DISERTASI
KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DARI Aeromonas caviae DAN EKSPRESINYA PADA Pseudomonasfluoresceiti
Oleh AMARLLA MALIK
PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT PERTANTAN BOGOR 2000
DISERTASI
KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DARI Aerornonas caviae DAN EKSPRESINYA PADA Pseudomonas fluorescens '
Oleh AMARILA MALIK
PROGRAM PASCASAWANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2000
". . .plXzli meninggit&an orang yang 6eriman di antara &mu dan orang-oraw yang di6eri $mu pengetahuan, 6e6erapa derajat ... " @ l % ~ ~ ~ M d a h: l1iI )
To my parents. To my beloved husband, Rusli, and our children. Rizka and Radhian
ABSTRACT
Chitinase gene (chi) fiom A e r o m o w m i a e WS%, which was cloned previously in pUC19 based plasmid vector, has been sequenced. Its completed nuceleotide sequence was determined. The structural gene consists of 2.937 bp with an ORF encoding 865 amino acids. DNA sequence analysis indicated that the gene was cloned without its indigenous promoter. Comparison to other chitinase genes in database shows that the deduced amino acid sequence was nearly identical (97%) to chiA from A. caviae isolated fiom Israel. In this study, chi was cloned either under a strong constitutive promoter, i.e. P K ~ as ~ a, transcriptional fusion, or under an inducible strong promoter, Pfac. To introduce the gene fision/s into Pseudomonas fluorescemfPf),the constructs were cloned into broad host range plasmid vectors such as pRK415, pBBRlMCS2, and pVSP61. Chitinolytic expression of ~ ~ m ~ - c h i fUsion on chitin agar plate as clear zones could only be demonstrated in a recombinant plasmid based on pBBRlMCS2 replicon, designated as pAM340. pBBRlMCS2, which has higher copy number than the either pRK415 or pVSP61, was used as a vector for the construction of Ptac-chi, which was designated as pAM630. A P ~ r n ~ - c h fision i in a suicide vector, pWTmini-TnS SplSm, has been constructed as well, and was designated as pAM520. Construction of pAM520 was performed to obtain the chi fision clone that integrated into Pf chromosome, and
that will be stably maintained as a single copy number. From the three transcriptional fusion recombinants, only Escherichia wIi harboring pAM520 recombinant could not demonstrated chitinolytic activity. To mobilize the chi fusion recombinant into PC gene tranfer was performed employing bacterial conjugation. Based on the time of incubation required to display transparent zone on chitin agar plate, the chi gene expression in Pf demonstrated much higher activity than when the same construct was present in E. colz. Chitinase activities were determined speckrophotometricaIly using colloidal chitin azure as a specific substrate.
The
results showed that the expression of chi fusion in E. w l i was significantly
influenced by plasmid w p y number as shown in E. coli (pWS506), which expressed intracellular chitinase activity (4.17 U/mg protein) several folds higher than that of medium copy plasmid in E. coZi (pAM630) (1.05 U/mg protein). Pf5 100 (pAM630) overnight culture accumulated chitinase in the intracellular fraction which is three folds higher (2.53 Ulmg protein) than the control strain. There was no significant chitinase activity in the extracellular fraction of PfS100 (pAh.4630). From these results, it could be concluded that the expression of chi was influenced by gene copy number of constructed gene, as well as the nature of bacterial host used in this study
AMi4RE.A h4AL.X. Konstmksi h s i translcripsi gen kitinase dari Aeromonas caviae dan ekspresinya pada Psetcdomonas fIuorescens. Di bawah bimbingan ANTONIUS SUWANTO sebagai ketua, dan berturut-tumt BUD1 TJAHJONO, MAGGY T. SUHARTONO, INDRAWAT1 GANDJAR d m ED1 GUHARDJA sebagai anggota komisi .
Penelitian tentang gen kitinase dan pemanfaatannya telah banyak dilakukan. Gen kitinase berpotensi antara lain untuk mengkonstruksi agens biokontrol terhadap ~endawanpatogen tanaman, selain untuk dimanfaatkan ddam stud1 regulasi dan ekspresi gen, serta proses degradasi kitin. Gen kitinase yang diisolasi dari Aeromollas caviae rnasih belurn banyak dilaporkan jika dibandingkan dengan
laporan tentang gen kitinase dari Serratia marcescens. Studi tentang kloning gen kitinase secara fisi transkripsi telah dilaporkan, namun sumber gen kitinase yang digunakan adalah gen kitinase dari S. marcescens. Di dalam penelitian ini gen kitinase (chi) dari A. cavzae isolat WS7b yang & i o n pada vektor berbasis pUC (pWS506) oleh peneliti sebelumnya, telah disekuens, dan sekuens nukleotida yang diperoleh diialisis dengan mernbandingkan dengan kitinase yang telah a& di ahtabase.
Konstruksi fisi transkripsi gen chi di daIam penelitian ini menggunakan vektor berspektmm inang has, yaitu pRK415, pBBRIMCS2, dm pVSP61. Ketiga vektor mempunyai karakter berbeda, yaitu dari jumlah kopi, penanda antibiotik, ulcuran plasmid, situs endonuklease restriksi,
dan kelompok inkompatibiiitas.
Promotor untuk ekspresi gen chi yang digunakan di dalam penelitian ini adatah promotor gen resistensi Kanamisin, P K ~ yang ~ , bersifat konstitutic yang diisolasi dari pUC4K, d m promotor hibrid trp-lac (Pfac) yang merupakan promotor kuat bersifat terinduksi, namun dalam keadaan tidak terinduksi bersifat konstitutif Konstruksi fbsi chi diintroduksi ke PseuCtOmo~sJluorescem (Pf) gatur dan isolat biokontrol. Galur yang digunakan adalah B29, yaitu biokontrol balcteri patogen penyebab pustul pada tanarnan kedelai, serta isolat Pf5024 dan Pf 5100, yaitu biokontrol penghasil biosurfkktan yang diisolasi dari tanaman brokoli.
Penelitian ini bertujuan untuk : (i) karakterisasi DNA gen chi dengan sekuensing, dan data sekuens yang diperoleh akan dibandingkan dengan kitikitinase yang sudah ada di &&base
unntuk mempelajari kekerabatannya; (ii)
mengkonstruksi gen chi sebagai fisi transkripsi di bawah prornotor ekspresi yang konstitutie (iii) mengintroduksi k s i transkripsi chi ke P. fluorescens (Pf) isolatisolat biokontrol ; (iv) menganalisis ekspresi gen chi pada isolat-isolat P f secara esei kualitatif dan esei kuantitatif. Untuk mencapai tujuan tersebut telah dilalcukan serangkaian percobaan sebagai berikut, yaitu (i) sekuensing DNA gen chi dengan stmtegi subkloning d m
primer waiking. Data sekuens yang diperoleh dianalisis dengan program BLAST dari European Bioinformatics Institute, dan sekuens asam amino turunan diperoleh dengan program Swiss-Prot. Pembandingan dengan kitinase-kitinase yang sudah ada dilakukan rnenggunakan program CIustaI-W, ((ii) konstruksi fbsi transkripsi P K ~ ~ -
chi pa&
vektor-vektor plasmid berspektrum inang luas, analisis ekspresi kitinolitik
rekombinan-rekombinan di klon E. wi'i, dan intnwluksi rekombinan kitinolitik
(pAh.4340)ke isolat-isolat Pf; (iii) konstruksi fusi translcripsi pICmR-chi pada vektor transposon mini, pUTmini-Tn5 Sp/Sm, menghasilkan pAMS20, analisis ekspresi kitinolitik rekombinan di klon E. d i , dao introduksi pAM520 ke isolat-isotat serta analisis keberadaan gen
chi dengan metode amplifikasi; (iv) konstruksi fusi
transkripsi
vektor
Pfac-chi
pada
berspektnun inang
luas
pBBRlMCS2,
menghasilkan pAM630, analisis ekspresi kitinolitik rekombinan di klon E colt, dan introduksi pAM630 ke Pf5100; (v) esei aktivitas kitinase secara spektrofotometxi rnenggunakan substrat spesifik Chitin Arure, serta mengukur konsentrasi protein total dari finksi ekstraselular dan intraselular.
Dari hasil sekuensing diperoleh selcuens nukleotida gen chi sepanjang 2.937 pasang bssa yang m e n y a n d i i 865 asam amino lmumm yang menunjukkan kemiripan sekuens DNA sangat tinggi (98%) dan kemiripan sekeuns asam amino
tunrnan 97% dengan chiA dari A. uzviue asal Israel. Fragmen DNA chi mengandung satu kerangka baca terbuka yang mempunyai selaens mirip sekuens Shine-Dai'garno
AGGA terletak 9 nukleotida mendahului kodon inisiasi transkripsi ATG. Pada ujung karboksil terdapat tiga buah sekuens ulangan terbalik yang potensial membentuk struktur hairpin-loop sebagai terminasi transkripsi yang didahului oleh kodon terminasi translasi TGA.
E. coli yang membawa konstruksi fisi transkripsi pECmR-chi di pRK415 (p-30)
dan pVSP61 (pAM430) tidak menunjukkan ekspresi kitinolitik medium
agar-agar kitin yang diamati sampai 7 hari inkubasi, sedangkan fisi di pBBRlMCS2 fpAM330 dan pAM340f dapat mendegradasi kitin, namun tidak sekuat di inang asalnya. Dari faktor jumlah kopi gen, pBBRlMCS2 mempunyai jumlah kopi lebih tinggi daripada pRK415 dan pVSP61. Introduksi pAM340 ke Pf B29 tidak berhasil memperoleh ekskonjugan yang kitinolitik. Introduksi pAM340 ke Pf 5200 berhasil memperoleh ekskonjugan yang menunjukkan ekspresi kitinolitik yang &p
lcuat
berupa wna bening setelah diinkubasi selama 9 hari. Hasil analisis ampiifikasi menunjukkan Pf B29 tidak membawa gen chi, sedangkan Pf 5100 membawa gen chi.
E. coli yang membawa h s i transkripsi ~ ~ m ~ - di c h pUTmini-TnS i Sp/Sm (pAM520) tidak menunjukkan ekspresi kitinolitik sampai 10 hari inkubasi. Introduksi pAM520 ke Pf B29, Pf 5024 dan Pf 5100 dianalisis dengan asnplifikasi
gen chi menunjukkan bahwa gen chi tidak ada di dalam Pf B29, namun terbukti ada di dalam Pf 5024 dan 5100. Ekspresi gen chi di Pf 5024 dan 5100 tidak terlihat sampai 10 hari inkubasi pa& medium agar-agar kitin.
E. coli yang membawa konstruksi fisi transhipsi Ptac-chi di pBBRlMCS2, yaitu pAM630, menunjukkan ekspresi kitinolitiik setelah d i i b a s i selama 11 hari,
namun zona bening yang dihasilkan lemah. Introduksi pAM630 ke Pf 5100 berhasil memperoleh ekskonjugan kitinolitik yang culcup kuat dari munadnya zona bening setelah diinkubasi selama 7 hari. Hasil esei aktivitas kitinase menunjukkan bahwa ekspresi fbsi chi di E c d i dipengaruhi oleh jumlah kopi plasmid sebagaimana yang ditunjukkan oleh E. cdi pembawa pWS506, yang merupakan plasmid bejumlah kopi tinggi, yang
mengekspresikan kitinase intraselular empat kali lipat lebih tinggi (4.17 U/mg protein) dari E. wli pembawa pAM630 yang merupakan plasmid berjumlah kopi medium (1.05 U/mg protein). Kitinase terakumulasi pada fiaksi intraselular dari
fkaksi
kuitur sernalarn Pf5100 (pAM630) yang menunjukkan aktivitas tiga kali lipat (2.53 U/mg protein) dari aktivitas pada
ekstraselular (0.93 Ulmg protein). Dari hasil
tersebut disimpulkan bahwa ekspresi gen chi dipenganthi oleh jumlah kopi gen serta sifat balcteri inang atau isolat yang digunakan pada penelitian ini.
KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DAM Aeromonas caviae DAN EKSPRESINYA PADA Pseudomonas fluorescens
Oleh
Disertasi Sebagai saiah satu syarat untuk memperoleh gelar DOKTOR pada Program Studi Biologi Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARTANA INSTITUT PERTANLAN BOGOR 2000
JUDUL DISERTASI
: KONSTRUKSI FUSI TRAlYSKRlPSI GEN KITINASE DARI Aeromunm &c DAN EBPRESINYA PADA 13eudomonmfZlcmescens
NAMA MAI-IASISWA : AlMARILA MALIK
NOMOR MAHASISWA: 95575 PROGRAM STUD1
: BIOLOGI
1. Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Antonius Suwanto M Sc. Ketua
no
Prof. Dr. -~nggota 2. Ketua Program Studi Biologi
A
Dr. Ir. Dedi Setiadi. MS Tanggal Lulus : 19 Agustus 2000
Prof. Dr. Edi Guhardja Anggota
ram Pas-
Saj a n a
Penulis adalah anak kedua dari empat bersaudara putra-putri dari ayah Amir Malik dan ibu Martha Amir, dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 Oktober 1964. Telah dikaruniai seorang putri Rizka h4aulida dan seorang putra Radhian Amandito dari suami Rusli Yunus. Penulis lulus pendidikan Sekolah Dasar (SD) di SD Adik Irma Suryani, Jakarta, bulan Desember tahun 1976, Iulus pendidikan Sekolah Menengah tingkat Pertama (SMP) di S M P Negeri I, Jakarta bulan Juni tahun 1980, dan lulus pendidikan Sekolah Menengah tingkat Atas (SMA) di SMA Negeri 4, Jakarta bulan Juni tahun 1983. Pada tahun yang sama melanjutkan pendidikan ke Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FhlIPA), Universitas Indonesia 0melalui Proyek Perintis I. Lulus sarjana Farmasi pada bulan September tahun 1988, melanjutkan ke pendidikan profesi Program Apoteker di Jurusan yang sama hingga iulus bulan Desember 1989. Penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang S2 pada tahun akademik 1991/1992 hingga lulus bulan Oktober tahun 1993 di Program Studi Farrnasi Pascasarjana fnstitut Teknologi Bandung dengan sponsor dari Tim Manajemen Program Doktor (TMF'D), Direktorat Pendidikan Tinggi (Dikti). Pada tahun akademik
1995/1996
penulis
melanjutkan p e n d i d i i ke jenjang 53 di Program Studi Biologi Prognun Pascasajana Institut Pertanian Bogor dengan sponsor dari Beasiswa Unggulan (URGE) dari Bank
Dunia melalui Dikti. Sejak bulan Maret 1990 hingga sekarang menjadi s t a f pengajar di Jurusan Farmasi FMfPA UI.
UCAPAN TERIMA KASIH Syukur AlhamduliUah penulis ucapkan atas segala rahmat dan hidayah dari Allah SWT atas s e l d y a pelaksanaan penelitii dan penulisan d semoga m
w
a e
i
i ini, dan
t bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi,
khususnya di bidang Biologi. Dalam mehksanakan penelitian dan penulisan disertasi penulis telah
mendapat bantuan dari berbagai pihak, baik bempa saran, kritik, dana, maupun bantuan moril dan d o a Pada kesemptan ini perkenankan penulis mengucapkan terima kasih yang tulus dan sebesar-besarnya kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan Kepada Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc., sebagai ketua komisi pembimbing
yang telah ~nemberikanbiibimgan, saran dan arahan mulai dari pemilihan mata ajaran, penyusunan usulan penelitian, pelaksanaan penelitian sampai penulisan disertasi.
Penghargaan yang tinggi penulis haturkan atas dorongan beliau yang
memotivasi penulis untuk rnenge-
kemampuan bersikap mandiri, tekun,
dan percaya diri dalam meneliti. Tidak lupa rasa terima kasih p u g besar atas kesempatan yang diperoleh
unNc
melakukan sebagian pekejaan penelitian ini di
Scottish Agricultural College, The University of Edinburgh, dari Higher Education
LINK Project, berjudd "Sustainable crop protection to improve food production: tra~ "
'
g technology h m m
f
i to practice'' dari DFID, The British Council,
dimana beliau adalah salah seorang koordinator.
Kepada Dr. Ir. Budi Tjahjono, M-Agr., sebagai anggota komisi pembiiing
yang telah membmhn b i i h g a n dan saran, serta kesempatan bergabung dalarn kelornpok peneliii H h h T i m (URGE) Project Grant 029/HTPP/WURGE/l996 "Construction of Biowntrol for B a c t d Disease in Plants: Genome Analysii Pathogenesis, and Molecular Ecology of Xanthomonas campestris pv. gZycines", sehingga mendapat bantuan dam yang b e r h g a untuk dapat mehksamkm dan
menyelesaikan pene-
ini Kepada Pro£ Dr. Ir. Maggy T. Suhartono, sebagai
anggota komisi pemb'img yang telah rnemberhn birnbingan dan saran, serta kesempatan melakukan sebagii pekerjaan peffilitian di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas-Bioteknologi, IPB yang beliau kepalai.
Kepada Prof. Dr. Indrawati Gadjar, sebagai anggota kornisi p e m b i i b ' i atas bib'mgan dan saran, serta dukungan m o d yang kuat sebagai intelektual dan Guru 3esar FMIPA, Universitas Indonesia, tempat penulis bekeja sebagai staf pengajar. Kepada Prof. Dr. Edi Guhardja, sebagai anggota komisis pembimbing atas bimbmgan dan saran, serta kearifan dalam memberikan pandangan dan masukan
yang berguna bagi kesempurnaan suaiu disertasi. Kepada
Dr. Endang Purwantini, staf pengajar FMIPA Institut Teknologi
Bandung, dan Dr. Anja Meryandini, staf pengajar FMIPA Institut Pertanian Bogor, sebagai penguji luar komisis, atas saran clan kritik yang menjadi masukan yang IJ~rInanfaatagar disertasi ini menjadi kbih sempuma lagi Kepada Direktur Program Pascasajana dan Ketua Program Studi Biologi,
Institut Pertanian Bogor. beserta staf yang telah memberikan kesempatan untuk pendidikan S3 dengan Beasiswa Unggulan URGE (Universify Research for
Graduate Education) Batch III tahun 1996/1997. Kepada Rektor Universitas Indonesia, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia, dan Ketua Jurusan Farmasi FMIPA UI yang telah memberikan kesempatan untuk pendidiken S3 di Institut Peaanian Bogor.
Kepada Direktur SEAMEO BIO'JXOP (South Easf Asia Regional Centrefor Tropical Biology) Pro£ Dr. Sitanala Arsyad rcmg telah memberikan kesempatan clan
..
melakukan penelitii di Laboratorium Molecular Biology. Kepada para
peneliti dan -wan
S
M
O BIOTROP atas kesempatan mengguaakan
hilitas, terutama kepada Pro€ Dr- Irene M U m b o h sebagai kepala Divisi
Biofechnology and Tree Breeding (ETB), beserta stafdan telcnisi yang dengan penuh kesabaran dan pengertian dalam suasana kekeluargaan dsn pmddxkm yang tulus
m e r n b e h d-an &lupakan.
bagi kelancaran pekejaan penelitian hi tidak akan dapat
Kepada Dr. Rob Harling, koordinator Higher Education LINK Project bejudul "Sustainable crop protection to improve f w d production: transferring technology porn research to practice" dari DFID, The British Council, atas
b i i a n , saran, dan arahan yang &bedcan selama rnehkukan sebagii penelitian ini di Scottish Agricultural College, Univemity of Edinburgh, Scotland, UK Kepada rekan-rekan mahasiswa, para staf dan karyawan Pascasarjana IPB, para teknisi PAU-Bioteknologi IPB dan Laboratorium Molecular Biology SEAMEO
BIOTROP, yang selama ini telah membantu dau bekejasama dengan baik. Kepada yang tercinta keluarga pen&,
kakak, ad&-ad&,
ibu, ayah, suami, anak-anakku, nenek,
dan ibu mertua, yang selalu memberikan dukungan moril dan
kekuatan do'a, serta toleransi yang talc terhingga berupa rasa pengertian dan sangat memaklurni sejak awd hingga selesainya pendidilcanS3 ini.
Kepada semua pihak yang belum disebutkan, penulis ucapkan banyak terima kasih. Atas segala bantuan clan amal ba&nya, penulis mendo'akan mudah-mudaban
Q
i h h l a n yaug setimpal oleh AUah SWT. Amiin
KATA PENGANTAR
Berkat rahmat Allah SWT, penelitian dan penulisan disertasi yang berjudul "Konstruksi
fisi transkripsi gen kitinase dari Aeromonas caviae clan ekspresinya
pa& Pseuabmo~sfluorescen.3' dapat diselesaikan. Dalam penelitian ini ditalcukan konstruksi penyisipan gen chi di bawah promotor konstitutif dan terinduksi , d m diklon pada vektor berspekttum inang luas dan vektor transposon, sehingga ekspresi gen chr akan dikendalikan secara konstitutif di inang Pseudomonas fluorescens isolat-isolat biokontrol. Melalui penelitian dan penulisan ini penulis ingin menyumbangkan informasi tentang karakteristik gen chi dari A. cuviae asal Indonesia, serta kemungkinan pemanfkatannya sebagai sumber gen chi yang berpotensi dalam mengkoastruksi biokontrol d w a a patogen tanaman. Berdasarkan konstruksi fUsi transkripsi yang dihasilkan di dalam penelitian ini maka ekspresi kitinase di biok-1
akan bersifat konstitutif tanpa induksi, yang
sangat sesuai untuk diimplikasikan sebagai biokontrol pencegah serangan ceadawan patogen alternatif. Dengan demikian, penggunaan firagisida kimia yang selama ini telah
terbukti
dapat
memberikaa
dam&
bumk
pada
liagkungan,
dan
membahayakan mahluk hidup serta m i k m o ~ s m enon target hinaya, dapat dihindari. Penulis mengharaplcaa adanya sumbang saran dan kritikan dari pembaca sekalian untuk meajadikan hasil penelitian &sertasi
temtaag konstruksi &si
transkripsi gen chi di biokontrol P.fr~orescensini berpotensi untuk dikembangkan dalam pencegahaa cendawan patogea altematifhagisida kimia.
Bogor, Agustus 2000 Penulis
DAFTAR IS1 ..................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ....................................................................... xvii DAFTAR TABEL .......................................................................... f.
xix
PENDAHULUAN ....................................................................
1
A . Latar Belakang .....................................................................
1
..
B . Tujuan Penelitran ...................................................................
6
C. Tahap Pengerjaan ..................................................................
6
D. Manfaat Penelitian .................................................................
7
I1. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................
..
A. Enzim IOt~nase....................................................................
B. Gen Kitinase bakteri yang telah dilaporkan .................................. C. Pseudornonc~sfluorescens........................................................ D . Teknologi DNA rekombinan ......................................................
E. Regulasi ekspresi gen dan fbsi transkripsi .....................................
F. Transfer gen pada Bakteri .......................................................... G. Sekuensing DNA .................................................................
III. BAHAN DAN METODE ........................................................... A. Tempat Penelitian .................................................................
B. Bahan ............................................................................... C. Prosedur Umum dan Peralatan ................................................... D . Metode .............................................................................. E. Sekuensing DNA gen kitinase .................................................. F. Konstruksi gen chi di bawah promotor gen
dan introduksi ke
P.ji'uorescens ...................................................................... xiv
8 8
11
F.1. Penyisipan gen penanda resistensi antibiotik ............................
59
F.2. Penyisipan gen KmRpada plasmid vektor berspektrum inang luas ...
59
F.3. Pembuatan fragmen gen chi bemjung tumpul dengan teknikfiCI-in ...
61
F.4. Penyisipan -men
tumpul gen chi pa& vektor perantara .............. 6 2
F.5.Penyisipan gen chi di bawah PKmR .........................................
62
F.6. Penyisipan gen penyandi CimRsebagai penanda seleksi ................. 63 F.7. Introduksi konstruksi fusi transkripsi ~ ~ r n ~ -pada c h ivektor
berspektrum inang luas ke Pf ...............................................
63
G. Rekonstruksi fusi transkripsi pKmR-chimenggunakan vektor integrasi dan introduksi ke P.fIuorescens .......................................
64
G.1. Konstruksi sisipan fragmen gen chi dengan penanda C+mR............... 64
G.2. Penyisipan fkagmen chi-GmR di bawah PKmR pada pUC4K ........
66
G.3. Penyisipan m e n fhsi PKmR-chi-GmR pada vektor perantara pUC 18NotI ....................................................................
66
G.4 Konstruksi h i PKrnR-chi-GmR pada vektor integrasi pUTmini .....
67
G.5. Introduksi konstnrksi fusi pI€mR-chipada pUTmini ke Pf ............
67
H. Konstruksi Fusi Transkripsi gen chi di bawah Ptac dan introduksi ke Pf
..
67
H.1. Pengambilan Ptac dari pKK223-3 dm penyisipan pada vektor plasmid 68 H.2. Fusi transkripsi m e n gen chi-GmR di bawah kontrol Ptac ..........
68
.................................
69
H.3. Introduksi konstruksi fusi Pfac-chi ke Pf
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... A. Sekuens DNA gen kitinase ........................................................ B . Konstruksi gen chi di bawah pKrnRdan introduksi ke ~f ...................
71 71 80
C . Rekonstruski fisi tramkripsi pKrnR-chi menggunakan velctor transposon dan inhoduksi ke Pf ................................................................
D . Konstruksi fusi transkripsi gen chi di b a w d Ptac dan introduksi ke Pf
....
92 97
E. Esei enzimatik kitinase dengan substrat spesifik ...... .................. ... 104 V.KESIMPZJLAN DAN SARAN ................................................ . .... 1 1 7 DAFTAR PUSTAKA .,. ...... . .. ..... .... ......... .. ........ ... .. .. ....... ..... . ... .....
120
DAFTAR GAMBAR
Halaman
..
2.1 Struktur htln ............................................................................
9
2.2 Lintasan degradasi kitin ..............................................................
10
2.3 Alur informasi dan fakto-faktor regulasi ekspresi gen .............................
26
2.4 Fusi gen terhadap suatu gen penyandi ............................................... 28 3.1 Strategi sekuensing gen chi dengan subkloning danprimer walking ...........
55
3.2 Skerna konstruksi fisi transkripsi ~ ~ m ~ -pada c h vektor i berspektrum
inang luas ................................................................................ 3.3 Plasmid p34S-Grn .....................................................................
60
63
pada vektor integrasi 3.4 Skema konstruksi k s i transkripsi pICmR-chi-~mR PUT mini-Tn5 Sp/Sm ................................................................. 65 3.5
Skema konstruksi h s i transkripsi ~fac-chiGrnR pada vektor berspektrum inang luas ............................................................................... 70
4.1 Sekuens nukleotida fragmen 2.9 kb gen chi beserta sekuens asam amino 4.2 Pembandingan sekuens asam amino turunan dari kitinasekitinase yang
berkerabat dekat ....................................................................... 4.3 Analisa perbandingan ujung karboksil gen chi WS7b ...........................
77
80
p ~ ~ 5 ...................... 0 6
81
4.5 Vektor-vektor berspektmm inang luas yang digunakan ..........................
83
4.4 ~ e n y i s i ~ gen a n T~~ di bagian hilir gen chi
chi-^^^
plasmid p ~ ~ 3 8............................ 5
84
4.7 Verifikas'l orientasi pAM201 dengan enzim restriksi pada gel agaros ........
86
4.6 ~ e n y i s i ~&agmen an 4.8 Fragmen
chi-^^^ disisipkan di vektor-vektor pembawa gen ICmR..............
87
4.9 Verifikasi orientasi rekombinan fbsi transkripsi pAM330 .......................
88
4.10 Peta restriksi plasmid pAM330 .....................................................
89
4.1 1 Ekspresi kitinolitik gen chi pada klon E. coli dan P.fluorescem 5 100
pembawa pAM340 ...................................................................
91
4.12 Peta restriksi plasmid pernbawa sisipan fragmen chi-GnR, pAM202 .........
93
4.13 Peta restriksi pAMSOO (A) ..........................................................
94
4.14 Verifikasi rekombinan pAMSOO. p a 5 0 3 dan pAh4520 .....................
95
4.15 Esei aktivitas kitinolitik E. coZi (pAM500) .......................................
96
4.16 Anaiisis keberadaan gen chi dengan teknik amplifikasi .......................
97
4.17 Konstruksi Ptac pada pBBRlMCS2 dalam dua orientasi ........................ 99 4.18 Hasil elektroforesis pengambilan h g m e n Pfac dari pKK223-3 dan verifikasi pAM601 clan pAM630 ..............................................................
101
4.19 Peta plasmid rekombinan pAM630 ...............................................
102
4.20 Esei aktivitas kitinolitik bakteri pembawa fUsi transkripsi Ptac-chi ..........
103
4.21 Kurva pengukuran waktu inkubasi optimum dan lcurva standar ...............
106
4.22 Aktivitas kitinase A . cavim WS7b pada dua suhu inkubasi ....................
107
4.23 Esei kuantitatif aktivitas kitinase gen chi di E. colz dan P.fluorescens terhadap substrat Chitin Azure .....................................................
xviii
109
DAFTAR TABEL Halaman 3.1 Galur bakteri yang digunakan ................................................. 3.2 Plasmid yang digunakan .......................................................
4.1 Ukuran £'ragmen DNA hasit verifikasi pAh4201 .......................... 4 . 2 Ukuran fragmen DNA hasil verifikasi pAM330 .......................... 4.3 Ukuran ftagmen DNA hasil verifikasi pAMSOO, pAMS03 dan pAM520 4.4 Ukuran fragmen DNA hasil verifikasi pAM601 dan pAM630 ........ 4.5 Ekspresi kitinolitik gen chi pada reombinan plasmid ...................
4.6 Aktivitas kitinase hasil ekspresi gen chi di E. coli dan P.fluorescem...
