolekulare Chemie 1981;182:687-92. Wulff G, Sarhan A. Über die Anwendung von enzymanalog gebauten Polymeren zur Racemattrennung. Angewandte Chemie 1972;84:364-. Sellergren B. Direct Drug Determination by Selective Sample Enrichment on an Imprinted Polymer. Analytical Chemistry 1994;66:1578-82. Kempe M, Mosbach K. Molecular imprinting used for chiral separations. Journal of Chromatography A 1995;694:3-13. Turiel E, Martin-Esteban A. Molecularly imprinted polymers: towards highly selective stationary phases in liquid chromatography and capillary electrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2004;378:1876-86. Kriz D, Ramstroem O, Svensson A, Mosbach K. A Biomimetic Sensor Based on a Molecularly Imprinted Polymer as a Recognition Element Combined with Fiber-Optic Detection. Analytical Chemistry 1995;67:2142-4. Haupt K, Mosbach K. Molecularly Imprinted Polymers and Their Use in Biomimetic Sensors. Chemical Reviews 2000;100:2495-504. Dickert FL, Tortschanoff M, Bulst WE, Fischerauer G. Molecularly Imprinted Sensor Layers for the Detection of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Water. Analytical Chemistry 1999;71:4559-63. Piletsky SA, Turner APF. Electrochemical Sensors Based on Molecularly Imprinted Polymers. Electroanalysis 2002;14:317-23. Wulff G. Enzyme-like Catalysis by Molecularly Imprinted Polymers. Chemical Reviews 2001;102:1-28. Cammidge AN, Baines NJ, Bellingham RK. Synthesis of heterogeneous palladium catalyst assemblies by molecular imprinting. Chemical Communications 2001:2588-9. Alvarez-Lorenzo C, Concheiro A. Molecularly imprinted materials as advanced excipients for drug delivery systems. In: El-Gewely MR, ed. Biotechnology Annual Review: Elsevier; 2006:225-68. Zhou X, Li W, He X, Chen L, Zhang Y. Recent Advances in the Study of Protein Imprinting. Separation & Purification Reviews 2007;36:257-83. Kryscio D, Fleming M, Peppas N. Conformational studies of common protein templates in macromolecularly imprinted polymers. Biomedical Microdevices 2012;14:679-87.
103
133. 134. 135. 136. 137. 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153. 154. 155. 156.
Kryscio DR, Fleming MQ, Peppas NA. Protein Conformational Studies for Macromolecularly Imprinted Polymers. Macromolecular Bioscience 2012:n/a-n/a. Hjertén S, Liao J, Nakazato K, Wang Y, Zamaratskaia G, Zhang H. Gels mimicking antibodies in their selective recognition of proteins. Chromatographia 1997;44:227-34. Tao Z, Tehan EC, Bukowski RM, et al. Templated xerogels as platforms for biomolecule-less biomolecule sensors. Analytica Chimica Acta 2006;564:59-65. Pang X, Cheng G, Li R, Lu S, Zhang Y. Bovine serum albumin-imprinted polyacrylamide gel beads prepared via inverse-phase seed suspension polymerization. Analytica Chimica Acta 2005;550:13-7. Ge Y, Turner APF. Too large to fit? Recent developments in macromolecular imprinting. Trends in Biotechnology 2008;26:218-24. Brüggemann O, Haupt K, Ye L, Yilmaz E, Mosbach K. New configurations and applications of molecularly imprinted polymers. Journal of Chromatography A 2000;889:15-24. Ciardelli G, Cioni B, Cristallini C, Barbani N, Silvestri D, Giusti P. Acrylic polymeric nanospheres for the release and recognition of molecules of clinical interest. Biosensors and Bioelectronics 2004;20:1083-90. Kan X, Zhao Q, Shao D, Geng Z, Wang Z, Zhu J-J. Preparation and Recognition Properties of Bovine Hemoglobin Magnetic Molecularly Imprinted Polymers. The Journal of Physical Chemistry B 2010;114:3999-4004. Hoshino Y, Koide H, Urakami T, et al. Recognition, Neutralization, and Clearance of Target Peptides in the Bloodstream of Living Mice by Molecularly Imprinted Polymer Nanoparticles: A Plastic Antibody. Journal of the American Chemical Society 2010;132:6644-5. Pang X, Cheng G, Zhang Y, Lu S. Soft-wet polyacrylamide gel beads with the imprinting of bovine serum albumin. Reactive and Functional Polymers 2006;66:1182-8. Pang X, Cheng G, Lu S, Tang E. Synthesis of polyacrylamide gel beads with electrostatic functional groups for the molecular imprinting of bovine serum albumin. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2006;384:225-30. Qin L, He XW, Zhang W, Li WY, Zhang YK. Surface-modified polystyrene beads as photografting imprinted polymer matrix for chromatographic separation of proteins. Journal of Chromatography A 2009;1216:807-14. Bossi A, Piletsky SA, Piletska EV, Righetti PG, Turner APF. Surface-grafted molecularly imprinted polymers for protein recognition. Analytical Chemistry 2001;73:5281-6. Shi H, Tsai W-B, Garrison MD, Ferrari S, Ratner BD. Template-imprinted nanostructured surfaces for protein recognition. Nature 1999;398:593-7. Schirhagl R, Lieberzeit PA, Dickert FL. Chemosensors for Viruses Based on Artificial Immunoglobulin Copies. Advanced Materials 2010;22:2078-81. Hayden O, Haderspock C, Krassnig S, Chen X, Dickert FL. Surface imprinting strategies for the detection of trypsin. Analyst 2006;131:1044-50. Li Y, Yang H-H, You Q-H, Zhuang Z-X, Wang X-R. Protein Recognition via Surface Molecularly Imprinted Polymer Nanowires. Analytical Chemistry 2005;78:317-20. Takeuchi T, Hishiya T. Molecular imprinting of proteins emerging as a tool for protein recognition. Organic & Biomolecular Chemistry 2008;6:2459-67. Chou P-C, Rick J, Chou T-C. C-reactive protein thin-film molecularly imprinted polymers formed using a micro-contact approach. Analytica Chimica Acta 2005;542:20-5. Lin H-Y, Hsu C-Y, Thomas JL, Wang S-E, Chen H-C, Chou T-C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics 2006;22:534-43. Syritski V, Reut J, Menaker A, Gyurcsányi RE, Öpik A. Electrosynthesized molecularly imprinted polypyrrole films for enantioselective recognition of l-aspartic acid. Electrochimica Acta 2008;53:2729-36. Belmont AS, Jaeger S, Knopp D, Niessner R, Gauglitz G, Haupt K. Molecularly imprinted polymer films for reflectometric interference spectroscopic sensors. Biosensors and Bioelectronics 2007;22:3267-72. Ebarvia BS, Sevilla Iii F. Piezoelectric quartz sensor for caffeine based on molecularly imprinted polymethacrylic acid. Sensors and Actuators, B: Chemical 2005;107:782-90. Liang C, Peng H, Nie L, Yao S. Bulk acoustic wave sensor for herbicide assay based on molecularly imprinted polymer. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry 2000;367:551-5.
104
157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166. 167. 168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179. 180. 181.
Kröger S, Turner APF, Mosbach K, Haupt K. Imprinted polymer-based sensor system for herbicides using differential- pulse voltammetry on screen-printed electrodes. Analytical Chemistry 1999;71:3698-702. Schmidt RH, Mosbach K, Haupt K. A simple method for spin-coating molecularly imprinted polymer films of controlled thickness and porosity. Advanced Materials 2004;16:719-22+668. Schmidt RH, Haupt K. Molecularly imprinted polymer films with binding properties enhanced by the reaction-induced phase separation of a sacrificial polymeric porogen. Chemistry of Materials 2005;17:1007-16. Vandevelde F, Belmont AS, Pantigny J, Haupt K. Hierarchically nanostructured polymer films based on molecularly imprinted surface-bound nanofilaments. Advanced Materials 2007;19:3717-20. Pardieu E, Cheap H, Vedrine C, et al. Molecularly imprinted conducting polymer based electrochemical sensor for detection of atrazine. Analytica Chimica Acta 2009;649:236-45. Malitesta C, Losito I, Zambonin PG. Molecularly imprinted electrosynthesized polymers: New materials for biomimetic sensors. Analytical Chemistry 1999;71:1366-70. Deore B, Chen Z, Nagaoka T. Overoxidized polypyrrole with dopant complementary cavities as a new molecularly imprinted polymer matrix. Analytical Sciences 1999;15:827-8. Deore B, Chen Z, Nagaoka T. Potential-induced enantioselective uptake of amino acid into molecularly imprinted overoxidized polypyrrole. Analytical Chemistry 2000;72:3989-94. Yeh WM, Ho KC. Amperometric morphine sensing using a molecularly imprinted polymermodified electrode. Analytica Chimica Acta 2005;542:76-82. Özcan L, Şahin Y. Determination of paracetamol based on electropolymerized-molecularly imprinted polypyrrole modified pencil graphite electrode. Sensors and Actuators, B: Chemical 2007;127:362-9. Sergeyeva TA, Piletsky SA, Brovko AA, et al. Conductimetric sensor for atrazine detection based on molecularly imprinted polymer membranes. Analyst 1999;124:331-4. Kugimiya A, Yoneyama H, Takeuchi T. Sialic acid imprinted polymer-coated quartz crystal microbalance. Electroanalysis 2000;12:1322-6. Kugimiya A, Takeuchi T. Surface plasmon resonance sensor using molecularly imprinted polymer for detection of sialic acid. Biosensors and Bioelectronics 2001;16:1059-62. Lai E, Fafara A, VanderNoot V, Kono M, Polsky B. Surface plasmon resonance sensors using molecularly imprinted polymers for sorbent assay of theophylline, caffeine, and xanthine. Canadian Journal of Chemistry-Revue Canadienne De Chimie 1998;76:265-73. Lotierzo M, Henry O, Piletsky S, et al. Surface plasmon resonance sensor for domoic acid based on grafted imprinted polymer. Biosensors & Bioelectronics 2004;20:145-52. Li X, Husson S. Adsorption of dansylated amino acids on molecularly imprinted surfaces: A surface plasmon resonance study. Biosensors & Bioelectronics 2006;22:336-48. Choi SW, Chang HJ, Lee N, Kim JH, Chun HS. Detection of Mycoestrogen Zearalenone by a Molecularly Imprinted Polypyrrole-Based Surface Plasmon Resonance (SPR) Sensor. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009;57:1113-8. Uzun L, Say R, Unal S, Denizli A. Production of surface plasmon resonance based assay kit for hepatitis diagnosis. Biosensors & Bioelectronics 2009;24:2878-84. Matsunaga T, Hishiya T, Takeuchi T. Surface plasmon resonance sensor for lysozyme based on molecularly imprinted thin films. Analytica Chimica Acta 2007;591:63-7. Matsui J, Akamatsu K, Hara N, et al. SPR sensor chip for detection of small molecules using molecularly imprinted polymer with embedded gold nanoparticles. Analytical Chemistry 2005;77:4282-5. Riskin M, Tel-Vered R, Willner I. Imprinted Au-Nanoparticle Composites for the Ultrasensitive Surface Plasmon Resonance Detection of Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX). Advanced Materials 2010;22:1387-+. Wood RW. XLII. On a remarkable case of uneven distribution of light in a diffraction grating spectrum. Philosophical Magazine Series 6 1902;4:396 - 402. Kretschmann E, Raether H. Radiative decay of non-radiative surface plasmons excited by light. 1968;23A:2135–6. Otto A. Excitation of nonradiative surface plasma waves in silver by the method of frustrated total reflection. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei 1968;216:398. Liedberg B, Nylander C, Lunström I. Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing. Sensors and Actuators 1983;4:299-304.
105
182. 183. 184. 185. 186. 187. 188. 189. 190. 191. 192. 193. 194. 195. 196. 197. 198. 199. 200. 201. 202. 203. 204. 205. 206.
Kooyman RPH, Kolkman H, Van Gent J, Greve J. Surface plasmon resonance immunosensors: sensitivity considerations. Analytica Chimica Acta 1988;213:35-45. Lee HJ, Wark AW, Corn RM. Creating Advanced Multifunctional Biosensors with Surface Enzymatic Transformations. Langmuir 2006;22:5241-50. Kanda V, Kariuki JK, Harrison DJ, McDermott MT. Label-Free Reading of Microarray-Based Immunoassays with Surface Plasmon Resonance Imaging. Analytical Chemistry 2004;76:7257-62. Homola J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2003;377:528-39. Jonsson U, Fagerstam L, Ivarsson B, et al. Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology. BioTechniques 1991;11:620-7. Mannen T, Yamaguchi S, Honda J, Sugimoto S, Kitayama A, Nagamune T. Observation of Charge State and Conformational Change in Immobilized Protein Using Surface Plasmon Resonance Sensor. Analytical Biochemistry 2001;293:185-93. Stenberg E, Persson B, Roos H, Urbaniczky C. Quantitative determination of surface concentration of protein with surface plasmon resonance using radiolabeled proteins. Journal of Colloid and Interface Science 1991;143:513-26. Chiang HP, Wang YC, Leung PT. Effect of temperature on the incident angle-dependence of the sensitivity for surface plasmon resonance spectroscopy. Thin Solid Films 2003;425:135-8. Moreira CS, Lima AMN, Neff H, Thirstrup C. Temperature-dependent sensitivity of surface plasmon resonance sensors at the gold–water interface. Sensors and Actuators B: Chemical 2008;134:854-62. Day YSN, Baird CL, Rich RL, Myszka DG. Direct comparison of binding equilibrium, thermodynamic, and rate constants determined by surface- and solution-based biophysical methods. Protein Science 2002;11:1017-25. McDonnell JM. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Current Opinion in Chemical Biology 2001;5:572-7. Langmuir I. The adsorption of gases on plane surfaces of glass, mica and platinum. The Journal of the American Chemical Society 1918;40:1361-403. Ullman EF, Kirakossian H, Singh S, et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. PNAS 1994;91:5426-30. Ullman EF, Kirakossian H, Switchenko AC, et al. Luminescent oxygen channeling assay (LOCI): sensitive, broadly applicable homogeneous immunoassay method. Clinical Chemistry 1996;42:1518-26. Skovsen E, Snyder JW, Lambert JDC, Ogilby PR. Lifetime and Diffusion of Singlet Oxygen in a Cell. The Journal of Physical Chemistry B 2005;109:8570-3. Glickman J, Wu X, Mercuri R, et al. A comparison of ALPHAScreen, TR-FRET, and TRF as assay methods for FXR nuclear receptors. Journal of Biomolecular Screening 2002;7:3-10. Kolb AJ, Kaplita PV, Hayes DJ, et al. Tyrosine kinase assays adapted to homogeneous time-resolved fluorescence. Drug Discovery Today 1998;3:333-42. Burns S, Travers J, Collins I, et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Protein Kinase B (PKB/AKT) in an AlphaScreen™ High-Throughput Screen. Journal of Biomolecular Screening 2006;11:822-7. Eglen RM, Reisine T, Roby P, et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Chem Genomics 2008;1:2-10. Smith WW. Occurrence of "stem pitting" and necrosis in some body stocks of apple trees. Proceedings American Society of Horti- cultural Science 1954;63:101-13. Koganezawa H, Yanase H. A new type of elongated virus isolated from apple-trees containing the stem pitting agent. Plant Disease 1990;74:610-4. Jelkmann W. Nucleotide sequences of apple stem pitting virus and of the coat protein gene of a similar virus from pear associated with vein yellows disease and their relationship with potexand carlaviruses. Journal of General Virology 1994;75:1535-42. Yoshikawa N, Matsuda H, Oda Y, et al. Genome heterogeneity of Apple stem pitting virus in apple trees. Proceedings of the 18th International Symposium on Virus & Virus-Like Diseases of Temperate Fruit Crops - Top Fruit Diseases, Vols 1 and 2 2001:285-90. Komorowska B, Malinowski T, Michalczuk L. Evaluation of several RT-PCR primer pairs for the detection of Apple stem pitting virus. Journal of Virological Methods 2010;168:242-7. MacKenzie D, McLean M, Mukerji S, Green M. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription-polymerase chain reaction. Plant Disease 1997;81:222-6.
106
207.
208. 209.
210. 211. 212. 213. 214. 215. 216. 217. 218. 219. 220. 221. 222. 223. 224. 225. 226. 227. 228.
Kummert J, Marinho V, Rufflard G, Colinet D, Lepoivre P, Hadidi A. Sensitive detection of apple stem grooving and apple stem pitting viruses from infected apple trees by RT-PCR. 17th International Symposium on Virus and Virus-Like Diseases of Temperate Fruit Crops: Fruit Tree Diseases, Vols 1 and 2 1998:97-104. Klerks M, Leone G, Lindner J, Schoen C, van den Heuvel J. Rapid and sensitive detection of Apple stem pitting virus in apple trees through RNA amplification and probing with fluorescent molecular beacons. Phytopathology 2001;91:1085-91. Gugerli P, Ramel M, Llacer G. Production of monoclonal antibodies for the serological identification and reliable detection of Apple stem pitting and pear yellow vein viruses in apple and pear. Proceedings of the Xixth International Symposium on Virus and Virus-Like Diseases of Temperate Fruit Crops: Fruit Tree Diseases 2004:59-69. Paunovic S, Jevremovic D, Caglayan K, Ertunc F. Comparative results of detection of pome fruit viruses by different methods. Proceedings of the Twentieth International Symposium on Virus and Virus-Like Diseases of Temperate Fruit Crops - Fruit Tree Diseases 2008:147-53. Beusink JB, Lokate AMC, Besselink GAJ, Pruijn GJM, Schasfoort RBM. Angle-scanning SPR imaging for detection of biomolecular interactions on microarrays. Biosensors and Bioelectronics 2008;23:839-44. Mannelli I, Minunni M, Tombelli S, Mascini M. Quartz crystal microbalance (QCM) affinity biosensor for genetically modified organisms (GMOs) detection. Biosensors and Bioelectronics 2003;18:129-40. Yu H-Z, Luo C-Y, Sankar CG, Sen D. Voltammetric Procedure for Examining DNA-Modified Surfaces: Quantitation, Cationic Binding Activity, and Electron-Transfer Kinetics. Analytical Chemistry 2003;75:3902-7. Ge B, Huang Y-C, Sen D, Yu H-Z. Electrochemical investigation of DNA-modified surfaces: From quantitation methods to experimental conditions. Journal of Electroanalytical Chemistry 2007;602:156-62. Steel AB, Herne TM, Tarlov MJ. Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold. Analytical Chemistry 1998;70:4670-7. Kikin O, D'Antonio L, Bagga PS. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Research 2006;34:W676-W82. Grönbeck H, Curioni A, Andreoni W. Thiols and Disulfides on the Au(111) Surface: The Headgroup−Gold Interaction. Journal of the American Chemical Society 2000;122:3839-42. Balamurugan S, Obubuafo A, McCarley RL, Soper SA, Spivak DA. Effect of Linker Structure on Surface Density of Aptamer Monolayers and Their Corresponding Protein Binding Efficiency. Analytical Chemistry 2008;80:9630-4. Hermann T, Patel DJ. Biochemistry - Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science 2000;287:820-5. Minunni M, Tombelli S, Gullotto A, Luzi E, Mascini M. Development of biosensors with aptamers as bio-recognition element: the case of HIV-1 Tat protein. Biosensors & Bioelectronics 2004;20:1149-56. Balamurugan S, Obubuafo A, Soper SA, McCarley RL, Spivak DA. Designing highly specific biosensing surfaces using aptamer monolayers on gold. Langmuir 2006;22:6446-53. Prime KL, Whitesides GM. Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide): a model system using self-assembled monolayers. Journal of the American Chemical Society 1993;115:10714-21. Anderson P, Mecozzi S. Unusually short RNA sequences: Design of a 13-mer RNA that selectively binds and recognizes theophylline. Journal of the American Chemical Society 2005;127:5290-1. Markham N, Zuker M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Research 2005;33:W577-W81. Baerenfaller K, Grossmann J, Grobei MA, et al. Genome-Scale Proteomics Reveals Arabidopsis thaliana Gene Models and Proteome Dynamics. Science 2008;320:938-41. Decher G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science 1997;277:1232-7. Hall KB, Kranz JK. Nitrocellulose Filter Binding for Determination of Dissociation Constants RNAProtein Interaction Protocols. In: Haynes SR, ed.: Humana Press; 1999:105-14. Menaker A, Syritski V, Reut J, Opik A, Horvath V, Gyurcsanyi R. Electrosynthesized SurfaceImprinted Conducting Polymer Microrods for Selective Protein Recognition. Advanced Materials 2009;21:2271-+.
107
229. 230. 231.
Weber PC, Ohlendorf DH, Wendoloski JJ, Salemme FR. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science 1989;243:85-8. Ekgasit S, Tangcharoenbumrungsuk A, Yu F, Baba A, Knoll W. Resonance shifts in SPR curves of nonabsorbing, weakly absorbing, and strongly absorbing dielectrics. Sensors and Actuators BChemical 2005;105:532-41. Xia YJ, Ouyang JY. Salt-Induced Charge Screening and Significant Conductivity Enhancement of Conducting Poly(3,4-ethylenedioxythiophene):Poly(styrenesulfonate). Macromolecules 2009;42:4141-7.
108
NYILATKOZAT
Alulírott Lautner Gergely kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést magam készítettem és abban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, amelyet szó szerint, vagy azonos tartalomban, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen, a forrás megadásával megjelöltem.
Budapest, 2012. szeptember 6. …………………………….. Lautner Gergely
Analyst Interdisciplinary detection science www.rsc.org/analyst
Volume 135 | Number 5 | May 2010 | Pages 809–1156
ISSN 0003-2654
CRITICAL REVIEW Anthony J. Killard et al. Advanced printing and deposition methodologies for the fabrication of biosensors and biodevices
PAPER Róbert E. Gyurcsányi et al. Aptamer-based biochips for label-free detection of plant virus coat proteins by SPR imaging
0003-2654(2010)135:5;1-K
PAPER
www.rsc.org/analyst | Analyst
Aptamer-based biochips for label-free detection of plant virus coat proteins by SPR imaging Gergely Lautner,a Zs ofia Balogh,b Viola Bardoczy,c Tamas Meszarosb and Robert E. Gyurcsanyi*ad Received 2nd November 2009, Accepted 25th January 2010 First published as an Advance Article on the web 11th February 2010 DOI: 10.1039/b922829b Specific detection of virus strains by affinity-based bioassays is often limited by the availability of ligands able to differentiate among close homologues of virus coat proteins. As viruses are prone to mutation, the ligand generation should, in addition, be fast enough to allow rapid identification of new varieties. These two criteria are difficult to be fulfilled by antibodies; however, they open up opportunities for aptamer-based detection. Here we report on the feasibility of selectively detecting the apple stem pitting virus (ASPV) coat proteins (PSA-H, MT32) using original DNA aptamers. Surface plasmon resonance (SPR) imaging was used together with aptamer-modified sensor chips to optimize the aptamer immobilization for highest sensitivity and to characterize the aptamer-virus coat protein binding. Different parameters affecting this binding, such as the aptamer flanking, surface coverage, and type of spacer molecules, were identified and their influence was determined. A direct label-free method is proposed for assessing the ASPV based on the detection of the respective virus coat proteins in plant extracts.
Introduction Aptamers are in vitro generated, short, single stranded nucleic acids that selectively bind to target compounds ranging from small molecules to macromolecules. The principle of aptamer selection, referred to as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), is simple.1,2 The target compound is screened against an oligonucleotide library consisting, typically, of 1012–1014 random sequences. While oligonucleotides that do not bind the ligand are discarded by various washing steps, the aptamers, i.e., oligonucleotides exhibiting high affinity for the target, are ultimately separated and sequenced. The dissociation constants of published aptamer– target complexes seem to be similar to those of antibody–antigens; however, this emerging class of biorecognition molecules is superior to antibodies in many additional aspects.3 Besides the obvious advantages of the in vitro selection, aptamers, owing to their nucleic acid composition, are amenable to well controlled chemical modifications, have good chemical stability, and are easy to handle; thus, they could prevail over antibodies in various areas of life sciences, the pharmaceutical industry,4,5 and bioanalysis.6 Apparently, most of the routine immunoanalytical methodologies were seamlessly adapted to detect aptamer–ligand interactions.7 Thus, utilization of aptamers in a Department of Inorganic and Analytical Chemistry, Budapest University of Technology and Economics, Szt. Gell ert t er 4, H-1111 Budapest, Hungary. E-mail:
[email protected]; Fax: +36 1 4633408; Tel: +36 1 4631592 b Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, T} uzolt o u. 37-47, H-1094 Budapest, Hungary. E-mail:
[email protected] c Department of Applied Biotechnology and Food Science, Budapest University of Technology and Economics, M} uegyetem rkp. 3, H-1111 Budapest, Hungary d Research Group for Technical Analytical Chemistry of the Hungarian Academy of Sciences, Szt. Gell ert t er 4, H-1111 Budapest, Hungary
918 | Analyst, 2010, 135, 918–926
label-free techniques such as surface plasmon resonance (SPR),8 SPR imaging,9 quartz crystal microbalance,10–12 microelectromechanical sensing,13 nano-field effect transistors (nanoFETs),14 and electrochemical impedance15 as well as in various amplification schemes based on enzymes,16 luminescence generating labels, and nanoparticles17,18 has been demonstrated. Moreover, the range of bioassay methodologies was further extended by exploiting the inherent properties of nucleic acid aptamers in molecular beacons,19–21 ligation assays,22 electrophoresis,23 microarrays,24 and direct reporting through the use of catalytic oligonucleotides (ribozymes and deoxyribozymes).25 Despite their evident potential in bioanalysis, most of the analytically aimed studies were performed on a relatively limited number of well characterized model aptamers, such as thrombin, in ideal samples.26 However, for practical applications the aptamer selection is influenced decisively by the analytical task. Sufficient background information on the sample matrix allows the selectivity to be increased against known critical interferents by counter-selection, i.e., by screening only those oligonucleotides against the target compound that did not, previously, show affinity for the tested interferents. As the majority of analytical reports do not employ custom-selected original aptamer sequences, this striking advantage of aptamer-based assays seems to be less emphasized. As the fast generation of highly discriminating receptors makes aptamers ideal candidates for the detection of various virus strains and their rapidly evolving mutants, we present here, for the first time, a line of aptamerbased assay developments against plant virus coat proteins. As model application, the DNA aptamer-based label-free assay of apple stem pitting virus (ASPV) is presented through the selective detection, enabled by counter-selection, of two closely homologous virus coat proteins, PSA-H and MT32, with amino acid sequences identical in 81%.27 This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
The ASPV is a worldwide spread filamentous virus from the genus Foveavirus.27,28 Although most infections are latent, the occurrence of ASPV has been associated with complex growth disorders of pomes and fruits.29 While routine ASPV detection methods rely on biological indexing by grafting or mechanical inoculation of infected tissues onto indicator hosts, the importance of the nucleic acid-based ASPV determinations,30 and especially of RT-PCR techniques, is continuously increasing.31 The various nucleic acid-based detection protocols are fast and sensitive; however, they involve rather substantial sample pretreatment and are susceptible to errors.32 Reliable detection of ASPV is further complicated since, owing to the frequently used grafting procedure, the wide distribution of ASPV is associated with high genetic variability.33,34 Therefore, efforts were made to generate monoclonal antibodies as a basis of reliable serological enzyme immunoassays for fast routine determinations.29 Here, we show that due to their inherent advantages, aptamers can constitute also the basis of high-throughput SPR imaging biosensors enabling the direct, label-free detection of virus coat proteins in plant extracts. By using thiol-labeled aptamers, bare gold SPR chips could be modified directly, in one step, while further functionalization with a thiol derivative of tetraethylene glycol was employed to address non-specific adsorption issues. In this respect, imaging SPR (iSPR) facilitates also the rapid optimization of the aptamer immobilization, which is generally the neuralgic point in obtaining proper binding characteristics for proteins. While, certainly, viral peptides are an essential starting point of both ligand generation and their characterization, a major challenge in virology is the direct and specific detection of whole viruses and virus fragments. Therefore, we have investigated the feasibility of stepping up from viral peptide recognition to virus detection, which is by far not straightforward since it depends upon the conservation of the structure and conformation of the targeted epitopes upon incorporation in the virus. Thus, we here report the first direct, label-free detection of ASPV in plant extracts.
Experimental Biochemicals, reagents and buffers The degenerate oligonucleotide library was synthesized at the 1 mM scale and purified by HPLC (Metabion). This library, referred as the SELEX library, is composed of 40 random nucleotides flanked by fixed sequences, 50 -agcctcgtctgttctccc40N-gggaagacaagcagacgt-30 . All other oligonucleotides were custom synthesized at the 200 nmol scale and purified by HPLC from Genosys: SELF, 50 -agcctcgtctgttctccc-30 , and SELR, in biotinylated and non-biotinylated form; primers annealing to the flanking regions were used during the selection procedure. The applied aptamers have the following sequences: MT32: 50 -ggg gtg gtg ggt tct ttt tgt ggt att ggt gtg ggg ggc a-tttt-C6-SH-30 ; PSA-H: 50 -agc aag gtt tgg tgt tgg ttg gtt gct ggt ttt ggt ttg gc-tttt-C6-SH-30 ; PSA-H Flank: 50 -agc ctc gtc tgt tct ccc agc aag gtt tgg tgt tgg ttg gtt gct ggt ttt ggt ttg gcg gga aga caa gca gac gt-tttt-C6-SH-30 ; Random 45: 50 -HS-C6-ttt tta aag aga cat ctc ttc tcc gag ccg gtc gaa ata gtg agt-30 ; Random 81: 50 -HS-C6-ttg acc aag cgc tgg ata acg aca tta ctt cta ttt tta ttt ggg ggt tga cga aca agc ttt att ttt atc ttc att-30 . Avidin and (1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
(HS-TEG) were purchased from Sigma-Aldrich. All other reagents such as inorganic salts, buffer components and surfactants were of the highest analytical or bioanalytical grade from Sigma-Aldrich. Solutions were prepared with deionized water (18.2 MU cm resistivity; Millipore). Composition of the buffers used: PBS (pH 7.4, 0.01 M phosphate buffer with 2.7 mM KCl and 137 mM NaCl); PBS-T (PBS with 0.05% Tween 20); PBS-TE (PBS-T with 1 mM EDTA); and PBS-TPO (PBS-T with 2% polyvinylpyrrolidone). Preparation of virus coat proteins Virus coat proteins34 with and without His tag: MT32Cds (pI/MW: 6.71/42.6 kDa), MT32Cds-His (6.95/43.4 kDa), PSAHcds (6.51/43.7 kDa), and PSA-Hcds-His (6.75/44.5 kDa) were prepared by cloning, protein expression and purification as detailed below. BL21(DE3)pLysS cells were transformed with coat protein coding pDEST17 constructs. The cells were grown at 37 C in Luria Broth (LB) (500 mL) containing ampicillin (100 mg/mL), chloramphenicol (35 mg/mL) until reaching OD 600 ¼ 0.5 and incubated at 30 C with 0.4 mM isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside (IPTG) for a further 5 h. Bacterial cells were collected by centrifugation at 5000 rpm for 20 min, resuspended in PBS (5 mL) containing 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, 0.1% Triton X-100, and Protease Inhibitor Cocktail (Sigma) and disrupted by sonication. Following centrifugation at 13 000 rpm for 30 min the supernatant was incubated with Ni-charged His Bind resin (250 mL; Novagen) for another 30 min at 4 C. Unspecific proteins were removed by washing the beads 5 times with LB containing 100 mM imidazole, and the resins were kept at 4 C in PBS. Selection of virus coat protein (PSA-H and MT32) specific aptamers A slightly modified SELEX procedure35 was used to select the virus coat protein aptamers. Briefly, 1 nmol of SELEX library was denaturated at 95 C for 2 min, immediately cooled on ice and completed with PBS-T (9.9 mL) containing dIdC (random DNA strand consisting of desoxyinositol and desoxycytosine, 0.1 mg/mL) and bovine serum albumin (1 mg/mL) as well as of 30 mL (ca. 300 pM) bead-bound PSA-H or MT32 protein. After incubating at room temperature for 30 min and extensive washing to remove non-specifically bound single stranded DNA (ssDNA) with PBS-T, protein–oligonucleotide complexes were eluted by adding 500 mM imidazole in 20 mM Tris at pH 8.0 (20 mL), and transferred to the PCR mixture. This PCR mixture (100 mL) contained 10 mL 10X reaction buffer, 1.5 U of Taq polymerase (Invitrogen), 1 mM SELF and biotinylated SELR primers, 0.8 mM dNTPs, and 1.5 mM MgCl2. Amplification conditions were 2 min at 95 C; 18 cycles of 30 s at 95 C; 30 s at 56 C; 30 s at 68 C; 2 min at 68 C. After checking the PCR product quality on 2% agarose gel, 5 M NaCl (23 mL) was added to the remaining PCR mixture (90 mL). This solution was divided into two parts and incubated in a Reacti-Bind Streptavidin Coated High Binding Capacity microtiter plate (Pierce) followed by thorough washing with PBS-T. The desired strands were eluted by a 5 min incubation with fresh 100 mM NaOH Analyst, 2010, 135, 918–926 | 919
(30 mL/well) and immediately diluted into PBS-T (1 mL) containing 1 M NaH2PO4 (1.5 mL). Finally, the solution was heated to 95 C for 5 min, immediately placed on ice, and kept at 4 C until the next round of SELEX. In the following selection rounds, the amount of protein was reduced to 150 pmol (rounds 2–9) and subsequently to 100 pmol (rounds 11–14), the other conditions of selection remaining identical during the whole SELEX procedure. In order to increase the specificity of aptamers, counter-selection was performed after rounds 3, 6, 9, and 12. Bead-bound PSA-H or MT32 (15 mL) was added to MT32 or PSA-H ssDNA in PBS-T (1 mL), respectively, incubated for 30 min with shaking and the supernatants were removed for the next selection round. The final PCR of SELEX was performed with SELF and non-biotinylated SELR primers. In order to determine the sequence of obtained oligonucleotides, the PCR mixture was ligated into the pGEM-T Easy (Promega) vector system and Escherichia coli (DH5a) competent cells were transformed with the ligation mixture. Twenty colonies were picked and sequenced from both selections by using the M13 promoter primer. Plant protein extracts Plant extracts were prepared from 0.2 g of fresh leaves (tobacco, apple, or pear) by grinding in 4 mL PBS-TPO buffer.36 The extracts were divided into 0.5 mL aliquots and were then lyophilised. ASPV-positive and -negative controls were made from extracts of plants or, alternatively, ordered from Bioreba AG (CH-4153 Reinach, Switzerland). Imaging surface plasmon resonance (iSPR) For iSPR experiments, an IBIS iSPR instrument (IBIS Technologies BV, Hengelo, The Netherlands) equipped with the 4.2 version of the operating software was used. The instrument is capable of simultaneously recording the SPR signal (by angle modulation) in regions of interest freely assignable on the sensor surface. Up to 30 spots designating either replicates or regions of different molecular interactions were used in this study. In all
SPR experiments, built-in automatic liquid handling was used in conjunction with a 3 mL flow cell thermostated at 25 C. Prior to every measurement, the surface was equilibrated with PBS-TE buffer. Sample volumes of 75 mL were injected into the flow cell at a flow rate of 30 mL s1, followed by continuous back and forth pumping of the sample plug during the interactions at a rate of 30 mL s1 to minimize mass transport related limitations of the binding reaction. A typical measurement cycle involved 15 min association, 10 min dissociation, and a short 45 s regeneration step. For surface regeneration, a solution (30 mL) of 12 mM NaOH and 1.2% EtOH was used.8
Aptamer-based iSPR chip preparation Planar, bare Au SPR sensor chips (IBIS) were first cleaned with a mixture of 30% H2O2/25% NH4OH/H2O (1:1:5, v/v) for 20 min, then washed with deionized water, and dried under N2 stream.37 Then the surface of the unpatterned Au chips was modified with a mixed self-assembled monolayer of thiol-modified aptamer and HS-TEG (Fig. 1A) in the SPR flow channel using automatic fluid handling. First, the surface was modified for 1 h using 1 mM thiol-modified aptamer in 1.0 M KH2PO4 (Fig. 1B). The excess of aptamer was removed by rinsing the surface 3 times with PBS (1 mL each). In the second step, to avoid non-specific protein adsorption, the surface was left to react for an additional hour with 0.1 mM TEG-SH in PBS again followed by 3 consecutive washing steps with PBS (1 mL each). Patterns of oligonucleotides (various aptamers and random sequence oligomers) on the surface of bare Au chips were generated with a microspotter (Calligrapher MicroArrayer, Bio-Rad, Hercules, CA) (Fig. 1C). Mixtures with various molar ratios of the thiolated aptamer probe and HS-TEG were spotted in two consecutive steps by using solid contact pins (350 mm diameter). The relative humidity in the spotting chamber was adjusted to a constant value of 65%, while the temperature of the stage was fixed at 10 C. Between spotting, the pin was first washed with a solution of 10% ethanol and 0.01% Tween 20 and then with deionized water in a predefined automatic sequence.
Fig. 1 (A) Schematics of the surface chemistry of aptamer-based biochips. (B) Typical raw sensorgram showing the two-step immobilization of the thiolated aptamer (1 mM PSA-H aptamer in 1 M KH2PO4) and HS-TEG (0.1 mM in PBS-T) as well as successive response cycles to increasing concentrations of virus coat proteins. Downward pointing arrows mark the addition of the PSA-H samples, while upward arrows indicate the beginning of regeneration. (C) Typical real-time SPR image of a sensor chip spotted with multiple aptamers. The scale bar is 500 mm.
920 | Analyst, 2010, 135, 918–926
This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
After spotting, the spotted surface was incubated in the spotting chamber at 10 C, 65% relative humidity for 30 min. The chip was treated with HS-TEG for 1 h in the SPR flow cell to block the unspotted Au surface. Electrochemical determination of the aptamer surface density The aptamer surface density on gold surfaces modified in two consecutive steps with HS-aptamer and HS-TEG was determined by linear sweep voltammetry (LSV) based on assessing the amount of Ru3+ compensating the negative charge of the immobilized DNA strands.38,39 This method was shown to give the same results as the chronocoulometric method of Steel et al.40 LSV curves were recorded by scanning the potential at a rate of 0.1 V/s from 0.1 V to 0.6 V in deoxygenated solutions of 10 mM Tris buffer (pH ¼ 7.4) with 50 mM [Ru(NH3)6]Cl3. The charge (Q) of the integrated cathodic peak originates dominantly from the electrostatically adsorbed Ru3+ onto dense surface-immobilized DNA strands.39 The surface coverage (GRu) of the specifically adsorbed redox probe was calculated as GRu ¼ Q/nFA, where A is the electrode area, F the Faraday constant and n the number of electrons in the redox reaction. Ultimately, the DNA coverage is given by GDNA ¼ zNAGRu/m, where z is the charge of the redox molecule (z ¼ 3), NA Avogadro’s number, and m the number of nucleotides.
Results and discussion Selection of DNA aptamers for virus coat proteins Isolation of ssDNA aptamers with the ability to discriminate the virus strain specific coat proteins from a pool of 1014 different oligonucleotides was performed by the application of His6-tagged protein targets bound to Ni-NTA beads. The stringency of selection was ensured by various factors: (1) addition of an excess amount of dIdC and BSA to the selection buffer to eliminate general, non-specific, protein-binding sequences; (2) extensive washing of oligonucleotide–protein complex binding beads to discard weakly bound aptamers; and (3) gradually decreasing protein concentration in the consecutive selection rounds to favor the high affinity oligonucleotides. Furthermore, in order to obtain aptamers that are capable to differentiate between two very close homologue proteins, counter-selection steps were incorporated into our SELEX procedure. Finally, 20-20 colonies were isolated and sequenced from the 15th round of selection. Interestingly, though the majority of clones selected for MT32 and PSA-H proteins possessed the same sequences in 10 and 9 colonies, respectively, alignment of these two sequences showed no similar motifs. Many published aptamers are G-rich and adopt a variety of G-quadruplex structures; therefore, our sequences were evaluated in this respect.41 Sending the variable sequence part of the selected aptamers to the online G-quadruplex analyzing tool (QGRS Mapper) resulted in the identification of G-quadruplexes in both sequences; however, the determined structures were diverse in the individual aptamers. The collective data of sequence analysis hint at a successful aptamer selection producing specific aptamers for two highly similar proteins. For the direct attachment to the Au chips, the aptamers were synthesized with HS-(CH2)6-TTTT linkers at the This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
30 end to attain proper spacing between the surface and the binding sequence.42 Development of aptamer-based SPR chips Aptamers have large conformational flexibility and bind to their ligands by adaptive recognition mechanism.43 Thus, their application to SPR requires a more thorough optimization of the surface density and properties of the sensor chips than in the case of antibodies. Immobilization strategies generally take advantage of either biotin-labeled aptamers11 attached via streptavidin to functionalized surfaces or thiol-labeled aptamers, which spontaneously chemisorb on Au surfaces. Here, we have explored the direct attachment of aptamers to bare gold chips by using thiolated probes. A previous study44 showed that the efficiency of aptamer–ligand binding is extremely sensitive to the surface density and length of the linker, separating the aptamer sequence and the thiol functionality reacting with the surface, as well as to the properties of the co-immobilized thiol derivative. The latter ensures desorption of nucleic acid strands from the Au surface and reduction of non-specific adsorption. Since their introduction by Prime and Whitesides, various thiolated oligoethylene glycols are the molecules of choice to design monomolecular layers with good resistance against non-specific adsorption of various components from biological samples.45 However, most of these studies aimed primarily at the adsorption of serum proteins, and according to our knowledge, their resistance to plant extract proteins has not been reported. Therefore, we have investigated the adaptability of commercially available thiolated poly(ethylene glycol)s of MW 5 and 20 kDa as well as HS-TEG. Earlier studies have shown that longer EG chains better resist non-specific adsorption of proteins. Indeed, all ethylene glycol derivatives showed very low non-specific binding for various plant extracts, but mixed monolayers of aptamer– poly(ethylene glycol) derivatives also exhibited very low specific binding (data not shown). Since mixed HS-aptamer/HS-TEG monolayers provided excellent specific binding (Fig. 1B), it is reasonable to assume that the long poly(ethylene glycol) chains sterically hinder the specific binding events. This again highlights the sensitivity of aptamer monolayers to the type of co-immobilized thiols and the importance of a properly optimized surface layer, which apparently should involve only spacer molecules that do not exceed the length of the linker used to immobilize the aptamer sequence. The result of challenging the HS-TEG monolayer with various protein solutions is summarized in Table 1. Table 1 Resonant angle shifts of HS-TEG-modified surfaces upon contacting them with various protein matrices Total protein concentration/mg mL1 Pear leaf extract Apple leaf extract Tobacco leaf extract MT32 PSA-H BSA Avidin Bioreba + Bioreba
145 223 800 50 50 100 100 100 200
Resonant angle shift/m ( SD) 0.9 0.3 1.8 0.3 7.0 3.0 3.1 0.7 0.7 0.4 0.5 0.4 0.5 0.1 5.0 2.1 4.2 0.3
Analyst, 2010, 135, 918–926 | 921
The non-specific adsorption of pure protein extracts was found to be within the experimental error, while the different extracts, even at the highest concentration, resulted in an average shift in the resonant angle of only up to 7 m . In the second step, the optimization of mixed monolayers consisting of HS-TEG and thiolated aptamer probes was pursued. The aptamer sequences were designed to have an additional HS-(CH2)6-TTTT spacer, which places the binding sequence above the HS-TEG spacer layer (Fig. 1A) to ensure the availability of the binding sequence for interaction with the virus coat proteins. The optimization of the mixed aptamer–TEG monolayers for optimal specific binding was made by changing the three essential parameters that were previously identified as determinant on the surface coverage of self-assembled nucleic acids, i.e., the concentration of the two thiolated compounds (HS-aptamer and HS-TEG) and the ion strength of the surface-modifying solution. The effect of these three parameters was evaluated by following a 33 experimental design based on Taguchi’s method. Premixed aqueous solutions of HS-aptamer and HS-TEG at different ionic strengths were prepared and spotted in a random order onto the
Fig. 2 Two-dimensional representation of the resonant angle shifts for (A) specific aptamer–ASPV-infected plant protein extract (dilution, 10) interactions and (B) 1% BSA non-specific adsorption onto the surface as a function of the thiolated aptamer and HS-TEG concentration. The values associated with the individual contour lines are the resonant angle shifts corresponding to a given mixing ratio of the two thiols.
922 | Analyst, 2010, 135, 918–926
surface of a bare Au SPR chip. The concentration of the aptamer was varied from 0 to 10 mM, and that of the HS-TEG between 1 and 100 mM. Meanwhile the concentration of the working buffer was fixed between 0.1 and 1.0 M. Three repeated measurement were made at center point parameters. The surface interactions for all microspots (Fig. 1C) were monitored in real time, first with 1% BSA solution to assess the level of non-specific interaction. After a short regeneration, measurement cycles were performed with ASPV-infected plant protein extracts at three different dilutions. The results show that optimal aptamer– ligand binding, i.e., at the lowest non-specific and highest specific response, requires aptamer concentrations of at least 5 mM, while the HS-TEG concentration is kept at its highest value in the studied concentration range, 100 mM (Fig. 2). The effect of the ionic strength was insignificant in this rather high concentration range, which was used deliberately as it was shown previously that electrostatic shielding of the negative charges on the DNA backbones is required to create reasonably dense nucleic acid monolayers. Remarkably, the same optimal sensitivities and specific responses could be obtained by a two-step surface modification procedure, which involves incubating the surface in two consecutive steps with aqueous solutions of the HS-aptamer and HS-TEG. Due to the non-competitive character of this modification procedure optimal results were obtained at a different thiolated probe concentration, i.e., for 1 mM HS-aptamer in 1 M KH2PO4 (Fig. 1B). This is in accordance with the expectations that the first, aptamer-binding step of the two-step surface modification procedure requires a lower HS-aptamer concentration than the one-step modification. The electrochemical assessment of the aptamer surface coverage gave a value of 1.9 1012 molecules cm2 for the PSA-H aptamer, which corresponds to an average of 2 molecules on a 100 nm2 surface. This is, indeed, very reasonable if little steric hindrance between the surface-bound proteins is expected. The results were obtained for 45-mer ssDNA, which is close to the most often used aptamer length in SELEX libraries. In our studies, however, we also used flanked aptamer strands of 81 base length, and some sensors only use the highly conserved short motifs of the aptamers for binding (down to 13-mer were reported46). Therefore, we also determined the surface densities of 81 (PSA-H-Flank) and 20 (thrombin) base length aptamers. The results show that with the longer aptamer, the surface density decreases only by 25% (1.3 1012 molecules cm2), while the use of shorter aptamers results in a more than 3 times larger aptamer surface coverage (6.2 1012 molecules cm2). The similar surface coverage values of the aptamers, which are relevant to our study (45- and 81-mer), make separate optimizations superfluous. However, in case of using short aptamer sequences, the optimal surface modification protocol might differ significantly from what is proposed here. Characterization of interactions between aptamer and plant virus coat protein The concentration dependence of the SPR signal was investigated, first, for MT32 and PSA-H viral proteins (purified from bacterial lysates) in PBS. Aptamers for MT32 and PSA-H proteins were immobilized on bare Au SPR chips according to This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
the optimized protocol. While the aptamer selection employs nucleic acids with the variable sequence flanked by two primers, in the majority of the studies only the variable region is used further for affinity binding. This is based on the assumption that the flanks do not influence the aptamer–ligand binding. To test this assumption, we have extended our study to the HS-PSA-H aptamer flanked by the two primers (PSA-H-Flank). In all cases, the aptamers were more selective to the protein for which they were selected (Fig. 3). Rather remarkably, specificity was obtained only in the case of the PSA-H-Flank aptamer, which gave no response at all to MT32 protein. However, the PSA-HFlank aptamer also showed a lower sensitivity to PSA-H than the shorter PSA-H aptamer. While the sensitivity decrease for PSA-H can be explained by the ca. 25% smaller surface coverage (binding capacity) of the longer aptamer strand as compared with its shorter counterpart, the specificity requires a separate study to determine whether it is only an effect of the longer linker or the primer regions are, indeed, involved in the aptamer–ligand binding. Preliminary calculations revealed considerably stronger secondary structures for the PSA-H-Flank due to at least one additional stem in the secondary structure and further stabilization of the only stem in the PSA-H aptamer by two additional base pairs.47 Overall, the implication of the flank region in
secondary structure formation decreases the minimal free energy associated with the most probable structure of PSA-H aptamer from 2.4 to 13.7 kcal/mol. On the other hand, evaluation of aptamers with a QGRS mapping48 tool indicated that the flank region does not contribute to the formation of better G-quadruplex candidates but increases the number of G-planar candidates. The selectivity order correlates with the dissociation constants (Kd) of the aptamer–protein complexes derived from the kinetic analysis of SPR transients. Thus, in the case of MT32 protein, the HS-MT32 aptamer was characterized by a Kd that was lower with ca. 1 order of magnitude than that of the HS-PSA-H aptamer, i.e., 5.5 108 M as opposed to 2.9 107 M. The PSA-H protein–aptamer dissociation constants also increased in the order PSA-H (8.0 109 M), PSA-H-Flank (2.6 108 M), and MT32 (8.3 108 M), in agreement with the observed selectivity behavior.
Determination of virus coat proteins in plant extracts While the HS-TEG background resists well the non-specific adsorptions, the mixed self-assembled monolayer of HS-aptamer and HS-TEG remained to be tested owing to the fact that aptamer layers with high negative surface charge densities might induce non-specific electrostatic adsorption of proteins with isoelectric points (pI) higher than the pH of the working buffers. The complexity of the plant extract samples is well illustrated by the results of a recent genome-scale proteomic analysis of the common Arabidopsis thaliana, which identified more than 13 000 plant proteins.49 Indeed, challenging the aptamer surfaces with concentrated protein extracts from non-infected plants showed considerable non-specific adsorption (Table 2). The extent of the non-specific adsorption from a single batch of plant extract was practically the same for HS-MT32 and HS-PSA-H-modified surfaces, but significantly lower for the longer HS-PSA-H-Flank. This indicates an excellent reproducibility of the microspotted aptamer surfaces. However, the non-specific adsorption varied to a much greater extent from plant to plant and even from batch to batch of the same plant species (Table 2). To test whether the non-specific adsorption is indeed caused by electrostatic interaction, we used two purified proteins, i.e., avidin from egg white and its derivative, Neutravidin, having pI values of 10.5 and 6.3, respectively. PSA-H aptamer-coated chips were challenged with 250 nM concentrations of these proteins. According to the expectations, avidin, which is positively charged at pH 7.4, gave a resonant angle shift Table 2 Extent of non-specific interactions from a single batch of plant extract expressed as a shift in the resonant angle at various HS-aptamer/ HS-TEG surfaces Resonant angle shift/m ( SD)a
Fig. 3 SPR calibration curves of (A) MT32 and (B) PSA-H proteins by using MT32 (a), PSA-H (b), and PSA-H-Flank (c) aptamer-modified biochips. The experimental data are fitted with a hyperbolic equation for specific binding.
This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
Apple leaf extract Pear leaf extract
HS-MT32
HS-PSA-H
HS-PSA-H-Flank
33.8 1.4 13.5 0.5
34.5 1.6 15.1 0.4
21.0 1.6 10.0 1.0
a The SD of the non-specific adsorption levels were up to 23.2 m for different extracts of the same plant.
Analyst, 2010, 135, 918–926 | 923
of 220.5 ( 3.0) m while Neutravidin, slightly negatively charged at this pH, only gave 8.5 ( 0.5) m . Due to the similarity in size, the large resonant angle shift obtained for avidin is difficult to be explained by anything else other than electrostatic interaction. In fact, the interaction between a positively charged macromolecule and a negatively charged surface resembles the formation of polyelectrolyte multilayers.50 Of note, HS-TEG surfaces showed insignificant non-specific adsorption with all studied samples, which makes them ideal to compensate for refraction index-based changes, but completely inadequate as reference surfaces to assess the virus coat protein concentration in plant extracts. Since non-specific interactions are difficult to be reproduced even with extracts from the same type of plant, the classical differential approach, i.e., subtraction of the signal of a reference plant extract from that of the virus-infected plant extract cannot be used. Extensive dilutions of the sample and stringent washing are also inappropriate since they result in a dramatic decrease in sensitivity. Therefore, we adopted another approach based on the assumption that the electrostatic interaction is the dominant driving force in the non-specific adsorption. We implemented a reference surface modified with random sequence DNA strands of similar length as the aptamer probe and immobilized at the same surface density. The use of such a ‘self-referencing’ surface on the aptamer chip, in principle, circumvents the need for standardized blank plant extracts and considerably simplifies the assay. To prove the hypothesis, microspots of the three aptamer probes and a random sequence DNA were made on bare Au SPR chips and the interactions between the surface-bound oligonucleotides and the MT32 virus coat protein-spiked apple leaf extracts were determined (Fig. 4). The obtained data are comparable to those measured in ideal solutions, the longer PSA-H-Flank and shorter PSA-H aptamers showing a very low response, while the MT32 aptamer produced almost linear resonant angle shift increments with increasing MT32 protein concentrations. The proportional decrease in the sensitivity can be attributed to the concurrent non-specific
Fig. 4 Calibration curves of MT32 in apple leaf extract with the three different aptamers. The curves were corrected for non-specific interaction by using the average resonant angle shifts (DQ) recorded on reference spots consisting of a mixed HS-TEG and a random sequence thiolated ssDNA. The experimental data are fitted with a hyperbolic equation for specific binding.
924 | Analyst, 2010, 135, 918–926
adsorption, which apparently reduces the binding capacity of the surface-bound aptamers. Measuring virus-infected plant samples The self-referencing method used for detecting virus coat proteins in plant extracts was tested on the ASPV-positive plant extracts obtained from Bioreba. The responses of the three aptamers to ASPV-infected plant extracts and to their negative control are shown in Fig. 5 at a total protein concentration of 500 mg mL1. In all cases, the aptamer responses were corrected by subtracting the signal measured on the random sequence modified reference. The results clearly show that a proper discrimination of the positive and negative controls can be made by label-free detection based on HS-PSA-H and HS-MT32 aptamers. The lack of response of the highly specific HS-PSA-H-Flank aptamer and the highest response obtained from MT32 aptamer suggest that the plant extract contains only the MT32 protein, indicating the presence of the ASPV in agreement with the specifications of the manufacturer. We further investigated the concentration dependence of the signal and, thus, the feasibility of detecting ASPV infections in samples of various dilutions. Fig. 6A shows typical response curves for ASPV-infected samples and of the negative control at different dilutions. As expected, the SPR signals decrease upon dilution, and an excellent discrimination of the negative control was obtained. While the lack of response of the PSA-H-Flank aptamer was preserved throughout the investigated concentration range, HS-MT32 and HS-PSA-H exhibited a well distinguishable response in the studied concentration range, which again demonstrates the feasibility of detecting ASPV infections even in considerably diluted plant extracts. The different forms in which the virus proteins can be present in the samples should, however, have an influence on the magnitude of the SPR response. The ASPV-contaminated plant extracts might contain whole viruses, virus fragments, and virus coat proteins. As the sensitivity of the SPR response is influenced by the form of the surface-bound species, the standardization and quantitative determination of ASPV without previous
Fig. 5 Responses to ASPV-infected apple leaf extracts at a total protein concentration of 500 mg mL1: (a) MT32, (b) HS-PSA-H, (c) HS-PSA-HFlank aptamers.
This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
Fig. 7 Typical scanning electron micrographs: (A) of the reference surface without immobilized aptamer and (B) the HS-MT32-modified surface after incubation in ASPV-contaminated plant extract. Fixation with glutaraldehyde and negative staining was used to image the surfacebound virus segments. The scale bars are 500 nm. Fig. 6 (A) Background-corrected SPR response curves of HS-MT32based aptamer chips to ASPV-contaminated apple leaf extracts at different dilutions of the total protein content. (B) Concentration dependence determined for the three different aptamers: (a) HS-MT32, (b) HS-PSA-H, (c) HS-PSA-H-Flank.
purification is hardly possible in real samples. Unfortunately, the purification is extremely tedious and time-consuming and by far exceeds the requirements for a fast routine analysis. Therefore, it is important to find out whether the aptamers are capable of recognizing the virus coat proteins even if they are part of a whole virus or a virus fragment. The relatively large SPR signal suggests that virus fragments may also bind to the surfaceimmobilized aptamers. To confirm this assumption, the sensor surface was subjected to scanning electron microscopy (SEM) analysis. In this respect, an MT32-modified SPR sensor chip was incubated in the ASPV-contaminated sample (total protein concentration in working buffer, 693 mg mL1) with concomitant assessment of the SPR response. After the binding was confirmed, the surface was flushed with 5% glutaraldehyde for 15 min to fix the virus to the surface. The sensor chip was dismounted from the instrument and incubated with 1% Zn uranyl acetate for 1 min (negative staining). Fig. 7 shows the SEM images of an aptamer-modified surface and a HS-TEG protected surface. Filamentous virus fragments (2.2 107 virus fragments cm2)28 are clearly visible on the aptamer-modified surfaces, while they are missing on all images recorded on the aptamer-free surfaces. This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
Conclusions Here, we show that it is possible to produce by contra-selection aptamers with differentiated response to close homologues of plant virus coat proteins, and by that, to specifically detect ASPV virus fragments. SPR imaging is introduced both as a fast means to optimize a mixed HS-aptamer/HS-TEG self-assembled monolayer for optimal binding and for analyzing plant virus contamination in plant extracts. While ethylene glycol-modified surfaces by themselves proved to have excellent resistance against non-specific adsorption even from highly concentrated plant protein extracts, their mixing with aptamers increases the nonspecific adsorption. This is shown to originate from the generally not mentioned, electrostatically-driven non-specific interaction between the negatively charged aptamers and sample proteins with high pI. Such interactions render especially difficult the use of aptamer chips in plant protein extracts. Obvious approaches such as increasing the ionic strength of the sample (washing solutions) or using non-infected samples as references were found to reduce the sensitivity or to be severely limited by a high variation in the composition of plant protein extracts (even for the same plant), respectively. The use of a reference surface modified with a random sequence oligonucleotide of similar length as the aptamer and of the same surface coverage is shown to provide a simple solution to this problem as it can be used to effectively correct for the non-specific adsorption enabling the direct assessment of ASPV contamination even in concentrated plant extracts. Analyst, 2010, 135, 918–926 | 925
Acknowledgements This work was supported by the Hungarian Scientific Fund OTKA (NF 69262) and NKTH-OTKA (K68161). T. M. gratefully acknowledges the support of the Bolyai Janos Fellowship. The authors thank Beata Komorowska for providing virus coat protein coding vector constructs and Dr D. Wegmann for careful reading of the manuscript.
References 1 C. Tuerk and L. Gold, Science, 1990, 249, 505–510. 2 A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature, 1990, 346, 818–822. 3 S. Klussmann, The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications, Wiley-VCH, Weinheim, 2006. 4 O. C. Farokhzad, J. J. Cheng, B. A. Teply, I. Sherifi, S. Jon, P. W. Kantoff, J. P. Richie and R. Langer, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2006, 103, 6315–6320. 5 C. M. Blake, B. A. Sullenger, D. A. Lawrence and Y. M. Fortenberry, Oligonucleotides, 2009, 19, 117–128. 6 S. Tombelli, M. Minunni and M. Mascini, Biosens. Bioelectron., 2005, 20, 2424–2434. 7 S. D. Jayasena, Clin. Chem., 1999, 45, 1628–1650. 8 S. Tombelli, M. Minunni, E. Luzi and M. Mascini, Bioelectrochemistry, 2005, 67, 135–141. 9 Y. Li, H. J. Lee and R. M. Corn, Anal. Chem., 2007, 79, 1082–1088. 10 L. M. Furtado, H. Su, M. Thompson, D. P. Mack and G. L. Hayward, Anal. Chem., 1999, 71, 1167–1175. 11 M. Minunni, S. Tombelli, A. Gullotto, E. Luzi and M. Mascini, Biosens. Bioelectron., 2004, 20, 1149–1156. 12 M. Liss, B. Petersen, H. Wolf and E. Prohaska, Anal. Chem., 2002, 74, 4488–4495. 13 C. A. Savran, S. M. Knudsen, A. D. Ellington and S. R. Manalis, Anal. Chem., 2004, 76, 3194–3198. 14 K. Maehashi, T. Katsura, K. Kerman, Y. Takamura, K. Matsumoto and E. Tamiya, Anal. Chem., 2007, 79, 782–787. 15 D. K. Xu, D. W. Xu, X. B. Yu, Z. H. Liu, W. He and Z. Q. Ma, Anal. Chem., 2005, 77, 5107–5113. 16 D. W. Drolet, L. Moon-McDermott and T. S. Romig, Nat. Biotechnol., 1996, 14, 1021–1025. 17 O. C. Farokhzad, S. Y. Jon, A. Khadelmhosseini, T.-N. T. Tran, D. A. LaVan and R. Langer, Cancer Res., 2004, 64, 7668–7672. 18 V. Pavlov, Y. Xiao, B. Shlyahovsky and I. Willner, J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 11768–11769. 19 N. Hamaguchi, A. Ellington and M. Stanton, Anal. Biochem., 2001, 294, 126–131. 20 R. Yamamoto and P. K. R. Kumar, Genes Cells, 2000, 5, 389–396. 21 X. H. Fang, A. Sen, M. Vicens and W. H. Tan, ChemBioChem, 2003, 4, 829–834.
926 | Analyst, 2010, 135, 918–926
22 S. Fredriksson, M. Gullberg, J. Jarvius, C. Olsson, K. Pietras, S. M. Gustafsdottir, A. Ostman and U. Landegren, Nat. Biotechnol., 2002, 20, 473–477. 23 I. German, D. D. Buchanan and R. T. Kennedy, Anal. Chem., 1998, 70, 4540–4545. 24 T. G. McCauley, N. Hamaguchi and M. Stanton, Anal. Biochem., 2003, 319, 244–250. 25 C. Wilson and J. W. Szostak, Chem. Biol., 1998, 5, 609–617. 26 L. C. Bock, L. C. Griffin, J. A. Latham, E. H. Vermaas and J. J. Toole, Nature, 1992, 355, 564–566. 27 G. P. Martelli and W. Jelkmann, Arch. Virol., 1998, 143, 1245–1249. 28 H. Koganezawa and H. Yanase, Plant Dis., 1990, 74, 610–614. 29 P. Gugerli and M. E. Ramel, Acta Hort. (ISHS), 2004, 657, 59–69. 30 L. Nemchinov, A. Hadidi and F. Faggioli, Acta Hort. (ISHS), 1998, 472, 67–73. 31 J. Kummert, V. L. A. Marinho, G. Rufflard, D. Colinet and P. Lepoivre, Acta Hort. (ISHS), 1998, 472, 97–104. 32 J. Kummert, M. Malice, S. Marbot, P. Lepoivre, S. Steyer and R. Oger, Acta Hort. (ISHS), 2004, 657, 541–546. 33 N. Yoshikawa, H. Matsuda, Y. Oda, M. Isogai, T. Takahashi, T. Ito and K. Yoshida, Acta Hort. (ISHS), 2001, 550, 285–290. 34 W. Jelkmann, J. Gen. Virol., 1994, 75, 1535–1542. 35 M. B. Murphy, S. T. Fuller, P. M. Richardson and S. A. Doyle, Nucleic Acids Res., 2003, 31, e110. 36 P. Gugerli, Rev Suisse Vitic. Arboric. Hortic., 1984, 16, 87–88. 37 I. Mannelli, M. Minunni, S. Tombelli and M. Mascini, Biosens. Bioelectron., 2003, 18, 129–140. 38 H.-Z. Yu, C.-Y. Luo, C. G. Sankar and D. Sen, Anal. Chem., 2003, 75, 3902–3907. 39 B. Ge, Y.-C. Huang, D. Sen and H.-Z. Yu, J. Electroanal. Chem., 2007, 602, 156–162. 40 A. B. Steel, T. M. Herne and M. J. Tarlov, Anal. Chem., 1998, 70, 4670–4677. 41 D. Montesarchio, Nucleic Acids Symp. Ser., 2008, 52, 9–10. 42 S. Balamurugan, A. Obubuafo, R. L. McCarley, S. A. Soper and D. A. Spivak, Anal. Chem., 2008, 80, 9630–9634. 43 T. Hermann and D. J. Patel, Science, 2000, 287, 820–825. 44 S. Balamurugan, A. Obubuafo, S. A. Soper, R. L. McCarley and D. A. Spivak, Langmuir, 2006, 22, 6446–6453. 45 K. L. Prime and G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 10714–10721. 46 P. C. Anderson and S. Mecozzi, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 5290– 5291. 47 N. R. Markham and M. Zuker, Nucleic Acids Res., 2005, 33, W577– W581. 48 O. Kikin, L. D’Antonio and P. S. Bagga, Nucleic Acids Res., 2006, 34, W676–682. 49 K. Baerenfaller, J. Grossmann, M. A. Grobei, R. Hull, M. HirschHoffmann, S. Yalovsky, P. Zimmermann, U. Grossniklaus, W. Gruissem and S. Baginsky, Science, 2008, 320, 938–941. 50 G. Decher, Science, 1997, 277, 1232–1237.
This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2010
The FASEB Journal article fj.09-144246. Published online July 12, 2010.
The FASEB Journal • Research Communication
Selection and versatile application of virus-specific aptamers Zso´fia Balogh,* Gergely Lautner,† Viola Bardo´czy,‡ Beata Komorowska,§ Ro´bert. E. Gyurcsa´nyi,†,储 and Tama´s Me´sza´ros*,储,1 *Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, Budapest, Hungary; †Department of Inorganic and Analytical Chemistry and ‡Department of Applied Biotechnology and Food Science, Budapest University of Technology and Economics, Budapest, Hungary; §Research Institute of Pomology and Floriculture, Skierniewice, Poland; and 储 Research Group of Technical Analytical Chemistry, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary ABSTRACT Although the significance of molecular diagnostics in routine plant virus detection is rapidly growing, the preferred methods are still antibody-based enzyme immunoassays. In the past decade, aptamers have been demonstrated to be viable alternatives of antibodies in many applications. We set out to select apple stem pitting virus (ASPV)-specific aptamers and to apply them as antibody substitutes in various immunoassay methods. The applied systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) procedure resulted in highly discriminative aptamers selectively binding to the target virus coat protein even in complex protein matrixes. We developed protocols for exploitation of aptamers in diverse plant virus diagnosis methods, such as dot and Western blot analyses and enzyme-linked oligonucleotide assay (ELONA). Our selected aptamers proved to be superior to the available antibody in all aspects. In contrast to the antibody, the aptamers decorate both native and denaturated proteins, and ELONA produces higher signal intensity than traditional enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with virus-infected plant extract. Summarily, our results present the selection and practical utilization of first plant virus-specific aptamers. Most important, the first application of ELONA for virus detection is demonstrated, which proposes a novel, more flexible, and cost-effective means of virus diagnostics.—Balogh, Z., Lautner, G., Bardo´czy, V., Komorowska, B., Gyurcsa´nyi, R. E., Me´sza´ros, T. Selection and versatile application of virus-specific aptamers. FASEB J. 24, 000 – 000 (2010). www.fasebj.org
Key Words: DOS-ELONA 䡠 SELEX 䡠 immunoblot 䡠 virus coat protein Pathogen detection, identification, and quantification are crucial tasks of human, animal, and plant health protection. Despite the established pathogen detection systems, there is a clear demand for rapid, highly selective, and low-cost approaches. Because of the relatively high mutation rates and evolution of viruses, development of protocols for virus detection is 0892-6638/10/0024-0001 © FASEB
especially challenging, as pathogen detection protocols have to be readily convertible for detection of continuously appearing new strains (1). Methodologically, virus identification tests can be divided into direct identification of the virus or indirect demonstration of virus exposure by observing the symptoms or detecting the specific antibodies raised by the infection (2). Direct detection comprises the traditional viral isolation culture, as well as application of more recent methodologies, allowing the measurement of virus-specific antigens and genetic components. Although PCR-related methods, especially real-time PCR, have become widely accepted molecular tools for virus detection, typing and subtyping, their application is limited by a complicated procedure, susceptibility to contamination, and a high false-positive rate (3). Considering these drawbacks, detection of virus-specific antigens with various immunoassay protocols seems to be preferred for screening large number of samples (4). In addition, protein-based detection is often more informative than nucleic-acid-based identification protocols since determination of viral proteins that exist only in the acute phase of the disease provides valuable information about the activity of virus (5). The increasing interest in point-of-care pathogen detection further highlights the inevitability of antibodies in virus diagnostics because most of these systems use immobilized immunoglobulins for specific capture of the targeted analytes (6). Since antibodies are basic components of the most popular virus diagnostic tests, generation of highly selective antibodies remains one of the major bottlenecks of method development. Although appearance of hybridoma technology has provided the theoretical background for the unlimited production of uniform antibodies, in practice, monoclonal antibody genera1 Correspondence: Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, Tuˆzolto´ u. 37-47, H-1094 Budapest, Hungary. E-mail:
[email protected] doi: 10.1096/fj.09-144246
1
tion is laborious, time consuming, and most important, could not circumvent the inherent limitations of antibody production (7). In the past decade, the different in vitro antibody library display systems have superseded the hybridoma technology, but their widespread application is restricted by the lack of costeffective scale-up production of the selected immunoglobulin fragments (8). In principle, disadvantages of antibody generation could be considerably obviated if the selective recognition of target molecules is based on receptors of synthetic origin. Because of their in vitro selection and production, aptamers are one of the most promising synthetic receptor alternatives (9). Aptamers are singlestranded oligonucleotides that can be selected to bind various target molecules, including small organic molecules and macromolecules or even whole cells, by an in vitro procedure, referred to as SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (10). There are now various methodological variations to the original SELEX protocol, but the essence remains the selection of specific target binding sequences from a DNA or RNA library, typically comprised of 1012 to 1015 different sequences, via an iterative procedure (11). After folding into well-defined spatial structure, aptamers bind their targets with affinities similar to those of antibody-antigen interactions, but they are easier to reproduce and chemically modify. Since the description of SELEX, a panel of virus protein-specific aptamers has emerged as potential antiviral drug molecules, but only a few of them were applied for specific detection of viruses (12–14). Apple stem pitting virus (ASPV) is commonly present in apple and pear cultivars worldwide, causing various symptoms, such as xylem pitting, epinasty, partial yellowing of leaf veins, and red mottling on infection (15, 16). ASPV has been described as a filamentous virus with single-stranded RNA forming 15-nm-wide and 800-nm-long particles and grouped into the Foveavirus plant virus genus (17). Sequence analysis of virus isolates revealed significant level of genome heterogeneity among the isolates, which makes the reliable ASPV detection challenging (18). Presently, the routine ASPV detection relies on biological indexing by grafting or mechanical inoculation of infected tissues onto indicator hosts, but several efforts have been made to invent faster, more robust, and flexible detection protocols. The developed nucleic acid-based detection protocols, such as RT-PCR (19 –21) and molecular beacons (22), are sensitive but cannot fulfill the requirements of highthroughput virus tests because they involve rather substantial sample pretreatment and are error prone (3). Recently, monoclonal antibodies have been also produced for serological identification of ASPV isolates in apple and pear protein extracts, and an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) protocol has been introduced using this monoclonal antibody (23). In the present study, we selected the first aptamers 2
Vol. 24
November 2010
recognizing plant virus coat proteins with affinities in the micromolar-to-nanomolar range, as determined by surface plasmon resonance (SPR). The selected aptamers were successfully used for identification of virusinfected plant protein extracts with SPR and dot blot, as well as for detection of coat proteins with Western blot analysis, which implies recognition of both native and denatured proteins. Most important, we invented a double oligonucleotide sandwich-enzyme-linked oligonucleotide assay– enzyme-linked oligonucleotide assay (DOS-ELONA) protocol for determination of protein concentration that completely relies on aptamers circumventing the antibody demand of ELISA. Using this novel method, we found that virus coat protein was detectable with high accuracy in complex protein matrix with general instrumentation. Finally, we demonstrated that DOS-ELONA is an apt approach for sensitive and specific identification of ASPV-infected plant samples. Collectively, the presented data suggest that aptamers can be used as receptor molecules of various virus identification methods in raw samples and could prove to be a valuable tool for developing simple, cost-effective virus diagnostic systems in the future.
MATERIALS AND METHODS Cloning of virus coat protein coding sequences The ASPV coat protein coding sequences of MT32 isolate from apple (AF438521) and PSA-H isolate from pear (D21828) were amplified by attb1ASPV7956; 5⬘-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgacttccaatggatccca-3⬘ and attb2ASPV9263; 5⬘ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcatagccgccccggttaggtt-3⬘ primers from cDNA. The Gateway entry clones were created by inserting the PCR products into pDONR 201 vectors (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) by BP recombination, and the fidelity of amplification was confirmed by sequencing. The purified pDONR 201 vectors containing specific viral cDNA fragments were used in LR recombination with pDEST17 (Invitrogen) expression vector. Expression and purification of virus coat proteins BL21(DE3)pLysS cells (Novagen; EMD Biosciences, Gibbstown, NJ, USA) were transformed with the ASPV coat protein coding pDEST17::MT32 and pDEST17::PSA-H constructs. Bacterial cell cultures were grown in 500 ml Luria-Bertani medium containing carbenicillin (100 g/ml) and chloramphenicol (35 g/ml) at 37°C with intensive agitation until midlog phase, then protein expression was induced for further 5 h at 30°C with 0.4 mM isopropyl--d-thiogalactopyranoside (IPTG). Bacterial cells were harvested by centrifugation at 5000 rpm, 4°C for 20 min, resuspended in 20 ml lysis buffer [10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, and 0.1% Triton X-100; Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); pH 7.5] and disrupted by sonicating on ice 5 times for 30 s. Following centrifugation at 13,000 rpm for 30 min, at 4°C, the supernatant was incubated with 200 l of Ni-charged His Bind resin (Novagen; EMD Biosciences). Unspecific proteins were removed by washing the resin with lysis buffer complemented with 150 mM imidazole, then His-tagged coat proteins were eluted by incubating the resin with PBS (10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, and 137 mM NaCl; pH 7.5)
The FASEB Journal 䡠 www.fasebj.org
BALOGH ET AL.
containing 500 mM imidazole. The elution was repeated twice, and purity of the eluted fractions was analyzed by SDS-PAGE. Selection of aptamers The degenerate oligonucleotide library was synthesized at 1 M scale and HPLC purified (Metabion, Martinsried, Germany). This library, referred to as the SELEX library, is composed of 40 random nucleotides flanked by fixed sequences; 5⬘-agcctcgtctgttctccc-40N-gggaagacaagcagacgt3⬘. SELF, 5⬘-agcctcgtctgttctccc-3⬘, and SELR, 5⬘-biotinacgtctgcttgtcttccc-3⬘, primers annealing to the flanking regions were used during selection procedure. The final PCR for cloning was carried out by applying the nonbiotinylated version of SELR. The SELEX procedure was implemented according to published protocol with minor modifications (24). Oligonucleotide library stock solution (1 nmol) was diluted into 100 l of PBS-T solution (10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, and 0.05% Triton-X; pH 7.5), incubated at 95°C for 2 min, and immediately cooled on ice. The obtained mixture was completed with 9.9 ml of PBS-T containing 0.1 g/ml dIdC and 1 g/ml BSA. Bead-bound PSA-H or MT32 protein (30 l; ⬃300 pM) was added to this solution and incubated with shaking for 30 min at room temperature. Following incubation, the nonspecifically bound oligonucleotides were discarded by washing the resins 3 times with 1 ml of PBS-Tween solution. The proteins with the remaining aptamers were eluted from the resin with 20 l 500 mM imidazole and 20 mM Tris (pH 8.0), and transferred to the PCR mixture. The 100-l PCR mixture contained 10 l 10⫻ reaction buffer, 1.5 U of Taq polymerase (Invitrogen), 1 M primers SELF and biotinylated SELR, 0.8 mM dNTPs, and 1.5 mM MgCl2. Amplification conditions were 2 min at 95°C; 18 cycles of 30 s at 95°C; 30 s at 56°C; 30 s at 68°C; 2 min at 68°C. After checking the PCR product quality on 2.5% agarose gel, 23 l of 5 M NaCl was added to the remaining 90 l PCR mixture. This solution was divided into two parts and incubated with Reacti-Bind streptavidincoated high-binding capacity plate (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) then washed with 3⫻ 1 ml of PBS-Tween. The nonbiotinylated strands were separated from the immobilized complementary strand by a 5-min incubation with 30 l/well of fresh 100 mM NaOH. The ssDNA was removed and diluted into 1 ml of PBS-Tween containing 1.5 l of 1 M NaH2PO4 buffer to adjust the pH to 7.5. Finally, the material was heated to 95°C for 5 min and then immediately placed on ice and kept at 4°C until the next round of SELEX. In the following rounds of selection, the conditions were identical, except that the amount of protein was reduced to 150 pmol (rounds 2–9) and subsequently 100 pmol (rounds 11–15). To increase the specificity of aptamers, counterselection was performed after rounds 3, 6, 9, and 12. Bead-bound PSA-H and MT32 (15 l) was added to the oligonucleotide batches selected for MT32 and PSA-H in the preceding rounds, respectively, incubated for 30 min with shaking, and the supernatants were used for the next round of selection. The final PCR of the selected ssDNAs was performed with SELF and nonbiotinylated SELR primers. Finally, 4 l of PCR mixture was ligated into p-GEM-T-easy (Promega, Madison, WI, USA) vector by T/A cloning, and DH5␣ Escherichia coli-competent cells were transformed with the ligation mixture. Twenty colonies were picked from both selections and tested for the presence of the right size inserts by colony PCR with M13 forward and reverse primers. The PCR products were purified by polyethylene glycol precipitation and sequenced by using M13 promoter primer (25). The SPR analysis and dissociation constants (Kd) of the aptamer-protein complexes were determined as described by Lautner et al. (26). APPLICATION OF VIRUS-SPECIFIC APTAMERS
Western and dot-blot analysis with aptamers The viral coat protein-expressing bacterial cells were used for Western blot analysis as follows. IPTG-induced culture medium (1 ml) was collected by centrifugation and resuspended in 100 l Laemmli sample buffer (62 mM Tris-HCl, 2% SDS, 50 mM dithiothreitol, 10% glycerol, and 0.002% bromophenol blue; pH 6.8), and incubated for 5 min at 95°C. Denatured proteins (20 g) were resolved by 10% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membranes (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) by semidry blotting. The membranes were then blocked with protein-free blocking buffer (Thermo Fisher Scientific), for 20 min at ambient temperature. After blocking, the membranes were incubated for 90 min with PBS containing 50 nM 3⬘-biotinylated aptamer at room temperature, and washed 3⫻ 10 min with washing buffer (PBS with 0.2% Tween 20). ExtrAvidin-conjugated HRP (Sigma-Aldrich) was diluted in PBS (1:2000) and incubated with the membrane for 1 h at room temperature. After we discarded nonspecifically bound ExtrAvidin-HRP by washing, the bands were visualized on film by using SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific). Native viral coat protein-containing plant extracts were used for dot-blot analysis. 100 ng ASPV, ApMV, ACLSVpositive (BioReba AG, Reinach, Switzerland) protein extracts were directly spotted onto nitrocellulose membrane. All the following steps of dot-blot analysis were identical to the Western blot procedure, except that the applied aptamer concentration was 25 nM. Detection of coat protein by DOS-ELONA Maleimide-activated clear strip plates (Thermo Fisher Scientific) were activated with 50 pmol 3⬘-thiolated MT32 aptamer without flank regions in 100 l binding buffer (PBS, 10 mM EDTA, and 0.05% Tween-20; pH 7.2) for 150 min at ambient temperature. Prior to activation, thiol groups were reduced by sodium borohydride treatment (27). After aptamer immobilization, the wells were washed 3 times with washing buffer (PBS, 1 mM EDTA, 0.2% and Tween-20; pH 7.2), and the unreacted binding sites were eliminated by incubating the wells with 150 l 10 mM cystein solution in binding buffer for 30 min at ambient temperature. The plate was washed as before and blocked by incubation with 150 l/well proteinfree blocking buffer (Thermo Fisher Scientific) for 30 min at ambient temperature. In the next step, 100 l bacterial crude protein extract (PBS, 1 mM EDTA, 0.2% Tween-20, 1 mM PMSF; pH 7.2 with 0.5 mg/ml protein concentration) and the same extract spiked with various amount of PSA-H protein were added onto the aptamer-coated, pretreated wells and gently shaken for 1 h at ambient temperature. The plate was washed, as described previously, and then all wells received 50 pmol 3⬘-biotinylated PSA-H aptamer in 100 l washing buffer. After 1 h incubation at ambient temperature, the plate was washed, and 100 l/well of 1:5000 diluted ExtrAvidin-conjugated alkaline phosphatase (Sigma-Aldrich) in PBS was added. Following 1 h incubation at room temperature and three consecutive washing steps, 100 l ASPV-detecting kit substrate solution (BioReba) was introduced in each well, and the absorbance was measured at 405 nm after 1-h incubation at 30°C. Detection of virus particles by DOS-ELONA The NucleoLink plate (Thermo Fisher Scientific) was modified according to the manufacturer’s instructions. The MT32 protein-specific aptamer was synthesized with 5⬘-end phosphorylation and TTTTT linker. Modified oligonucleotide 3
(10 pmol) was covalently linked to the wells by incubating it overnight at 50°C with 10 mM 1-methylimidazole (SigmaAldrich) and 10 mM 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide methiodide (Sigma-Aldrich), pH 7.0 in 100 l total volume. Following the binding, the wells were washed 3 times with 200 l 0.4 M NaOH containing 0.25% Tween 20 at 50°C, soaked for 15 min, then washed 3 times again. To remove residual NaOH, the wells were washed 3 times with 200 l ultrapure water, soaked for 5 min, and washed 3 times again. The aptamer-coated wells were blocked for 30 min with 150 l 5% BSA (Sigma-Aldrich) containing 0.1 g/ml dIdC (Sigma-Aldrich) at ambient temperature. After blocking, 100 l of ASPV, APMV, and ACLSV virus-infected samples (BioReba), or virus-free apple leaf extract with 100 g/ml protein concentration was added to the wells for 30 min at room temperature. In next step, the wells were washed 3 times with 200 l washing buffer (PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.2), then incubated with 10 pmol MT32 protein specific 3⬘-biotinylated aptamer in 100 l PBS, pH 7.2 for 30 min at room temperature. Nonspecifically bound aptamers were removed by washing the wells 3 times with 200 l of washing buffer, then 100 l of diluted ExtrAvidin conjugated alkaline phosphatase (Extravidin-AP, 1:5000) in PBS (pH 7.2) was added to each well. After 1 h of incubation and 3 washing steps, the signal development was achieved by adding 100 l ASPV detecting kit substrate solution. The color development was detected after 15 min of incubation by absorbance measurement at 405 nm.
RESULTS Selection of virus coat protein-specific aptamers Plant virus infection can be effectively assessed by detection of specific coat proteins (28). Therefore, our aptamers were developed against virus coat protein of two ASPV isolates (MT32 and PSA-H), whose amino acid sequences show 81% identity. The MT32 and PSA-H protein binding oligonucleotides were isolated according to previously published in vitro ssDNA selection protocol with minor modifications (24). Briefly, His-tagged ligand proteins were produced and purified, as described in Materials and Methods and immobilized on Ni-NTA beads. The aptamers were selected by incubating the immobilized proteins with a random oligonucleotide library, consisting of ⬃1014 diverse sequences. Selection of nonspecific, general proteinbinding oligonucleotides was eliminated by the addition of excess amount of dIdC and BSA into the selection buffer, and vigorous washing of protein-oligonucleotide complex-bearing beads. Following the 15th round of selection, sequences of 20 –20 virus coat protein binding ssDNA were determined (Supplemental Fig. 1). Interestingly, though 50% of clones selected for MT32 and 45% of clones selected for PSA-H proteins possessed identical sequences, alignment of these two sequences did not reveal homologous sequences or similar motifs. Many published aptamers are G rich and adopt a variety of G-quadruplex structures. Since the guanosine content of the most abundant aptamers was ⬃50%, their nucleotide sequences were analyzed to evaluate G-quadruplex-forming capacity (29). The search re4
Vol. 24
November 2010
sulted in identification of G-quadruplexes in both sequences; however, the determined structures were diverse (Fig. 1). Characterization of aptamers by SPR To study the binding characteristics of the two most abundant aptamers, the variable regions of oligonucleotides were synthesized with HS-(CH2)6-TTTT linkers at the 3⬘ end and directly attached to gold chips (30). The affinities between the aptamers and the purified proteins were measured with surface plasmon resonance (SPR) (26), and the dissociation constants Kd of the aptamerprotein complexes were derived from the kinetic analysis of SPR transients. The PSA-H aptamer demonstrated an ⬃2 orders of magnitude lower Kd for PSA-H (8.0⫻10⫺9 M) than for MT32 protein (2.9⫻10⫺7 M). In contrast, alteration of the purified proteins produced a minor difference in the Kd values associated with the MT32 aptamer binding either MT32 (5.5⫻10⫺8 M) or PSA-H protein (8.3⫻10⫺8 M), as determined by SPR. According to data obtained from SPR analysis, MT32 aptamer seemed to be the appropriate candidate for generic detection of ASPV coat proteins; thus, its selectivity was tested by application of plant protein extracts contaminated with ASPV, apple mosaic virus (ApMV), or apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV). Bare gold SPR chips were microspotted with thiolated MT32 aptamer and oligoT strands of similar length as the aptamer. The oligoT strands provided the reference spots to correct for contingent nonspecific binding. The imaging SPR measurements and subsequent two-sample t test revealed no significant resonant angle shift difference at 0.05 level between the surface bound reference oligoT and MT32 on challenging with ApMVand ACLSV-infected plant samples. In contrast, the ASPV-containing samples produced ⬃5 times higher signal with the specific aptamer-coated chips in comparison to the reference (Fig. 2). These results indicated that the MT32 aptamer is able to discriminate between different virus species. Aptamer-assisted Western and dot-blot analysis The specificity of selected aptamers was further validated by Western blot analysis of the protein extracts of bacterial cells synthesizing the relevant virus coat proteins. MT32- and PSA-H-overexpressing bacterial crude protein extracts were separated by PAGE, and the optimal conditions of Western blot were determined by testing various membranes and blocking solutions. Once we optimized the protocol, the nitrocellulose membrane with immobilized crude protein extracts was blocked with protein-free blocking solution, and incubated with biotin-labeled MT32 and PSA-H protein-specific aptamers. The oligonucleotide binding was detected by ExtrAvidin-HRP catalyzed, enhanced chemiluminescence. Although both aptamers decorated a single protein at the expected
The FASEB Journal 䡠 www.fasebj.org
BALOGH ET AL.
Figure 1. Nucleotide sequence and predicted secondary structures of MT32- and PSA-H aptamers. Putative secondary structures were predicted by quadruplex analyzing tool, and most presumptive structures are illustrated. G-quadruplexes forming guanosines are underscored.
size, neither of them could differentiate the virus protein homologues (Fig. 3). Next, to determine whether the aptamers could be used to differentiate between various virus-infected
samples by dot-blot analysis, ASPV-, ApMV-, and ACLSV-infected crude plant protein extracts were spotted on nitrocellulose membrane and detected as described for Western blot analysis. In accordance with
Figure 2. Surface plasmon resonance responses to ASPV-, APMV- and ACLSV-infected plant extracts. Resonant angle shifts recorded on MT32 aptamer (a) and oligoT reference spots (b) at 100 g/ml total protein concentration.
Figure 3. Western blot analysis of crude protein extracts from virus coat protein-overexpressing bacterial cells with aptamers. Total protein extracts of MT32- (A) and PSA-H-overexpressing E. coli cells (B) were separated by 10% PAGE and blotted onto nitrocellulose membrane. The MT32- and PSA-H proteins were decorated with MT32 (1) and PSA-H biotinylated aptamers (2) and detected by ExtrAvidin-HRPcatalyzed-enhanced chemiluminescence.
APPLICATION OF VIRUS-SPECIFIC APTAMERS
5
the studies on denatured proteins, both aptamers produced signal with similar intensity on ASPV-containing spots, while no signal could be detected with ApMVand ACLSV-infected plant samples (Fig. 4). Notably, according to densitometric evaluation, aptamer labeling of infected plant protein extracts generated roughly 10 times more intensive signal compared to detection with a monoclonal antibody (Supplemental Fig. 2). These results indicate that the selected aptamers are suitable for specific and sensitive detection of virus coat proteins both in their native and denatured form in complex protein matrices, but they could not differentiate the two closely homologous coat proteins in these circumstances. Detection of virus coat proteins by ELONA The ELONA has been published as an alternative of traditional ELISA method (31). Although the combined ELONA detects its target protein with high sensitivity and specificity, it does not present a genuine alternative of well-established ELISA systems, since its application is largely limited by the availability of the appropriate antibody. To circumvent this shortcoming, we set out to compose a virus coat proteindetecting method solely based on aptamers. The MT32 aptamer was synthesized with 5⬘-terminal thiol functional group and immobilized on a maleimide activated microtiter plate. The aptamer-coated wells were saturated with protein-free blocking solution and incubated with bacterial, crude protein extracts spiked with various amounts of purified PSA-H protein. Following the protein incubation and washing steps, biotinylated PSA-H aptamer was applied into the wells, and binding of the biotin-labeled aptamer was detected with ExtrAvidin-AP and p-nitrophenyl phosphate substrate. On the basis of the results of the t test performed at the 0.05 level, the alkaline phosphatase-catalyzed reaction produced a clearly discernible signal down to 100 ng of PSA-H protein, even in such a complex matrix as a crude bacterial extract (Fig. 5). These data are well described (R2⫽0.999) by a standard 4-parameter logistic function. The ASPV genome is encapsulated by thousands of copies of the same protein; hence, in theory, the
Figure 4. Specificity of MT32 and PSA-H protein specific aptamers and ASPV assessed by dot-blot analysis. Virus-infected plant protein extracts were spotted onto nitrocellulose membrane and probed with either biotinylated MT32 (A) or PSA-H aptamers (B). Binding of aptamers was detected by ExtrAvidin-HRP-catalyzed-enhanced chemiluminescence. 6
Vol. 24
November 2010
Figure 5. DOS-ELONA for PSA-H determination in crude bacterial extracts. Thiol-labeled MT32 aptamer was immobilized onto maleimide-activated microtiter plate, and the plates were incubated with bacterial crude protein extract containing different amounts of PSA-H protein. Captured virus coat protein was detected by using biotinylated PSA-H aptamer and ExtrAvidin-AP. Indicated absorbance values are average of 3 measurements, with the background corresponding to bacterial crude protein extract (A405⫽0.16) subtracted at each concentration level. Data are fitted with a 4-parameter logistic model; insert shows the residual plot.
virions can be identified by using a single aptamer. To confirm this hypothesis, MT32 aptamer coated plates were incubated with extracts from ASPV-, ApMV-, and ACLSV-infected and healthy plants and the captured viruses were detected by using biotin labeled MT32 aptamer and ExtrAvidin-AP. The signals produced by extracts from ApMV- and ACLSVinfected plants were at the level of the negative control. In comparison, challenging the aptamercoated wells with ASPV-containing samples, the signal intensity was 3 times higher (Fig. 6). To determine the accordance between ELONA and ELISA virus detection, the ASPV and negative control samples were assayed by commercial dual antibody sandwich (DAS) ELISA. Although this second approach was also suitable for identification of virusinfected samples, the DOS-ELONA proved to be superior in terms of sensitivity. While the 1:20 diluted samples could be clearly identified with ELONA, the purely antibody-based detection produced signal was around the background level already at 1:6 dilution (Supplemental Fig. 3). In agreement with the semiquantitative dot-blot analysis, these data indicated that detection of virus particles by aptamers is definitely more sensitive compared to the antibody-based methodologies. DISCUSSION Antibodies with high affinity and specificity are still at the heart of many pathogen diagnostic systems, but
The FASEB Journal 䡠 www.fasebj.org
BALOGH ET AL.
Figure 6. DOS-ELONA for virus detection in crude plant extracts. Phosphorylated MT32 aptamer was immobilized onto microtiter plate, and the plates were incubated with 10 g of protein extract from ASPV-, APMV-, or ACLSV-infected or virus-free plants. Captured virus particles were detected by using biotinylated MT32 aptamer and ExtrAvidin-AP. Indicated absorbance values are averages of 4 measurements.
their predominance has been challenged by various nucleic acid-based methods. Although most of these approaches aim at identification of pathogens via determination of their nucleic acid composition, since the advent of aptamers, oligonucleotides could be exploited for direct detection of the protein components of a given microbe. In this report, we presented selection and application of the first plant virus-specific aptamers. Because of their more straightforward isolation protocol and nuclease resistance, DNA rather than RNA aptamers were evolved following a slightly modified SELEX procedure that uses Ni-NTA beads for immobilization of His6-tagged target proteins during selection (32, 24). The presented protocol can be conveniently performed in general molecular biology laboratories without any specialized instrumentation. The selection conditions and stringent washing of protein-oligonucleotide complex-bearing beads put forward in this report generate aptamers with high affinity and specificity. Our selection procedure resulted in isolation of 6 MT32 and 8 PSA-H-specific aptamer sequences (Supplemental Fig. 1). Notably, the same oligonucleotide sequence was identified 10 times for MT32 protein, while the most prominent PSA-H protein-specific aptamer was found in 9 clones, indicating that the applied SELEX protocol sufficiently enriched the target protein specific aptamers. The 4-stranded DNA structures, known as G quadruplexes, are stabilized by planar tetramers formed by Hoogsteen-bonded guanosine moieties. The pivotal role of G quadruplexes in tertiary structure formation of oligonucleotides has been revealed by NMR studies with a thrombin-specific aptamer (33). Since then, diverse aptamers have been analyzed in this respect, and in several cases, the G tetrad represented the key structural motif for target binding (34). Our selected APPLICATION OF VIRUS-SPECIFIC APTAMERS
aptamers are guanosine rich with putative Gquadruplex-forming capacity, and inspection of their sequences by G-tetrad mapping algorithm indeed identified a panel of possible quadruplexes in both aptamers. Furthermore, multiple sequence alignment analysis of enriched oligonucleotides indicated that their most homologous region overlaps with the assumed G quadruplexes; however, the most prominent MT32 aptamer showed the lowest homology with all other oligonucleotides (Supplemental Fig. 1). Interestingly, planar array of guanosines of the studied PSA-H aptamer is further stabilized by a stem formed by 5 complementary base pairs that could explain the low dissociation constant of proteinaptamer complex and dominance of this sequence among the emerged oligonucleotides. The binding characteristics of the two most abundantly emerged oligonucleotides were determined by SPR analysis, and the obtained 10⫺9 to 10⫺8 M dissociation constants were similar to or even orders of magnitude lower than Kd values of previously published hepatitis and influenza virus-specific aptamers, confirming the success of the selection procedure (35–37). The two studied aptamers showed marked difference in changes of dissociation constants on alteration of protein ligands. The aptamer evolved for PSA-H protein displayed 2 orders of magnitude higher dissociation constant with MT32 than with PSA-H protein, 2.9 ⫻ 10⫺7 M vs. 8.0 ⫻ 10⫺9 M. On the contrary, binding kinetics analysis of MT32-specific aptamer with the two different proteins revealed a negligible difference in values of the dissociation constant, both were in the 10⫺8 M range. Seemingly, the studied MT32 aptamer could not discriminate between the homologous proteins; thus, it is likely to recognize a common epitope of them. According to these data, MT32 aptamer can be used for detection of coat proteins of various ASPV isolates. The specificity of MT32 aptamer was studied by SPR with the application of crude plant extracts infected by ASPV, ApMV, or ACLSV. These latter two viruses were chosen for being widespread apple viruses and often coinfecting with ASPV. A novel approach was developed to enhance the selectivity of the virus detection by using oligoT reference spots to correct the SPR signal obtained at the virus protein-specific aptamer-coated spots. As the oligoT strands have identical length as the aptamers, they are especially suitable to assess the extent of nonspecific adsorption from crude plant extracts; thus, this method circumvents the need for virus-free samples and considerably simplifies the assay (26). The data acquired from these measurements clearly demonstrated selectivity of MT32 aptamer, showing 5 times higher background-corrected resonant angle shift increment with ASPV-contaminated sample and no significant increase with ApMV and ACLSVcontaining plant extracts. Significantly, besides confirmation of the specificity of our aptamers, these results imply a general approach for rapid detection of viruses in complex matrices. The selectivity of aptamers developed for MT32 and PSA-H virus coat proteins were also verified by means of 7
using biotinylated oligonucleotides in Western blot analysis. Both aptamers decorated the denatured, crude protein extracts at the expected size and showed no crossreactivity to any E. coli proteins, indicating that the tested aptamers recognize their protein epitopes even in linear form. According to the SPR studies, the PSA-H aptamer distinguishes between the coat proteins of the different ASPV isolates; however, it did not demonstrate discriminating capability with membrane-immobilized proteins. Lack of virus coat protein selectivity of PSA-H aptamer could be the result of either the altered structure of epitopes or the diverse incubation conditions of aptamerprotein complexes (38). During the SPR analysis, the immobilized aptamers were allowed to capture their native protein partners in solution, and the duration of incubation was in the order of a few minutes, which is only a fraction of 2 h, the time applied in Western blot analysis. The conditions of aptamer-protein complex formation applied during SPR analysis might favor selective binding of the two homologous proteins, while the selectivity is lost in Western blot. Although the sensitivity of PCR-based virus detections are orders of magnitude higher than that of immunological methods, due to its rapidity, simplicity, and cost-effectiveness, dot-blot enzyme immunoassay could be an apt method of choice for on-site virus detection (39, 40). To test whether MT32 and PSA-H aptamers could serve as antibody-substituting reagents in dot-blot analysis, plant crude protein extracts with different viruses were directly applied on nitrocellulose filter and incubated with biotinylated aptamers as sensor molecules. As shown in Fig. 2, aptamers bound exclusively to the protein extracts derived from ASPV-infected plants, while no detectable signal was obtained with ApMV- and ACLSVinfected plant samples. Furthermore, sensitivity comparison of antibody and aptamer-based dot-blot analysis indicated that detection of virus infection requires magnitudes lower plant protein extract with the aptamer-based approach (Supplemental Fig. 2). Although the first application of aptamers in ELONA was published with encouraging results ⬎10 yr ago, since then, only a limited number of publication have presented utilization of this methodology (31, 41, 42). Here, we offered the first instances of using ELONA as a virus detection approach; moreover, the presented methods circumvent the antibody demand of the original ELONA format (31). Hitherto, the double aptamer sandwich format has been applied mainly to enhance the sensitivity of protein-detecting biosensors (43). A microbe-detecting sandwich aptamer-linked immobilized sorbent assay (ALISA) with superiority to ELISA also has been reported, but its reproducibility is questionable since the authors utilized a cocktail of the selected oligonucleotides rather than single aptamers, and the aptamers were immobilized nonspecifically through hydrophobic and ionic interactions onto the microtiter plate (44). In our first DOS-ELONA, two stipulated aptamers that can bind simultaneously to their protein targets were used, and the proper orien8
Vol. 24
November 2010
tation of capture aptamer was ensured by covalent linkage via functionalized 3⬘ end of oligonucleotide. This novel DOS-ELONA configuration was suitable for accurate determination of target protein concentration in crude protein extract. In the second DOS-ELONA protocol, exploiting the composition of viral capsids, the same aptamer was used for capturing and detection of virions, further simplifying the sample analysis. The single aptamer-based DOS-ELONA was able to differentiate between crude plant extracts infected with various plant viruses and proved to be superior to the available ASPV-detecting ELISA in terms of sensitivity. The shown ELONA data attest that the aptamer sandwich assay is a plausible alternative of traditional ELISA, having equal specificity and higher sensitivity than the antibody-based assay. The measured higher sensitivity could not be unambiguously elucidated because of the unknown characteristics of the applied antibody, yet some assumption could be considered. First, the target protein of ASPV-specific antibody is obscure since it was raised against purified virions; thus, it cannot be ruled out that the availability of antibody epitopes depends on the actual extraction conditions. In contrast, the aptamers were selected with purified virus coat proteins and recognize their ligands even in denatured form. Consequently, the sample preparation is less likely to influence the accessibility of aptamerbinding motifs of the protein. Second, considering their micromolar to nanomolar Kd values, our studied aptamers could be superior to the applied antibody in terms of binding kinetics. Most importantly, the virus capsid consists of thousands of identical coat proteins, and the smaller size of the aptamers allows them to bind to the virions more densely than the IgG molecules; hence, detection of viruses with aptamers could produce higher signal intensity at the same virion concentration. While the first two possible drawbacks of antibodies can be alleviated by raising high-quality antibodies, the smaller size is an inherent advantage of aptamers, implying that they could generally surpass performance of antibodies as virus-detecting tools. Although aptamers have become increasingly popular recognition elements, only a limited number of publications demonstrate their diagnostic application in complex matrix. The data showed in this study emphasize the potentiality of aptamers as feasible recognition molecules in diverse immunoassay methods and offer the very first instance for measuring protein concentration and virus identification in complex sample matrix by DOS-ELONA. Considering their flexible selection, small size, stability, and higher sensitivity, aptamers are expected to rival antibodies as recognition molecules of virus diagnostics. The authors thank Wilhelm Jelkmann (Julius Kuehn Institute-Federal Research Center for Cultivated Plants, Institute for Plant Protection in Fruit Crops and Viticulture, Dossenheim, Germany) for kindly providing PSA-H-infected plants. This work was supported by the Hungarian Scientific Fund OTKA (NF 69262) and NKTH-OTKA (K68161). T.M. gratefully acknowledges the support of the Bolyai Ja´nos Fellowship.
The FASEB Journal 䡠 www.fasebj.org
BALOGH ET AL.
REFERENCES 1. 2. 3.
4.
5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
15. 16.
17. 18. 19.
20.
21.
22.
23.
24.
Bonhoeffer, S., and Sniegowski, P. (2002) Virus evolution. The importance of being erroneous. Nature 420, 367–369 Charlton, B., Crossley, B., and Hietala, S. (2009) Conventional and future diagnostics for avian influenza. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 32, 341–350 Kummert, J., Malice, M., Marbot, S., Lepoivre, P., Steyer, S., and Oger, R. (2004) Sampling protocols and risk of error significance in molecular detection tests for fruit trees certification. Acta Hortic. (ISHS) 657, 541–546 Takahashi, M., Saito, H., Higashimoto, M., Atsukawa, K., and Ishii, H. (2005) Benefit of hepatitis C virus core antigen assay in prediction of therapeutic response to interferon and ribavirin combination therapy. J. Clin. Microbiol. 43, 186 –191 Thompson, R. L., Preston, C. M., and Sawtell, N. M. (2009) De novo synthesis of VP16 coordinates the exit from HSV latency in vivo. PLoS Pathog. 5, e1000352 Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., and Justesen, A. F. (2008) Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors. Biosens. Bioelectron. 24, 339 –348 Jayasena, S. D. (1999) Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628 –1650 Hudson, P. J., and Souriau, C. (2003) Engineered antibodies. Nat. Med. 9, 129 –134 Mairal, T., Ozalp, V. C., Lozano Sanchez, P., Mir, M., Katakis, I., and O’Sullivan, C. K. (2008) Aptamers: molecular tools for analytical applications. Anal. Bioanal. Chem. 390, 989 –1007 Tuerk, C., and Gold, L. (1990) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment—RNA ligands to bacteriophage-T4 DNA-polymerase. Science 249, 505–510 Gopinath, S. C. B. (2007) Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171–182 Dausse, E., Gomes, S. D., and Toulme, J. J. (2009) Aptamers: a new class of oligonucleotides in the drug discovery pipeline? Curr. Opin. Pharmacol. 9, 602– 607 Bunka, D. H., and Stockley, P. G. (2006) Aptamers come of age—at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588 –596 Ahn, D. G., Jeon, I. J., Kim, J. D., Song, M. S., Han, S. R., Lee, S. W., Jung, H., and Oh, J. W. (2009) RNA aptamer-based sensitive detection of SARS coronavirus nucleocapsid protein. Analyst 134, 1896 –1901 Nemeth, M., (1986) Viruses, Mycoplasma and Ricketsia Diseases of Fruit Trees pp. 216 –219, Akademiai Kiado, Budapest, Hungary Cameron, H. R. (1989) Pear vein yellows. In Virus and Viruslike Diseases of Pome Fruits and Simulating Noninfectious Disorders (Fridlund, P.R., ed.) pp. 175–181, Cooperative Extension College of Agriculture and Home Economics, Washington State University, Pullman, WA, USA Martelli, G. P., and Jelkmann, W. (1998) Foveavirus, a new plant virus genus. Arch. Virol. 143, 1245–1249 Yoshikawa, N., Matsuda, H., Oda, Y., Isogai, M., Takahashi, T., Ito, T., Yoshida, K., (2001) Genome heterogeneity of apple stem pitting virus in apple trees. Acta Hortic. (ISHS) 1–2, 285–290 Kummert, J., Marinho, V. L. A., Rufflard, G., Colinet, D., Lepoivre, P. (1998) Sensitive detection of apple stem grooving and apple stem pitting viruses from infected apple trees by RT-PCR. Acta Hortic. (ISHS) 472, 97–104 MacKenzie, D. J., McLean, M. A., Mukerji, S., Green, M. (1997) Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription-polymerase chain reaction. Plant. Dis. 81, 222–226 Komorowska, B., Malinowski, T., and Michalczuk, L. (2010) Evaluation of several RT-PCR primer pairs for the detection of Apple stem pitting virus. [E-pub ahead of print] J. Virol. Methods doi: 10.1016/j.jviromet.2010.04.024 Klerks, M. M., Leone, G., Lindner, J. L., Schoen, C. D., and van den Heuvel, J. F. J. M. (2001) Rapid and sensitive detection of Apple stem pitting virus in apple trees through RNA amplification and probing with fluorescent molecular beacons. Phytopathology 91, 1085–1091 Gugerli, P., and Ramel, M.E. (2004) Production of monoclonal antibodies for the serological identification and reliable detection of Apple stem pitting and Pear yellow vein viruses in apple and pear. Acta Hortic. (ISHS) 657, 59 – 69 Murphy, M. B., Fuller, S. T., Richardson, P. M., and Doyle, S. A. (2003) An improved method for the in vitro evolution of
APPLICATION OF VIRUS-SPECIFIC APTAMERS
25. 26.
27. 28.
29. 30.
31. 32. 33.
34. 35.
36. 37.
38. 39.
40. 41.
42.
43. 44.
aptamers and applications in protein detection and purification. Nucleic Acids Res. 31, e110 Rosenthal, A., Coutelle, O., and Craxton, M. (1993) Large-scale production of DNA sequencing templates by microtitre format PCR. Nucleic Acids Res. 21, 173–174 Lautner, G., Balogh, Z., Bardo´czy, V., Me´sza´ros, T., and Gyurcsa´nyi, R., E. (2010) Aptamer-based biochips for label-free detection of plant virus coat proteins by SPR imaging. Analyst 135, 918 –926 Nivison, T. Helen, and Hanson, R. Maureen (1987) Production and purification of synthetic peptide antibodies. Plant Mol. Biol. Rep. 5, 295–309 Croft, H., Malinowski, T., Krizbai, L., Mikec, I., Kajic, V., Reed, C., Varga, A., and James, D. (2008) Use of Luminex xMAPderived Bio-Plex bead-based suspension array for specific detection of PPV W and characterization of epitopes on the coat protein of the virus. J. Virol. Methods 153, 203–213 Kikin, O., D’Antonio, L., and Bagga, P. S. (2006) QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Res. 34, W676 –W682 Balamurugan, S., Obubuafo, A., McCarley, R. L., Soper, S. A., and Spivak, D. A. (2008) Effect of linker structure on surface density of aptamer monolayers and their corresponding protein binding efficiency. Anal. Chem. 80, 9630 –9634 Drolet, D. W., Moon-McDermott, L., and Romig, T. S. (1996) An enzyme-linked oligonucleotide assay. Nat. Biotechnol. 14, 1021–1025 Dougan, H., Lyster, D. M., Vo, C. V., Stafford, A., Weitz, J. I., and Hobbs, J. B. (2000) Extending the lifetime of anticoagulant oligodeoxynucleotide aptamers in blood. Nucl. Med. Biol. 27, 289–297 Macaya, R. F., Schultze, P., Smith, F. W., Roe, J. A., and Feigon, J. (1993) Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3745–3749 Gatto, B., Palumbo, M., and Sissi, C. (2009) Nucleic acid aptamers based on the G-quadruplex structure: therapeutic and diagnostic potential. Curr. Med. Chem. 16, 1248 –1265 Jones, L. A., Clancy, L. E., Rawlinson, W. D., and White, P. A. (2006) High-affinity aptamers to subtype 3a hepatitis C virus polymerase display genotypic specificity. Antimicrob. Agents. Chemother. 50, 3019 –3027 Chen, F., Hu, Y., Li, D., Chen, H., and Zhang, X. L. (2009) CS-SELEX generates high-affinity ssDNA aptamers as molecular probes for hepatitis C virus envelope glycoprotein E2. PLoS One 4, e8142 Gopinath, S. C., Misono, T. S., Kawasaki, K., Mizuno, T., Imai, M., Odagiri, T., and Kumar, P. K. (2006) An RNA aptamer that distinguishes between closely related human influenza viruses and inhibits haemagglutinin-mediated membrane fusion. J. Gen. Virol. 87, 479 – 487 Baldrich, E., Restrepo, A., and O’Sullivan, C. K. (2004) Aptasensor development: elucidation of critical parameters for optimal aptamer performance. Anal. Chem. 76, 7053–7063 Reina, J., Padilla, E., Alonso, F., Ruiz De Gopegui, E., Munar, M., and Mari, M. (2002) Evaluation of a new dot blot enzyme immunoassay (directigen flu A⫹B) for simultaneous and differential detection of influenza a and B virus antigens from respiratory samples. J. Clin. Microbiol. 40, 3515–3517 Nadala, E. C. B., and Loh, P. C. (2000) Dot-blot nitrocellulose enzyme immunoassays for the detection of white-spot virus and yellow-head virus of penaeid shrimp. J. Virol. Methods 84, 175–179 Ferreira, C. S. M., Papamichael, K., Guilbault, G., Schwarzacher, T., Gariepy, J., and Missailidis, S. (2008) DNA aptamers against the MUC1 tumour marker: design of aptamer-antibody sandwich ELISA for the early diagnosis of epithelial tumours. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1039 –1050 Papamichael, K. I., Kreuzer, M. P., and Guilbault, G. G. (2007) Viability of allergy (IgE) detection using an alternative aptamer receptor and electrochemical means. Sensor Actuat. B-Chem. 121, 178–186 Ikebukuro, K., Kiyohara, C., and Sode, K. (2004) Electrochemical detection of protein using a double aptamer sandwich. Anal. Lett. 37, 2901–2909 Vivekananda, J., and Kiel, J. L. (2006) Anti-Francisella tularensis DNA aptamers detect tularemia antigen from different subspecies by aptamer-linked immobilized sorbent assay. Lab. Invest. 86, 610–618 Received for publication March 19, 2010. Accepted for publication June 17, 2010.
9
www.afm-journal.de www.MaterialsViews.com
FULL PAPER
Selective Artificial Receptors Based on Micropatterned Surface-Imprinted Polymers for Label-Free Detection of Proteins by SPR Imaging Gergely Lautner, Jevgeni Kaev, Jekaterina Reut, Andres Öpik, Jörg Rappich, Vitali Syritski,* and Róbert E. Gyurcsányi* cost-effective fabrication. Therefore, generating stable, selective receptors on an entirely chemical basis has received a lot of interest and, accordingly, MIPs were tested for a rather comprehensive range of applications focusing mainly on separation,[3–5] sensing,[6–9] catalysis,[10,11] and drug delivery.[12] Molecular imprinting has proven to be very successful in generating polymeric materials for recognizing small molecular weight compounds. However, the simple extrapolation of bulk molecular-imprinting methods to biomacromolecules, in particular proteins, has encountered difficulties.[13] These difficulties are related to the mass transport limitation of large molecular weight compounds in highly reticulated polymeric networks, which leads to their entrapment during imprinting rather than to binding sites permitting free ligand exchange with the sample solution. Additional challenges arise owing to the necessity of using aqueous media for imprinting, the flexibility of the protein conformation and its susceptibility to environmental conditions, and the inherent complexity and diversity of the interactions between proteins and MIPs.[14] Therefore, new strategies and materials were proposed to address the intricacy of protein imprinting. Obvious solutions include the use of macroporous polymers[15,16] and polymers with a lower degree of cross-linking to permit access to the protein targets in the bulk MIP[17] as well as the use of MIP films of thicknesses comparable to the size of the proteins. Although successful examples were reported for both of these approaches, the use of thin MIP films seems to be preferred, especially for sensing applications, since polymers of low degree of cross-linking are predisposed to lose their recognition properties.[18] The MIP nanoparticles[19] and nanometer thin films formed either on planar[20] or microparticle supports[21] have a significant part of their imprinted binding sites on their surface; thus, this approach was shown to be feasible for protein imprinting and compatible with common bioassay formats.[20,22] Sophisticated surface imprinting (SI) approaches were also introduced with the aim to ensure that the binding sites are exclusively located on the surface of MIPs as well as in an attempt to better control the binding site density and homogeneity. The SI methods involve the immobilization of protein templates on a solid support that acts either as a sacrificial[23]
A novel concept to generate micropatterned surface-imprinted polymers (SIPs) for protein recognition by using standard photolithographic technology is introduced. Avidin-imprinted poly(3,4-ethylenedioxythiophene)/ poly(styrenesulfonate) (PEDOT/PSS) conducting polymer microbands are prepared directly on surface plasmon resonance (SPR) chips, which enable convenient label-free monitoring of the binding events. The novel surfaceimprinted microstructures bind avidin, the template protein, with dissociation constants in the submicromolar range (125 nM). The SIPs have an avidin binding capacity approximately one order of magnitude higher than the corresponding nonimprinted polymers and are able to discriminate among functional homologues of avidin, i.e., neutravidin, extravidin, and streptavidin.
1. Introduction Molecularly imprinted polymers (MIPs) are selective, synthetic sorbents prepared from a mixture of functional monomers in the presence of a target molecule that acts as a template.[1,2] During polymerization, the template induces binding sites in the polymer matrix that are capable of selectively recognizing the target molecule. The main benefits of this universal approach are related to the synthetic nature of MIPs, i.e., their excellent chemical and thermal stability associated with reproducible,
G. Lautner, Prof. R. E. Gyurcsányi Department of Inorganic and Analytical Chemistry Budapest University of Technology and Economics Szt. Gellért tér 4, Budapest, H-1111, Hungary E-mail:
[email protected] J. Kaev, Dr. J. Reut, Prof. A. Öpik, Dr. V. Syritski Department of Materials Science Tallinn University of Technology Ehitajate tee 5, Tallinn, 19086, Estonia E-mail:
[email protected] Dr. J. Rappich Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie GmbH Institut für Si-Photovoltaik Kekuléstrasse 5, 12489 Berlin, Germany Prof. R. E. Gyurcsányi Research Group for Technical Analytical Chemistry Hungarian Academy of Sciences Szt. Gellért tér 4, Budapest, H-1111, Hungary
DOI: 10.1002/adfm.201001753
Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 591–597
© 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
wileyonlinelibrary.com
591
www.afm-journal.de www.MaterialsViews.com
FULL PAPER
or transfer material.[24–26] Since protein imprinting is rendered more difficult by the thermodynamic motion of proteins in the solution,[27] the quality of the imprint is expected to be improved by using immobilized templates. Imprinting exclusively the surface of a polymer was realized in a variety of ways including microcontact printing with protein-modified stamps[28,29] and taking advantage of immobilized templates within the pores of sacrificial nano-[23] or microporous membranes.[30] In terms of effective protein sensing, however, it still remains to develop synthesis procedures for surface-imprinted polymers (SIPs) that are compatible with large-scale fabrication technologies. Additionally, they have to offer the possibility of patterning multiple recognition sites for various proteins on one chip and can be intimately integrated with a suitable sensor substrate enabling the direct, label-free detection of selective recognition events. In an attempt to fulfill all these expectations, we introduce a novel concept of generating micropatterned, surfaceimprinted electrically conducting polymers for protein recognition and demonstrate their application within an SPR imaging sensing platform. Apart from the overwhelming majority of the MIPs prepared by chemical synthesis, we used electrochemical oxidation to form surface-imprinted poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) doped with poly(styrenesulfonate) (PSS). The PEDOT/ PSS material provides a matrix with low nonspecific protein adsorption and, together with the electrochemical synthesis, offers clear advantages in terms of controlling the deposition process and compatibility with aqueous media.[30] The procedure is based on forming 5-μm-wide and 2-μm-deep microchannels from AZ photoresist on the Au substrate and then depositing polycarbonate (PC) within the channels by spin coating. After subsequent removal of the photoresist, the model protein (avidin (Av)) is adsorbed on the walls of the PC microchannels. Thus, the electrodeposition of PEDOT results in polymer film bands confined within the PC microchannels. Dissolution of the sacrificial PC leads to chips with micropatterned polymer structures possessing the complementary imprint of the target protein on their lateral surface (Figure 1).
2. Results and Discussion Since SPR is a surface analytical technique, the protein binding sites of the MIPs should be within the penetration depth of the evanescent wave, i.e., roughly up to a few hundred nanometers depending primarily on the wavelength of the light source and the properties of the dielectric layers. For small molecular weight compounds, the integration of MIP films with SPR detection might seem less demanding because such compounds can diffuse within the MIP films and give a response even if the thickness of the film exceeds that of the SPR sensing zone. Still, the response time and sensitivity dramatically improve with films of nanometer thickness. Therefore, starting from the first report on using SPR for monitoring MIP–target binding events, care was taken to keep the film below ≈50 nm.[31] Various strategies were implemented to prepare thin MIP films involving surface grafting of a photoinitiator,[32] atom transfer radical polymerization,[33] and, recently, controlled electrochemical deposition[34] resulting in films with thicknesses as low as 5 nm. Interestingly,
592
wileyonlinelibrary.com
Figure 1. Schematics of the SI procedure for fabricating molecularly imprinted polymer microbands on bare Au SPR chips (a–f, left side) and the optical (a–c,e,f) microscopy images of the relevant microstructures (right side). In case of (d) the protein adsorption on PC microbands was visualized by using fluorescently labeled protein (avidin-fluorescein isothiocyanate (Av-FITC)) and epifluorescence imaging.
reports on protein detection by using MIP films on SPR transducers are scarce[35] although SPR is inherently more sensitive for detecting macromolecules[36] than low molecular weight compounds, which generally require additional amplification procedures to measure trace concentrations.[37,38] In contrast to common thin-film strategies, we here adopted a different approach to form binding sites within the sensing zone of the SPR chip by taking advantage of the inherent benefits of SI. Figure 1 shows the schematics of the imprinting process based on photolithographic patterning, which generates protein binding sites only on the lateral walls of the PEDOT/ PSS bands, i.e., perpendicular to the chip surface. Given the remarkably poor adsorption of Av used as model protein on AZ photoresist (data not shown), an additional processing step was
© 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 591–597
www.afm-journal.de www.MaterialsViews.com
needed to deposit a sacrificial material characterized by high protein adsorption. We have found that PC is well suited to adsorb Av,[30] whose surface coverage at saturation in this work was determined as 8.8 pmol cm−2, in rather close agreement with 8.3 pmol cm−2 calculated for a close-packed Av layer on the basis of a theoretical molecular cross-sectional area of 20 nm2.[39] An equally high level of adsorption was recorded also for immunoglobulins (IgGs) suggesting that PC is a generally suitable material for adsorbing high amounts of template protein (data not shown). After deposition of the PC bands and removal of the AZ photoresist, Av was adsorbed from a solution of 1 mg mL−1. According to the adsorption isotherm (Figure 2), at this concentration, the surface coverage of protein reaches its saturation value, which is preferred to maximize the binding site density on the surface of the subsequently formed PEDOT/ PSS bands. With a light source of 840 nm wavelength, the penetration depth of the evanescent wave is less than 400 nm. Therefore, the contribution of the upper surface of the polymer band located at 200–300 nm from the Au surface (Figure 3) is minimal, especially as the broadening of the SPR reflectivity curves and the concomitant shift in the resonant angle indicate that the PEDOT/PSS acts as a highly absorbing dielectric.[40] Thus the SPR will primarily detect the binding onto the lateral walls
FULL PAPER
Figure 2. The adsorption isotherm of Av on a PC surface. The amount of adsorbed protein was calculated using the Sauerbrey equation from resonant frequency changes measured upon Av adsorption on PC-coated quartz crystals by a quartz crystal microbalance (QCM).
of the SIP bands and the Au surface exposed after removing the PC. In order to ensure that the SPR signal originates exclusively from the protein binding to the SIP, the Au surface exposed upon removal of the PC layer was modified with 11-mercaptoundecyltetra(ethylene glycol) (HS-TEG), which possesses an excellent resistance to the nonspecific adsorption of proteins.[41] The presence of Av binding sites on the lateral surface of the Av-imprinted PEDOT/PSS bands was first confirmed by performing binding assays of Av-fluorescein isothiocyanate (Av-FITC) and imaging the micropatterned surface by epifluorescent microscopy. The micropatterned SIP chips were incubated in Av-FITC solutions of various concentrations for 15 min, thoroughly washed with phosphate buffer (0.05 M, pH 7.0) containing 0.05% Tween 20 solution. As negative controls, nonimprinted polymer (NIP) patterns synthesized in the absence of the target protein were also tested for Av-FITC binding. In contrast to NIP surfaces, fluorescent images of SIP micropatterns, presented in the insert of Figure 4, show fluorescent lines (white lines on a non-fluorescent black background in the grayscale image) coinciding with the location of the lateral walls of the surface-imprinted PEDOT/PSS bands. The characteristic fluorescence lines originating from the selective binding of AvFITC are noticeable from 10−4 mg mL−1. At Av-FITC concentrations exceeding 0.1 mg mL−1, there is evidence of nonspecific adsorption on both the NIP and SIP (upper surface of the polymeric bands). The nonspecific adsorption is clearly discernible as it occurs uniformly on the whole surface of the polymer bands. 2.1. SPR Measurements The SPR measurements with micropatterned polymer chips were typically performed using the arrangement shown in Figure 5. On the chip, SIP and NIP structures were formed to allow the simultaneous measurement of the binding events on both types of surfaces. The chip-to-chip reproducibility reported as the relative standard deviation of the resonance angle changes at saturation (1 mg mL−1 Av) for the different chips was 11%. Due to the high density of the SIP bands, the SPR signals were processed simply from rectangular measuring spots of 210 μm × 210 μm, which provided average resonance angle shifts from
Figure 3. Cross-sectional scanning electron microscopy images. A) PC and PEDOT/PSS bands; B) surface-imprinted PEDOT/PSS bands after removal of PC. The arrow highlights the interface between PC and PEDOT/PSS where the transfer of the protein mold takes place.
Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 591–597
© 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
wileyonlinelibrary.com
593
www.afm-journal.de
FULL PAPER
www.MaterialsViews.com
Figure 4. Fluorescence intensity of the surface-imprinted (a) and nonimprinted (b) PEDOT/PSS micropatterns as a function of Av-FITC concentration in the range of 10−5 to 1 mg mL−1. The inset shows the raw fluorescence images of the respective micropatterned surfaces.
the respective areas. This is in contrast to fluorescent measurements, where the individual SIP regions need to be selected from high-resolution fluorescence images for proper sensitivity and minimization of nonspecific contributions. The additive calibration curves shown in Figure 6 clearly demonstrate the effect of SI by enhanced Av binding of the Av–SIP micropatterns as compared to the NIP. At the highest Av concentration tested, the response of NIP microstructures was lower than that of SIPs by ca. one order of magnitude, which means that the imprinting factor is among the highest reported for protein MIPs. Remarkably, the fluorescent measurements resulted in only a twofold factor between SIPs and NIPs. This is most likely due to the much smaller contribution of the nonspecific adsorption to the overall SPR signal than in fluorescent measurements. The data were fitted with the hyperbolic equation for specific binding: B = Bmax × C/(Kd + C),
Figure 5. SPR image of the micropatterned chips. Rectangles (A) and (B) show two areas with different surface properties, typically demarking the surface-imprinted and nonimprinted polymer micropatterns. The small rectangles within each of these two large areas denote replicate spots from where the SPR signal is processed.
594
wileyonlinelibrary.com
Figure 6. A) SPR sensorgrams recorded on micropatterned Av-SIP (a) and NIP (b) surfaces upon consecutive addition of solutions with increasing Av concentration; B) the respective cumulative calibration curves fitted with a 4-parameter logistic function.
where C is the concentration of Av in the solution, and B and Bmax are the fraction of bound protein and its saturation value, respectively. As it was also found earlier[20,35] the simple monosite model fitted rather well the experimental data (R2 = 0.94, Bmax = 392.0). The calculations gave a Kd of 125 nM, which is somewhat better than we reported earlier for surface-imprinted PEDOT/PSS microrods and also more than tenfold lower than that obtained for NIP (1.4 μM). The selectivity of SIPs was further investigated with respect to Av analogues, i.e., streptavidin (ST), neutravidin (NA), and extravidin (EA) as well as proteins with similarly high isoelectric points (pIs) at the same concentration, such as lysozyme (Lys, pI 11.35) (Figure 7). The study also included bovine serum albumin (BSA), a protein of significantly lower pI (4.7) but similar molecular weight. In general, the NIPs gave a lower response to the tested proteins than Av-SIPs, which is due to the low protein adsorption on native PEDOT/PSS surfaces. As expected, the highest response on SIP surfaces was recorded for Av followed by EA, NA, and ST (Figure 7). Within the Av analogues, the magnitude of the SPR responses seems to correlate with their structural similarity to Av, as neither their pIs nor molecular weights differ significantly from each other. The proteins EA and NA are close to neutral, deglycosylated forms of Av. NA has, in addition, modified arginines. ST is a protein purified from the bacterium Streptomyces avidinii with mildly acidic pI and only 33% of the amino acid residues identical to those found in Av. In accordance, the SPR responses decreased in the order of Av, EA, NA, and ST; BSA, similar to ST, gave
Figure 7. Response of Av-SIP (a) and NIP (b) surfaces for various proteins at a concentration of 10−2 mg mL−1.
© 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 591–597
www.afm-journal.de www.MaterialsViews.com
almost no response. However, the response of Lys approached that of EA on SIP surfaces, which owing to the significant net positive charge of Lys (+7, at pH = 8) suggests that the SIPprotein interactions may have a significant electrostatic component. Importantly, Lys adsorbs in a greater extent than EA on NIP indicating an inherently significant nonspecific adsorption on the PEDOT/PSS material. While in general, little is known about the exact type of interactions between MIPs and their target proteins, the regeneration experiments might give further hints regarding the nature of these interactions. Therefore, after Av binding, the surface was treated with agents able to disrupt H bonds (1 mM NaOH, 10 mM glycine-HCl buffer (pH 2.0)), electrostatic interactions (high ionic strength solutions, 1 M NaCl), and hydrophobic interactions (1% sodium dodecyl sulfate (SDS)). Regeneration with SDS and high ionic strength solutions was found to be effective, suggesting that both hydrophobic and electrostatic interactions might play a role in the protein–MIP binding. The high charge density PEDOT/PSS films might also undergo morphological changes upon contact with high ionic strength solutions, additionally explaining the efectiveness of surface regeneration by high ionic strength solutions. Although such studies are not available for electrochemically synthesized PEDOT/PSS, chemically synthesized PEDOT/PSS films contacted with high ionic strength solutions showed a roughening of the surface, as determined by atomic force microscopy (AFM), together with evidence provided by UV-vis-NIR spectroscopy for PSS loss and incorporation of small ions.[42] On the long term, the SDS solution affected the reproducibility of further binding events; therefore, 1 M NaCl was chosen to regenerate the surface. The response of regenerated surfaces shown in Figure 8A indicates an insignificant baseline drift but somewhat lower imprinting factors. This suggests that highly concentrated NaCl solutions might affect the binding sites of the SIP. Previously, for Lys-imprinted crosslinked acrylic acid polymers, it was also reported that the NaCl concentration during polymerization and rebinding greatly affects their selectivity.[36] Performing the association steps in working buffers of increasing NaCl concentration, the amount of Av bound to the SIP surface decreased significantly (Figure 8B). This again suggests a considerable electrostatic contribution to the interaction between Av and SIP, contrary to Av-NIP
Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 591–597
FULL PAPER
Figure 8. A) SPR response of a micropatterned Av-SIP surface corrected for nonspecific interaction to various Av concentrations with subsequent regeneration between the different samples. The inset shows the relevant calibration curves fitted with a 4-parameter logistic function. B) Effect of the NaCl concentration of the working buffer in the association step on the SPR signal given by Av-SIP (a) and NIP (b) surfaces to 5 × 10−2 mg mL−1 Av solution.
binding, which is not affected by altering the ionic strength during association. It is likely that imprinting with a positively charged protein induces an increase in the concentration of PSS on the surface of PEDOT/PSS films. This phenomenon, would explain the higher affinity of the SIP for proteins of high pI and also the higher adsorption of Lys on SIP than on NIP surfaces. Still, the interaction between Av and SIP cannot be of purely electrostatic nature, as suggested by the higher response to Av and the neutrally charged EA as compared with that to Lys.
3. Conclusions
In summary, we have proved the principle of a new concept of preparing SIPs for protein recognition. The main advantage of the technology is that the SIPs are directly fabricated on SPR chips using standard photolithographic technology, which enables label-free detection of the rebinding effects and provides the premises for their routine large-scale production. Despite the structural complexity of the PEDOT/ PSS micropatterns, their interaction with proteins can be determined in a straightforward manner with SPR imaging at sensitivities that, in this particular case, outperform those of fluorescence imaging. Imprinting factors of approximately 10 and submicromolar dissociation equilibrium constants for specific bindings were obtained, which places the protein-imprinted PEDOT/PSS among the best SIPs reported so far. The avidinimprinted PEDOT/PSS microstructures were shown to discriminate even between close functional Av homologues. The ionic strength dependence of the Av binding to the SIP as well as the lesser selectivity towards lysozyme suggest a major electrostatic contribution to the binding interactions, which, however, is not solely responsible for the selective recognition of Av.
4. Experimental Section Chemicals and Materials: PVP-Free Nucleopore track etch polycarbonate (PC) membrane disks with pore diameter and density rated at 8 μm and 105 pores cm−2, respectively, were purchased from Whatman plc (Maidstone, UK). The proteins, avidin (Av, MW ≈ 66 kDa, pI ≈ 10.5), ExtrAvidin (EA, pI ≈ 6.5), lysozyme (Lys, MW 14.3 kDa, pI 11.35), bovine serum albumin (BSA, MW 66.4 kDa, pI 4.7), and streptavidin (ST, MW ≈ 60 kDa, pI 5.5), were purchased from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA) and NeutrAvidin (NA, MW 60 kDa, pI 6.3) was purchased from Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA). The buffer components (100× TRISethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (TE) buffer concentrate (pH 8.0), Tween 20, NaCl, KH2PO4, and K2HPO4) as well as 11-mercaptoundecyltetra (ethylene glycol) (HS-TEG), poly(sodium 4-styrenesulfonate) (NaPSS, MW ≈ 70 000 Da), 3,4-ethylenedioxythiophene (EDOT), and organic solvents were obtained from Sigma–Aldrich. All salts were of analytical grade and aqueous solutions were made with ultrapure water (18 MΩ cm, Millipore Corporation, USA). Fabrication of SIP Micropatterns on SPR Chips: The surface-imprinted PEDOT/PSS micropatterns were prepared on the surface of planar, bare Au SPR sensor chips (Xantec Bioanalytics GmbH, Düsseldorf, Germany) as shown in Figure 1. Thus, the Au-coated glass substrates were heated to 90 °C and transferred to a bottle containing bis(trimethylsilyl)amine
© 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
wileyonlinelibrary.com
595
www.afm-journal.de
FULL PAPER
www.MaterialsViews.com (hexamethyldisilazane, HMDS) for 3 min, using HMDS (MicroChemicals GmbH, Ulm Germany) as an adhesion promoter for the following spincoating of photoresist AZ 1518 (MicroChemicals GmbH) at 4000 min−1. Then, the samples were annealed at 90 °C for 30 min and then illuminated with a UV light via a 5-μm striped mask using a MA45 (SUSS MicroTec, Garching, Germany) with a HBO 350-W lamp (light emitting range: 350–450 nm, 18 mW cm−2, calibrated at 365 nm) for 9 s. Finally, the samples were developed from 0.6% NaOH during 10 s. A PC solution in chlorobenzene (6 mg mL−1) made by dissolving Nucleopore PC membranes was spin-coated onto the AZ-patterned Au substrate at 2000 rpm for 60 s followed by ethanol washing to remove the photoresist. The template protein solution (typically Av, 1 mg mL−1) was drop-cast onto the PC-patterned substrates and evenly spread by placing a cover glass on the chip surface, which also impeded the evaporation of the solution during incubation (15 min). The excess protein was rinsed with buffer and the protein-modified PC-patterned substrates were placed into a custom-made electrochemical cell. The 8-mL volume electrochemical cell accommodated three electrodes, i.e., the micropatterned substrate with an exposed area of 0.38 cm2 as working electrode, a Pt plate counter electrode, and a Ag/AgCl pseudo reference electrode, all connected to a Reference 600 potentiostat/galvanostat (Gamry Instruments, Inc., Warminster, PA, USA). The electrochemical deposition of PEDOT/PSS within the PC-patterned microchannels was performed in a deoxygenated aqueous solution of 0.01 M EDOT and 0.025 M NaPSS by potentiostatic electropolymerization at 0.75 V for 25 s. This resulted in PEDOT/PSS polymer bands confined to the microchannels delimited by the PC. The sacrificial PC material was then removed from the substrate surface by immersion into CH2Cl2 for 30 min. Slow stirring (ca. 120 rpm) was applied to enhance the dissolution and within this time period, CH2Cl2 was exchanged three times. The removal of the sacrificial PC pattern led to micropatterned polymer bands possessing the complementary imprint of the target protein on their lateral surface. Finally, after removing the PC, the exposed Au surface was modified with 1 mM HS-TEG solution for 30 min. After all these fabrication steps, the microstructures were imaged by optical microscopy and high-resolution field emission scanning electron microscopy (HR-SEM, Zeiss Ultra 55, Carl Zeiss SMT GmbH, Germany). For SEM images, the samples were covered with 0.5 nm of Pt by sputtering. Fluorescence Imaging: For fluorescence measurements, an epifluorescent microscope setup based on a Nikon LV100 microscope, a metal halide lamp based illumination system for excitation (Prior Lumen 200, Prior Scientific Instruments Ltd., Cambridge, UK), and a longpass emission filter set (Nikon, B-2A) was used. The fluorescence images were acquired with a Peltier-cooled charge coupled device (CCD) camera (Nikon DS-5Mc) and processed by using the NIS Elements software (Nikon). The relevant areas, i.e., the edge of the PEDOT/PSS microbands (ca. 0.7 μm) were selected on the fluorescence images and the mean values of the fluorescence intensity in arbitrary units were determined and corrected with the camera’s gain control for comparable quantitative information. Quartz Crystal Microbalance: The adsorption of the template protein, Av, on PC was studied by modifying the surface of 5-MHz Au-plated quartz crystals (Stanford Research Systems, Inc., Sunnyvale, CA, USA) by spin-coating 50 μL of PC in C6H5Cl (1 mg mL−1) at 2000 rpm for 60 s. The frequency changes due to protein adsorption were studied in a quartz crystal microbalance-flow injection analysis (QCM-FIA) system comprising two programmable precision syringe pumps (Cavro XLP 6000, Tecan Nordic AB, Mölndal, Sweden), a motorized six-way port injection valve (C22–3186EH, VICI, Valco Instruments Company Inc., USA) controlled by a microelectric actuator and a small volume (150 μL) axial flow cell attached to the QCM sensor holder of a QCM100 system (Stanford Research Systems, Inc.). All elements of the system were connected to a personal computer and controlled by a custommade software written in LabVIEW. The experimental cycles consisted in washing the PC-modified QCM sensor with TE buffer (10 mM TRIS with 1mM EDTA, pH 8.0) at 62.5 μL min−1 and then, injecting various concentrations of Av (8 × 10−4–0.5 mg mL−1) prepared in the same
596
wileyonlinelibrary.com
buffer via an injection loop (250 μL) into the flow cell. The amount of protein adsorbed was calculated from the recorded resonant frequency change using the Sauerbrey equation. Imaging SPR Measurements: For SPR imaging, an IBIS iSPR instrument (IBIS Technologies BV, Enschede, The Netherlands) equipped with version 4.2 of the operating software was used. The instrument is capable of simultaneously recording the SPR signal on the sensor surface in predefined regions of interest. Up to 30 rectangular spots of 30 × 30 pixel (approximately 210 μm × 210 μm) designating replicates or regions of different surface characteristics were used. For precise timing of the experiments, the built-in automatic liquid handling system was used in conjunction with a 3-μL flow cell thermostated at 25 °C. Sample volumes of 75 μL were injected into the flow cell at a flow rate of 30 μL s−1, followed by continuous back and forth pumping of the sample plug during the interactions at the same flow rate to diminish mass transport related limitations of the interactions. Prior to every measurement, the surface was equilibrated with TE-Tween working buffer (0.01 M TRIS, 1 mM EDTA, 0.01 wt% Tween 20, pH 8.0). A typical measurement cycle involved 300 s of association, 270 s of dissociation, and a short, 10-s regeneration step with 1 M NaCl. During the dissociation phase, the surface was washed in nine cycles with 20 μL of fresh working buffer at 30 μL s−1 for 30 s.
Acknowledgements This work is part of a Joint Research Project under the Agreement on Scientific Cooperation between the Hungarian Academy of Sciences and the Estonian Academy of Sciences. The financial support of the Hungarian Scientific Fund (NF 69262), Estonian Ministry of Education and Research Grant (SF0142714s06, ETF8249 and B612), and the EU (MRTN-CT-2006–033873) are gratefully acknowledged. This work is connected to the scientific program of the “Development of qualityoriented and harmonized R+D+I strategy and functional model at BME” project (TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010–0002). We thank Mrs. Jacob for the photolithography preparation of the samples, Dr. O. Volobujeva for SEM imaging and Dr. D. Wegmann for careful reading of the manuscript. Received: August 24, 2010 Revised: October 11, 2010 Published online: December 7, 2010
[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]
R. Arshady, K. Mosbach, Makromol. Chem. 1981, 182, 687. G. Wulff, A. Sarhan, Angew. Chem. 1972, 84, 364. B. Sellergren, Anal. Chem. 1994, 66, 1578. M. Kempe, K. Mosbach, J. Chromatogr. A 1995, 694, 3. E. Turiel, A. Martin-Esteban, Anal. Bioanal. Chem. 2004, 378, 1876. D. Kriz, O. Ramstrom, A. Svensson, K. Mosbach, Anal. Chem. 1995, 67, 2142. K. Haupt, K. Mosbach, Chem. Rev. 2000, 100, 2495. F. L. Dickert, M. Tortschanoff, W. E. Bulst, G. Fischerauer, Anal. Chem. 1999, 71, 4559. S. A. Piletsky, A. P. F. Turner, Electroanalysis 2002, 14, 317. G. Wulff, Chem. Rev. 2002, 102, 1. A. N. Cammidge, N. J. Baines, R. K. Bellingham, Chem. Commun. 2001, 2588. C. Alvarez-Lorenzo, A. Concheiro, M. R. El-Gewely, in Biotechnology Annual Review, Vol. 12, Elsevier, Amsterdam 2006, p. 225. M. Glad, O. Norrlöw, B. Sellergren, N. Siegbahn, K. Mosbach, J. Chromatogr. A 1985, 347, 11. X. Zhou, W. Li, X. He, L. Chen, Y. Zhang, Sep. Purif. Rev. 2007, 36, 257. S. Hjertén, J. Liao, K. Nakazato, Y. Wang, G. Zamaratskaia, H. Zhang, Chromatographia 1997, 44, 227.
© 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 591–597
www.afm-journal.de www.MaterialsViews.com
Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 591–597
FULL PAPER
[16] Z. Tao, E. C. Tehan, R. M. Bukowski, Y. Tang, E. L. Shughart, W. G. Holthoff, A. N. Cartwright, A. H. Titus, F. V. Bright, Anal. Chim. Acta 2006, 564, 59. [17] X. Pang, G. Cheng, R. Li, S. Lu, Y. Zhang, Anal. Chim. Acta 2005, 550, 13. [18] Y. Ge, A. P. F. Turner, Trends Biotechnol. 2008, 26, 218. [19] Y. Hoshino, H. Koide, T. Urakami, H. Kanazawa, T. Kodama, N. Oku, K. J. Shea, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 6644. [20] A. Bossi, S. A. Piletsky, E. V. Piletska, P. G. Righetti, A. P. F. Turner, Anal. Chem. 2001, 73, 5281. [21] X. W. Kan, Q. Zhao, D. L. Shao, Z. Geng, Z. L. Wang, J. J. Zhu, J. Phys. Chem. B 2010, 114, 3999. [22] S. A. Piletsky, E. V. Piletska, A. Bossi, K. Karim, P. Lowe, A. P. F. Turner, Biosens. Bioelectron. 2001, 16, 701. [23] Y. Li, H. H. Yang, Q. H. You, Z. X. Zhuang, X. R. Wang, Anal. Chem. 2006, 78, 317. [24] H. Shi, W.-B. Tsai, M. D. Garrison, S. Ferrari, B. D. Ratner, Nature 1999, 398, 593. [25] R. Schirhagl, P. A. Lieberzeit, F. L. Dickert, Adv. Mater. 2010, 22, 2078. [26] O. Hayden, C. Haderspock, S. Krassnig, X. H. Chen, F. L. Dickert, Analyst 2006, 131, 1044. [27] T. Takeuchi, T. Hishiya, Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 2459. [28] P.-C. Chou, J. Rick, T.-C. Chou, Anal. Chim. Acta 2005, 542, 20.
[29] H. Y. Lin, C. Y. Hsu, J. L. Thomas, S. E. Wang, H. C. Chen, T. C. Chou, Biosens. Bioelectron. 2006, 22, 534. [30] A. Menaker, V. Syritski, J. Reut, A. Öpik, V. Horváth, R. E. Gyurcsányi, Adv. Mater. 2009, 21, 2271. [31] E. P. C. Lai, A. Fafara, V. A. VanderNoot, M. Kono, B. Polsky, Can. J. Chem. 1998, 76, 265. [32] M. Lotierzo, O. Y. F. Henry, S. Piletsky, I. Tothill, D. Cullen, M. Kania, B. Hock, A. P. F. Turner, Biosens. Bioelectron. 2004, 20, 145. [33] X. Li, S. M. Husson, Biosens. Bioelectron. 2006, 22, 336. [34] S. W. Choi, H. J. Chang, N. Lee, J. H. Kim, H. S. Chun, J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 1113. [35] L. Uzun, R. Say, S. Unal, A. Denizli, Biosens. Bioelectron. 2009, 24, 2878. [36] T. Matsunaga, T. Hishiya, T. Takeuchi, Anal. Chim. Acta 2007, 591, 63. [37] J. Matsui, K. Akamatsu, N. Hara, D. Miyoshi, H. Nawafune, K. Tamaki, N. Sugimoto, Anal. Chem. 2005, 77, 4282. [38] M. Riskin, R. Tel-Vered, I. Willner, Adv. Mater. 2010, 22, 1387. [39] P. C. Weber, D. H. Ohlendorf, J. J. Wendoloski, F. R. Salemme, Science 1989, 243, 85. [40] S. Ekgasit, A. Tangcharoenbumrungsuk, F. Yu, A. Baba, W. Knoll, Sens. Actuators, B 2005, 105, 532. [41] G. Lautner, Z. Balogh, V. Bardóczy, T. Mészáros, R. E. Gyurcsányi, The Analyst 2010, 135, 918. [42] Y. Xia, J. Ouyang, Macromolecules 2009, 42, 4141.
© 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
wileyonlinelibrary.com
597
Analyst
View Online / Journal Homepage
C
Dynamic Article Links <
Cite this: DOI: 10.1039/c2an35419e www.rsc.org/analyst
COMMUNICATION
Homogeneous assay for evaluation of aptamer–protein interaction†
Downloaded by Budapest University of Technology and Economics on 18 July 2012 Published on 06 July 2012 on http://pubs.rsc.org | doi:10.1039/C2AN35419E
Gergely Lautner,a Zs ofia Balogh,c Anna Gyurkovics,c Robert E. Gyurcsanyiab and Tamas Meszaros*bc Received 28th March 2012, Accepted 4th July 2012 DOI: 10.1039/c2an35419e
We introduce Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (ALPHA) to assess the KD value of aptamer–protein complexes as demonstrated through the study of apple stem pitting virus coat protein-specific aptamers. This method can be used as a simple, cost-effective method for screening aptamer–target protein interactions during aptamer selection. Aptamers are short, single-stranded oligonucleotides that selectively bind to their cognate molecules upon forming specific 3D structures.1 Although many modifications have been made to the originally described in vitro selection protocol, referred to as SELEX,2 most of the aptamer generating methods fundamentally follow the same iterative procedure to isolate and identify those sequences that bind their molecular targets with the highest affinity from a random oligonucleotide library.3 Among the analytical end users, however, there is little awareness about the large number of different aptamer candidates that a selection process might generate. Ideally, the identified oligonucleotides have to be evaluated individually in terms of their binding properties, e.g., by determining the dissociation constant (KD) of aptamer–target molecule complexes to designate the most auspicious aptamers. For a great number of selected sequences this becomes an arduous task with currently employed techniques such as surface plasmon resonance (SPR),4 filter binding,5 fluorescence anisotropy (FA),6,7 and capillary electrophoresis.7,8 While SPR is the gold standard for determining the KD of biomolecular interactions9,10 it is very demanding in terms of properly optimizing the surface immobilization and has a rather low throughput even when using SPR imaging. At the same time, methods providing higher throughputs and involving simple assay methodology such as the homogeneous FA assay might not offer the desired sensitivity. Moreover, since anisotropy change of aptamer–protein systems is a complex function of multiple parameters the interpretation of the data is not always straightforward.11 a Department of Inorganic and Analytical Chemistry, Budapest University of Technology and Economics, Szt. Gell ert t er 4, H-1111 Budapest, Hungary. E-mail:
[email protected]; Fax: +36 1 4633408; Tel: +36 1 4631592 b Research Group for Technical Analytical Chemistry of the Hungarian Academy of Sciences, Szt. Gell ert t er 4, H-1111 Budapest, Hungary c Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, T} uzolt o u. 37-47, H-1094 Budapest, Hungary. E-mail:
[email protected] † Electronic supplementary information (ESI) available: Reagents, experimental details. See DOI: 10.1039/c2an35419e
This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2012
Due to the obvious advantages of simple mix-and-measure homogeneous assays without the necessity of separation and washing steps, we aimed at developing a fast, cost-effective and versatile homogeneous assay for screening protein-specific aptamers. Herein, we introduce the use of Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (ALPHA)12 for assessing the KD of protein–aptamer complexes. The approach relies on the use of donor and acceptor beads, which are coated with the binding partners, i.e., aptamer and protein target, respectively. The donor bead contains a photosensitizer that upon excitation with monochromatic light at 680 nm converts ambient oxygen to the singlet state. The singlet oxygen diffuses and reacts with the thioxene derivative in the acceptor bead generating chemiluminescence that in turn activates the fluorophore contained within the same bead. Since the singlet oxygen can travel less than ca. 200 nm in solution, the assay mixture luminescence is observed only if the interaction between the studied molecules brings the two types of beads into close proximity.13 The ALPHA method has a series of advantages even compared with other established homogeneous assays based on fluorescence detection, such as fluorescence polarization14 and time-resolved fluorescence resonance energy transfer assays.15 The outstanding sensitivity of ALPHA originates from signal amplification, i.e., each donor bead generates ca. 6 104 singlet oxygen molecules, and low fluorescence background owing to time-gated detection of the long lived fluorescence signal and the combination of a longer excitation wavelength with a shorter emission wavelength. While the utility of the technique has been demonstrated for a wide range of DNA assays,16 immunoassays,17 functional studies,18 and interaction analysis,19,20 we explore here its suitability for the evaluation of aptamer–protein interactions. Our laboratory previously selected aptamers for apple steam pitting virus (ASPV) coat proteins and determined the KD of protein– aptamer complexes by SPR.10 As this provides a proper reference we decided to apply our characterized aptamers to assess the ALPHA technology as a putative aptamer evaluating system. We focused in this study on PSA-H viral coat protein and two aptamers, PSA-H and MT32, that were shown previously to exhibit strong and medium affinity to the target protein, respectively. The recombinant PSA-H ASPV coat protein was produced with a hexahistidine tag since it is less disruptive to the properties of proteins that the tag is attached to. Due to similar considerations, the PSA-H and MT32 aptamers were synthesized with a biotin label – a small compound, which rarely interferes with the function of labelled molecules – at their 30 end linked via a tetraethylene glycol spacer. Accordingly, we chose the Streptavidin Donor and Ni2+ Chelate Analyst
Downloaded by Budapest University of Technology and Economics on 18 July 2012 Published on 06 July 2012 on http://pubs.rsc.org | doi:10.1039/C2AN35419E
View Online
Acceptor beads to capture the aptamer and protein, respectively (Fig. 1). One of the main advantages of aptamers over antibodies is that they can be selected in a wide range of buffer compositions without the necessity of working under physiological conditions. On the other hand, the target binding capacity of aptamers is sensitive to changing pH values and ion concentrations; therefore, evaluation of aptamers must be implemented in the buffer which was applied during the selection procedure. ALPHA assay generally does not limit the composition of the evaluation buffer since it is highly tolerant to the presence of a comprehensive panel of ions, and a broad range of pH (2.5–9) also has no influence on its performance. Due to the above considerations, we carried out the ALPHA assay measurements in the physiological buffer PBS (10 mM phosphate buffer with 2.7 mM KCl, and 137 mM NaCl, pH 7.4), which was used during the PSA-H specific aptamer selection procedure. Proteins and polymers are commonly added to the buffers of protein interaction studies to reduce the sassay background. Therefore, we tested the effect of bovine serum albumin (BSA) on the background luminescence of the reaction mixture containing either (i) aptamer-coated Donor and non-coated Ni2+ chelate Acceptor, (ii) non-coated Donor and protein-coated Ni2+ chelate Acceptor, or (iii) non-coated Donor and Acceptor beads by addition of BSA. We found that complementing the binding buffer with BSA dramatically decreased the background luminescence in all cases (see ESI, Fig. S1†). Therefore, after identifying the optimal blocking concentration of BSA (Fig. S2†), we
supplemented the binding buffer with BSA at 1 mg mL1 concentration in all subsequent experiments. Each type of ALPHA beads has a characteristic binding capacity, that is, the bead is saturated with the target molecule. The maximum signal is achieved when either of the beads is saturated with the target molecule. Further increase of the target molecule concentration results in a drop in the luminescence signal (hooking effect) owing to the inhibiting effect of the excess of free target molecules on the association of the beads. For the applied 25 ml of assay mixture with equal concentration of 20 mg mL1 of the donor and acceptor beads, the theoretical binding capacities of Streptavidin Donor and Ni2+ Chelate Acceptor beads are 30 nM and 300 nM–1 mM, respectively. The binding capacity of the Acceptor bead is much larger than the SPR determined KD value of ASPV coat protein selective aptamers (8–83 nM);10 thus, we only evaluated the binding capacity of the Streptavidin Donor bead to rule out the hooking effect. We performed saturation assays with varied amounts of biotinylated aptamer at constant PSA-H protein concentration and measured the highest response at 12.5 nM aptamer concentration (Fig. S3†). In all cases, incubation of free aptamers and protein target in the optimized buffer was followed by addition of the beads and ultimately by the measurement of the resulting luminescence. Having optimized the binding buffer composition and determining the binding capacity of the donor bead, we embarked on assessing the KD of the ASPV coat proteins specific aptamers. First, we determined the KD values with a saturation assay by measuring the luminescence at constant aptamer and varied protein concentration (Fig. 2). The experimental data were fitted with equation (1) derived for 1 : 1 stoichiometry taking into account that the free target concentration at equilibrium might change significantly from the total target concentration:21,22 Bmax ¼1 B þ
KD qffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi ffi1 0 CA þ CT þ KD ðCA þ CT þ KD Þ2 4 CA CT A CT @ 2 (1)
where B and Bmax are the fraction of bound target protein and its saturation value; CA and CT are the total aptamer and target protein
Fig. 1 Schematic of aptamer evaluation by ALPHA. The recombinant PSA-H protein (c) is produced with a hexahistidine tag and the proteinspecific aptamer (b) is labelled with biotin, thus they can bind to the Ni2+ chelate Acceptor (e) and Streptavidin Donor (d) beads, respectively. The aptamer–protein interaction brings the two beads into proximity and the singlet oxygen generated by the donor turns on the luminescence of the acceptor bead. (A) In saturation assay, the KD value is assessed by measuring the luminescence at constant aptamer and varied protein concentration. (B) In competition assay, concentration of recombinant protein and labelled aptamer is constant and non-biotinylated aptamer (a) is added in various amounts.
Analyst
Fig. 2 Saturation curves for PSA-H protein interaction with MT32 (-) and PSA-H (C) aptamers. The curves were fitted with eqn (1) that provided KD values of 5.3 3.9 nM for PSA-H and 70.5 28.0 nM for MT32 aptamer (68.3% confidence level).
This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2012
Downloaded by Budapest University of Technology and Economics on 18 July 2012 Published on 06 July 2012 on http://pubs.rsc.org | doi:10.1039/C2AN35419E
View Online
concentration, respectively. The obtained KD values for PSA-H and MT32 aptamers were 5.3 3.9 nM and 70.5 28.0 nM, respectively, in very close agreement with the previously published values determined by SPR: 8 nM (PSA-H aptamer) and 83 nM (MT32 aptamer).10 The latter values were determined using DNA aptamers immobilized to planar gold SPR chips through thiol functionalities at their 30 end and free PSA-H in solution. The results are very assuring in terms of having a close agreement between the results obtained by SPR and ALPHA for assessing biomolecular interactions for similarly 30 end-immobilized aptamer molecules, but with free and nanoparticle-conjugated protein targets, respectively. Given the oriented immobilization of the protein through the hexahistidine tag to the Acceptor bead this is a logical outcome. We also explored the feasibility of using a competitive assay format for the determination of KD. The competitive assay was implemented by the addition of various concentrations of non-labelled aptamer, while the concentration of the protein and the labelled aptamer were held at 3 nM and 15 nM, respectively (Fig. 3). The data from the competitive experiment were fitted with the one-site homologous competition model assuming that the competing biotinylated and non-labelled aptamers have identical affinity for the target protein. The equation
the competitive and sandwich assays suggests that the biotinylation affects only to a small extent the binding properties of the respective aptamer. Hence, combination of ALPHA with straightforward biotinylated, single-stranded DNA generating protocols such as asymmetric PCR and lambda exonuclease treatment23 could provide a reasonable approach for identification of most auspicious aptamers directly from the bacterial colonies generated in the last step of aptamer selection. The results are promising in terms of using ALPHA for characterizing aptamer–protein interaction; however, a larger number of systems should be investigated to confirm whether the finding shown here can be generalized.
Bmax CA þ NS B¼ CAL þ CA þ KD
1 E. Cho, J. Lee and A. Ellington, Annu. Rev. Anal. Chem., 2009, 2, 241– 264. 2 C. Tuerk and L. Gold, Science, 1990, 249, 505–510. 3 S. Gopinath, Anal. Bioanal. Chem., 2006, 387, 171–182. 4 H. Kaur and L. Yung, PLoS One, 2012, 7, e31196. 5 D. Daniels, A. Sohal, S. Rees and R. Grisshammer, Anal. Biochem., 2002, 305, 214–226. 6 G. Gokulrangan, J. R. Unruh, D. F. Holub, B. Ingram, C. K. Johnson and G. S. Wilson, Anal. Chem., 2005, 77, 1963– 1970. 7 R. K. Mosing, S. D. Mendonsa and M. T. Bowser, Anal. Chem., 2005, 77, 6107–6112. 8 R. K. Mosing and M. T. Bowser, ed. G. Mayer, Methods in Mol. Biol., Humana Press Ltd., New York, Nucleic Acids and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, 2009, Vol. 535, (Vol. Editor: G. Mayer), pp. 33–43. 9 I. Navratilova and D. G. Myszka, Springer Series on Chemical Sensors and Biosensors, ed. J. Homola, 2006, vol. 4, pp. 155–176. 10 G. Lautner, Z. Balogh, V. Bard oczy, T. Meszaros and R. E. Gyurcsanyi, Analyst, 2010, 135, 918–926. 11 D. Zhang, M. Lu and H. Wang, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 9188– 9191. 12 E. F. Ullman, H. Kirakossian, S. Singh, Z. P. Wu, B. R. Irvin, J. S. Pease, A. C. Switchenko, J. D. Irvine, A. Dafforn and C. N. Skold, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1994, 91, 5426–5430. 13 R. M. Eglen, T. Reisine, P. Roby, N. Rouleau, C. Illy, R. Bosse and M. Bielefeld, Curr. Chem. Genomics, 2008, 1, 2–10. 14 M. Jing and M. T. Bowser, Lab Chip, 2011, 11, 3703–3709. 15 J. Glickman, X. Wu, R. Mercuri, C. Illy, B. Bowen, Y. He and M. Sills, J. Biomol. Screening, 2002, 7, 3–10. 16 L. Beaudet, J. Bedard, B. Breton, R. J. Mercuri and M. L. Budarf, Genome Res., 2001, 11, 600–608. 17 E. Cauchon, S. Liu, M. Percival, S. Rowland, D. Xu, C. Binkert, P. Strickner and J. Falgueyret, Anal. Biochem., 2009, 388, 134–139. 18 C. Marchand, W. Lea, A. Jadhav, T. Dexheimer, C. Austin, J. Inglese, Y. Pommier and A. Simeonov, Mol. Cancer Ther., 2009, 8, 240– 248. 19 V. Hornung, A. Ablasser, M. Charrel-Dennis, F. Bauernfeind, G. Horvath, D. R. Caffrey, E. Latz and K. A. Fitzgerald, Nature, 2009, 458, 514–518. 20 P. Parekh, Z. Tang, P. Turner, R. Moyer and W. Tan, Anal. Chem., 2010, 82, 8642–8649. 21 K. B. Hall and J. K. Kranz, in RNA-protein interaction protocols, Humana Press, Totowa, N. J., 1999, vol. 118, pp. 105–114. 22 M. Jing and M. Bowser, Anal. Chim. Acta, 2011, 686, 9–18. 23 C. Marimuthu, T. Tang, J. Tominaga, S. Tan and S. Gopinath, Analyst, 2012, 137, 1307–1315.
(2)
was fitted using non-linear regression, where, B and Bmax are the fraction of bound target protein and its saturation value, respectively. CA and CAL are the concentration of the unlabelled and labelled (biotinylated) aptamer in the solution, and NS is the level of nonspecific binding. The KD of 28.4 16.6 nM obtained by the competitive assay slightly overestimates the value determined by SPR; however, based on an independent two-sample t-test the results of the competitive and saturation assays were found not to be significantly different at the 95% confidence level. While we found it important to compare both saturation and competitive methods to assess the KD of aptamer–protein interaction, the competitive assay should be primarily used for the determination of significantly lower affinity interactions than investigated here. In summary, the presented data suggest that for aptamer–protein interactions the ALPHA methodology, in particular the saturation assay, provides KD values that are in very close agreement with those determined by SPR, the gold standard for biomolecular affinity interaction kinetics. The accordance between the values obtained by
Fig. 3 Competitive assay for PSA-H aptamer. The experimental data were fitted with the one-site homologous competition model (eqn (2)) resulting in KD ¼ 28.4 16.6 nM (68.3% confidence level).
This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2012
Acknowledgements The financial support of the Hungarian Scientific Fund (OTKA NF 69262 and K 68161), ENIAC CAJA4EU and New Hungary Development Plan (TAMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0002 and 0001) is gratefully acknowledged.
Notes and references
Analyst
