KROMATOGRÁFIA (elválasztási technika) kémiai analízisek ~70% Történeti áttekintés Mózes: iható víz eloállítása keseru vízbol: fa ágak bemerítése (adszorpció) Arisztotelész: édesvíz készítése sós vízbol agyagon (ioncsere)
Ferdinánd RUNGE: XIX. sz közepe: „muvészi” színes alakzatok
M??au? Ce? ????u? ? ? ? ? ? (Cvett,Tswett) (1872-1919) Szorbens oszlopok-növényi pigmentek Kromatográfia – chromos graphos
Összetett minták elemzésénél gyakran szükséges a mérendo anyag komponenseinek elválasztása. Ez rendszerint az analizálandó alkotók egymással nem elegyedo két fázis közötti megoszlásán alapul. KROMATOGRÁFIA
többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyujtoneve közös alap: az elválasztandó komponensek egy állófázis és egy azon, meghatározott irányban átáramló mozgófázis (eluens) között megoszlanak Elválasztás alapja: komponensek: eltéro fizikai, kémiai tulajdonság
3 lényeges elem: 1. álló- és mozgófázis 2. fázisok között anyagátmenet játszódik le 3. kölcsönhatás az állófázis és a mintát alkotó komponensek között
A mozgófázisban a komponensek eltéro sebességgel haladnak, így egymástól elválnak. Az állófázis egy meghatározott pontján (általában a végén) egy érzékelo (detektor) jelzi a komponenseket, valamilyen fizikai vagy kémiai tulajdonságuk mérésével. A detektor által eloállított jel kiértékelése teszi lehetové az elválasztott komponensek azonosítását (minoségi analízis) és mennyiségük meghatározását (kvantitatív analízis).
CSOPORTOSÍTÁS mozgófázis halmazállapota alapján GÁZKROMATOGRÁFIA (GC)
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (LC) Állófázis:
Állófázis:
folyadék: LLC szilárd: LSC
folyadék: GLC szilárd: GSC
SZUPERKRITIKUS FLUID KROMATOGRÁFIA (SFC) Állófázis: folyadék szilárd
technikai kivitelezés alapján sík (planáris): papír, vékonyréteg oszlop
megkötodés alapjául szolgáló fizikai-kémiai folyamat szerint 1.
Fizikai kölcsönhatások -szorpciós:
adszorpciós abszorpciós (oldódás, megoszlás) kemiszorpció (ioncsere)
-méret szerinti kölcsönhatások (gél) 2.
Kémiai kölcsönhatások -sav-bázis kölcsönhatás -komplex képzodés -H-hidas kölcsönhatások
3.
Biokémiai kölcsönhatások -biokémiai affinitás
Kényszeráramot létrehozó ero alapján: nyomáskülönbség elektromos erotér
Álló fázis
Elektromos erotér
Kényszeráramlást okozó ero
Nyomáskülönbség
Mozgó fázis Szilárd
Folyadék
Gáz kromatográfia GC
gáz
GSC
GLC
Szuperkritikus kromatográfia SFC
szuperkritikus fluid
SFC
SFC
TLC IC GPC,SEC
PC
CE GEL ELFO
CEC
Folyadék kromatográfia LC Folyadék kromatográfia LC
folyadék
folyadék
megvalósítás módja alapján:
1. frontális 2. kiszorításos 3. elúciós elválasztás
Frontális analízis: a minta folyamatosan áramlik az állófázisra detektorjel B-t megköti az állófázis
A+B
Minta: A & B A: kevésbé kötodik
A
1: B telíti az állófázist
1
ido
2
2: a minta változatlan összetétellel hagyja el az állófázist
Csak a legkisebb szorpciójú alkotó (egy részlete) különítheto el! Regenerálni kell az oszlopot!
Kiszorításos analízis: a mintának csak egy diszkrét részletét juttatjuk az állófázisra (a kolonna kapacitásának töredékét) 1. minta bevitele: A & B 2. egyensúly beállta 3. kiszorító anyag alkalmazása: K detektorjel K B A ido a kiszorító anyag telíti a rendszert regenerálni kell a rendszert
Alkalmazási terület: ionkromatográfia
Elúciós analízis leggyakrabban alkalmazott technika
jel
integrális detektor
1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása 2. minta bevitele 3. elúció A detektort eléro mintakomponens(ek)
B
felgyülemlett mennyiségét méri.
A
Minta: A & B A: kevésbé kötodik
tA
tB differenciális detektor
Analitikai információ: üminoségi: t (retenciós ido) ümennyiségi: csúcs területe
ido
jel
•az állófázisra juttatott minta mennyisége igen kicsiny „elhanyagolható” az eluenséhez képest •nincs szükség regenerálásra
Pillanatnyi különbséget mérnek az áthaladó eluens összetételében.
ido
A KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁS ÁLTALÁNOS JELLEMZÉSE ALAPFOGALMAK A kromatográfiás elválasztások hajtóereje: az egyes komponensek kémiai potenciáljának különbözosége az álló- és a mozgófázisokban A komponensenként eltéro hajtóero azt eredményezi, hogy a minta különbözo összetevoi eltéro ideig tartózkodnak az állófázison. jel
KROMATOGRAM
retenciós (visszatartási) ido (tR): a minta mozgófázisba (eluensbe) történo bevitelének pillanatától (adagolásától) a komponens maximális koncentrációban való megjelenéséig eltelt ido Ez az ido minden mintaalkotóra más és más.
MINOSÉGI JELLEMZO tA
tB
ido
A tR tartalmazza azt az idot is, amit az eluens a mintaadagolóban, a kolonnaszemcsék közötti térben és a detektorban (a jel képzéséig) eltölt. HOLTIDO: (tM) a kolonnán nem kötodo komponens áthaladási ideje redukált (nettó) retenciós idot: t’R = tR – tM A komponens visszatartását (retencióját) kifejezhetjük azzal az retenciós térfogattal (VR) is, ami az adott komponens kolonnán való átviteléhez szükséges. VR = tRv v: áramlási sebesség
Holt térfogat: VM = tMv
jel
visszatartási tényezo:
t R − tM k= tM
egy nem visszatartott komponenshez képest mikor eluálódik az adott komponens
1 < k’ < 10
t1
szelektivitási tényezo:
k2 α= k1
két, egymást követo csúcs elválasztását jellemzi
α=1 α>1 szeparáció
k2 = k1 nincs szeparáció
t2
ido
Az elválasztás hatékonyságának jellemzése:
felbontás (RS)
Rs =
t R 2 − t R1 1 ( w1 + w2 ) 2
A kromatográfiás elválasztást leíró elméletek ØTányérelmélet ØSebességi (kinetikus) elmélet Tányérelmélet
1
Martin & Synge, 1941. A komponensek megkötodése az állófázison és visszajutása a mozgófázisba dinamikusan ismétlodik. D=1 Vá = Vm
n=0
1/2 1/2
n=1
1/4 1/4
1/4 1/4
1/8
1/4 1/4
n=2
n=3
n=4
1/8 1/16 1/16 1/32 1/32
Gauss-eloszlás Edénykék méretének csökkentése 1/8 1/8
3/16 3/16
3/16
1/16
3/16
1/16
4/32
6/32 6/32
4/32 4/32
4/32
kolonna a fázisok térfogatát csökkentve 1/32 1/32
„kvázi egyensúly”
elméleti tányér: a kolonnának az a kis „elemi” része, amelyben az elválasztandó anyagok a 2 fázis között egyensúlyban vannak
elméleti tányérral ekvivalens oszlop-magasság: amelyen kialakul egy egyensúlyi egység (H, vagy HETP = Height Equivalent to Theoretical Plate),
elméleti tányérszám:
L N= H
L: a kolonna hosszúsága
(N: 10000-100000)
Kromatográfiás csúcs jellemzése csúcs szimmetria: •10 %-nál mért szélesség
csúcsszélesség: oszlop & rendszer hatékonyság
a b
szimmetrikus: a = b
a b
a>b fronting elülso megnyúlás
a b
b>a tailing hátsó megnyúlás
Sebességi (kinetikus) elmélet a két fázis közötti anyagátadási folyamat dinamikáját veszi figyelembe van Deemter 1956 A töltet inhomogenitásának és a diffúziós folyamatok hatásának vizsgálata.
van Deemter-egyenlet: az elméleti tányérral ekvivalens oszlopmagasságnak (H) az eluens lineáris áramlási sebességétol (u) való függését:
H = A + B/u + C u A: a töltet geometriájának hatását veszi figyelembe egyes molekulák hosszabb, mások rövidebb utat tesznek meg a kolonnán való áthaladáskor, ami csúcsszélesedést eredményez (eltéro áramlási csatornák, Eddy-diffúzió)
B: az elválasztandó komponensnek a mozgófázisban bekövetkezo tengelyirányú (longitudinális) diffúzióját értelmezi a komponens tartózkodási idejével arányos (elsosorban a mozgófázisban, de nem elhanyagolható az állófázisban sem)
C: tartalmazza az anyagátadással szembeni gátlás hatását Az állófázisban szorbeált molekuláknak idore van szükségük ahhoz, hogy az állófázisból visszajussanak a mozgófázisba. (Lemaradnak társaiktól.)
H = A + B/u + C * u H [mm]
A van Deemter egyenlet általános ábrázolása
C*u
Hmin
B/u A u
szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlotlenségek kisebb szemcseméret: kisebb egyenlotlenségek
(WCOT: A tag elhanyagolható: Golay egyenlet)
u [cm/s]
Minoségi analízis Alapja: a retenciós ido a minta komponenseinek minoségétol függ A legegyszerubb módszer: a retenciós idok (pontosabban a redukált retenciós idok) összehasonlítása ismert vegyületek retenciós idejével jel
relatív retenció (rx,r): a kísérleti körülmények különbözoségébol származó eltéréseket kompenzálja egy kiválasztott (r) anyagra vonatkoztatott redukált retenciós ido hányadosaként adnak meg: '
rx , r ido
tx
t Rx = ' t Rr
jel
ido
tr
tx
Mennyiségi értékelés a kromatogramon levo csúcsok területe (magassága) arányos a mintakomponensek mennyiségével, ill. koncentrációjával. Detektor: a komponensek vagy az eluens fizikai vagy kémiai tulajdonságainak mérése
1. kalibrációs módszer 2. addíciós módszer 3. belso standard módszer
jel
A kalibrációs módszer
c1
T1
T = mc T: csúcs területe c: koncentráció (anyagmennyiség) m: arányossági tényezo (érzékenység) 1. független standard (kalibráló) oldatok
T
ido jel
c2
T2
ismeretlen oldat: Tx
T3 Tx T2
ido jel
T1
c3
T3
m c1
c2
cx
c3
c ido
jel
Standard addíció
cx
Tx
T1,x= Tx+T1 T1=T1,x-Tx
ido
T2,x= Tx+T2 T2=T2,x-Tx
jel
cx+ c1
T
T1,x
T2 ido
T1 jel
Tx cx
c1
c2
c2 + cx
T2,x
c ido
Belso standard: relatív terület meghatározása a mintán belüli referencia Ørögzített (meghatározott és állandó) koncentrációban (mennyiségben) a mintához hozzáadjuk a referencia anyagot Øa referencia anyag csúcsára vonatkoztatjuk a meghatározni kívánt csúcsok területét Elonyök: az analízis során fellépo hibák egy részét küszöböli ki: adagolás érzékenység változása
A KROMATOGRÁFOK FELÉPÍTÉSE
eluens tároló
detektor
eluens továbbító (pumpa) jelfeldolgozó
mintaadagoló
oszlop
KROMATOGRAM
• MINOSÉGI & • MENNYISÉGI INFORMÁCIÓ
GÁZKROMATOGRÁFIA (GC) 1952: A.T. James & A.J.P. Martin
Ønagyhatékonyságú analitikai módszer •1956: van Deemter: sebességi elmélet Økvalitatív & kvantitatív információk •M. Golay: kapilláris oszlopok Øösszetett minták analízise •Schay Géza: 1961: GC elmélete Øa mintát alkotó komponensek szétválasztása •Szepesy László Mozgófázisa: gáz Állófázisa: felületen kötött folyadék, vagy szilárd anyag (GLC, GSC) technikai kivitelezés: oszlop elúciós analízis Elválasztás alapja: 1. illékonyság (forráspont) 2. szerkezet A gázkromatográfia bomlás nélkül gozzé, ill. gázzá alakítható vegyületek elválasztására és analízisére szolgáló módszer. ~12 millió szerves vegyület: jelentos részük hoérzékeny nagyobb jelentoséggel ~ 50 ezer bír: jelentos része gázkromatografálható Illékonyság: hostabilitás •molekula tömege •molekula polaritása
GÁZKROMATOGRÁFIA (GC) Minta: be kell juttatni a mozgófázisba gázzá/gozzé kell alakítani Minta halmazállapota: 1. Gáz 2. Folyadék: el kell párologtatni (pillanatszeruen) 3. Szilárd: el kellene párologtatni (pillanatszeruen): oldat formában
gáztartály nagynyomású palack
tisztító egység
nyomásszabályozó egységek reduktorok, szelepek
Gázkromatográf (GC)
GÁZKROMATOGRÁFIA (GC)
injektor
detektor
tisztító patron
PC
oszlop termosztát
gázpalack
nyomásméro áramlás-szabályozók
Vivogáz elnevezés tiszta nagy tisztaságú
ultra
jelölés
%
ppm
2.5
99,5
5000
3.0
99.9
1000
3.5
99,95
500
4.0
99,99
100
4.5
99,995
50
5.0
99,999
10
6.0
99,9999
1
7.0
99,99999
0,1
Reduktor: a gáz anyagi minoségének és a nyomásnak megfelelot választani készüléken belül: szelepek
az alkalmazott detektortól függoen: •H2 •Ar •N2 •He
áramlási sebesség
Mintaadagolás 1. A mintát pillanatszeruen kell bejuttatni az eluensbe 2. Goz/gáz halmazállapot létrehozása 3. Keveredjen el a vivogázzal
mikroliterfecskendo: speciális tu gáz & folyadék halmazállapotú minta
viszonylag kicsiny térfogat 0,1 µl-1 ml folyadék elpárologtatva: 100-10000 X térfogatnövekedés
hatutas beméro szelep
Az injektor felépítése (üveg) betétcsovel ellátott fémcso szeptum
INJEKTOR 1. minta befogadása 2. elpárologtatása 3. oszlopba történo bejuttatása
vivogáz bevezetés
futoblokk (25 – 300 oC) liner (betétcso)
kolonna Töltetes oszlopok: nagyobb átméro: nagyobb mintatérfogat Kapilláris oszlopok: kisebb mintatérfogat
Injektor muködése Injektálás
1. fecskendovel átszúrjuk a szeptumot 2. minta bevitele mikroliterfecskendovel 3. eltávolítjuk a fecskendot
Elpárologtatás
1. elpárolog a minta 2. kitölti az injektor teljes térfogatát (100 – 1000 X térfogatnövekedés) 1. elkeveredik a vivogázzal
gyors injektálás
oldószer
lassú
A vivogáz a beadagolt (és elpárologtatott) mintát bejuttatja az oszlopra.
Az injektorok típusai Split-injektor
•SPLIT •SPLITLESS •ON-COLUMN •PTV
vivogáz Szeptum öblítés
split-gáz
Splittelési arány: meghatározza a kolonnára jutó anyag mennyiségét
5:1
200:1
SPLITLESS INJEKTOR
Purge Off
Purge On
On-column
PTV (Programmed Temperature Vaporizer)
közvetlenül az oszlopba fecskendezzük a mintát
Kolonnák (kromatográfiás oszlopok) szerep: ELVÁLASZTÁS Øtöltetes Økapilláris Kapilláris: üveg, (fém)
Töltetes: fém vagy üveg
Fémcso: nemkívánatos katalitikus folyamatok töltetes
kapilláris
0,5 - 5
5-100
2-4
0,1 – 0,7
10 – 60
0,5-10
4000
250000
Kapacitás (µg/csúcs)
10
0,1
Film vastagság (µm)
1-10
0,1-10
Hossz (m) Belso átméro (mm) Áramlási sebesség (ml/perc) Tányérszám
védoréteg (poliimid, 350 oC) kvarc d
állófázis mikrokapilláris (microbore): d < 150 µm standard kapilláris: 150 µm < d < 500 µm makrokapilláris (widebore): d > 500 µm
Kapilláris oszlopok: Adszorpciós:
Megoszlásos:
PLOT (porózus rétegu nyitott végu oszlop)
WCOT (falborítású nyitott végu oszlop)
(Porous Layer Open Tubular)
(Wall Coated OT) SCOT (hordozóval borított nyitott végu oszlop) (Support Coated OT)
Kölcsönhatás: CSAK AZ ÁLLÓFÁZISSAL üvegfelelület dezaktiválása Aktivitás: szilanol csoportok SiOH SiOH
•„tailing” •nem szimmetrikus jelalak
SiOH SiOH
dezaktiválás: szililezo reagens
SiOH SiOH üvegfelület
Si-O-Si(CH3)3 Si-O-Si(CH3)3 SiOH Si-O-Si(CH3)3
Állófázisok Követelmények: Øhostabilitás Ønincs számottevo „bleeding” Øjól definiált kémiai szerkezet Økémiai inertség Ømérsékelt ár Adszorbensek (GSC) porózus, nagy fajlagos felületu anyagok szerves eredetuek: •aktív szén •gyöngypolimerek
szervetlen adszorbensek: •szilikagél •alumínium-oxid •zeolitok (molekulasziták)
módosított adszorbensek: szén vagy szilikagél alapúak
kicsiny molekulatömegu szénhidrogének, nemesgázok
(PLOT) (adszorpció: gázok/folyadékok szilárd felületen történo megkötodése)
Állófázisok (GLC) megosztó folyadékok
(abszorpció: gázok/folyadékok folyadékban történo oldódása)
Különféle polimerek: egyenletes bevonat a kapilláris belso felületén (WCOT) viszonylag kevés állófázis: 12-15 szubsztituált polisziloxánok (szilikonok): kedvezo tulajdonság: hosszú élettartam R Si R
R: polisziloxánvázhoz kapcsolható szubsztituensek Feltétel: termikus stabilitást ne befolyásolja
R O
Si R
O n
Fontosabb szubsztituensek: ØMetil ØFenil ØCianopropil ØTrifluoropropil
Metil: -CH3
Fenil:
Cianopropil: -CH2CH2CH2CN Trifluoropropil: -CH2CH2CF3
O CH 3
Si CH 3 O Si O CH 3 Si CH 3 O CH 3 CH 3 Si
•metil-fenil •cianopropil-fenil •stb.
helyettesítés: Si atomok hány %-át 100 % metil 5 % fenil & 95 % metil
Polietilénglikolok (PEG)
HO CH2 O CH2 O H n Carbowax
speciális szeparációs karakterisztika Hátrány: •kisebb hostabilitás •„oxigén-érzékenység”
Állófázis polaritása: •állófázis szerkezete •funkciós csoportok minosége •az egyes funkciós csoportok száma Apoláris állófázisok: • 100 % metil • 5 % fenil
Közepes polaritás: •35 % fenil •50 % fenil
Poláris állófázis: PEG
Szelektivitás: kölcsönhatás létrejötte az állófázis és a mintát alkotó komponensek között
Kölcsönhatás: •adott komponens minosége •állófázis szerkezete
Kölcsönhatások
1. diszperziós 2. dipólusos 3. H-híd
Diszperziós kölcsönhatás: apoláris-apoláris kh. (átmenetileg keletkezo dipólusok) mindegyik állófázisra jellemzo Molekula polarizálhatósága: méret függés Forráspont helyett inkább goznyomás Kisebb goznyomással bíró komponensek: erosebb visszatartás (sok esetben nem fellelheto)
Oldhatóság: nagyobb oldhatóság: hatékonyabb visszatartás (nehéz becsülni) ÁLLÓFÁZIS
KÖLCSÖNHATÁS
metil
eros
fenil
nagyon eros
cianopropil
eros
trifluoropropil
eros
PEG
eros
Dipólusos kölcsönhatás mind az állófázis mind a molekula rendelkezzen dipólus momentum
PEG & cianopropil szubsztituált állófázisok Dipólus momentummal rendelkezo molekulák: „egyenetlen” töltéseloszlás
O, N, S, P, Cl, F, Br, I -tartalmú molekulák: általában rendelkeznek dipólus momentummal
-OH,-NH csoportok: nagy dipólus momentum Szimmetrikus a molekula: kicsiny dipólus momentum Elválasztás: eltéro dipólus momentumok (a dipólus momentumok különbsége számít) Kicsi a dipólus momentum különbség az elválasztandó komponensek között: nagy dipólus momentumú állófázis alkalmazása szükséges
Dipólusos kölcsönhatás ÁLLÓFÁZIS
KÖLCSÖNHATÁS
metil
nincs
fenil
nincs
cianopropil
nagyon eros
trifluoropropil
közepes
PEG
eros
Hidrogén-híd kölcsönhatás az állófázis és a molekula között kialakuló H-híd
OH, NH csoport jelenléte (a H-híd erosségének különbsége számít) Kicsi a H-híd erosségek különbség az elválasztandó komponensek között: eros H-híd kialakítására képes állófázis alkalmazása szükséges
Hidrogén-híd kölcsönhatás ÁLLÓFÁZIS
KÖLCSÖNHATÁS
metil
nincs
fenil
gyenge
cianopropil
közepes
trifluoropropil
gyenge
PEG
közepes
Az állófázis kiválasztása: 1. tudomány 2. tapasztalat 3. (tipp)
publikációk applikációs adatbázisok (internet) hasonló a hasonlóval választható el: apoláris molekula – apoláris állófázis poláris molekula – poláris állófázis
Elvárások:
Szelektivitás: az elválasztó rendszer azon tulajdonsága, hogy különbséget tud tenni: az állófázis és a mintaalkotói között kialakuló kölcsönhatások révén jön létre Hatékonyság: minél rövidebb ido alatt minél több komponenst lehessen meghatározni kicsiny szélességu elúciós csúcsok
Termosztát
homérséklet •retenciós ido •elválasztás hatékonysága •kevésbé illékony komponensek goznyomásának növelése Kétféle üzemmód: •izotermikus •programozott felfutés
oszlop
T (oC) termosztát •szabályozható homérséklet •változtatható felfutési sebesség: 0- 40 oC/perc •visszahutés: „szelloztetés” elemzési ido csökkentése megfelelo jelalak
t (perc)
jelentos eltérés a mintát alkotó komponensek fizikai, kémiai tulajdonságaiban
Detektorok Kolonna: idoben (térben) elválasztja az egyes alkotókat Az adott komponens az eluenssel (vivogázzal) együtt beáramlik a detektorba. mennyiségi analízis: a detektor által eloállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy idoegység alatt bejutott mennyiségével univerzális: minden molekulára ad jelet szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet destruktív nem destruktív dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben a koncentráció változása detektorjel változást eredményez lineáris tartomány: T= mc (eltérés < 5 %) érzékenység: m (egységnyi koncentrációváltozás hatására bekövetkezo jelváltozás) kimutatási határ: az a koncentráció, melynek mérésénél a detektor válaszjele egyértelmuen megkülönböztetheto a háttértol (LOD) meghatározási határ: az a legkisebb koncentráció, amely megfelelo precizitással és pontossággal meghatározható (LOQ)
Detektorok hovezetoképesség-méro detektor (Thermal Conductivity D) (katarométer) ellenállás megváltozása
hídkapcsolás W-szálak: 100-200 mA futoáram nem destruktív univerzális
dinamikus tartomány: 105 LOD: 5-50 ng
Vivogáz: H2, He N2
lángionizációs detektor (FID)
hidrogén/levego eleggyel táplált mikroégo, amely fölé elektródpárt helyeznek el nem ionizálható eluens: N2, Ar, He, H2 A kolonnát elhagyó szerves komponensek a lángba jutva többlépéses reakcióban, oxigén közremuködésével ionizálódnak. a képzodött ionok hatására áram folyik, ami erosítés után mérheto C-detektor: minden égheto anyagra ad jelet destruktív dinamikus tartomány: 105-106 LOD: 0,05-0,5 ng
elektronbefogási detektor (ECD)
F, O, Cl, Br
β-sugárzó radioaktív forrás (pl. 63Ni) Az elektron áramlás kicsiny (10-12 A) állandó elektromos áramot hoz létre a megfelelo feszültségre kapcsolt elektródok között nagy elektronegativitású elemet tartalmazó komponensek az elektromos térben az elektronokat befogják és így jelentosen csökkentik az áramot vegyületcsoport
relatív válaszjel
szénhidrogének
0
éterek, észterek
10
alkoholok, ketonok, aminok
100
monobromidok, dikloridok
1000
trikloridok
öblítogáz bevezetés öblítogáz kivezetés anód (+) 63Ni
fólia (-): 1-10 V polarizációs feszültség
10000
poliklórozott vegyületek (peszticidek)
100000
dinamikus tartomány: <103 LOD: 0,1-10 pg
Vivogáz: He (nagytisztaságú)
„make up” gáz
kolonna
Alkalmazások Roppant széles kör: •egyszeru •hatékony •szelektív •kicsiny mintaigény •sorozatelemzésre alkalmas •automatizálható •az elválasztás során a minta nem roncsolódik, így kapcsolt módszerekkel (MS, IR) az analízis tovább folytatható Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari KÖRNYEZETVÉDELMI
1. illékony 2. hostabilis
SZÁRMAZÉKKÉPZÉS
NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Ønagyhatékonyságú analitikai módszer
Mozgófázisa: folyadék Økvalitatív & kvantitatív információk Állófázisa: felületen kötött folyadék, vagy Øösszetett minták analízise szilárd anyag (LLC, LSC) Øa mintát alkotó komponensek szétválasztása technikai kivitelezés: oszlop elúciós analízis Minta halmazállapota: folyadék eluens tároló
gázmentesíto kolonna termosztát
pumpa detektor
adagoló PC
HPLC moduláris felépítés
gázmentesíto
pumpa
adagoló
detektor (termosztát)
Eluens Választási szempontok: Øviszkozitás: kisebb = kedvezobb (nyomás & anyagtranszport) Øinert: ne lépjen reakcióba a mintát alkotó komponensekkel Økémiai stabilitás Øne legyen korrozív Øne legyen mérgezo Ømegfelelo forráspont (buborékképzodés elkerülése) Øne legyen nagyon illékony Ømegfizetheto legyen Ømegfelelo tisztaságban rendelkezésre álljon Øne legyen „detektor-aktív” (kivétel: indirekt detektálás) ØUV-elnyelés: minél kisebb
Tisztaság: HPLC grade víz & adalékok is !!!
Eluens két fázis közti megoszlás: komponens kölcsönhatása a két fázissal
molekula & mozgófázis & állófázis polaritása hexán kloroform tetrahidrofurán acetonitril izopropanol etanol metanol víz
P O L A R I T Á S
polaritás változtatása: •anyagi minoség változtatása •különbözo oldószerek elegyítése oldószer elegyek/keverékek (2-3 féle oldószerbol): elegyedjenek egymással (homérséklet függo) oldószer erosség: szilikagélen meghatározott erosségi sorrend: eluotróp sorozat izoeluotróp elegy: oldószererosség megegyezik: k’, Rs: változik !!!
Izokratikus elúció: állandó oldószerösszetétel Gradiens elúció: változó oldószerösszetétel Pufferek: pH beállítása: ionizálható komponensek esetén
Pumpák eluens áramoltatása Elvárások: •nyomás (400 bar) (kisméretu részecskékkel töltött oszlop) •stabil áramlási sebesség biztosítása •kompatibilis legyen a különféle oldószerekkel (korrózió állóság) •kis holttérfogata legyen •pulzálás mentes szállítási karakterisztika klasszikus analitikai HPLC: 0,1-1,5 ml/perc (0-5 ml/perc) injekciós tu típusú pumpa
alternáló mozgást végzo, kis dugattyú-térfogatú pumpa (reciprocating pump)
pulzálás: jelentosen csökkentheto: ikerfej alkalmazása (fáziseltolás) V
térfogat: 10-100 µl továbbított folyadék mennyisége: korlátlan áramlási sebesség változtatása: •löket hossz •dugattyú sebessége
ido
Gázmentesítok folyadékok: különbözo mennyiségben oldott gázokat tartalmaznak gázbuborékok hatásai: Pumpa: •ingadozó nyomás •egyenetlen szállítási térfogat •mechanikai igénybevétel Detektor: •ingadozó detektorjel Ultrahang: •olcsó •egyszeru •legkevésbé hatékony
Vákuum: •drágább •egyszeru •hatékony
He-purge: •egyszeru •hatékony •megfizetheto
Mintaadagolás 1. a mintát pillanatszeruen kell bejuttatni az eluensbe 2. keveredjen el az eluenssel (OLDHATÓSÁG) minta térfogata: 10-50 µl (nincs térfogatváltozás) mikroliterfecskendo:
A bevitt minta térfogatát az adagolón elhelyezett hurok („loop”) térfogata határozza meg.
hatutas beméro szelep
Kolonnák (kromatográfiás oszlopok) szerep: ELVÁLASZTÁS LC: NP LC: normál fázisú LC (Normal Phase) RP LC: fordított fázisú LC (Reversed Phase)
NPLC: állófázis polaritása > mozgó fázis polaritása (poláris állófázis & apoláris mozgófázis)
RPLC: állófázis polaritása < mozgó fázis polaritása (apoláris állófázis & poláris mozgófázis) Oszlop anyaga: •saválló acél •üveg •PEEK (poli(éter-éter-keton)
Oszlop méretei: átméro: 2-5 mm hossz: 5-25 cm
Töltet: reguláris szférikus
Töltet: kisebb átméro nagyobb N, de nagyobb nyomás is
Töltetek porózus részecskék (szivacs-szeru szerkezet) átméro: 3-10 µm pórusok belsejében: diffúzió
H [mm]
nem-porózus részecskék nincs belso felület: nincs (elhanyagolható) diffúzió: C-tag kicsi lesz átméro: 1-2 µm kicsiny retenciós térfogat: gyors kromatográfia nagy nyomás kicsiny mintakapacitás
H = A + B/u + C * u C*u C: anyagátadással szembeni gátlás
Hmin
u
u [cm/s]
Az állófázisban szorbeált molekuláknak idore van szükségük ahhoz, hogy az állófázisból visszajussanak a mozgófázisba.
Töltetek „átjárható” részecskék: átjárható pórusok: 600-800 nm diffúziós pórusok: 80-150 nm 20 µm-es részecskék kicsiny ellenállás, kedvezo tulajdonságok
monolit töltet: pórusos rúd kicsiny ellenállás kedvezo tulajdonságok
pellikuláris töltet: az állófázis porózus külso héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén szilikagél: (Si & O atomok háromdimenziós rácsa) legszélesebb körben alkalmazott állófázis kémiai inertség mechanikai ellenállóképesség: pmax˜ 250 bar pH stabilitás: 2< pH < 9 szerves polimer-alapú töltetek: sztirol-divinilbenzol kopolimer kevésbé nyomásturo (keresztkötések számával javítható) duzzadnak: szerves oldószer csak kisebb koncentrációban alkalmazható pH stabilitás: 1< pH < 14
Módosított szilikagél OH OH SiO2
OH OH OH
fontosabb módosító csoportok: C18: oktadecil: C18H37 C8: oktil: C8H17 C4: butil: C4H9 Amino: CH2CH2CH2NH2 Ciano: CH2CH2CH2CN Fenil: C6H5
RPLC: C18 állófázis & metanol/víz mozgófázis NPLC: szilikagél & hexán
elotét oszlop (guard column): szennyezésektol védi az analitikai oszlopot
Termosztát homérséklet •Egyensúlyi folyamatok homérséklet függok! •retenciós ido •elválasztás hatékonysága •eluens viszkozitása csökken: nagyobb áramlási sebesség alkalmazható: gyorsabb analízis, kisebb diffúzió •anyagátadás javul
•szabályozható homérséklet: izotermikus Homérséklet növelése: •no az eluens goznyomása (buborékképzodés) •minta elbomolhat •állófázis oldhatósága •5 oC- 80 oC
elválasztás: jobb/rosszabb
Detektorok Kolonna: idoben (térben) elválasztja az egyes alkotókat Az adott komponens az eluenssel együtt beáramlik a detektorba. mennyiségi analízis: a detektor által eloállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy idoegység alatt bejutott mennyiségével univerzális: minden molekulára ad jelet szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet (destruktív) nem destruktív dinamikus tartomány lineáris tartomány érzékenység kimutatási határ meghatározási határ
UV-Vis spektrofotométer Alkalmazható: UV-Vis tartományban elnyel az adott komponens
Lambeert-Beer: Aλ = eλ c l
méro ág
„fényosztó” (splitter)
I0
rés
cella (küvetta)
I
I0 fényforrás
I0 referencia ág
monokromátor Fényforrás: UV: deutérium lámpa Vis: volfrám lámpa
Detektor: fotodióda
D E T E K T O R
A = lg I0/I
Cella: kvarc küvetta l=5-10 mm
(eluens tisztasága: UV cutoff: az a λ, ahol a tiszta oldószerre A=1, T=10 % (l=1 cm)) leggyakrabban használt HPLC detektor 190 nm < λ < 800 nm
Diódasoros detektor DAD (Dioda Array Detector) polikromátor
fényforrás
lencse
cella (küvetta) diódasor
Elony: különbözo hullámhosszúságon mért elnyelések egyideju mérése spektrum felvétele: minoségi információ
Fluoreszcencia mérésen alapuló detektor fluoreszkáló anyagok detektálása monokromátor rés
cella (küvetta)
fényforrás monokromátor
Detektor: a kibocsátott fényt méri
Törésmutató mérésen alapuló detektor univerzális detektor a minta és az eluens törésmutatója közti különbséget méri Diffrakciós detektor: fényelhajlás mérésen alapul rés
fényforrás méro ág referencia ág detektor tükör lencse Törésmutató: homérséklet függo: TERMOSZTÁLT detektor
Elektrokémiai detektorok vezetoképesség mérésen alapuló detektor (IC) potenciometriás: potenciál mérésen alapul amperometriás: oxidáción/redukción alapul
Alkalmazások Roppant széles kör: •egyszeru •hatékony •szelektív •kicsiny mintaigény •sorozatelemzésre alkalmas •automatizálható •az elválasztás során a minta nem roncsolódik, így kapcsolt módszerekkel (MS) az analízis tovább folytatható korlát: OLDHATÓSÁG Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari KÖRNYEZETVÉDELMI
SZÁRMAZÉKKÉPZÉS: „detektor-aktívvá” tenni a mérendo komponenseket kromatográfiás tulajdonságok befolyásolása
Szuperkritikus folyadékkromatográfia Olyan elválasztási módszer, melynél a mozgófázisként használt folyadék kritikus homérséklete és nyomása fölött, de annak közvetlen közelében van. mozgófázis: szuperkritikus fluidum tulajdonságai: gáz - folyadék - 2 között nagy diffúziós együttható: gyorsabb, hatékonyabb elválasztás, mint a HPLC-nél kis viszkozitás: hosszú oszlop készítheto Technikai kivitelezés: hasonló, mint a HPLC Állófázis: HPLC
Analitikai jelentosége: mérsékelt Alkalmazás: (szemi)preparatív kromatográfia
Papírkromatográfia sík elrendezés (planáris) hordozó: speciális papír (nagytisztaságú cellulóz) állófázis: papír vagy a felületén rögzített film Kivitelezés lépései: Ømintát tartalmazó oldatot felcseppentjük a papírcsík egyik végére Øelpárologtatjuk a minta oldószerét Øalkalmasan megválasztott eluensbe merítjük (futtató kád) Øfuttatás: kapilláris hatáson alapul Økifejlodik a kromatogram: a minta alkotói (térben) elválnak egymástól Øelohívás: alkotók megjelenítés: festés, kémiai reakciók, UV-megvilágítás mozgófázis megválasztása: HPLC minoségi értékelés: retenciós adatok (távolság mérés) mennyiségi értékelés: foltok kivágását követoen Elonyei: •egyszeru •olcsó
Vékonyrétegkromatográfia üveg- vagy muanyaglemezen, vékony rétegben elterített adszorbenst használunk szilikagél alumínium-oxid diatomaföld
módosítás: felületen rögzített film
Kivitelezés lépései: hasonló, mint a papírkromatográfiánál elonyei a papírkromatográfiával szemben: •jobb felbontás (kevésbé terülnek el a foltok) •reprodukálhatóbb analízis
Gélkromatográfia Gélszurés: méretkizárásos kromatográfia (size-exclusion chramotography) térhálós polimer gélek: jól definiált méretu, belso járatokkal, pórusokkal rendelkeznek nagyobb molekulák: nem férnek bele az üregekbe/járatokba: nincs visszatartás kisebb molekulák: behatolnak a járatokba: mérettol függo visszatartás a gél megfelelo megválasztása: a vizsgálható molekula méret-tartomány változtatható állófázis: •agar-agar gél •akril-amid alapú gélek Technikai kivitelezés: oszlop Detektor: UV-Vis, RI
mozgófázis: •víz •THF •kloroform
Affinitás kromatográfia az elválasztandó vegyület és a ligandum közötti specifikus biológiai kölcsönhatás képezi az elválasztás alapját szelektív specifikus
antigén – antitest enzim – inhibitor
biológiai minták tisztítása analízist megelozo mintaelokészítés
Ionkromatográfia (IC: Ion Chromatography) elválasztás: álló- és mozgófázis közötti ioncsere-egyensúlyon alapul szervetlen és szerves ionok elválasztására Minta halmazállapota: folyadék Ønagyhatékonyságú analitikai módszer Økvalitatív & kvantitatív információk Øösszetett minták analízise Øa mintát alkotó komponensek szétválasztása
Mozgófázisa: folyadék Állófázisa: ioncserélo technikai kivitelezés: oszlop (kiszorításos), elúciós analízis
Ionkromatográf felépítése: hasonló a HPLC-hez
Állófázis: •térhálósított mugyanta (pl: polisztirol-divinilbenzol kopolimer) vázon ioncserélo funkciós csoportok •módosított szilikagél Ioncserélok: •eros •gyenge
Ioncserélok: •kationcserélok •anioncserélok eros kation: -SO3H (szulfonsav) gyenge kation: -COOH
eros anion: kvaterner aminocsoport gyenge anion: primer aminocsoport
Kationcserélo: n RSO3H + Mn+
(RSO3)nMn+ + n H+
anioncserélo: n RN(CH3)3OH + An-
[RN(CH3)3]nA + n OH-
Ionok megkötodése függ: Øméret Øtöltés Øhomérséklet Øionerosség ØpH Állófázis: pórusos gyanták: diffúzió: csúcs kiszélesedés hatékonyság növelése: felületi porózus réteg: éles csúcsok (kicsiny minta kapacitás) Mozgófázis: Kationok elválasztása: eros sav híg (vizes) oldata Anionok elválasztása: eros bázis híg (vizes) oldata Detektor: vezetoképesség mérés eluens: nagy a vezetoképessége: nagy háttérjel szupresszor oszlop: vezetoképesség „elnyomó”
Kationcserélo analitikai oszlop: nagykapacitású anioncserélo szupresszor Analízis: Kationcserélo: n RSO3H + Mn+
(RSO3)nMn+ + n H+
Elnyomás: H+ semlegesítése n RN(CH3)3OH + An- + nH+
[RN(CH3)3]nA + n H2O
An-: az eluens anionja az eluens anionja megkötodik és vele ekvivalens mennyiségu hidroxidion kerül az oldatba lecserélodik az analitikai oszlopon elválasztott kation ellenionja is: ekvivalens mennyiségu OH- jut az oldatba vezetoképesség mérés & kationok eluens tároló
pumpa
ionelnyomó kolonna
adagoló detektor
analitikai kolonna PC ionelnyomásos IC
anionok elválasztása: kationcserélo szupresszor nem szupresszált rendszer (nincs szupresszor oszlop): kicsiny vezetoképességu mozgófázis alkalmazása eluens tároló
detektor Mozgófázis: •benzoesav •ftálsav •borkosav •citromsav
adagoló
pumpa PC
analitikai kolonna
egykolonnás (nem szupresszált) IC
Detektor: •vezetoképesség mérés •UV-Vis eltérés a HPLC-tol: •Ionokat mérünk (HPLC is) •Ioncserélo oszlopokat használ (HPLC is) Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari KÖRNYEZETVÉDELMI
Kapilláris elektroforézis elektroforézis: valamely vezeto közegben (általában víz) elektromos erotér hatására a töltéssel rendelkezo részecskék elmozdulnak elektroforetikus elválasztás: az elválasztandó komponensek adott elektromos tér hatására kialakuló eltéro migrációs sebességén alapul elektroozmotikus áramlás: (electroosmotic flow, EOF) a folyadék elektromos tér hatására valamely töltéssel bíró felület mentén kialakuló elmozdulása üveg felület & víz: szilanol csoportok pH > 2,5: deprotonált forma: pozitív töltéseket vonzanak: negatív elektród (katód) felé mozognak: folyamatos áramlás (dugószeru áramlási profil)
PC D
E
K
E
D
P „outlet”
P V
„inlet”
A kapilláris elektroforetikus készülék sematikus rajza E: elektród; K: kapilláris; D: detektor, P: puffertartó edény; PC: személyi számítógép; V: tápegység
kation semleges molekula anion
µa: látszólagos mozgékonyság µe: effektív mozgékonyság µEOF: elektroozmotikus áramlás
µa = µe + µEOF
Alapeset: kation: komigrál anion: kontramigrál
Áramlási profil
EOF
lamináris áramlás
A kapilláris követelmények: •kémiailag és elektromosan inert •hajlékony •kelloen szilárd •megfizetheto •ne nyeljen el az UV-Vis tartományban
kvarc kapilláris (poliimid bevonattal)
A detektor UV-Vis fluoreszcencia vezetoképesség MS
UV-Vis
fluoreszcencia
A tápegység U=5-30 kV I=3-300 µA
Mintabevitel Hidrodinamikai injektálás: nyomás alkalmazása
Elektrokinetikus injektálás: feszültség alkalmazása
Alkalmazások bármi, ami befér a kapillárisba
Elonyök rövid analízis ido •nagy felbontóképesség (N: 105-106) •kicsiny oldószerfelhasználás •egyszeru mintaelokészítés
Hátrányok: kisebb érzékenység •kevésbé robusztus (reprodukálhatósági problémák)
Tömegspektrometria (MS) Alapelve: a gázállapotú ionizált molekulákat, ezek töredékeit (un. fragmenseit) vagy bizonyos esetekben az atomokból képzodött ionokat tömegük alapján szétválasztja, majd mennyiségileg meghatározza 1. mintabevitel és a minta gázállapotba hozása 2. ionizáció és bizonyos esetekben fragmentáció 3. a keletkezett ionok töltésegységre jutó tömegük szerinti elválasztása 4. a szétválasztott, különbözo tömegu ionok mennyiségének meghatározása
A készülék felépítése: vezérlo- és adatfeldolgozó rendszer mintabevitel
ionforrás
analizátor
vákuumrendszer
detektor
A vákuumrendszer 1. az ionforrásban megfelelo hatékonysággal elo állíthatók legyenek az ionok 2. megfelelo hosszúságú szabad úthosszat kell biztosítani: az ionforrásban képzodött ionok ütközés nélkül eljuthassanak a detektorba kb. 10-3 Pa vákuumszivattyú: 1. atmoszférikus nyomásról képes közvetlenül gázt elszívni (rotációs szivattyúk) 2. muködéséhez un. elovákuum megteremtése szükséges (diffúziós szivattyúk)
Ionizációs módszerek lehetové teszik a különféle halmazállapotú, igen eltéro tulajdonságokkal bíró anyagféleségek ionizációját Elektronionizáció (electron impact ionization, EI) legáltalánosabban alkalmazott ionizációs technika
EI
1: mintabevezeto nyílás; 2: ionvisszavero lemez (repeller); 3: izzószál; 4: elektronbevezeto nyílás; 5 és 6: iongyorsító rés; 7: belépo nyílás; 8: ionképzodés helye; 9: anód ∆U=5-100 V
EI
oC
T˜ 200 p ˜ 10-8-10-9 atm elektronok
U energia
molekula
gerjesztett molekula elektron emisszió molekulaion
fragmens ionok
fragmentáció: elektronok energiája (gyorsító feszültség: 70 eV) minoségi azonosítás (ujjlenyomat) általában : egyszeres pozitív ionok képzodnek negatív ionok: nagy elektronegativitású atomok vannak jelen a molekulában
Kémiai ionizáció (CI) a mintát az elektronforrásba történo belépése elott un. „reagens” gázzal hígítják nem a vizsgálandó minta lép közvetlen kölcsönhatásba az elektronokkal, hanem a hígító gáz molekulái mintát alkotó komponensek: szekunder ionizáció RH e
RH+ + M
RH+ MH+ + R
primer-ion képzodés CH4 + e– = CH4+ + 2e– (CH3+) szekunder-ion képzodés CH4+ + CH4 = CH5+ + CH3 (CH3+ + CH4 = C2H5+ + H2)
protontranszfer a) proton transzfer CH5+ + MH = CH4 + MH2+ b) hidrogén absztrakció CH3+ + MH = CH4 + M+ (C2H5+ + MH = C2H6 + M+) c) töltésátvitel CH4+ + MH = CH4 + MH+
Kémiai ionizáció (CI) Reagens gáz: •metán •i-bután •ammónia Ionizáció: a hígító gáz minoségétol függoen [M+H]+, [M-H]-, [M+NH 4]+ Elonyök: •egyszerusíti a tömegspektrumot •molekulaion tömegét adja meg
Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák (atmoszférikus nyomáson muködnek) minta
T
elpárologtatás
ionizálás
kapcsolt technikák: HPLC-MS
•termikus ionizáció •elektromos tér okozta ionizáció •ionütközés okozta ionizáció •gyors atom ütközési
Analizátorok az ionok tömeg/töltés szerinti elválasztása Jellemzése: 1. maximális tömegszám: amelynek vizsgálatára még alkalmas az adott analizátor 2. transzmisszió: a detektort eléro és az ionforrásban keletkezett ionok hányadosa 3. felbontás: az analizátor mekkora tömegkülönbséggel tud elválasztani két iont
•szektor típusú •kvadrupól •ioncsapdás •repülési ido analizátor
Szektor típusú analizátorok Ionok elválasztása: Mágneses tér vagy a gyorsító feszültség változtatása mágnes ionnyaláb
Fc = mv2/r
½ mv2 = zeU v=
ionforrás Lorentz-ero FL = zevB
E= qU=zeU Ekin= ½ mv2
2 zeU m
detektor
FL= Fc
mv2/r= zevB
mv 2 r= zevB r = mv/(zeB) = (m/z) (v/eB)
egyszeres fókuszálás: felbontása korlátozott kétszeres fókuszálás: mágneses + elektromos fókuszálás: jobb felbontás
Kvadrupólus analizátorok olcsó, egyszeruen kezelheto, stabilis, reprodukálható tömegspektrumot eredményezo analizátor
1: ionizáló elektronsugár; 2: az analizátor által kiszurt ionok útja 3: az analizátor által átengedett ionok útja; 4: detektor
egymással szemben elhelyezkedo rudakat elektromosan összekötve azokra egyenés váltóáramot kapcsolva kvadrupoláris változó elektromos tér alakul ki az ionok oszcilláló mozgást végezve haladnak át oszcilláció amplitúdója függ: •ion töltése •ion tömege •alkalmazott feszültségek Ioncsapdás analizátor: módosított kvadrupólus analizátor
Repülési ido analizátorok azonos kinetikus energiájú ionok sebessége vákuumban, külso elektromos vagy mágneses teret nem tartalmazó közegben, tömegük négyzetgyökével fordítva arányos ionforrás
U
Ionok (egyenlo mozgási energia)
Kisebb tömegu ion: nagyobb sebesség
repülési cso (tér mentes)
v=
2 zeU m
Detektorok az analizátor által elválasztott, adott ido alatt becsapódott ionok számát határozza meg pontdetektor: az ionok egymást követoen érik el a detektor ugyanazon pontját Csak olyan analizátorral alkalmazható együtt, amely képes az ionokat idoben elválasztani egymástól: pl. kvadrupólus Elektronsokszorozó: 1. a fókuszált ionnyaláb egy un. konverziós dinódába ütközve onnan elektronokat lök ki 2. kilökodött elektronokat megfelelo feszültséggel gyorsítjuk 3. újabb és újabb felülettel ütköztetve megsokszorozott elektronáramot kapunk fotokonverziós detektorok: a becsapódó ionok hatására kilökodött elektronokat szcintillátor segítségével fotonokká alakítjuk, majd a kibocsátott fotonokat fotoelektronsokszorozóval elektromos jellé alakítjuk jobb hatásfok, hosszabb élettartam és kisebb karbantartási igény
Sordetektor: egymástól térben elválasztott ionok egyidoben érik el a kiléporésnél elhelyezett detektor sort drága: magasabb árfekvésu készülékekben alkalmazzák (TOF, szektor)
Kapcsolt technikák valós minták: komplex, sokkomponensu rendszerek A pontos és megbízható minoségi és mennyiségi analízis elképzelhetetlen a mintát alkotó komponensek elválasztása nélkül. elválasztástechnikai eljárás alkalmazása szükséges A hagyományos kromatográfiás technikák azonban még tökéletes szeparáció esetén sem kínálnak abszolút biztonságos minoségi azonosítást. minoségi információ: csak az adott komponens retenciós viselkedése a manapság megkövetelt megbízható és reprodukálható meghatározások indokolják a tömegspektrometria és az elválasztástechnikai módszerek kombinálását
A következo feltételeknek kell teljesülnie ahhoz, hogy a két, meglehetosen eltéro körülmények között muködo módszert kapcsolni tudjuk egymáshoz:
•A kombináció ne vezessen kromatográfiás hatékonyság csökkenéshez. •A kromatográfból a tömegspektrométerbe történo bevezetés során a minta alkotóiban nem kontrollált kémiai átalakulás ne menjen végbe. •A minta megfelelo mennyisége bejusson és ionizálódjon a tömegspektrométerben. •A kromatográfot és az MS-t összekapcsoló un. interfész ne növelje számottevoen a háttérzajt. •Az interfész legyen egyszeru felépítésu, könnyen használható, tisztítható és karbantartható valamint lehetoség szerint olcsó. •Az interfész legyen kompatibilis valamennyi kromatográfiás körülménnyel (pl. vivogázok, oldószerek, áramlási sebesség, pH, homérséklet, stb.). •Az interfész ne korlátozza az MS nyújtotta lehetoségeket (pl. ionizáció, vákuum, felbontóképesség, stb.). •Az interfész alkalmazásával nyert eredmények reprodukálhatók legyenek.
HPLCMS Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák ESI (ElectroSpray Ionization)
ESI az oldatbeli ionok gázfázisba juttatása
COULOMB FISSION
ION EVAPORATION
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) nem szükséges ionok jelenléte az oldatban elektromos kisülés: szekunder ionizáció
Interface: •jet-szeparátor •membrán alkalmazása
GCMS
kicsiny átméroju (d = 0,25 mm) kapilláris oszlopok elterjedése: interface nélküli, közvetlen csatlakoztatás EI 1. anyamolekula gerjesztodik 2. ionizálódik 3. fragmentáció
fragmentáció: •kötéshasadás •a molekulát alkotó atomok átrendezodése
tömegspektrum: m/z függvényében ábrázolt beütésszám molcsúcs: molekulaion csúcsa báziscsúcs: legintenzívebb vonal leányion: molekulaionból képzodo ion unokaion: leányionokból képzodo ion
relatív intenzitás m/z = 15 Ir ˜ 95
CH4
m/z = 16 Ir = 100
m/z = 14 Ir ˜ 20 m/z = 17 Ir = 1,1
m/z
hexán: C6H14
homológ sorozatok: 14 tömegkülönbséggel
3-Pentanol C5H12O M = 88,15
relatív intenzitás m/z = 78 Ir = 100
m/z = 77 m/z = 76 Ir ˜ 15 Ir ˜ 5
m/z = 79 Ir = 6,6
C6H6
naftalin: C10H8
