Kolonizace Střední Evropy bentickým sladkovodním korýšem Asellus aquaticus (Isopoda, Crustacea)

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA EKOLOGIE

Kolonizace Střední Evropy bentickým sladkovodním korýšem Asellus aquaticus (Isopoda, Crustacea)

Bc. Antonín Střížek

Školitelka: RNDr. Veronika Sacherová, PhD.

Praha 2012

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracoval samostatně, pod vedením školitelky RNDr. Veroniky Sacherové, Ph.D., a že jsem všechny použité prameny řádně citoval. Jsem si vědom toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. Svoluji k zapůjčení této práce pro studijní účely a souhlasím s tím, aby byla řádně vedena v evidenci vypůjčovatelů. V Praze dne 27. 8. 2012 ________________________ Bc. Antonín Střížek

-2-

ABSTRAKT Dlouhodobé klimatické změny, jsou pevnou součástí vývoje planety Země. V několika posledních miliónech let znamenalo střídání glaciálů a interglaciálů stejně běžný a pravidelný proces jako je střídání dne a noci, nebo jara a zimy. Stejně významně také tyto cykly ovlivňují vývoj přírody na Zemi. I když se nám v průběhu několika uplynulých lidských generací zdá stav přírody stabilním, realita v dlouhodobém je měřítku podstatně jiná. Během těchto cyklů se významně měnila poloha podnebních pásů, velikost ledovců, pouští, savan, stepí či deštných pralesů. Ogranizmy měnily polohy svých areálů rozšíření, mnoho dnes široce rozšířených druhů bylo zatlačeno do izolovaných lokálních populací. Tato diplomová práce odhaluje dopad glaciálních cyklů na drobného sladkovodního korýše berušku vodní (Asellus aquaticus). Vysoce variabilní mitochondriální gen COI byl osekvenován u 139 jedinců tohoto druhu z 62 lokalit střední Evropy. Tato data byla doplněna do širšího rámce již známé fylogeografické struktury celého kontinentu. Beruška vodní na území České republiky vykazuje poměrně vysokou míru genetické heterogenity (maximální objevená nukleotidová divergence dosahuje hodnoty 0,132 a průměrna hodnota je 0,016). Na území České republiky se vyskytují zástupci dvou hlavních evropských genealogických linií, které se od sebe odělili přibližně před 5 miliony lety. Tyto dvě linie tvoří hybridní zónu na území jižních Čech. Hlavní evropská linie se rozkládá na většině území České republiky a je rozdělena do několika vnitřních pod-linií. Tyto vnitřní pod-linie jsou staré mezi 0,5 až 2 miliony let.

Klíčová slova: Asellus aquaticus,COI, disperse, fylogeografie

-3-

ABSTRACT Longterm climate changes are an inseparable part of the evolution of Earth. In the last few milions of years the changing of glacials and interglacials was as ordinary and regular phenomenon as changing from day to night or from spring to summer. These cycles also have similar influance on evolution of nature on Earth. Eventhough the state of nature appears to us stable for the few last human generations, the reality from the long term point of view is differnt. During these cycles, the location of climatic zones, size of glaciers, deserts, savannahs, steppes or rainforests have changed. Organisms changed locations of their areas of distribution, many nowadays widespread species were pushed into isolated local populations. This Master’s thesis reveals the impact of glacial cycles on a freshwater crustacean aquatic Isopod (Asellus aquaticus). Very variable mitochondrial COI gene was sequenced within 139 individuals of this species from 62 different localities in Europe. This data were included into an extensive scope of an already known phylogeographic structure of the continent. An Aquatic Sowbug shows a quite high rate of a genetic heterogenity (maximum Nucleotide Divergence discovered is 0,132 and average is 0,016) in the area of the Czech Republic. Where there are found representatives of two main European genealogical lines, which detached from each other approximately 5 milion years ago. These two lines make a hybrid zone in the South Bohemia Region. The Main European line, which is situated in a majority of the czech land, is divided into several inner lines. These inner lines are 0,5 – 2 minilon years old.

Keywords: Asellus aquaticus, COI, dispersion, phylogeography

-4-

Poděkování: První komu bych chtěl především poděkovat, je má školitelka RNDr. Veronika Sacherová, Ph.D. Děkuji jí za velkou míru trpělivosti a důvěry, kterou ve mě během mého dlouhého úseku studia vložila. Také jí děkuji za vedení práce, její přípravu a financování, za pěkné chvíle strávené v terénu i ve škole. Dále bych chtěl poděkovat RNDr. Martinovi Černému, Ph.D. za pomoc při sbírání vzokrů a inspiraci k cestě na Katedru ekologie. Mé poděkování si dále zaslouží všichni ti, co se podíleli na sbírání vzorků a terénních cestách. Tedy především Markétě Peškové a dále Evě Kozubíkové, Petrovi J. Juračkovi, Janu Špačkovi, Petrovi Komzákovi a Martinovi Krajíčkovi. Z celého srdce, děkuji.

-5-

Obsah: 1. Úvod ............................................................................................................... 7 1.1. PLANETÁRNÍ KLIMATICKÉ ZMĚNY ............................................................................... 7 1.1.1. Metody paleoklimatologie ...................................................................................... 7 1.1.2. Průběh klimatických změn ..................................................................................... 8 1.1.3. Příčiny klimatických změn ................................................................................... 10 1.2. BIOLOGICKÁ REAKCE NA ZMĚNY KLIMATU ............................................................... 12 1.2.1. Pojem migrace ...................................................................................................... 13 1.2.2. Demografické změny populací............................................................................. 13 1.2.3. „Refugia“ .............................................................................................................. 15 1.2.4. Kategorie refugií .................................................................................................. 16 1.2.5. Jiné reakce na klimatické změny .......................................................................... 20 1.3. DOPADY DEMOGRAFICKÝCH ZMĚN NA FYLOGENEZI .................................................. 21 1.3.1. Refugia – centra divergence a heterogenity ......................................................... 21 1.3.2. Expanze z refugií a její charakteristika ................................................................ 22 1.3.3. Fylogeografie ....................................................................................................... 24 1.4. SCHOPNOST DISPERZE ............................................................................................... 25 1.4.1. Disperse v ekologii a evoluci ............................................................................... 26 1.4.2. Disperse sladkovodních bezobratlých .................................................................. 29 1.5. MODELOVÝ ORGANISMU BERUŠKA VODNÍ (ASELLUS AQUATICUS) .............................. 31

2. Cíle práce ...................................................................................................... 36 3. Metody .......................................................................................................... 38 3.1. 3.2. 3.3. 3.4.

VYMEZENÍ A SBĚR DAT .............................................................................................. 38 LABORATORNÍ ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ A SEKVENACE ................................................. 42 DOPLŇUJÍCÍ DATA ..................................................................................................... 43 FYLOGEOGRAFICKÉ ZPRACOVÁNÍ SEKVENCÍ ............................................................. 44

4. Výsledky ....................................................................................................... 46 4.1. 4.2. 4.3.

HAPLOTYPOVÉ SÍTĚ ................................................................................................... 46 ODHADY STŘEDNÍCH VZDÁLENOSTÍ SEKVENCÍ GENU COI......................................... 62 GENETICKÉ ROZDÍLY MEZI POPULACEMI ................................................................... 65

5. Diskuse ......................................................................................................... 66 6. Závěr ............................................................................................................. 72 Literatura ............................................................................................................. 74 Přílohy ................................................................................................................. 82

-6-

1. Úvod

1.1.

Planetární klimatické změny

Současné rozšíření většiny druhů živočichů a rostlin se z hlediska evolučního času utvářelo poměrně nedávno. Distribuci organizmů na celém povrchu planety totiž z velké míry ovlivňuje klima. Globální klima se však v průběhu vývoje Země neustále mění. Pro pochopení současného rozložení areálů výskytu jednotlivých druhů, ale i pro pochopení samotného vývoje druhů, je důležité si tuto klimatickou nestabilitu uvědomit. Stav podnebí, který nám dnes připadá jako naprosto přirozený, je ve skutečnosti jen jednou z nesčetných period, která zatím trvá jen poměrně krátké období, tedy od konce poslední doby ledové, což je přibližně 11 tisíc let (Webb & Bartlein 1992).

1.1.1. Metody paleoklimatologie Uplynulými

změnami

planetárního

klimatu

se

zabývá

disciplína

zvaná

paleoklimatologie. Je to vědní obor s dlouhou tradicí. První dohady o možných dávných změnách klimatu formuloval již kolem roku 1840 švýcarský vědec Louis Agassiz a byly založené na geomorfologických stopách po pevninských ledovcích (Raymo & Huybers 2008). Následná teorie o dávném průběhu minimálně třech glaciálů byla všeobecně přijata již kolem roku 1920 (Ehlers et al. 2007a). V dnešní době paleoklimatologie čerpá z množství paleontologických materiálů, kde hodnotí především nepřímé kvantitativní ukazatele, které jsou senzitivní na stav klimatu. Může se jednat jak o abiotické ukazatele (geofyzikální, geochemické), tak o ukazatele biologického původu (rostlinné a živočišné fosilní záznamy). Jako materiál poskytující vhodná data se obvykle používají kóry (sloupce materiálu, který zachovává časově oddělené vrstvy) z dna moří a jezer, z nerozmrzajícího polárního ledu či vhodných terestrických oblastí, které uchovávají fosilní záznamy. Pomocí laboratorních analýz se z kórů dají na časové ose dokládat různé teplotně či vlhkostně senzitivní veličiny. Nejčastěji jsou to poměrná množství izotopů a molekul různých atmosférických plynů (Spahni et al. 2005). Z těchto výsledků se dají vyvozovat informace jako na příklad povrchová teplota oceánů, množství oxidu uhličitého v atmosféře, množství ledu na pólech, či průměrná teplota na dané lokalitě. Tyto rozbory mohou být dále doplněny fosilními záznamy,

-7-

které odhalují dřívější přítomnost různě ekologicky přizpůsobených organizmů. Tímto způsobem podávají přibližnou informaci o předešlých ekologických podmínkách panujících na dané lokalitě. Další informace o množství povrchové vody, výšce hladiny oceánu či poloze kontinentálních a horských ledovců mohou poskytnout geomorfologická a geolimnologická data (Allen 2008). Možnost získávat informace o časově více vzdálených dobách je samozřejmě omezena stářím zkoumaného materiálu. Čím více se zkoumané období blíží k přítomnosti, tím je možné získat větší množství přesnějších údajů. Nejobvyklejším teplotně závislým ukazatelem, se kterým se můžeme v literatuře či na internetu setkat, je δ18O (Hays et al. 1976, Lisiecki & Raymo 2005, Zachos et al. 2008, Raymo & Huybers 2008), ten vyjadřuje poměr dvou izotopů kyslíku O16 a O18 v atmosféře, vztažený ke světovému standardu. Udává se v jednotkách promile, s tím že nižší hodnota δ18O značí vyšší teploty. Vědci tyto údaje získávají z molekul vody vázaných v podobě ledu na pólech, nebo ze schránek dírkonožců (Foraminifera). Tito prvoci během života u hladiny jezer a oceánů vážou atmosféricky kyslík do svých schránek, které se po jejich odumření vrství na dně. δ18O nelze jednoduše převádět rovnou na průměrné planetární klima, protože je závislé, krom teploty také na množství srážek, odparu či salinitě. Pro přesnější odhady je tedy žádoucí kombinovat různé metody a mít na paměti, že klimatické změny měly různý lokální charakter, závislý na specifických geografických podmínkách (Webb & Bartlein 1992).

1.1.2. Průběh klimatických změn Početné výzkumy prováděné v uplynulých dekádách odhalily mnoho trendů planetárního klimatu. Hlavní trend předešlých 50 milionů let, tedy od období zvaného Eocén, je postupné ochlazování planety. Druhý trend má podobu cyklicky se opakujících změn a začíná se objevovat až později, tedy v období svrchního Pliocénu což je přibližně před 3 až 5 miliony let (Zachos et al. 2001). Posledních 900 tisíc let, v období Pleistocénu, se tyto klimatické cykly více méně ustálily na periodě trvající 100 tisíc let. (Hays et al. 1976, Lisiecki & Raymo 2005). Tento cyklus je obecně znám jako střídání glaciálů a interglaciálů. V době kvartéru (od 2,5 milionů let do současnosti) již byla podoba země v podstatě shodná s dneškem. Kontinenty byly na stejných místech, drtivá většina dnešních biologických druhů již dávno existovala ve stejné podobě, jako je známe dnes. Složení atmosféry a intenzita záření dopadající na povrch planety bylo v podstatě shodné s dneškem (Ložek 1999). Důležitým charakteristickým rysem tohoto období jsou zmiňované pravidelné klimatické

-8-

cykly. Glaciály měly nejsilnější dopad na temperátní a subpolární oblasti pevniny. Mnoho těchto oblastí bylo v průběhu glaciálu pokryto pevninským ledovcem, nebo zde byla trvale zamrzlá půda. V průběhu glaciálu bylo obrovské množství vody vázáno do mocných polárních ledovců. To způsobilo globální úbytek vody jak v atmosféře a tak v oceánech, což se projevilo snížením hladiny oceánů až o 121 metrů (Fairbanks 1989). To výrazně ovlivnilo celoplanetární koloběh vody, což mělo pochopitelně dopad na celou biosféru. Například v tropických oblastech tak došlo ke změnám v režimu monzunů (Braconnot et al. 2008), k úbytku atmosférické vlhkosti a k celkovému snížením teploty (Driscoll & Haug 1998). Zatímco přechod z glaciálu do interglaciálu, byl poměrně pozvolný a pomalý proces, v opačném případě, tedy na konci interglaciálu, byl pokles teploty často téměř skokový. V průběhu glaciálů také mnohdy nastávaly kratší teplé epizody (interstadiály), kdy se klima prudce měnilo i v průběhu desetiletí (Dansgaard et al. 1993). Doba glaciálu se projevovala různě v závislosti na lokalitě. Dokonce se v jeho samotném průběhu pevninský ledovec různě přesouval. Na příklad ke konci posledního glaciálu před 11 tisíci let v době posledního maximálního zalednění Evropy (LGM), byla severní část Sibiře bez ledu, i když na začátku stejného glaciálu tomu bylo přesně naopak (Ehlers & Gibbard 2008), viz obr. 1. Na území ČR tento pevninský ledovec zasahoval jen naprosto okrajově. Naše území ale bylo v době glaciálu ovlivňováno současně i druhým evropským ledovcem, který se rozkládal v Alpách. Střední Evropa tak tvořila nezaledněný pás ohraničený ze severu i z jihu ledovcem. Zdejší podmínky neumožňovaly růst lesa, proto byl typickým glaciálním ekosystémem do západní až po východní Evropu suchá a studená sprašová prašná step, brázděná širokými, mělkými řekami ve štěrkovitých korytech (Ložek 1999).

-9-

Obr. 1:

Mapa Evropy znázorňující rozložení pevninského ledovce na začátku posledního glaciálu před přibližně 90 000 lety (mapa vlevo) a rozložení ledovce na konci posledního glaciálu před přibližně 18 000 lety (mapa vpravo). Překresleno z (Ehlers et al. 2007b).

Interglaciály trvaly kratší dobu, jen 10 až 20 tisíc let oproti až 100 tisíciletým glaciálům. Vlhčí a teplejší podnebí bylo vhodné pro růst listnatého lesa, který v průběhu interglaciálu celistvě pokryl většinu Evropy. Na území ČR se mezi glaciálem a interglaciálem měnila průměrná roční teplota z - 4°C na +10°C (Ložek 1999). Od posledního glaciálního maxima (18 000 let před současností) postupně nastal interglaciál, který trvá dodnes. Je nazýván Holocén (z řečtiny Holos – celé, kainos – nové), protože toto období je razantně pozměněno činností člověka, který se naučil hospodařit a využívat půdu. Jeho činnost způsobila mimo jiné vyhynutí mnoha velkých býložravých savců a zabránila kompletnímu zalesnění Evropy. Období od konce posledního zalednění se proto vyvíjí jiným způsobem než předešlé interglaciály, a tak můžeme tato období srovnávat jen v omezené míře.

1.1.3. Příčiny klimatických změn Pro odpověď na otázku hlavních příčin opakujících se klimatických změn musíme zamířit do oblasti astrofyziky. Hlavní příčinou těchto změn jsou prokazatelně neustálé drobné změny v intenzitě slunečního záření dopadajícího do zemské atmosféry. Tyto změny intenzity záření jsou dány především třemi nezávisle fungujícími astrofyzikálními jevy: 1) Změnou excentricity (tj. výstřednosti) oběžné dráhy Země kolem Slunce. 2) Změnou naklonění zemské osy (angl. axial tilt) vůči rovině ekliptiky (tj. pomyslná rovina, na které leží dráha oběhu Země kolem Slunce). 3) Precesí zemské osy (tj. rotace osy po plášti pomyslného dvojkužele), (obr. 2). To, že intenzita slunečního záření dopadajícího do atmosféry Země má řídící efekt na cyklické změny klimatu, minimálně v průběhu posledních stovek tisíců let, poprvé

- 10 -

publikovali v roce 1976 Hays et al. Od té doby bylo toto tvrzení několikrát podpořeno množství podstatných důkazů z celého světa (Raymo & Huybers 2008).

Obr. 2:

Graf znázorňující tři hlavní astrofyzikální jevy (A, B, C) ovlivňující intenzitu dopadajícího slunečního záření (D). Překresleno z Hewitt 2003.

Přes objevené příčiny změn v ozáření země zůstává nejasné to, jak mohou mít tyto velmi slabé změny, promítající se jen do horních vrstev zemské atmosféry, tak výrazný dopad na planetární klima. Objasněn není také rozdíl v rychlostech růstu a poklesu teplot. Zatím co vzrůstání teploty je velmi pozvolné v řádu tisíců až desetitisíců let, pokles bývá, dá se říct, téměř skokový (Lisiecki & Raymo 2005). Proč se například posledních 0,9 miliónů let mění

- 11 -

klima pravidelně, ve 100 tisíciletých cyklech, přitom v předešlém období (1-3 mil. let před současností) byly cykly spíše 40 tisícileté? Je zřejmé, že pouhé popsání těchto prediktabilních astrofyzikálních jevů nestačí k dokonalé determinaci vývoje klimatu v minulosti. Klima se nemění jen cyklicky, ale v dlouhodobém měřítku i lineárně (Zachos et al. 2001). Trvalé změny klimatu jsou zapříčiněny změnami v samotné planetě. Významný podíl mají pozvolné změny ve složení atmosféry, pohyb kontinentů, či změny pod zemským povrchem. Druhotně klima také ovlivňují vzdušné a mořské proudy, velikost ledovců, vlhkost atmosféry a výskyt oblačnosti (Ehlers et al. 2007a). Všechny tyto, a jistě také mnoho dalších neustále se měnících parametrů ovlivňuje klima v průběhu celého vývoje Země. Odhalení přesných příčin klimatických změn je dosti složité a pokusy správně odhadnout budoucí vývoj jsou přinejmenším velmi nejisté. Téma klimatických změn je samozřejmě velmi závažné díky tomu, že se hluboce dotýká současné lidké populace a je možné, že dokonce ohrožuje samotnou její existenci. Výzkumu předešlých změn a jejich příčin je proto v současné době věnováno mnoho úsilí a prostředků.

1.2. Biologická reakce na změny klimatu Planetární klima se v průběhu uplynulých několika milionů let neustále mění. Tyto změny se promítaly ve změnách velikosti polárních ledovců, výšky hladiny a teploty oceánů, vlhkosti atmosféry, vzdušném i oceánském proudění a v neposlední řadě i ve změnách globální teploty. Takové změny by nemusely mít na biosféru příliš výrazný dopad v případě, že by probíhaly dostatečně pomalu, a živočichové a rostliny by se jim plynule přizpůsobovali. Jenže vývoj klimatu rozhodně nebyl v minulosti ani pomalý ani plynulý, naopak výrazné klimatické změny prokazatelně probíhaly i v mnohem kratším časovém měřítku než jsou miliony let. Výrazné změny klimatu se v minulosti odehrávaly běžně v řádech stovek či dokonce desítek let (Dansgaard et al. 1993). Skutečností přitom je, že většina současných druhů organizmů existuje mnohem déle (Hewitt 2000), než aby se mohly vyvinout čistě v reakci na nedávné změny prostředí. Proto se obecně soudí, že druhy na změny reagují především změnou svého areálu rozšíření (Huntley & Webb 1989), než setrváváním na místě a snahou přizpůsobit se novým vlivům prostředí. Druhy tedy reagují na vývoj klimatických změn nejčastěji změnami v jak distribuci, tak abundanci či densitě, avšak nikoli nutně všech těchto veličin současně (Bennett & Provan 2008). Změny klimatu tedy vyvolávají demografické změny v populacích zasažených druhů a ovlivňují jejich populační dynamiku.

- 12 -

1.2.1. Pojem migrace Pokud se mluví o změnách v distribuci organizmů, často zaznívá termín migrace. Tento termín je však často používán i v případech, které by z evolučního hlediska vůbec za migraci považovány nebyly. Takovým případem jsou na příklad sezonní migrace tažných ptáků či diurnální migrace zooplanktonu. Ekologie a jiné biologické disciplíny totiž používají pojem migrace jednoduše jako pohyb organizmů bez ohledu na to, jestli vyvolává změny v genetické struktuře populací. V této práci bude pro lepší orientaci pojem migrace používán pouze ve stejném smyslu, jako jej používá evoluční biologie. Tedy ve smyslu překonávání vzdálenosti mezi místem, kde se určitý jedinec narodil, a kde se narodili jeho potomci (Flegr 2005). Pomocí svých semen nebo gamet mohou migrovat na obrovské vzdálenosti i zcela nepohybliví, přisedlí jedinci. Naopak tažní ptaci, kteří se rok co rok vracejí na stejné hnízdiště, migrují, v tomto smyslu slova, naprosto minimálně.

1.2.2. Demografické změny populací Záznamy o předešlých výskytech různých druhů vědci zjískávají z fosilních záznamů, jako jsou zvířecí kosti, schránky některých prvoků, exoskelety členovců a otisků listů. Velmi zásadní jsou v tomto směru schránky suchozemských plžů, zbytky těl zooplanktonu a stopy pylů dřevin. Metodu pylové analýzy zavedl již roku 1916 švedský geolog Lennart von Post (Ložek 1999). Od té doby se rychle rozšířila a dnes se používá jako naprostu rutinní metoda. Pylová analýza dokládá výskyt určitého rostlinného druhu na dané lokalitě v dané době. Metoda je však omezena výskytem lokalit, které udržují podmínky bránící rozkladu tohoto materiálu. Pyl se dobře uchovává ve vlkých, kyselých půdách bez přístupu kyslíku, nejčasjtěji tedy ve slatinách a rašeliništích. Touto metodou tudíž nelze docílit celoplošného obrazu dřívější vegetace, nicméně tisíce pylových rozborů prováděných v minulosti mají své jisté výsledky. Tradičně a dlohodobě se zájem vědců zaměřuje především na oblasti Evropy a Severní Ameriky (Hewitt 1996). Důvody k tomuto zacílení jsou dané především tím, že v těchto oblastech má vědecká obec dlouhou tradici a silné zastoupení. Současně však, díky tomu, že právě na tyto oblasti mírného podnebí měly glaciální cykly velmi silný enviromentální dopad, odhalovaly již prvotní výzkumy poměrně jednoznačné a vzájemně se podporující výsledky (Huntley & Webb 1989) . Záznamy z pylových analýz promítnuté do pylových map ukazují, jak se od posledního glaciálního maxima (před 20 – 18 tisíci lety) postupně posouvají areály zozšíření

- 13 -

různých stromů směrem na sever. Tyto záznamy ukazují nejen prostorové hledisko a změny v deznitě, ale také hledisko časové, tedy rychlost, jakou k posunu dochází. Každý druh mohl reagovat na změny klimatu individuálně, protože byl ovlivněn různými okolnostmi. Často tak vznikly lesy s různou skladbou stromů. Určitý vliv na vývoj biosféry od konce posledního glaciálu mohla mít i činnost člověka, který v této době začínal využívat půdu k hospodaření. Trend posunu areálu rozšíření různých stromů a keřů v návaznosti na oteplování byl dostatečně podložen již před několika desetiletími (Prentice et al. 1991). Mimo samotné posuny areálů rozšíření byly také u většiny druhů rostlin i živočichů odhaleny změny v abundanci, které probíhaly v důsledku klimatických změn. Některé druhy málo rozšířené či naprosto vzácné v glaciálu prožily na jeho konci vyrazný nárůst velikosti populace a postupně se staly běžnými a široce rozšířenými (Bennett & Provan 2008). Toto se předpokládá i v opačném směru, kdy některé druhy byly během glaciálu hojnější než dnes, např. polární liška (Dalén et al. 2005). Tyto změny v populační dynamice jsou pro různé druhy velmi individuální, zakládají se na druhově specifických nárocích a nejspíš i na různých náhodných událostech. Takovéto změny abundance jsou podle pylových analýz, ale i genetických studií, prokazatelně návazné na změny klimatu (Hewitt 2004). Proto se předpokládá, že tyto změny probíhaly v minulosti opakovaně v návaznosti na cyklické střídání glaciálů a interglaciálů. Pro tento koncept byl navržen takzvaný „contraction-expansion model“ (Taberlet et al. 1998). Ten předpokládá, že když pro určitý druh nastanou příznivé klimatické podmínky, začne zvyšovat svou abundanci a rozšiřovat svůj areál výskytu, tak, aby obsadil území, kde pro něj panují optimální podmínky. Pokud příznivé klima skončí, začne se opět stahovat. Toto stahování však nemusí nutně probíhat pouze v rámci posunu areálu rozšíření, naopak nejčastěji je provázeno celkovými demografickými změnymi, tedy také úbytkem abundance a denzity (Bennett & Provan 2008). Význam změn v abundanci býval často opomíjen, protože je složité jej zaznamenat pylovými analýzami. V dnešní době nástupu molekulárních sekvenačních metod se dá mnohem lépe dokumentovat. V genomu lokálních populací totiž výrazné snížení abundace způsobí úbytek celkové genetické diverzity, který po následné expanzi zůstane v genofondu patrný, protože nové alely vznikají pomalu. Tento efekt se nazývá bottleneck (doslova přeloženo efekt hrdla lahve). Implikuje buď razantní snížení počtu jedinců dané populace, například z důvodu nepříznivých klimatických podmínek, nebo tak zvaný efekt zakladatele. Efektem zakladatele rozumíme vznik nové subpopulace z pouze malého počtu migrantů,

- 14 -

v extrémním případě z jediné oplodněné samice. Pokud známe přibližnou rychlost vzniku nových alel (empirická zjištění) daného genu, můžeme odhadnout přibližnou dobu, kdy k efektu bottleneck došlo. Populace s malou efektivní velikostí se mimo to projevují rychlejší fixací alel, ať už působením genového driftu či selekce, a inklinují tedy ke zrychlené evoluci. Kontrakce a bottleneck efekt proto může často vést ke vzniku geneticky odlišných subpopulací, poddruhům či ke speciaci (Stewart et al. 2010). Proti těmto jevům stojí genový tok, který pomocí migrantů rozšiřuje unikátní alely v rámci metapopulace a tím jí homogenizuje. Organizmy s vysokou mírou migrace určenou buď vysokou schopností disperse nebo spojitostí habitatu mají matapopulace geneticky homogennější než organizmy s nízkou schopností disperse a habitatem nespojitým (Flegr 2005).

1.2.3. „Refugia“ Na základě četných výzkumů zabývajících se „contraction-expansion“ modelem a změnami v distribuci populací byla založena teorie refugií (Hewitt 1996, 1999, Taberlet et al. 1998). Ta předpokládá, že změny v distribuci organizmů měly a stále mají opakující se cyklický charakter zavislý na dlouhodobě se opakujících klimatických změnách. Pojem refuge (česky útočiště) byl mezi vědci používán již v první polovině 20. století v podobném smyslu jako je chápan dnes. Ale až v roce 1955 použil kanadský vědec Heusser latinskou formu slova tedy „refugium“, ta již zůstala zachována (Bennett & Provan 2008). Obecně má tento výraz označovat místo, kde jsou schopny dostatečně velké subpopulace určitého druhu dlohodobě přežívat klimatické změny, tedy jak glaciály tak interglaciály (Bennett et al. 1991). Jedná se tedy o území uvnitř areálu rozšíření druhu, která jsou pochopitelně menší, než je celý tento areál. Změnami klimatu dochází ke změnám různých faktorů, které ovlivňují obyvatelnost lokality pro určitý druh. Těmito faktory jsou například druhové složení, množství potravy, přítomnost predátorů, sezonalita počasí, vlhkost, vlastnosti půdy atd. Refugium není automaticky celé území, kde se v nepříznivých obdobích druh vyskytuje, v té době totiž může být rozšířen i na lokality, které před změnou byly neobyvatelné a naopak. Z toho lze správně vyvodit, že slovní spojení „příznivé klimatické období“ nebo „nepříznivé klimatické období“ může být pro některé druhy přinejmenším diskutabilní. Avšak pozici refugia toto neovlivní. Stanoviště příhodná pro refugia jsou lokality topograficky členité. Ty totiž umožnují pohybovat se mezi různými mikrohabitaty v reakci na klimatické změny, aniž by druh musel překonat velkou vzdálenost. Nejčastěji tedy jako

- 15 -

refugia slouží různá pohoří či krasové oblasti. Koncept refugií byl brzy obecně přijímaným a výzkumy na toto téma se začaly rychle množit. Díky tomu, že se tento pojem ve vědeckých publikacích v dnešní době stále více používá, dochází k jeho postupnému vyčerpání (Bennett & Provan 2008). Mnohdy totiž slouží k označení různých situací, které nejsou v úplné shodě. V podstatě se tak již dnes pojem refugium neobejde bez doplňkových přízvisek a vysvětlujících komentářů, které tento pojem kategorizují a vyjasňují jeho smysl.

1.2.4. Kategorie refugií

Obr. 3:

A: Klasické glaciální refugium, které předpokládá, že druh je v průběhu interglaciálu široce rozšířen a v době glaciálu se stahuje do jižního refugia

B: Glaciální mikro-refugium, které předpokládá, že druh je v průběhu interglaciálu široce rozšířen a v době glaciálu se jeho areál rozšíření fragmentuje do většího množství izolovaných subpopulací

C: Severní kryptické mikro-refugium, které předpokládá, že druh je v průběhu

interglaciálu široce rozšířen a v době glaciálu se stahuje do většího množství menších severněji položených refugií

D: Interglaciální refugium, které předpokládá, že druh je široce rozšířen v průběhu

glaciálu a v době interglaciálu se stahuje na sever, nebo do vyšších horských poloh, kde přetrvávají chladnější podmínky

Překresleno z (Bennett & Provan 2008).

- 16 -

Klasická glaciální refugia (obr. 3 - A a obr. 4) Na základě poznání tohoto typu refugia byl celý koncept refugií založen, jsou proto dobře zdokumentována a prokázána (Hewitt 2000). Nejvíce se glaciální refugia projevují v mírném pásu severní polokoule. Princip klasického glaciálního refugia je takový, že druhy obývající mírný pás se v odbobí glaciálu stahovaly na jih do refugií, kde pro ně setrvávalo příznivější klima (vztaženo pouze na severní polokouli). Naopak v době příznivých podmínek interglaciálu, tedy také v současné době, druhy migrovaly na sever, kde se široce rozšířily. Nejlépe popsaná a prostudovaná je situace tak zvaných klasických glaciálních refugií, které jsou přítomny v Evropě. Evropa díky své jedinečné geografii představuje prostor, kde mnoho druhů z rozdílných taxonů rostlin, bezobratlých i obratlovců vykazuje podobné trendy v procesu kontrakce-expanse a tedy i podobné lokality refugií. Celá Evropa má charakter velkého východo-západně orientovaného poloostrova s důležitou jižní barierou v podobě Středozemního moře (Taberlet et al. 1998). Tato situace zapříčiňuje, že nové druhy mírného podnebí mohou přicházet jen z Asie a v dobách glaciálu, také po „pevninském mostě“ spojujícím Pyrenejský poloostrov se severní Afrikou. V oblastech východní Evropy a v Asii jsou předpokládána východní refugia. Druhým specifikem Evropy jsou tři severojižně orientované poloostrovy směřující do středozemního moře, tedy poloostrov Pyrenejský neboli Ibérský, Apeninský a Balkánský. Tyto tři poloostrovy byly označeny jako hlavní evropská glaciální refugia, která byla krom podnebí příhodná také rozmanitou topografií. Populace z evropských refugií kolonizovaly Evropu, díky kratším vzdálenostem, dříve, než to mohly stačit populace z východních refigií, tím jejich expanzi do Evropy většinou zablokovaly. Stejné principy byly odhaleny i v Severní Americe (Swenson & Howard 2005), která má sice jiný topografický charakter, na příklad absenci podobné bariéry jako je Středozemní moře, nicméně rozšiřování ledovce a klesání průměrné teploty mělo na pohyby organismů v Severní Americe podobný vliv jako v Evropě. Pro potřeby této práce však není podstatné blíže se americkými refugii zabývat.

Glaciální mikro-refugia (obr. 3 - B) Jak už sám pojem mikro-refugium naznačuje, jedná se o nějaký typ menšího lokálnějšího refugia než jsou původně navržená klasická poloostrovní refugia, která jsou v tomto konceptu nazývána makro-refugia. Nejde však o pojmy jasně velikostně definované, spíše je můžeme chápat jakoby se nacházely na protilehlých koncích široké škály možných velikostí refugia. Mikro-refugia jsou území, kde je z různých příčin stabilnější mikroklima,

- 17 -

které se udržuje v průběhu střídání dob glaciálu a interglaciálu (Ashcroft 2010). Takovéto mikrohabitaty poskytující stabilní environmentální podmínky mohou být na příklad prameniště, mokřiny, zalesněné prohlubně, říční kaňony, jeskyně. Tyto mikrohabitaty se obvykle vyskytují v různých pohořích a vrchovinách, která svou topografií navíc druhy chrání a umožňují jim reagovat na změny klimatu přesunem areálu do jiné nadmořské výšky. Tato místa se nám v současném klimatu jeví jako oblasti, kde se stabilně udržuje nižší průměrná teplota než je obvyklá v okolí, podle toho se také dají teoreticky lokalizovat. Naopak v dobách glaciálu byla tato místa oproti převládajícímu okolí teplejší. Mikro-refugia se dají dobře dokládat pro druhy, které nejsou typickými představiteli prvotního konceptu poloostrovních refugií. Pokud se zaměříme na současné středomořské druhy, zjistíme, že pro ně tato klasická refugia příliš nefungují. Areály rozšíření současných středomořských druhů, se totiž od dob glaciálu na první pohled téměř nezměnily. Pohybují se jak v oblastech evropských poloostrovů, tak i v severní Africe a na Blízkém východě. Jak se však ukazuje, jejich populace jsou navzájem geneticky odlišné, což nasvědčuje tomu, že byly jejich subpopulace od sebe v dobách glaciálu izolovány. To znamená, že tyto druhy nemigrovaly na velké vzdálenosti do makro-refugií, ale pouze se fragmentovaly do většího množství navzájem izolovaných subpopulací. Jejich kontrakce tak proběhla spíš v podobě úbytku abundance a denzity než změnou distribuce. Takto přežívaly v různých příznivých mikrohabitatech v rámci celého středomoří.

Glaciální severní kryptická refugia (Obr. 3 - C) Jedním ze speciálních typů mikro-refugií jsou kryptická refugia, s často používaným přízviskem severní. Tato refugia byla navržena pro boreální druhy adaptované na chladnější podnebí. Tyto druhy v současné době žijící na hranici permafrostu i za ní se nemusely stahovat tak na jih jako druhy mírného pásu. Pravděpodobně však v severních kryptických refugiích přežívaly i některé temperátní druhy (Bennett et al. 1991, Willis et al. 2000). Předpokládá se, že druhy přečkávaly glaciály v různých mikrohabitatech, které si zachovávaly příznivé podmínky, i když okolí pro ně příznivé nebylo, a zůstávaly tedy více na severu (Provan & Bennett 2008). Kde přesně tyto lokality byly a jak byly rozsáhlé se v dnešní době interglaciálu jen těžko odhaduje, protože neznáme podrobnosti o specifických podmínkách a individuálních požadavcích jednotlivých druhů. Je také pravděpodobné, že severní kryptická refugia nejsou tak konzervativní, jako ta klasická jižní, a v průběhu různých cyklů glaciálu a interglaciálu mohla různá kryptická refugia vznikat a zanikat. U boreálních druhů také

- 18 -

docházelo také k posunům center rozšíření na mnohem větší vzdálenosti, což znesnadňuje možnost přesnějšího lokalizování těchto kryptických refugií. Obecně lze říci, že se tato kryptická refugia v Evropě vyskytovala v oblastech střední Evropy, v okolí Arden, ve Skandinávii a na Britských ostrovech, které ale v době glaciálu nebyly ostrovy (Stewart & Lister 2001). Předpokládá se, že severní kryptická refugia mohla existovat i obklopená jinak zaledněnou krajinou.

Interglaciální refugia (obr. 3 - D) Interglaciální refugia jsou, zjednodušeně řečeno, jevem opačným ke glaciálním refugiím. Jde o místa, kde studenomilné organizmy přežívají během pro ně nepříznivých teplejších podmínek interglaciálu. Jedná se tedy především o druhy boreální a polární, které se v současné temperátní přírodě často označují jako glaciální relikty (Ložek 1999, Stewart et al. 2010). Interglaciální refugia zatím nejsou podložena příliš velkým množství studií a do jisté míry jde sice o smysluplný, avšak pouze hypotetický koncept. V současné době jsou oblasti vhodné pro život polárních organismů podstatně menší, než tomu bylo v průběhu dlouhých období glaciálů. Oblasti, kde vládly podmínky podobné polárním, byly rozšířeny hlouběji na jih až místy až do střední Evropy a také do vysokých pohoří, v Evropě především do Alp. Podmínky v zaledněných pohořích však mají oproti polárním oblastem mírně odlišný charakter především z důvodu jiného solárního režimu. Přesto se však Alpy považují za současný příklad významného interglaciálního refugia, které by se dalo podrobněji definovat jako interglaciální jižní kryptické mikro-refugium. Předpokládá se, že některé druhy lokalizované v Alpách by při příchodu glaciálu expandovaly do nižších nadmořských výšek do dalších horských lokalit a možná i do polárních oblastí. Za interglaciální severní makrorefugium se považuje celý polární prstenec a předpokládá se, že fauna a flora vázaná na toto prostředí byla v době glaciálu rozšířena na mnohem větším území, než je tomu nyní v době interglaciálu (Dalén et al. 2005).

Ostatní typy refugií Další koncept refugií není založen na změnách teploty, ale na změnách vlhkostních podmínek, které střídání glaciálu a interglaciálu provázely a významně je charakterizovaly. Mnoho druhů stromů bylo v průběhu glaciálu omezeno právě z důvodů nedostatku vláhy, nikoli kvůli nízké teplotě. Tyto, mnohdy obrovské, nezalesněné plochy tak mohly hostit specifickou kontinentální travnatou savanu, na kterou bylo adaptováno mnoho druhů

- 19 -

živočichů. K doložení existence současných refugií kontinentální savany opět není dostatek jednoznačných dokladů, avšak předpoklad je to smysluplný. Biotop chladné kontinentální stepi byl v dobách glaciálu daleko rozsáhlejší než je dnes, což myšlenku těchto refugií oceánicko-kontinentálního gradientu podporuje. V současnosti se podobné stepi v Evropě nacházejí na území Maďarska a východního Rumunska. Hlavní makro-refugium této stepní flory a fauny je podle předpokladu ve střední Asii. Existence refugií stejného oceánicko-kontinentálního gradientu, ale v opačné poloze, tedy pro organizmy, které špatně snášejí suché a sezonní kontinentální podnebí, není úplně pravděpodobný. Protože tyto organizmy jsou také většinou celkově náchylné na studené podnebí a budou se tedy nejspíš projevovat stejně jako běžné temperátní druhy s klasickým jižními glaciálními refugii (Bennett & Provan 2008). V literatuře se také můžeme setkat s pojmy in-situ a ex-situ refugium, což je ovšem rozdělení podle jiných kritérií než dosud popisované charakteristiky. Tato označení zahrnují předešlé typy refugií. In-situ refugium znamená místo v současnosti reálně obsazené daným organismem, pro které funguje jako refugium i když je třeba aktuálně rozšířen i v jiných oblastech. Ex-situ refugium znamená teoretické, vědeckým modelováním odhadnuté refugium, kde by podle předpokladů mohl daný druh dlouhodobě existovat, kdyby z nějakého důvodu přišel o svoje původní rozšíření. Zjišťování a zachovávání těchto refugií je důležité v rámci managementu ochrany biodiverzity (Ashcroft 2010).

1.2.5. Jiné reakce na klimatické změny Literatura se často rozchází v názoru na to, co ještě je a co už není refugium, jde však jen o terminologický, nikoli faktický problém. Důležité je danou situaci dobře popsat a definovat, použitý termín už pak může být druhotnou záležitostí. Je zřejmé, že klimatické změny měly mnoho přímých i nepřímých dopadů na biosféru celé planety. Organismy na ně reagovaly druhově specificky a podle lokálních zákonitostí. V průběhu statisíců let často docházelo k cyklicky se opakujícím epizodám fragmentace populací a izolace subpopulací, které dnes můžeme jen velmi složitě mapovat. Organismy reagovaly na klimatické změny nejčastěji kontrakcí, expansí, či posuny distribuce na horizontální i vertikální škále (Schmitt 2007). Na popsání těchto jevů mnohdy lépe slouží pojmy jako cyklická alopatrie, vikariance, změna distribuce, než samotný pojem refugium, který je ale přesto často používán. Obvyklé procesy provázející nástup glaciálu jsou změny ve velikosti a spojitosti ostrovů z důvodu

- 20 -

poklesu mořské hladiny, zmenšování a ustupování tropických deštných lesů před rozšiřující se savanou a pouští, sestup horských lesů do nížin, izolace jednotlivých vrcholků horským ledovcem, porušení režimu monzunů a mnoho dalších podobných událostí. Je naprosto zřejmé, že takovéto přelévání lokalizací a velikostí různých ekosystémů se promítalo do demografických změn jednotlivých druhů a silně ovlivňovalo jejich populační dynamiku. A všechny tyto změny mají podstatný vliv na genetickou strukturu populací, mohou se promítnout do zásadních evolučních procesů jako je extinkce a speciace, proto se většina ekologů i evolučních biologů shoduje, že planetární klimatické změny mají významný dopad na celosvětovou biodiverzitu (Ashcroft 2010).

1.3. Dopady demografických změn na fylogenezi Změny v efektivní velikosti populace nutně dopadají na genofond druhu. Čím je efektivní velikost populace menší, tím snadněji se v ní fixují nebo naopak eliminují nefixované alely (Flegr 2005). Selekční tlak může u malých populací mnohem rychleji fixovat kladné mutace, což může vést ke zrychlené speciaci. Pokud je tedy metapopulace efektivně rozdělena vikariancí na menší subpopulace, mezi kterými je velmi omezena výměna migrantů, může působením genetického driftu dojít k vytvoření nových poddruhů nebo druhů. Tento samovolný proces postupného rozrůznění jednotlivých subpopulací, může být výrazně posílen, pokud na jednotlivé subpopulace působí rozdílné selekční tlaky. Jak bylo představeno v předešlé kapitole, klimatické změny často vedou k fragmentaci metapopulace a vzniku různých migračních bariér. Důsledkem těchto událostí jsou změny v genetické struktuře metapopulací, a to i v poměrně krátkém evolučním čase. Díky tomu v dnešní době můžeme dokumentovat uplynulé změny v distribuci a abundanci organismů kromě fosilních záznamů také genetickými metodami (Walker & Avise 1998).

1.3.1. Refugia – centra divergence a heterogenity Refugia jsou charakteristická svou stabilitou v prostoru a čase. Jsou to místa, která svými environmentálními vlastnostmi umožňují dlouhodobé přežívání dostatečně velkých populací v průběhu střídání glaciálu a interglaciálu. Proto se refugia časem stávají centrem genetické rozmanitosti daného druhu. Tato genetická rozmanitost v refugiích vzniká kontinuálním hromaděním mutací, které není přerušeno lokálními extinkcemi, jako tomu je

- 21 -

u subpopulací mimo refugium. Pokud dojde ke změně klimatických podmínek, populace mimo refugia na to mohou reagovat dvěma způsoby. Buď začnou vymírat a s nimi i jejich specifické alely, nebo začnou migrovat do refugia. Jaký z těchto dvou procesů v přírodě reálně převládá, není příliš jasné, nejspíše se oba v určitém poměru kombinují. Obě tyto strategie však mají za následek to, že se genetická diverzita dlouhodobě udržuje pouze v rámci refugií. Refugia tak po čase začnou obsahovat větší množství unikátních haplotypů než populace mimo něj (Hewitt 2004).

1.3.2. Expanze z refugií a její charakteristika Proces expanze neboli kolonizace či rekolonizace může probíhat různým tempem. Na jedné straně stojí typ kolonizace zvaný pionýr. To je situace kdy volné lokality kolonizuje jen malý počet jedinců z refugiální mateřské populace, kteří se zde rychle rozmnoží a území obsadí jen svými potomky. Ostatní linie tak mají šíření na tato území téměř znemožněno. Tento typ kolonizace má u dceřiných populací za důsledek vysokou míru homogenity a malé množstvím haplotypů oproti mateřské populaci. Je to situace srovnatelná s již zmiňovaným efektem zakladatele. Na druhé straně stojí pomalý průběh kolonizace zvaný falanga. Což je situace, kdy jsou nová stanoviště obsazována postupně potomky z velkého množství jedinců mateřské populace. Výsledná genetická struktura dceřiných populací je v tomto případě velmi podobná populaci mateřské (Hewitt 1996, 2004). Tyto dva principy se opět uplatňují v přírodních procesech společně, v různém druhově specifickém poměru. Důležitý je také počet refugií, které druh má, protože v průběhu fáze expanze se může z každého refugia šířit linie se jiným haplotypy. Celkový areál rozšíření je pak tvořen větším množstvím genealogických linií, které mají původ z rozdílných refugií. Pokud jsou lokality na spojnici mezi různými refugii obsazené, zabraňují dalším migratům stejného druhu předávat geny mezi těmito refugii. Refugia tak zůstávají navzájem geneticky odlišná i v průběhu období expanze. Pokud se populace pocházející z různých refugií dostanou do kontaktu, dají vzniknout tak zvané hybridní zóně, jinak také „suture zone“ (zóna švu). Zde dochází ke genovému toku a jedinci z takovýchto oblastí mají hybridní genotyp vzniklý spojením genotypů z různých genealogických linií (Hewitt 1996, 2000). Pokud bychom srovnali míru genetické heterogenity hybridních zón s heterogenitou uvnitř refugií, ukázalo by se, že genetická heterogenita hybridních zón je srovnatelná, v některých případech dokonce vyšší, než je heterogenita v refugiích. Důležité ovšem je, že v refugiích je podstatně větší

- 22 -

koncentrace unikátních haplotypů a větší stáří jednotlivých iter-refugiálních linií (Petit et al. 2003). Vznik refugií a genealogických linií je závislý na obrovském množství faktorů a hledat obecně platné zákonitosti pro větší počet různých druhů je téměř nemožné. Důležitou roli při vytváření refugií hrají především druhově specifické vlastnosti jako je schopnost disperse, míra tolerance vůči různým biotickým a abiotickým faktorům, velikost těla, teplotní, sezonální a vlhkostní preference, potravní strategie a podobné nároky. Dá se proto říci, že jen velmi málo druhů reagovalo na klimatické cykly podobným způsobem jako jiné druhy, avšak určité analogie se přeci jen objevit dají (obr. 4)

Obr. 4:

Plné šipky znázorňují předpokládané kolonizační trasy po konci posledního glaciálu. Přerušované čáry s písmeny HZ naznačují umístění hybridních zón. R1 až R3 naznačují umístění tří klasických evropských glaciálních refugií

A: Tato mapka znázorňuje situaci, kdy většinu Evropy kolonizovala linie pouze z balkánského

refugia a je prezentovaná pro saranči obecnou (Chorthippus parallelus) a pro olši lepkavou (Alnus glutinosa).

B: Tato mapka znázorňuje situaci, kdy Evropu kolonizovaly současně tři linie za všech tří refugií a je prezentovaná pro ježka (Erinaceus sp.) a pro dub (Quercus sp.).

C: Tato mapka znázorňuje situaci, kdy Evropu kolonizovaly pouze dvě linie a to z balkánského refugia a z iberského refugia. Apeninské refugium často nemá v Evropě svou linii, protože ho blokuje bariera v podobě alpského pohoří. Tuto situaci prezentuje medvěd hnědý (Ursus arctos) a rejsek obecný (Sorex araneus).

Překresleno z (Hewitt 2001).

- 23 -

1.3.3. Fylogeografie Tento výraz poprvé použil americký vědec John C. Avise v roce 1987 (Avise 1998). Pojmenoval tak svou vlastní myšlenku, která byla jen o několik let starší. Během několika následujících let se stal pojem fylogeografie často používaným a v dnešní době je nejen pojem, ale celá tato vědecká disciplína široce přijímána a aplikována. Základní myšlenkou fylogeografie je propojení fylogeneze s biogeografií. Jde v podstatě o promítnutí fylogeneze do prostoru. Fylogeografie zkoumá geografickou distribuci genealogických linií. Nejlépe se dá uplatňovat na nedávno vzniklé genealogické linie, u kterých je dobře zachováno jejich prostorové vymezení. To se většinou postupem času rozplývá, jak působením genového toku a migracemi populací, tak změnami v zemském povrchu. Nejčastěji se tak fylogeografie zabývá vnitrodruhovými vztahy (Avise 1998). K tomu, aby mohly být nedávné genetické změny fylogeneticky zaznamenatelné, musí být zvolen příhodný rychle mutující marker. Nejčastěji jsou k fylogeografii a fylogenezi obecně využívány genetické sekvenační metody porovnávající hromaděné mutace v molekule DNA. Mimo genetické analýzy však mohou ke zkoumání fylogeografie v omezené míře sloužit také morfologické či behaviorální poznatky nebo také nesekvenační molekulární metody, jako je alozymová elektroforéza nebo metoda „random amplified polymorphic DNA“ (RAPD). Nejčastější metodou pro účely fylogeografie se stala sekvenace některého mitochondriálního nebo plastidového genu (jen u rostlin). To má dva hlavní důvody. Za prvé tyto geny se ve všech organizmech vyskytují jen v jediné kopii, protože se na rozdíl od jaderných genů dědí pouze od mateřského jedince. Haploidita tak usnadňuje jejich laboratorní zpracování včetně samotné sekvenace. Za druhé tyto geny mají větší mutační rychlost, jsou méně konzervativní než geny jaderné, ale zároveň mají velmi konzervativní a napříč mnoha taxony univerzální primery (Hebert et al. 2003). Fylogeografie je poměrně mladou genetickou disciplínou, přes to se brzy stala zdrojem velmi zásadních a nových poznatků o průběhu kolonizací a populační dynamice. Narozdíl od původních metod zkoumání distribucí různých druhů není založena na sběru fosilních dat, což má hned několik zásadních výhod. Předně fylogeografie pracuje se současně dostupným živým materiálem, tudíž odpadají nevýhody spojené s hledáním a analyzováním fosilních dat. Další nové možnosti však fylogeografie přináší na poli mapování původu současných populací. Fosilní záznamy odhalují pouze přítomnost či nepřítomnost druhu v dané době. Fylogeografie však umožňuje určit vnitropopulační příbuzenské vstahy a dále i migrační trasy, polohy hybridních zón či refugií. Pokud je nám známa mutační rychlost zkoumaného

- 24 -

genu, můžeme dále také datovat stáří refugií, čas divergence, či období prvotní migrace na dané území. Všechny tyto poznatky jsou přitom uloženy uvnitř genomu kteréhokoli současně žijícího organismu. Většina současných vědomostí o refugiích, hybridních zónách, epizodách izolace a historických

demografických

změnách

pochází

především

z dat

získaných

z fylogeografických studií. V uplynulých dekádách jich byly vytvořeny stovky pro rozličné taxonomické skupiny a na mnoha různých územích. Poznatky velkého množství z nich jsou shrnuty v reveiw článcích, které popisují různé aspekty existence refugií a hybridních zón (Hewitt 1996, 2000, 2011, Taberlet et al. 1998, Swenson & Howard 2005, Schmitt 2007, Stewart et al. 2010). Studium fosilních záznamů je však stále velmi podstatnou součástí doplňující dosavadní vědomosti. Některé skutečnosti totiž není možné pouze genetickými studiemi doložit. Jde především o doložení přesných časových údajů o rozsahu a místu výskytu daného druhu. Je proto důležité tyto metody pokud možno kombinovat a vytvářet hypotézy tak, aby byly v souladu s výsledky obou těchto přístupů.

1.4. Schopnost disperze Pojem disperze je velmi blízký pojmu migrace, tak jak je migrace definovaná v kapitole 1.2.1. této práce. Obecně jej lze chápat jako proces šíření druhu. Přesné vymezení tohoto pojmu je však poněkud složitější, protože se nejedná o jednoznačně ohraničený děj či průběh děje. Disperze je pojem ekologický, který se používá pro popsání různých způsobů a strategií, které organizmy používají k překonávání fyzických barier, vzdálenosti či dokonce i času (Townsend et al. 2008). Je hlavním nástrojem genového toku mezi existujícími populacemi a mimo to zajišťuje také obsazování nových volných stanovišť. Jde o schopnost nezbytnou k stabilní a dlouhodobé existenci druhu, proces, který přirozeně snižuje riziko inbreedingu, vnitrodruhové i mezidruhové kompetice a omezuje negativní dopad různých nepříznivých environmentálních vlivů (Bowler & Benton 2005). Pro všechny organizmy je to proces do jisté míry samovolný, spojený se schopností pohybu a s rozmnožovacím cyklem, ale často je také vyvoláván změnami prostředí, jako je fragmentace habitatu, klimatické výkyvy či invaze nepůvodních druhů (Bowler & Benton 2005). Organizmy tedy často mění intenzitu disperse v reakci na změny podmínek k přežití. Disperse tak neovlivňuje pouze genetickou strukturu populace a distribuci, ale také celkovou populační dynamiku, protože zasahuje do energetických toků a fitness populace. Forma a způsob, kterým se disperse

- 25 -

uskutečňuje, stejně tak jako množství energie do ní vložené, či prostorový rozsah, již však rozhodně nejsou univerzální pro všechny organizmy. Právě naopak, konkrétní podoba, schopnost a účinnost disperse se v přírodě liší ve stejné šíři, jako se od sebe odlišují různé formy života naší planety. Z předchozího odstavce vyplývá, že proces disperse má v přírodě velký význam a tudíž se dotýká mnoha biologických odvětví. Velké množství empirických i teoretických prací se zabývá jak klasifikací a popisem různých forem disperse, tak příčinami, důsledky a průběhem evoluce tohoto jevu. Disperse se současně dotýká jak ekologie z hlediska populační dynamiky, tak evoluční biologie, protože ovlivňuje speciaci, extinkci a genetickou strukturu populací.

1.4.1. Disperse v ekologii a evoluci Jednou z podstatných výzev současné evoluční biologie je podepřít evoluci druhu o poznatky ekologie (Marten et al. 2006). V tomto směru je stavěn do popředí předpoklad, že typ habitatu vytváří selekční tlak na schopnost disperse organizmů a schopnost disperse současně ovlivňuje genový tok (Bohonak 1999). Tento princip se dá zjednodušeně shrnout do třech na sebe navazujících stupňů: 1) Typ habitatu určuje jeho trvanlivost v čase a prostoru. 2) Trvanlivost habitatu určuje schopnost disperse organismů, které se na něj specializují. 3) Schopnost disperse určuje genetickou strukturu metapopulace (Short & Caterino 2009). Dobrým modelovým prostředím pro výzkum schopnosti disperse jsou ostrovy a souostroví, díky tomu, že mají výrazný nespojitý charakter a jasně definované bariery v podobě moře. Podobný nespojitý charakter mají také limnetické ekosystémy, tedy pevninské vodstvo. Organismy, které je obývají, musí pro úspěšné rozšíření dokázat překonat bariery v podobě suché země. Tyto ekosystémy ale nabízejí kromě základního předpokladu nespojitosti také dva odlišné a jasně definovatelné typy habitatů. Jde o lotické (tekoucí voda) a lentické (stojatá voda) habitaty, přičemž většina druhů limnetických organismů je adaptovaných pouze na jeden z nich. Mezi lotickými a lentickými habitaty je pro výzkum disperse a fylogeografie podstatný především aspekt stability v čase a prostoru. Lotické habitaty, prameny a řeky, jsou v čase a prostoru mnohem trvanlivější (tisíce až miliony let) a mají také stabilnější fyzikálně chemické podmínky. Oproti tomu lentické habitaty postupem času zanikají působením zazemnění a vyschnutím. Předpokládá se, že na druhy obývající lentické habitaty je kvůli hrozící lokální extinkci vytvářen selekční tlak pro zvýšení schopnosti disperse (Marten et al. 2006). Druhy adaptované na lotické habitaty naopak příliš vysokou schopnost disperse

- 26 -

nemají, protože jejich habitat není tolik náchylný k zániku a na případné lokální změny mohou druhy reagovat pouhým posunem areálu v rámci stejného toku. Pro potvrzení těchto předpokladů dobře slouží poznatky získané metodou srovnávací fylogeografie. Aby byly výsledky srovnávací fylogeografie smysluplné a jednoznačné, je samozřejmě potřeba správně volit jak modelové prostředí, tak modelové organismy. Základním principem srovnávacích analýz je zvolit modely tak, aby se co nejvíce shodovaly ve všech aspektech kromě toho, na který chceme zaměřit svou pozornost. Pokud tedy například chceme srovnávat vliv habitatu na genetickou strukturu populace, musíme zvolit takové druhy organismů, které mají stejný nebo alespoň podobný způsob šíření, demografii, velikost těla, potravu, areál rozšíření a jsou si evolučně blízce příbuzní (Bohonak 1999). Řada takových srovnávacích fylogeografických studií byla již provedena. Na příklad na území Evropy proběhl výzkum různých skupin letu schopných vodních brouků, ze stejných rodů, kteří se odlišovali pouze v adaptaci na lotické nebo lentické hybitaty (Abellán et al. 2009, Papadopoulou et al. 2008, Ribera et al. 2001). Všechny tyto práce ukázaly, že druhy z lotických habitatů mají větší haplotypovou, fylogeograficky prostorovou i nukleotidovou diverzitu, a že rozdíl v genetické struktuře je v tomto případě jednoznačně dán typem habitatu. Nad to Marten et al. (2006) provedl velké srovnání asi 150 různých fylogeografických studií prováděných na sladkovodní bezobratlé. Jeho výsledkem bylo, že živočichové lotických habitatů mají v průměru o 10% diverzifikovanější genetickou strukturu, než ti z lentických. To se dá považovat za dosti robustní potvrzení předpokladu, že habitat, potažmo disperse opravdu ovlivňuje genový tok. Ribera & Vogler (2000) jdou s předpoklady o vlivu loticko-lentických odlišností ještě dále. Tito vědci prováděli porovnávání mezi velikostmi areálů rozšíření u 490 druhů vodních brouků jižní Evropy. Dospěli k názoru, že rozdílná schopnosti disperse má tak silný dopad na genový tok, že jsou lotické druhy náchylnější jak k extinkci, tak ke speciaci. Toto tvrzení dokládají skutečností, že vodní brouci obývající lotický habitat mají větší počet druhů a menší areály rozšíření než druhy lentické. K podobným výsledkům vedou i výzkumy jiných modelových habitatů. Například Papadopoulou et al. (2009) zkoumala 7 druhů nelétavých potemníků (Coleoptera) obývajících ostrovy v Egejském moři a pobřežní zóny Turecka a Řecka. Porovnávala mezi sebou vnitrozemské druhy obývající pevnou hlinitou půdu s druhy obývajícími písečné duny na pobřeží. Písečné duny v této práci figurují jako ekvivalent lentického habitatu. Jsou časově i prostorově velmi nestabilní, zvláště pokud si uvědomíme mnoha metrové výkyvy výšky hladiny moře, které probíhaly v důsledku klimatických změn. Výsledky opět jednoznačně

- 27 -

ukazují hlubokou genetickou strukturu u potemníků obývajících pevnou půdu a téměř žádnou u potemníků písečných. Předpokládá se, že i mnoho dalších příkladů rozdílně trvalých habitatů, by přineslo podobné výsledky (Marten et al. 2006). Všechny uvedené práce však varují před nekritickým přijetím publikovaných výsledků a často nabízejí různé alternativní scénáře a aspekty, které se nesmí opomenout. Míra genetické diverzity určitého druhu totiž určitě není rovna schopnosti disperse a naopak. Důležitou roli v utváření vnitrodruhových genetických struktur nepochybně hrají historické faktory jako je střídání klimatických cyklů, invaze organismů, či působení člověka (Ribera et al. 2003, Short & Caterino 2009). Také pokud druh není v demografické a ekologické rovnováze, ale prochází, nebo nedávno prošel razantní změnou velikosti populace, třeba jako nový imigrant, nemůže genetická struktura jeho populace vypovídat mnoho o jeho schopnosti disperse (Marten et al. 2006). Příkladem může být srovnávací fylogeografie prováděná na dvou druzích na první pohled téměř totožných scinků v Austrálii. Ta ukázala dvě velmi rozdílné genetické struktury, které autoři vysvětlují tak, že jeden druh nejspíš nebyl schopen přežívat glaciální klima a jeho areál se zmenšil do jediného refugia. Zatím co druhý druh klimatické změny snášel lépe a uchoval si diverzifikovanou genetickou strukturu ve větším počtu refugií. Výsledný rozdíl v genetické struktuře mezi oběma druhy tak vůbec není ovlivněn schopností disperse, nýbrž odolností na změny klimatu (Hodges et al. 2007). Další aspekt, který může být zavádějící, je způsob, jak správně určit míru spojitosti zkoumaného habitatu. Tedy vyřešit otázku, co je a co není skutečnou bariérou pro šíření druhu. Přičemž spojitost či spíše vzdálenost mezi jednotlivými habitaty je jednou z hlavních složek, která zapříčiňuje genetickou diferenciaci (obr. 5) a může vést až k alopatrické speciaci. Stejně tak se těžko posuzuje, natož matematicky kvantifikuje, schopnost disperse, její reálný průběh a dopad. Vyskytují se situace, kdy ekologicky podobné druhy hmyzu obývající stejný habitat vykazují dosti rozdílnou genetickou strukturu (Miller et al. 2002, Short & Caterino 2009). Tyto situace se vysvětlují tím, že dospělci mají různě vyvinutou schopnost letu a délku života. Potvrdit tato tvrzení odchytem a kvantifikací létajících dospělců hmyzu se provádí jen velmi obtížně. Dalším příkladem nejasností může být srovnávací fylogeografie filipínských kaloňů (Heaney et al. 2005). Ta ukázala jednak důležitou roli změn výšky hladiny oceánu, ale také to, že pro některé druhy jsou stejně významnými barierami jako mořské kanály mezi jednotlivými ostrovy i bezlesé a člověkem pozměněné oblasti ostrovů.

- 28 -

Obr. 5:

Graf závislosti genetické diferenciace na schopnosti kolonizace a izolovanosti jednotlivých stanovišť. Aby mohla vzniknout vysoká míra genetické diverzity, musí mít organismus nízkou schopnost disperse a zároveň musí být jeho habitat silně nespojitý. Tento graf je navržen pro filipínské kaloně. Překresleno z Heaney et al. (2005).

1.4.2. Disperse sladkovodních bezobratlých Limnetické ekosystémy jsou z hlediska disperse charakteristické svou nespojitostí. Bezobratlé organizmy, které je obývají, tak musejí být schopny nějakým způsobem překonávat bariéry mezi jednotlivými stanovišti (Cáceres 1997). Musí tedy mít ve svém životním cyklu zařazeno stádium, které dokáže přežít i mimo vodní prostředí. Tato schopnost je pro ně klíčová pro udržení genového toku. Bez dostatečného genového toku se malé lokální populace geneticky homogenizují a tím se pro ně zvyšuje riziko lokální extinkce při napadení patogeny či v případě náhlých změn prostředí. Zároveň se pomocí disperse druhy rozšiřují na neobsazená stanoviště. Charakter a intenzita disperse se jen velmi těžko empiricky zjišťuje, protože je za prvé složité migrující jedince odchytit, za druhé určit odkud, kam a jestli vůbec migrují. Možnosti telemetrie jsou velmi omezené, protože se jedná o malé organizmy, na které se dá jen těžko umístit vysílačka. Úspěšně se telemetrie využívá jen u větších korýšů (Matasová 2011). Dají se používat značkovací metody pomocí rybářských barev, děrování exoskeletu, izotopové značení či přivěšování drobných korálků (Bilton et al. 2001). Tyto metody však díky pochopitelným technickým a finančním komplikacím nejsou příliš rozšířeny. Míra disperse se proto většinou odhaduje z jiných ukazatelů, jako jsou fylogeografické studie, či studie průběhu osidlování nově vzniklých stanovišť (CañedoArguelles & Rieradevall 2011).

- 29 -

Schopnost šířit se je u vodních bezobratlých zachována v drtivé většině případů jen v určité fázi životního cyklu zvaném dispersní stádium. U vodního hmyzu je dispersním stadiem zpravidla letuschopný dospělec. Naopak u ostatních vodních bezobratlých bývá dispersním stádiem vajíčko či nějaký druh cysty nebo larvy (Panov et al. 2004), který mnohdy dokáže životaschopný přečkat i velmi dlouhé období v suchém stavu (Guidetti et al. 2006). Podle toho, jestli se jedinec šíří svým vlastním aktivním pohybem, nebo se nechává unášet nějakým vektorem, rozdělujeme dispersi na aktivní a pasivní. Aktivní disperse jsou schopni především dospělci vodního hmyzu. Většina skupin vodního hmyzu má vodní larvu a dospělce neboli imágo, které žije mimo vodní prostředí. Výjimku však tvoří dva významné řády vodního hmyzu a to ploštice a brouci, kteří mají ve vodním prostředí celý životní cyklus. Tento hmyz ale tvoří okřídlené letuschopné dospělce, kteří mohou opustit vodní prostředí a zajišťovat dispersi. Mnoho larev vodního hmyzu obývá horní toky řek, kde bývá často silný vodní proud, který larvy v průběhu dospívání postupně strhává dolů po směru toku. Většina larev tak dospívá níž po proudu, než se vylíhla. Aby tento proces postupně nevedl k extinkci druhů v horních tocích, předpokládá se, že imága těchto druhů hmyzu se aktivně pohybují jednosměrně proti proudu toku, kde pak kladou vajíčka (Williams & Williams 1993). Pasivní šíření je často spojeno se schopností organizmů vytvářet rezistentní dormantní stádia. Tento termín však sjednocuje širokou škálu fyziologických stavů, které u různých skupin vznikly v průběhu evoluce nezávisle na sobě (Cáceres 1997). Dormantní stadia tak můžeme dále rozdělit podle toho, jak jsou vyvolávána. Stadium diapauzy vzniká nezávisle na prostředí, jako fyziologická součást životního cyklu. Zatím co stadium vegetačního klidu (quiescence), při kterém se živočich dostává do stavu hibernace, cryptobiosy či ahydrobiosy, je vyvoláno v reakci na nepříznivé změny prostředí (Brendonck & De Meester 2003). Druhy, které obývají více nestabilní prostředí, jako jsou periodické tůně, mokřady a podobné přechodné habitaty, mají dormantní stádia často i velmi silně rezistentní. Pasivní šíření se pak uskutečňuje pomocí přenosu těchto dormantních dispersních stádií pomocí různých vektorů. Vektory mohou být jak abiotické, jako vodní proud či vítr (Brendonck & Riddoch 1999), tak biotické, jako jsou jiní vodní bezobratlí (Bilton et al. 2001), vodní ptáci (Figuerola et al. 2005), velcí obratlovci, na kterých se mohou na krátké vzdálenosti šířit i nerezistentní dospělci (Thiéry 1997), a v neposlední řadě člověk a jeho činnost (Panov et al. 2004, Williams et al. 2008). Pasivního šíření také často využívají různé parasitické larvy. Za speciální druh pasivního šíření může být také považováno unášení imág špatně létavého

- 30 -

hmyzu větrem (Kelly et al. 2001). Dormantní stádia jsou často adaptována pro lepší schopnost pasivního šíření tak, že vytvářejí různé povrchové struktury a obaly, díky kterým se mohou lépe přichytit a udržet na tělech svých přenašečů. Obaly některých dormantních stadií jsou tak rezistentní, že uchovají životaschopný obsah i po průchodu zažívacím traktem vodních ptáků. Další specifikum organismů schopných vytvářet rezistentní dormantní stadia je schopnost šířit se nejen v prostoru, ale i v čase. Trvalá vajíčka některých druhů korýšů mohou zůstat v sedimentu i několik desetiletí a po vylíhnutí mohou začlenit své staré alely do současného genofondu. Tímto způsobem probíhá genový tok v čase. V sedimentu dna tůní a podobných nestabilních habitatů tak vznikají vaječné banky (egg bank), které obsahují velké množství různě starých vajíček. Ty se nikdy nevylíhnou všechny najednou, naopak většina z nich zůstává nevylíhnutá i při období příznivých podmínek (tzv. bet-hedging strategie). Mohou tak sloužit k rychlému oživení habitatu v případě, že dochází k periodickému střídání příznivých a nepříznivých podmínek a některé z vylíhnutých generací se nepodaří rozmnožit se (Hairston et al. 1995, Hairston 1996).

1.5. Modelový organismu beruška vodní (Asellus aquaticus) Jedním z hojných a široce rozšířených vodních bezobratlých je drobný korýš beruška vodní (Asellus aquaticus, Linneus 1758), který má podle Martin & Davis (2001) následující zařazení v systému: Podkmen: Crustacea (korýši) Třída: Malacostraca (rakovci) Řád: Isopoda (stejnonožci) Podřád: Asellota Čeleď: Asellidae Druh: Asellus aquaticus (Linneus, 1758) – beruška vodní Beruška vodní je zástupcem řádu stejnonožci (Isopoda) což je velká skupina korýšů vyskytujících se v mnoha typech slaných i sladkých vod. Najdeme je také v hlubinách oceánu, v podzemních vodách, obsahuje mnoho parazitických taxonů a několik výhradně suchozemských druhů. V současné době je popsáno více než 10 300 druhů, z čehož pouze 9 % z nich obývá limnetické ekosystémy (Wilson 2008). Mnoho těchto limnetických druhů se ale řadí mezi lokální endemity, proto je beruška vodní (Asellus aquaticus) svou rozsáhlou

- 31 -

distribucí v této skupině spíše výjimkou. Největší objevený stejnonožec Bathynomus giganteus, který je současně jedním z největších korýšů světa, žije v hlubinách Atlantiku a měří okolo padesáti centimetrů (Barradas-Ortiz et al. 2003). Pro českou společnost jsou všeobecně známými zástupci stejnonožčů běžné suchozemské stinky (čeleď: Porcellionidae) a svinky (čeleď: Armadillidiidae), kterým jsou jak beruška vodní (Asellus aquaticus), tak i ostatní stejnonožci morfologicky podobní. Stejnonožci jsou totiž morfologicky poměrně konzistentní skupina s tělem viditelně článkovaným a dorso-ventrálně zploštělým, i když mnoho parazitických a podzemních forem se od základního tělního plánu odlišuje (Wilson 2008). Tělo berušky vodní se skládá ze tří částí: hlavy, thoraxu a telsonu (obr. 6). Hlava je tvořena srostlým hlavovým a prvním thorakálním článkem. Nese dva páry tykadel a čtyři páry příústních končetin. Tělo se skládá z osmi viditelných článků, z čehož poslední zvaný telson vznikl srůstem šesti abdominálních článků. Beruška má sedm párů kráčivých končetin, pereiopodů s jejichž pomocí se pohybuje po substrátu dna a vodní vegetaci. Plavat ve vodním sloupci nedokáže. Telson nese pět párů plochých, blanitých pleopodů, které slouží k dýchání a jeden pár uropodů. Samice má na bázi pereiopodů chitinósní lamely (oostegity), které na hrudi tvoří uzavřený vak zvaný marsupium. Marsupium slouží k odkládání oplodněných vajíček, která se zde vyvíjejí do vylíhnutí mladých jedinců. Berušky tímto způsobem hlídají a pečují o snůšku (Lellák et al. 1972). Beruška vodní je odděleného pohlaví s vnitřním oplozením, ke kopulaci dochází jen v krátkém období v průběhu svlékání, kdy se samicím otevře pohlavní otvor. Dochází u nich proto k několikadenní prekopulační fázi, kdy se samec drží samici na zádech, aby nepřišel o ten správný okamžik. Samice po oplození klade do svého marsupia 50 až 150 vajec (Lellák et al. 1972). Mladé berušky jsou po vylíhnutí veliké přibližně jeden milimetr a morfologicky se podobají dospělcům, jedná se tedy o přímý vývoj. Berušky mají dvougenerační roční cyklus. Jarní generace dorůstá menších velikostí a po podzimním množení hyne. Podzimní generace přečkává zimu zahrabaná v sedimentu a v řekách a dorůstá se větších velikostí (Murphy & Learner 1982). Berušky ve svém životním cyklu nemají žádné rezistentní dormantní stadium, proto se předpokládá, že jsou schopny v určitých případech na malé vzdálenosti překonat souš, avšak žádný výzkum na toto téma nebyl dosud proveden.

- 32 -

Obr. 6:

Beruška vodní (Asellus aquaticus) pohled na dorsální stranu těla. Převzato z Wilson (2008).

Beruška vodní se stejně jako většina jiných sladkovodních stejnonožců živí detritem, listovým opadem, jinými rostlinnými zbytky a nárostem na nich, neboli perifytonem (Arakelova 2001). Na rozdíl od většiny ostatních sladkovodních bezobratlých však není specializovaná na lentické nebo lotické habitaty. Vyskytuje se velice hojně v široké škále sladkovodních ekosystémů. Najdeme ji v menších tůních, větších rybnících a nádržích, zároveň v tekoucích vodách od potoků až po dolní toky řek, kde vyhledává klidnější úseky, ve kterých se hromadí naplavený rostlinný materiál (osobní sledování). Jejími predátory jsou dravé larvy vodního hmyzu, vodní ptáci a většina ryb (Hargeby et al. 2004). V závislosti na míře predace, dostupnosti potravy a stabilitě prostředí se může vyskytovat i v obrovských lokálních densitách více než 20 000 jedinců na m2 (Hargeby 1990). Vyskytuje se po celém euroasijském kontinentu. Její západní rozšíření je limitováno Pyrenejským pohořím, jinak se

- 33 -

vyskytuje skutečně v celé Evropě od jižní Itálie, Řecka a Turecka až po Británii, střední Švédsko, Norsko, Finsko a dále na východ (Prevorčnik et al. 2009). Tolerance k prostředí, široká ekologická valence a schopnost obsazovat lokality ve vysokých počtech, jsou možná do jisté míry dány vysokou schopností přizpůsobit se okolnímu prostředí (Eroukhmanoff et al. 2009a). Podrobný výzkum populací berušek v jezerech jižního Švédska odhalil její možnou adaptivní fenotypovou plasticitu. To znamená, že její genom obsahuje různé alely, díky kterým dokáže rychle měnit některé fenotypové charakteristiky. Při působení různého selekčního tlaku se tak rychle přizpůsobí. Jedním z konkrétních projevů této plasticity je vytváření dvou barevně a velikostně rozdílných ekotypů vázaných na dva druhy jezerních makrofyt (Hargeby et al. 2004). V rákosu (Phragmites australis) byl ekotyp berušky tmavší a větší, z něj se za pouhých 40 generací vyvinul světlejší a menší ekotyp obývající parožnatku (Chara sp.), která v jezeře předtím vůbec nerostla. Selekční tlak na změnu fenotypu byl dán rozdílným typem predace. Parožnatka má světle zelenou barvu a roste ve větších hloubkách dál od břehu, hlavními predátory berušek jsou v tomto případě opticky se orientující ryby. Zatím co v neprostupném a temném rákosu jsou hlavním predátorem berušek hmatem se orientující larvy hmyzu. Velmi zajímavá je skutečnost, že tato rychlá adaptace proběhla minimálně v 7 jihošvédských jezerech nezávisle na sobě a v mnoha dalších jezerech se vytvořily různé barevné varianty v závislosti na barvě substrátu (Hargeby et al. 2005). Při pokusech křížit ekotypy mezi sebou byla u těchto fenotypových projevů prokázána dědičnost, proto musí být ukotveny v genech, nikoli vyvolány až v průběhu ontogeneze. Lokální fylogeografická studie mitochondriálního genu pro cytochrom oxidásu I (COI) však neprokázala

pohyb

berušek

mezi

jednotlivými

jezery,

jedná

se

tak

s největší

pravděpodobností o koevoluci (Eroukhmanoff et al. 2009b). K podobným závěrům o fenotypové plasticitě a schopnosti koevoluce dospěl také výzkum troglomorfních (jeskynních) forem berušky vodní. V krasových systémech Itálie, Slovinska a Rumunska se vyskytuje několik jeskynních populací berušky vodní, které ztratily tělní i oční pigmentaci, ale některé z nich mají genetickou odlišnost od povrchových ekotypů poměrně nízkou (Turk et al. 1996). V laboratorních pokusech si většina z nich zachovala schopnost křížit se s povrchovými formami, takže se nejedná o nové druhy (Protas et al. 2011). I když Verovnik et al. (2003) nalezl v jihozápadním Slovinsku několik jeskynních populací, které s povrchovými beruškami nehybridizují. Tato forma dostala název Asellus aquaticus cavernicolus.

- 34 -

Podle osobního pozorování se mírně morfologicky odlišují i berušky obývající periodické tůně od těch nalézaných v tocích. Berušky v tocích byly mnohdy až o polovinu menší, méně sklerotizované a světleji zbarvené než ty z tůní. Nemůže jít o pouhé matoucí porovnávání dospělých a nedospělých jedinců, protože pohlavní dospělost jde u berušek jednoduše potvrdit, pokud je nalezen pár v prekopulační fázi. Toto pozorování však nebylo podrobeno bližšímu morfologickému zkoumání, proto jej nemůžeme považovat za spolehlivý fakt. Je však dosti možné, že kdyby se někdo podrobně zabýval morfologickým srovnáním na úrovni periodická tůň a tok, dospěl by k podobným závěrům o fenotypové plasticitě a schonosti koevoluce. Na berušce vodní byly prováděny již čtyři fylogeografické studie. První fylogeografická studie byla prováděna v menším geografickém rozsahu, tedy pouze v krasovém systému Postojna–Planina v jižním Slovinsku. Studie byla zaměřena především na výzkum původu jeskynních forem Asellus aquaticus cavernicolus. Byla prováděná na základě metody zvané Random amplified polymorphic DNA (RAPD) a výsledkem bylo zjištění, že berušky sestoupily do jeskyní vícekrát nezávisle v různých časových obdobích (Verovnik et al. 2003). Další podobně lokalizovanou fylogeografickou studii tentokrát ale už na základě sekvencí mitochondriálního genu COI prováděl také Verovnik et al. (2004). Tuto studii o rok později rozšířil o další množství vzorků z celé Evropy. Velká celoevropská fylogeografická studie berušky vodní (Verovnik et al. 2005) uskutečněná na základě sekvencí mitochondriálního genu COI čítá 346 vzorků a je doplněna o 45 sekvencí jaderného genu 28S. Největší množství analyzovaných vzorků bylo z území Slovinska, avšak dalších mnoho desítek vzorků pochází z celého evropského areálu rozšíření berušky (obr. 8). Výsledkem studie sekvencí COI bylo odhalení šesti poměrně starých genealogických linií (přibližně 5 mil. let) a také centrum genetické diverzity na řece Drávě ve východním Slovinsku. Tři z těchto šesti linií jsou lokalizovány jen na malém prostoru v Dinárském krasu na území Slovinska. Zbylé tři jsou pojmenovány podle lokalit Balkánská linie, Trans-alpinská linie a Hlavní evropská linie. Jaderný gen 28S byl mnohem více konzervativní. Jen malý počet haplotypů rozdělil Evropu na linii Dynárského krasu a zbytek Evropy. Verovnik et al. (2005) předpokládá, že kolonizace Evropy beruškou vodní proběhla přibližně před 5 až 7 miliony let ze střední Asie do současného centra genetické diverzity ve východním Slovinsku. Odtud berušky bezprostředně pokračovaly do míst současného rozšíření. Výsledkům této studie se bude tato práce dále podrobněji věnovat, protože jsou s touto prací velmi blízce provázané.

- 35 -

Poslední fylogeografická studie berušky vodní nebyla založená na genetických ukazatelích, ale na morfologické stavbě pátého pleopodu (dýchací plátek – končetina). Výsledky potvrzují centrum diverzity na území Slovinska (Prevorčnik et al. 2009), ale ostatní informace nejsou tak podrobné jako u předešlé molekulární studie.

2. Cíle práce

Z úvodní literární rešerše vyplývá, že současná distribuce organismů v Evropě je silně ovlivněna historickým vývojem, jako jsou Pleistocénní klimatické cykly a hospodářská činnost člověka v průběhu Holocénu. Modelový organismus beruška vodní (Asellus aquaticus) obývající velké množství sladkovodních ekosystémů byla tímto vývojem také nepochybně ovlivněna. Její evropská populace má poměrně silnou genetickou heterogenitu, která tvoří šest nezávislých genealogických linií, které jsou jasně geograficky vymezeny (Verovnik et al. 2005). Proběhlé geografické studie však podrobněji nezkoumají vnitřní struktury těchto linií a neobsahují žádné doklady o původu berušek na území střední Evropy (obr. 8, Verovnik et al. 2004, Verovnik et al. 2005). Beruška vodní obývá mimo jiné také specifický biotop periodické jarní tůně, který sdílí se silně adaptovanou faunou reprezentovanou především dvěma druhy drobných korýšů z třídy lupenonožci (listonoh jarní, Notostraca: Lepidurus apus a žábronožka sněžní, Anostraca: Eubranchipus grubi). Na tyto dva druhy schopné vytvářet velmi rezistentní vajíčka byl zaměřen podobný typ fylogeografické studie jako v této práci na berušku vodní. Fylogeografický výzkum české populace berušky vodní byl iniciován na základě širší studie biotopu periodické jarní tůně, kterému se v rámci již ukončeného mezinárodního projektu BIOPOOL věnuje větší počet studentů a pracovníků Katedry ekologie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze. Výsledky této práce by měly být srovnatelné s výsledky ostatních fylogeografických studií několika dalších bezobratlých obyvatel periodických jarních tůní, a vést tak k širšímu poznání tohoto biotopu a schopnosti disperse jeho obyvatel. Cílem této práce proto je podrobněji prozkoumat fylogeografické vztahy subpopulací berušky vodní na menším měřítku, tedy pouze na území ČR. Potvrdit předpoklad, že se na území ČR vyskytují zástupci Hlavní evropské genealogické linie (obr. 8, Verovnik et al.

- 36 -

2005), a zjistit, jestli se zde nevyskytují zástupci i jiných genealogických linií. Tedy odhalit jestli je nebo není na území ČR přítomna hybridní zóna, kde se mezi sebou kříží jedinci z různých genealogických linií (Hewitt 1996, 2000, 2001). Zároveň také odhalit vnitřní strukturu Hlavní evropské genealogické linie na území ČR a určit míru vnitřní genetické diverzity této linie a odhadnout stáří případných vnitřních podlinií. Na základě vytvořené fylogeografické studie je dalšími cíly práce: -

odhadnout přibližné období kolonizace ČR beruškou vodní;

-

zjistit, jestli tato kolonizace proběhla jednorázově či z více různých mateřských subpopulací;

-

zda beruška vodní reagovala na pleistocenní klimatické cykly podle klasického schématu „contraction-expansion model“ (Taberlet et al. 1998), tedy jestli se v dobách glaciálu stahovala do klasických jižních refugií a kolonizace Střední Evropy tak probíhala opakovaně, nebo jestli byla schopna přečkávat glaciály v severních kryptických mikrorefugiích (Stewart & Lister 2001, Provan & Bennett 2008) uvnitř území ČR a v jeho blízkosti;

-

posoudit, jaký charakter proběhlá kolonizace měla – zda současné populace berušek na území ČR byly založeny malou skupinou migrujících jedinců, tedy kolonizací typu pionýr, nebo spíše kolonizací typu falanga – tedy postupným rozšiřováním celé mateřské populace (Hewitt 1996, 2004);

-

pokusit se zjistit schopnost disperse berušek a míru spojitosti jejich habitatů;

-

zjistit, jak zásadní barierou v šíření jsou pro ně pohoří a hranice mezi povodími a do jaké míry se berušky dokážou šířit v rámci jednoho toku a povodí;

-

zjistit, zda se geneticky liší jedinci popuací z různých bitopů, tedy z tůní a toků.

- 37 -

3. Metody 3.1. Vymezení a sběr dat

V průběhu let 2007 až 2011 byly odebírány vzorky berušek vodních (Asellus aquaticus) z více než dvou set populací na území ČR. Na sběru vzorků se kromě autora této práce podílelo také několik dalších studentů a pracovníků Katedry ekologie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze i jiných vědeckých pracovníků (viz přílohy). Vzorkování lokalit bylo cíleno tak, aby vzorky zahrnovaly celé území ČR včetně všech hlavních povodí. Zároveň byla snaha odebírat vzorky tak, aby byl přibližně vyrovnán počet vzorků z lentických a lotických habitatů. K dalším analýzám byly použity vzorky pouze z 89 populací, jejichž přesné lokality a další podrobnosti jsou obsaženy v příloze této práce. Ostatní populace byly ze souboru dat vyřazeny z toho důvodu, že se buď nezdařila jejich laboratorní a sekvenační analýza, nebo že jejich lokality byly v příliš malé vzdálenosti od jiných úspěšně analyzovaných vzorků. Pro lepší zobrazení a popsání výsledků bylo několik populací, které sdílely velmi podobný prostor, sjednoceno do jedné lokality. Toto bylo uskutečněno jen u populací, které byly ve stejném povodí, geograficky si velmi blízké, v průměru kolem 1 km (maximálně 6,8 km na lokalitě Tvrdonice) a nacházely se v jednom logickém celku (např. v jednom lese, v jednom systému slepých ramen). Výsledně tak vzniklo 62 jednotlivých studovaných lokalit, jejichž přibližné umístění ukazuje schematická mapa ČR (obr. 6). Lokality byly pro některé analýzy a vyhodnocování výsledků dále seskupeny do jedenácti skupin. Tyto skupiny byly utvořeny podle geografické polohy s ohledem na hranice povodí, zároveň mají přibližně stejnou rozlohu (tab. 1, obr. 6). Povodí Labe, které se vlévá do Severního moře, je rozděleno do sedmi skupin, přičemž tři z nich jsou v povodí Vltavy. Skupinu „Horní Vltava“ tvoří všechny přítoky Vltavy až k místu soutoku Vltavy s Otavou. Skupina „Dolní Vltava“ spojuje především řeku Sázavu a dolní tok řeky Vltavy tedy úsek od přítoku Otavy po místo, kde se Vltava vlévá do Labe. Pouze povodí řeky Berounky do této skupiny nepatří a tvoří samostatnou skupinu „Berounka“. Zbylé čtyři skupiny povodí Labe jsou: skupina „Horní Labe“, kde jsou řeky Cidlina, Orlice a horní tok Labe k místu soutoku s Orlicí. Skupina „Střední Labe“ obsahuje především samotný tok řeky Labe a jeho bezprostřední okolí od místa soutoku s Orlicí do

- 38 -

místa, kde se do Labe vlévá Vltava. Potom také všechny levé přítoky Labe ve zmíněném úseku. Skupina „dolní Labe“ spojuje dolní tok Labe, tedy od místa přítoku Vltavy po hranice území ČR a jeho pravé přítoky počínaje Jizerou. Poslední skupinou povodí Labe je skupina „Ohře a Bílina“, která spojuje tyto dva levé přítoky Labe. Poněkud jednodušší je situace povodí Dunaje, který se vlévá do Černého moře. Toto povodí je rozděleno do dvou velkých skupin a jedné malé okrajové. Skupina „Dyje“ spojuje celé povodí řeky Dyje na našem území a je do ní zařazeno také mírně nejasná oblast soutoku řek Dyje a Moravy. Do této skupiny je zařazena i lokalita „Tvrdonice“. Populace z této lokality leží v úzkém pásu mezi řekou Morava a kanálem Kyjovka, který je z hydrologického hlediska součást povodí řeky Dyje. Celý tento pás široký přibližně 2,5 km je protknut sítí kanálů, tůní a slepých ramen, které komunikují jak s Moravou, tak s Kyjovkou. V případě povodní se mohou slít v jeden celek. Lokalita „Tvrdonice“ stejně jako lokalita „Soutok“ tak byly zařazeny do skupiny „Dyje“. Další skupina „Morava“ spojuje celé povodí řeky Moravy. Skupina „Váh“ čítá pouze jednu lokalitu, ta ale nespadá do ostatních skupin, protože drobný tok, ze kterého byl vzorek odebrán, vytéká pryč z území ČR a na území Slovenska, kde se vlévá do Dunaje až pod soutokem Dunaje a Dyje. Poslední skupina „Odra“ je jedinou skupinou celého povodí řeky Odry na území ČR, která se vlévá do Baltského moře. Povodí DUNAJE Rozloha na území ČR 21 656 km 2 Lokalita

Celkový počet skvencí genu COI 66 Smax [m]

DYJE Bohdalovsky Břeclav Býkovka Drnholec Kančí obora Lednice Lubě Mošovský luh Myslůvka Oslava Plačkův les Soutok Tvrdonice Vápovka Volfířovský

0 370 0 0 0 790 0 0 0 0 500 4900 6800 0 0

MORAVA Broděčka Filena Háj Horka Království Litovel Morava Střeň Včelín Zábřeh

0 350 0 0 920 0 1500 2800 0 2300

VÁH Vlára

0

Celkový počet haplotypů Odhad vzdálenosti genu COI Kimura 2-P. model 24 0,018

Počet vzorků z tůní/z toků 44/22

Počet individuí

Počet haplotypů

Haplotypy COI

TŮŇ/TOK

38

13

Kimura 2-P. = 0,010

22/16

2 2 2 2 1 3 2 1 2 2 3 6 6 2 2

2 2 2 1 1 1 1 1 2 2 1 2 3 1 1

Ea, Co A1a, A1q A1a, A1m A1b(2) A1a A1a(3) A1a(2) A1b A3b, A3c A1b, A1m A1a A1a(5),A1n(1) A1o(3), A1a(2), Da(1) A3a(2) Ca(2)

0/2 2/0 0/2 2/0 1/0 3/0 0/2 1/0 0/2 0/2 3/0 6/0 4/2 0/2 0/2

26

7

Kimura 2-P. = 0,028

22/4

2 3 2 2 5 2 3 3 1 3

1 2 2 1 2 1 2 2 1 1

A1a(2) A1a (2), A1p(1) A1a, A1k A1a(2) A1a(2), Ia(3) A1f(2) A1a(2), A1j(1) A1a(2), A1f(1) A1a A1a(3)

0/2 3/0 2/0 2/0 5/0 2/0 1/2 3/0 1/0 3/0-

2

2

Kimura 2-P. = 0,017

0/2

2

2

A1a, A2a

0/2

39 -

Tabulka 1:

V této tabulce je přehled všech odebíraných lokalit, rozdělených podle jednotlivých povodí a skupin. Hodnota Smax udává v metrech hodnotu maximální vzdálenosti mezi populacemi v rámci jedné lokality. V případě, že tato lokalita měla pouze jednu vzorkovanou populaci hodnota vzdálenosti je 0.

Povodí LABE Rozloha na území ČR 49 965 km

2

Lokalita

Celkový počet skvencí genu COI 59 Smax [m]

HORNÍ VLTAVA Borkovická blata Halámky Lužnice Rožmitál Tušť

0 250 0 0 1100

DOLNÍ VLTAVA Bakovský Sázava Staviště

0 0 0

BEROUNKA Radbůza Toužim Úhlava Vladař

0 0 0 0

HORNÍ LABE Častolovice Kralický Lovčice Mikulčský Týniště

0 0 0 0 0

STŘEDNÍ LABE Černínovsko Jeníkovický Kolesa Libický luh Loučná Mydlovary Přerov nad Labem Strakočský Svémyslický Úpor Záboří nad Labem

210 0 0 2400 0 0 1200 0 0 0 300

DOLNÍ LABE Kokřínsko Liblice

0 240

OHŘE A BÍLINA Budyně Most Terezín

0 0 0

Celkový počet haplotypů Odhad vzdálenosti genu COI Kimura 2-P. model 29 0,034

Počet vzorků z tůní/z toků 39/20

Počet individuí

Počet haplotypů

Haplotypy COI

TŮŇ/TOK

9

8

Kimura 2-P. = 0,074

6/3

1 2 2 1 3

1 1 2 1 3

Ic Ch(2) A1r, Ie B3a Ch, Id, Fa

1/0 2/0 0/2 0/1 3/0

5

4

Kimura 2-P. = 0,011

0/5

1 2 2

1 2 2

Cn Ca, Cc Ca, A1b

0/1 0/2 0/2

5

4

Kimura 2-P. = 0,077

3/2

1 2 1 1

1 2 1 1

Ib Cm, Ck Ia Cm

0/1 2/0 0/1 1/0

8

5

Kimura 2-P. = 0,012

5/3

2 1 2 2 1

1 1 1 2 1

Ca(2) Cb Cb(2) A1a, A1l Cl

2/0 0/1 2/0 0/2 1/0

23

16

Kimura 2-P. = 0,016

18/5

2 2 1 5 1 2 3 1 1 2 3

2 2 1 2 1 2 2 1 1 2 2

B2c, B2f Cg, Ch Cd Ca(3), Cf(2) A1a B1a, Ci B2a(2), B2d(1) B2b B2e Ce, B2a Ca(2), Cj(1)

2/0 0/2 1/0 5/0 0/1 2/0 3/0 0/1 0/1 2/0 3/0

4

3

Kimura 2-P. = 0,018

4/0

1 3

1 2

B3b B2a(2), Ca(1)

1/0 3/0

5

4

Kimura 2-P. = 0,017

3/2

1 2 2

1 2 1

Cm B2a, Ca B1b(2)

1/0 0/2 2/0

Povodí ODRY Rozloha na území ČR 7 246 km 2 Lokalita

Celkový počet skvencí genu COI 14 Smax [m]

ODRA Polanská niva Studénka Suchdol

500 1700 300

Celkový počet haplotypů Odhad vzdálenosti genu COI Kimura 2-P. model 7 0,002

Počet individuí

Počet haplotypů

Haplotypy COI

Počet vzorků z tůní/z toků 14/0 TŮŇ/TOK

14

7

Kimura 2-P. = 0,002

14/0

7 3 4

2 2 4

A1c(4), A1d(3) A1c(2), A1i(1) A1b, A1e, A1g, A1h

7/0 3/0 4/0

- 40 -

- 41 -

Obr. 7:

Mapa znázorňuje přibližné umístění vzorkovaných lokalit (černé body) a rozložení jednotlivých geografických skupin (černé čáry)

3.2. Laboratorní zpracování vzorků a sekvenace Vzorky byly okamžitě po odběru fixovány 96% etanolem. Poté byly přebírány pod binokulární lupou, aby z nich byl vytřízen morfologicky velmi podobný invazní druh berušky (Proasellus coxalis), který byl předán k jiné fylogenetické studii. Vzorky byly poté přefixovány opět 96% etanolem, aby byla prodloužena jejich životnost. Dále byla v laboratoři Katedry ekologie ze vzorků extrahována DNA. Z každé populace byli použiti dva celí jedinci k extrakci pomocí komerčně dodávaného protokolu DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN®) Extrakty byly uchovávány v označených mikrozkumavkách v laboratorním mrazáku při teplotě přibližně -18 °C. Jako hlavním genetickým ukazatelem byla zvolena sekvence relativně rychle mutujícího mitochondriálního genu pro cytochrom c oxidásu podjednotku I (COI), která je na podobný typ studií velmi vhodná a široce používaná (Hebert et al. 2003, Costa et al. 2007). Druhý důvod zaměření právě na gen COI byla již prováděná celoevropská fylogeografická studie na berušce vodní, postavená právě na základě sekvencí tohoto genu (Verovnik et al. 2005). Na doplnění výsledků byly sekvence COI doplněny o velmi několik jedinců analyzovaných na dalších dvou mitochodnriálních genech 12S a 16S, které kódují ribozomální podjednotky. Pro amplifikaci zkoumaných genů byla využita reakce „polymerase chain reaction“ (PCR) (Mullis et al. 1986), do které vstupovalo 30 μl celkového PCR mixu. Primery pro amplifikaci genu COI (Folmer et al. 1994) měli sekvence: 5´- GGTCAACAAATCATAAAGATATTG 3´- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA Sekvence primerů pro geny 12S a 16S: 12S: 5´- YCTACTWTGYTACGACTTATCTC 12S: 3´ - GTGCCAGCAGCTGCGGTTA 16S: 5´- ATTCAACATCGAGGTCACAA 16S: 3´ - CCGGTCTGAACTCAGATCACGT

Pro potvrzení správného průběhu PCR a vyloučení případných špatných vzorků bylo několik μl PCR produktu použito k vizualizační metodě gelové elektroforézy. PCR produkty, které v elektroforéze ukázaly kladný výsledek, byly doplněny vodou na požadované množství

- 42 -

30 μl. Po té byly v mikro-zkumavkách zajištěných mikrofilmem proti otevření spolu s jednou obsahující určité množstvím primerů expresně odeslány k sekvenaci. Sekvenaci PCR produktů prováděla firma MacroGen Inc. se sídlem v Jižní Korei, která do několika dní poslána získané sekvence elektronickou poštou.

3.3. Doplňující data Podstatnou součástí této práce, bez které by v podstatě nebylo možné data správně interpretovat, je širší rámec již zjištěných fylogeografických vztahů mezi populacemi berušky vodní. Verovnik et al. (2005) vytvořil rozsáhlou celo-evropskou fylogeografickou studii berušky vodní. Tím je dána struktura, do které současná práce implementuje své poznatky. Všechny haplotypy genu COI, které byly ve velké fylogeografii použity jsou volně dostupné na

portálu

http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Tyto

sekvence

byly

staženy

z GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), čísla konkrétních použitých sekvencí viz původní článek (Verovnik et al. 2005), část z nich byla přidána k novým sekvencím z území ČR a použita do nových fylogeografických analýz. Sekvence ze současné práce tak byly zařazeny do širšího rámce celo-evropské genetické struktury berušky vodní. Pro orientaci v geografické distribuci jednotlivých haplotypů byla použita schematická mapa ze zmíněné publikace (obr. 8). Mapa je sice jen málo podrobná, nicméně pro účely této práce je tato hrubá informace o rozmístění evropských haplotypů dostatečná. Nebylo proto třeba od slovinských autorů zjišťovat přesné souřadnice lokalit.

Obr. 8:

Mapa zobrazující fylogeografickou strukturu evropské populace berušky vodní (Asellus aquaticus), kde jsou schematicky znázorněny lokality analyzovaných vzorků. Je zde ukázáno rozdělení na šest hlavních genealogických linií, přičemž tři z nich jsou malé lokalizované na území Slovinska. Další tři jsou Balkánská, Trans-alpinská a Hlavní evropská. Na mapce jsou také vidět hybridní zóny mezi různými liniemi. Převzato z (Verovnik et al. 2005)

- 43 -

Menší soubor sekvencí genu COI berušky vodní, pouze ze čtyř lokalit v jižním Švédsku, je dostupný z jiné publikace (Eroukhmanoff et al. 2009b). Tato publikace nebyla primárně zaměřena na fylogeografii, přesto byly tyto sekvence v jedné z fylogeografických analýz v této práci použity. Eroukhmanoff et al. (2009b) však používal jiný typ primerů a tyto sekvence jsou proto o několik desítek nukleotidů kratší, z toho důvodu byly použity jen okrajově. Přesné počty sekvencí použitých z jiných výzkumů jsou udávány u konkrétních sítí v kapitole 4. Výsledky.

3.4. Fylogeografické zpracování sekvencí

Všechny získané sekvence byly nejprve ručně kontrolovány a editovány v programu BioEdit Sequence Alignment Editor ver. 7.1.3.0. (Hall 1999). Vadné a nesmyslné sekvence nebyly do analýz zařazeny. V programu BioEdit byl následně ručně vytvořen alignment. To bylo možné provést, protože sekvence na první pohled neobsahovaly žádné inserce/delece. Stačilo tedy pouze upravit všechny sekvence na stejný počet nukleotidů a seřadit je k sobě do jediného souboru dat. Sekvencím byla v programu BioEdit přidaná také jména lokalit geografických skupin a později i kódy jednotlivých haplotypů. Tento soubor dat dále sloužil jako primární vstup do ostatních analýz. Jako nejvhodnější formu pro zobrazení výsledných fylogeografických vztahů byly zvoleny haplotypové sítě v kombinaci se schematickými slepými mapami. S pomocí haplotypových sítí se dají vizualizovat vnitrodruhové fylogenetické vstahy přehledněji a přesněji než s pomocí klasických stromů. Je to dáno tím, že nejsou omezeny pouze na dichotomické větvení. Jednotlivé genealogické linie mohou být ve fylogenetické síti zobrazeny jako samostatné větve vycházející z centra sítě různými směry a do různých vzdáleností. V kombinaci s případnými barevnými úpravami může dát výsledný obraz rychlou a jednoduše pochopitelnou informaci o fylogenetických vztazích zkoumaného organizmu. Pro výpočet haplotypových sítí a odhady stáří divergence byl používán program Network ver. 4.6.1.0 (Fluxus Technology Ltd, UK). Pro zobrazení a editaci sítí byl použit program Network Publisher ver. 1.3.0.0 (Fluxus Technology Ltd, UK). Pro finální grafické zpracování sítí a map byl použit program Adobe® Illustrator® CS5 ver. 15.1.0. Fylogenetické sítě byly vypočítávány metodou Median-joining MJ (Bandelt et al. 1999). Síť poté prošla

- 44 -

redukční metodou Minimum spanning MP (Polzin & Daneschmand 2003), která redukuje nadbytečnou vnitřní strukturu sítě a vybere pouze nejpravděpodobnější podobu kostry. V jednom případě (viz výsledky) byla také použita před-kalkulační kontrakce urychlující analýzu v případě velkého množství vstupních dat. Jednalo se o metodu Star contraction (Forster et al. 2001). Pro výpočet míry nukleotidové diverzity byl použit program MEGA 5.05. (Tamura et al. 2011). Nukleotidová diverzita uvnitř i mezi jednotlivými geografickými skupinami a genealogickými liniemi byla vypočítána pomocí Kimura dvouparametrového modelu (Kimura 1980). Jako outgroup byla použita beruška druhu Proasellus coxalis, která byla nalezena v řece v Karlových Varech. Odhady stáří divergence budou postaveny na základě fylogenetické studie korýšů obývajících středomořské ostrovy. Ketmaier et al. (2003) pro podobný druh stejnonožce (Isopoda: Stenasellus sp.) stanovoval rychlost divergence genu COI na základě historických událostí oddělování středomořských ostrovů Sardinie a Korsiky. Hodnotu stanovil konkrétně na 0,0125 substutuce jednoho nulkeotidu za milión let. Pokud vztáhneme zmíněnou substituční rychlost na fragment DNA dlouhý 630 nulkeotidů, dojdeme k výsledné rycholsti jedné substituce přibližně za 127 000 let. Tuto hodnotu je možné zadat do programu Network (Fluxus Technology Ltd, UK) a jednoduše měřit stáří libovolných větví síťě. Stejně tak se dá tato hodnota použít i pro výpočet z hodnoty střední genetické vzdálenosti. V této práci budou použity oba přistupy a výsledek bude jejich kombinací. Pro statistické zhodnocení genetických rozdílů mezi povodími a skupinami v rámci povodí byl použit program ARLEQUIN 3.5.1. (Excoffier & Lischer 2010). Analýza molekulární variance (AMOVA) byla spočtena s defaultním nastavením programu (1000 permutací) a zvoleno bylo stanovení distance pomocí Kimura dvouparametrového modelu. Pro tuto analýzu bylo použito stejné seskupení populací jako v tabulce 1, tedy 3 hlavní povodí (Morava, Labe, Odra) s podskupinami: Morava – Morava, Dyje, Váh; Labe – Horní Labe, Střední Labe, Dolní Labe, Horní Vltava, Dolní Vltava, Berounka, Ohře/Bílina; Odra – Odra. Dále byly pro porovnání populací spočteny párové hodnoty FST mezi jednotlivými populacemi (1000 permutací).

- 45 -

4. Výsledky

Z odebraných vzorků v rámci této práce bylo získáno a do fylogeografických analýz zahrnuto celkem do 139 sekvencí genu COI berušky vodní (Asellus aquaticus). 131 z nich mělo délku 630 nukleotidů. Bohužel u 8 z nich byla reakce PCR nějakým způsobem porušená, což mělo za důsledek nečitelnost prvních 93 nukleotidů. Výsledná délka těchto 8 sekvencí tak byla jen 537 nukleotidů. Všechny tyto sekvence patřily do skupiny haplotypů, která byla výrazně odlišná od ostatních, protože, jak ukázaly následné analýzy, tyto sekvence patřily do jiné hlavní genealogické linie než všechny ostatní. Proto nebyly z fylogenetických analýz vyřazeny a některé výpočty tak musely probíhat pouze se sekvencemi zkrácenými na 537 nukleotidů. To, že zrovna těchto 8 sekvencí mělo poškozený začátek, nejspíš není náhoda. Zřejmě to souviselo s primery, které se nějakým způsobem špatně navázaly, a začátek sekvence byl překryt jinou krátkou sekvencí, což způsobilo onu nečitelnost. Mimo gen COI bylo dále analyzováno 9 sekvencí genu 16S o délce 448 nukleotidů a 7 sekvencí genu 12S o délce 447 nukleotidů.

4.1. Haplotypové sítě Hlavní výsledky této diplomové práce jsou prezentovány na několika haplotypových sítích, které přehledně zobrazují fylogenetické a fylogeografické vztahy mezi jednotlivými populacemi berušek vodních v rámci území ČR i v rámci širší celoevropské fylogeografie prováděné týmem slovinských vědců (Verovnik et al. 2005). Tyto sítě byly vypočítány a editovány v programu Network a Network Publisher (Fluxus Technology Ltd, UK) a dále graficky upraveny v programu Adobe® Illustrator® CS5.

- 46 -

Obr. 9: Haplotypová síť genu COI spojující většinu haplotypů z Verovnik et al. (2005) a všechny z této práce

- 47 -

Haplotypová síť na obrázku 9 byla zkonstruována na základě 28 sekvencí unikátních haplotypů genu COI z této diplomové práce a 167 sekvencí stejného genu převzatých z fylogeografické studie slovinských vědců (Verovnik et al. 2005). Sekvence byly zkráceny na 537 nukleotidů. Před výpočtem byla použita metoda Star contraction s hodnotou 5 (Forster et al. 2001). Tímto způsobem byly sjednoceny některé blízce příbuzné sekvence do jedné za účelem zpřehlednění sítě a zrychlení výpočtu. Pro výpočet sítě byla použita metoda MJ s hodnotou ɛ = 10 (Bandelt et al. 1999). Na této síti je na první pohled patrné jasné rozdělení celoevropské populace berušek do šesti jednotlivých skupin a také bazální pozice haplotypů označených kódem DR. Tyto haplotypy jsou z lokality na řece Drávě ve východním Slovinsku, kde Verovnik et al. (2005) předpokládá hlavní refugium berušky a také místo prvotní kolonizace Evropy. Tato síť však dokládá důležitý a do jisté míry nečekaný výsledek. Berušky z území ČR totiž nejsou zastoupeny pouze Hlavní evropskou skupinou, ale 8 hyplotypů spadá také do skupiny Trans-alpinké. Tuto skutečnost Verovnik et al. (2005) nepředpokládal, jak ukazuje mapa v jejich publikaci (Obr. 8). To, že se na území ČR vyskytují zástupci dvou hlavních genealogických linií, které se od sebe oddělily přibližně před 5 miliony lety, znamená, že je na našem území lokalizována hybridní zóna, kde se tyto linie stýkají a kříží.

- 48 -

Obr. 10: Haplotypová síť genu COI zobrazující vnitřní strukturu Trans-alpinské linie

- 49 -

Haplotypová síť na obrázku 10 byla zkonstruována na základě 8 sekvencí genu COI z této práce a 38 sekvencí stejného genu převzatých z fylogeografické studie Verovnik et al. (2005). Sekvence byly zkráceny na 537 nukleotidů. Síť byla vypočítána metodou MJ s hodnotou ɛ = 12 (Bandelt et al. 1999). Měřítko pod legendou znázorňuje délku větve adekvátní pěti substitucím v haplotypu. Šedivé spojnice mezi některými větvemi sítě naznačují alternativní cesty substitucí, ale nejsou v přesném měřítku. Na síti je vidět poměrně velká diverzita jednotlivých haplotypů této linie. Směrem ke kořenu hlavní sítě se vyskytují haplotypy z lokality na řece Drávě, což dokazuje původ této skupiny. Haplotypy berušek z území ČR se umístily v centru této sítě, ale není mnoho haplotypů, které by s nimi sdílely stejné větve. Pouze větev označená kódem „I1“ sdílí jak české zástupce, tak zástupce, kteří jsou lokalizováni na severním kraji Alp, přibližně na hranici Rakouska a Švýcarska. Je tedy možné, že berušky do této oblasti putovaly přes naše území. Skupina haplotypů označená kódem „I2“ čítá jen jedince z území jihozápadních Čech a žádné další berušky s nimi stejnou větev nesdílejí. Poslední větev označená kódem I3 se možná oddělila od skupiny „I1“, ale jak naznačuje alternativní šedá spojnice, možná tomu tak není a jedná se sesterskou, nikoli dceřinou větev. Na této větvi jsou ovšem opět berušky ze severního okraje Alp lokalizované již poměrně blízko našich jihozápadních hranic s Německem přibližně 150 km od výskytu skupiny „I2“. Dále jsou však ve skupině „I3“ berušky ze střední Francie a střední Itálie.

- 50 -

Obr. 11: Haplotypová síť genu COI zobrazující vnitřní strukturu Hlavní evropské linie

- 51 -

Fylogenetická síť na obrázku 11 byla zkonstruována na základě 131 sekvencí genu COI z této práce a 62 sekvencí stejného genu převzatých fylogeografické studie Verovnik et al. (2005). Sekvence měly délku 630 nukleotidů. Síť byla vypočítána metodou MJ s hodnotou ɛ = 12 (Bandelt et al. 1999). Síť ukazuje každý unikátní haplotyp jako jedno kolečko stejné velikosti jako ostatní. Není tedy zohledněn počet jedinců, kteří měli stejný haplotyp. Měřítko pod legendou znázorňuje délku větve adekvátní pěti substitucím v haplotypu. Šedivé spojnice mezi některými větvemi sítě naznačují alternativní cesty substitucí, nejsou ale v přesném měřítku. V této síti zobrazující vnitřní strukturu Hlavní evropské skupiny se berušky z ČR rozdělily do většího množství samostatných větví. Skupiny haplotypů byly pro usnadnění popisu sítě označeny písmeny A až F. Kromě haplotypu „F“ se všechny ostatní haplotypy ze současné studie umístily na větvi sdílené s blízce příbuznými haplotypy z práce Verovnik et al. (2005). Dokonce 5 haplotypů bylo totožných pro obě studie. Skupiny haplotypů nalezených na území ČR zde nejsou unikátní, naopak jsou sdíleny na mnohem větší rozloze. Podobná míra heterogenity, jaká byla objevena na území ČR, je současně sdílena v celém regionu, který se rozkládá od Francie a Anglie po střední a severní Evropu (obr. 8). Tato skutečnost by zůstala nepovšimnuta, pokud by data ze současné práce nebyla zasazena do širšího rámce celoevropské fylogeografie berušky. Fylogeografické vztahy u skupin haplotypů „C“ a „D“ jsou poměrně jednoduché. Tyto dvě skupiny jsou navzájem sesterské a vycházejí ze společného předka. Skupina „C“ se na území ČR nachází v horním toku Labe a nesdílí žádny totožný ani blíže příbuzný haplotyp převzatý z práce Verovnik et al. (2005). Společného předka však se skupinou „C“ sdílejí haplotypy z lokality na řece Drávě ve východním Slovinsku, kde je centrum diverzity a předpokládané refugium. Jediný haplotyp „D“, který se objevil v této studii, byl odebrán na jižní Moravě a je poměrně blízce příbuzný haplotypu nalezenému v severním Chorvatsku, opět v těsné blízkosti lokality na řece Drávě. Totožný haplotyp „E“ byl nalezen jak na Moravě, tak na jihu Maďarska přibližně 200 km od lokality na řece Drávě. Haplotyp „F“ byl nalezen v jižních Čechách a nemá žádný jiný blízce příbuzný haplotyp. Od zbytku sítě se odděluje již na její bázi. Možné vysvětlení bude probíráno v diskusi. Větev pod písmenem „A“ má podle prezentovaných výsledků jediného společného předka. Na území ČR se vyskytují tyto haplotypy především v povodí řek Dyje, Moravy a

- 52 -

Odry. Haplotypy z práce Verovnik et al. (2005) ve skupině „A“ jsou z území střední a jižní Francie a dále z východního Slovinska, středního Chorvatska a severní části Balkánského poloostrova. Tedy opět z lokalit velmi blízkých centru diverzity na řece Drávě. Nejsevernějším výskytem této větve je podle současných výsledků oblast východní Moravy. Skupina označená písmenem „B“ spojuje tři větve, které nemají úplně jasný vztah ani mezi sebou, ani vzhledem k větvi „A“. Je to způsobeno cyklem, který je vypočítán na bázi těchto větví. Soubor sekvencí nejspíš nebyl dostatečně obsáhlý, nebo obsahoval nějaké drobné vady, proto není možné přesněji vypočítat, jak substituce nukleotidů probíhaly. Síť naznačuje, že větve „B“ a větev „A“ nejspíš tvoří jeden celek vycházející ze společného předka. Obrázek sítě může budit dojem, že větve skupiny „B“ jsou bazální a tedy starší a původnější než větev „A“. Tato situace však na základě této sítě nejde ani potvrdit, ani vyvrátit. Spíše se dá říci, že větve „B1“, „B2“, „B3“ a větev „A“ jsou na podobné sesterské úrovni a bližší hierarchie mezi nimi se nedá prokázat. Obrázek 12 obsahuje fylogenetickou síť zaměřenou pouze na skupinu haplotypů „B“. Tato síť byla zkonstruována na základě 12 sekvencí genu COI z této práce, 12 sekvencí stejného genu z fylogeografické studie slovinských vědců (Verovnik et al. 2005) a 9 sekvencí z práce švédských vědců (Eroukhmanoff et al. 2009b). Sekvence měly délku 597 nukleotidů. Síť byla vypočítána metodou MJ s hodnotou ɛ = 15 (Bandelt et al. 1999). Na mapě jsou naznačeny přibližné lokality odkud haplotypy pocházejí a centrum diverzity na řece Drávě. Smyslem tohoto obrázku je ukázat, že diverzita haplotypů berušek není v této oblasti příliš závislá na měřítku. Stejné skupiny haplotypů, které byly odhaleny na území ČR, se vyskytují i v mnohem větším regionu. To naznačuje, že české haplotypy zde nevznikly, ale jsou společné pro celou Hlavní evropskou skupinu. Množství jednotlivých haplotypů je poměrně velké, ale většina z nich se odlišuje jen v jedné nebo dvou substitucích. Dokonce ve dvou případech jsou totožné haplotypy sdíleny dvěma velmi vzdálenými jedinci (západní Čechy – střední Francie, střední Čechy – jižní Švédsko). Situace ve větvi „A“ je obdobná. Opět jsou zde sdíleny stejné haplotypy mezi velmi vzdálenými populacemi (jižní Francie – Morava – východní Maďarsko, s jedinou substitucí). Zároveň se zde vyskytuje velké množství haplotypů, které se liší jen jednou či dvěma substitucemi. Celkově lze tedy prohlásit, že populace berušky v Evropě má velmi heterogenní genofond a různé populace sdílí podobné haplotypy napříč velmi rozsáhlým územím. Toto zjištění je ovšem v rozporu s předpokládanou nízkou schopností disperse.

- 53 -

Obr. 12: Haplotypová síť genu COI pro skupinu haplotypů „B“ a jejich lokalizace na mapě Evropy.

- 54 -

Obr. 13: Haplotypová síť genu COI, haplotypy z území ČR a jejich lokalizace na mapě ČR

- 55 -

Fylogeografická struktura populací berušky vodní na území ČR je znázorněna na obrázku 13. Hlavní haplotypová síť na tomto obrázku byla dotvořena připojením zmenšeniny sítě Trans-alpinské genealogické linie (v černém rámečku). Hlavní síť byla zkonstruována na základě 131 sekvencí genu COI z této současné práce doplněných 22 sekvencemi stejného genu převzatých z fylogeografické studie Verovnik et al. (2005). Převzaté sekvence byly do analýzy doplněny proto, aby struktura sítě byla co nejvěrohodnější. Všechny sekvence měly délku 630 nukleotidů. Síť byla vypočítána metodou MJ s hodnotou ɛ = 15 (Bandelt et al. 1999). K této síti byla v grafickém programu dodatečně připojena síť Trans-alpinské linie, stejná jako je použita na obrázku 10. Dodatečná síť čítá 8 sekvencí z této práce a jejich haplotypy jsou zde označeny písmenem „I“. Jedná se v podstatě o zmenšený, pootočený a částečně redukovaný obrázek 10. Důvod k této operaci je vysvětlen v kapitole 3: Metody. 8 sekvencí z území ČR, které spadají do Trans-alpinské linie, mělo 93 počátečních nukleotidů nečitelných, proto nebyly zařazeny do konstrukce hlavní sítě. Místo kde se doplňující síť napojuje k té hlavní, bylo odvozeno z obrázku 9. Pravdivý charakter výsledné sítě je tak zachován. Kolečka na mapě svou velikostí odpovídají počtu jedinců na lokalitě, tak jak ukazuje měřítko nad mapou. Kolečka v síti odrážejí svou velikostí počet jedinců sdílejících totožný haplotyp. Malá čísla uvnitř koleček v síti ukazují počet jedinců sdílejících stejný haplotyp. Měřítka délky větví jsou uvedena dvě. Měřítko v černém rámečku u Trans-alpinské sítě (délka udává 25 substitucí) se vztahuje jen k tomuto rámečku. Druhé měřítko znázorňující délku větve adekvátní k pěti substitucím se vztahuje k celé zbylé síti. Černé linky na mapě ukazují hranice mezi hlavními povodími Labe, Dunaje a Dyje. Barvy koleček v síti byly zvoleny tak, aby každá samostatná větev měla vlastní barvu. Skupiny „A“ a „B“ mají tři podskupiny, které mají odstíny podobné barvy, aby byla zviditelněna jejich příbuznost. Barvy určuje příslušnost ke skupinám haplotypů, tyto barvy byly promítnuty do mapy (Barvy určuje pozice v síti. Opačný přístup, kdy jsou barvy určovány z pozice na mapě, ukazuje následující obrázek 14). Nejfrekventovanějšími haplotypy byly ty ze skupiny A1, které sdílelo 72 jedinců, tedy více než polovina celkového počtu. Tyto haplotypy se vyskytovaly především na území Moravy. Tento výsledek je do určité míry ovlivněn tím, že z území Moravy bylo nasbíráno větší množství jedinců než z Čech (Morava – 80 jedinců, Čechy – 59). Přesné počty jedinců a haplotypů příslušejících k jednotlivým skupinách haplotypů jsou uvedeny v tabulce 9.

- 56 -

Postavení jednotlivých skupin haplotypů na mapě naznačuje, že skupiny mají určitý ohraničený regionální charakter, který však přesně nekopíruje příslušnost k jednotlivým povodím. Haplotypy nejsou na mapě rozmístěny náhodně. Je zde vidět jistá regionální strukturalita. To značí, že genový tok mezi populacemi je omezen. Skupina „A“ je lokalizována na Moravě, kde se vyskytuje v povodí všech tří hlavních řek Moravy, Dyje i Odry. Skupina „B“ je lokalizována v dolním a středním toku Labe. Skupina „C“ se vyskytuje v horním toku Labe a v povodí Vltavy. Na hranicích mezi povodími Labe a Dyje je patrné, že zde neexistuje ostrý předěl mezi jednotlivými skupinami haplotypů. Jednotlivci ze skupin „A“ i „C“ se vyskytují na obou stranách hranice mezi povodími, ale jen v horních tocích. Do větší vzdálenosti od této hranice nejsou rozšíření. Ojedinělé haplotypy označené „D“, „E“ a „F“ se vyskytly na různých místech území ČR, přičemž dva z nich „E“ a „F“ byly v horních tocích téměř u pramene („E“ lokalita Bohdalovský – přítok Oslavy – západní Morava, „F“ lokalita Tušť – Lužnice – jižní Čechy). Haplotyp „F“ se vyskytl v dolním toku v blízkosti soutoku řek Moravy a Dyje (lokalita Tvrdonice). Haplotypy „F“ a „I“ jsou jediné, které vybočují z jinak velmi homogenního moravského regionu. Ojedinělé podskupiny větve „A“ tedy větve „A2“ a „A3“ se také vyskytli jen v horních tocích. Trans-alpinská linie (skupina „I“) je přítomna v jižních a jihozápadních Čechách, což je směrem k centru výskytu této linie, zjištěného v rámci celo-evropské fylogeografie berušky (Verovnik et al. 2005). Nečekaný je však jejich ojedinělý výskyt také ve střední Moravě (lokalita Království). V této lokalitě byly sekvenováni tři jedinci spadající do této skupiny „I“. Další dva jedinci ze stejné lokality a mnoho dalších z nedalekého okolí však vykazovaly běžný haplotyp skupiny „A1“. Toto zjištění bude dále probíráno v diskusi. Následující obrázek (14) ukazuje fylogeografické vztahy s barevným označením určeným podle geografických regionů. Skupiny spadající do povodí Labe jsou zabarveny do zelených a modrých tónů, povodí Dunaje do červených a povodí Odry je žluté. Haplotypová síť na obrázku byla vytvořena stejným způsobem jako na předešlém obrázku (13) bez doplnění sítě Trans-alpinské linie. Na obrázku sítě je patrné, že jednotlivé hlavní skupiny haplotypů ( A, B a C) spojují více různých oblastí. Rozšíření haplotypů tedy není striktně určeno hranicemi povodí. Povodí Odry (žlutá) je o jednu až čtyři substituce odděleno od nejběžnějšího moravského haplotypu, je tedy mírně regionálně odlišné od zbytku Moravy. Haplotypy z oblasti „Horní Vltava“ (sytě modrá) jsou na obrázku sítě rozmístěny ve všech hlavních skupinách haplotypů a vyskytují se také v Trans-alpinské linii, což naznačuje, že je tato oblast geneticky velmi heterogenní.

- 57 -

Obr. 14: Haplotypová síť genu COI, haplotypy z území ČR, geografické skupiny promítnuty do sítě.

- 58 -

Obr. 15: Haplotypové sítě genů 12S a 16S a jejich lokalizace na mapě ČR.

- 59 -

Obrázek 15 ukazuje doplňující výsledky získané analýzou dvou mitochondriálních genů berušky vodní kódujících podjednotky ribozómu. Jedná se o geny

12S a 16S.

Haplotypové sítě byly vytvořeny na základě 7 sekvencí genu 12S o délce 447 nulkeotidů a 9 sekvencí genu 16S o délce 448 nukleotidů. Sítě byly vypočítány metodou MJ s hodnotou ɛ = 15 (Bandelt et al. 1999). Hlavní informace, kterou tyto výsledky ukazují, je patrná heterogenita haplotypů. Populace berušek na území ČR tedy není geneticky homogenní ani v rámci těchto genů, které mutují přibližně třikrát pomaleji než gen COI (Hebert et al. 2003). Tato heterogenita má i jistý regionálně závislý charakter, který však díky malému počtu osekvenovaných populací není možné blíže specifikovat. V dostupné literatuře není údaj o tom, že by se nějaká studie zabývala sekvenací těchto genů u berušky vodní. Za druhotný výsledek této pilotní sekvenace se tedy dá považovat zjištění, že použité primery (viz metody) u berušek úspěšně amplifikují geny 12S a 16S. V případných budoucích studiích by tak tímto způsobem bylo možné získat smysluplné sekvence těchto genů. Stručně řečeno výsledkem sekvenace genů 12S a 16S je zjištění, že amplifikace probíhá, sekvenace je možná a mezi populacemi se dá očekávat jistá míra heterogenity.

- 60 -

Obr. 16: Haplotypová síť genu COI berušek z území ČR a barevné rozlišení populací podle habitatu

Tato haplotypová síť (obr. 16) zobrazuje pozice haplotypů berušek vodních z dvou různých habitatů na základě haplotypové sítě genu COI. Tato síť byla vytvořena stejným, způsobem jako na předešlých obrázcích (13 a 14) pouze barvy koleček jsou změněny tak, aby představovaly dva typy odlišných habitatů. Tato data jsou zde prezentována bez podložení statistickými metodami. Statistické zhodnocení těchto výsledků by bylo problematické díky tomu, že v různých geografických oblastech byly odebírány vzorky v různém poměru těchto dvou habitatů, jak dokládá tabulka 1. Výzkum prezentovaný v současné studii byl zaměřen na fylogeografii berušek vodních na území ČR. Možnost, že fylogeografická struktura populací bude ovlivněna příslušností k habitatu, bylo jedním z teoretických předpokladů. V průběhu prvotních analýz nekompletních dat se však ukázalo, že závislost na habitatu se s největší pravděpodobností neprokáže. Pokud se totiž porovnávaly sekvence ze stejné lokality, ale z

- 61 -

různých habitatů, nebyl mezi nimi nalézán rozdíl. Díky tomu nebyl další výběr sekvenovaných populací pro celkovou analýzu zaměřen tak, aby dodržoval stejných poměr vzorků z obou habitatů. Na obrázku sítě je patrná náhodnost rozmístění populací z jednotlivých habitatů. V kolečkách, která obsahují větší počet jedinců sdílejících stejný haplotyp, je poměr počtu jedinců z tůně ku počtu jedinců z toku přibližně stejný jako v celkovém souboru dat, tedy přibližně 2:1 (přesně 97 – tůň : 42 – tok). Tato náhodná distribuce habitatů v rámci haplotypové sítě značí nezávislost substitucí genu COI na příslušnosti k habitatu. To ukazuje na existující genový tok na úrovni habitatů způsobený probíhající migrací mezi tůněmi a tokem.

4.2. Odhady středních vzdáleností sekvencí genu COI Pomocí programu MEGA 5.05 (Tamura et al. 2011) byly provedeny odhady střední genetické vzdálenosti u sekvencí genu COI berušky vodní (Asellus aquaticus). Všechny následující odhady byly vypočítány pomocí testu: Kimura dvouparametrový model (Kimura 1980). Invazní druh berušky Proasellus coxalis sloužil jako outgroup k porovnání. Tab. 2:

Tato tabulka značí odhadovanou střední vzdálenost mezi hlavními povodími ČR.

ODRA DUNAJ LABE

ODRA DUNAJ LABE 0,012 0,032 0,012 0,036 0,032 0,036

Tab. 3:

Tato tabulka značí odhadovanou střední vzdálenost uvnitř hlavních povodí ČR. ODRA DUNAJ LABE 0,002 0,0179 0,0338

Údaje z tabulek 2 a 3 značí, že povodí Labe je více odlišné od oblastí Moravy a zároveň má velmi heterogenní vnitřní strukturu. Je to dáno tím, že v povodí Labe je zastoupena většina haplotypů skupiny „C“, která je více vzdálena od Moravské skupiny (obr. 13, tab. 6). Současně se pouze v povodí Labe a to hlavně na jeho středním a dolním toku vyskytuje skupina haplotypů „B“. V povodí Vltavy, které je součástí povodí Labe se vyskytují i velmi vzdálené haplotypy z Trans-alpinské linie. Díky tomu je povodí Labe vnitřně nejvíce heterogenní. Povodí Odry je naopak velmi homogenní, vyskytují se zde haplotypy pouze z podskupiny „A1“. Tuto skupinu haplotypů sdílí současně s Odrou také povodí Dunaje, proto je povodí Odry blíže Dyji a Moravě než Labi, ve kterém se haplotypy „A1“ téměř nevyskytují. Povodí Dunaje také ukázalo poměrně vysokou míru vnitřní heterogenity, která je

- 62 -

daná jednak heterogenní oblastí na hranicích mezi povodími Dyje a Labe. Současně také výskytem Trans-alpinské linie v lokalitě „Království“ na řece Moravě.

Tab. 4:

Tato tabulka značí odhadovanou střední vzdálenost mezi jednotlivými geografickými skupinami, tak jak jsou definovány v kapitole 3.1 této práce a také na obrázku 14. ODRA

ODRA DYJE MORAVA DOLNÍ VLTAVA HORNÍ VLTAVA BEROUNKA STŘEDNÍ LABE OHŘE A BÍLINA VÁH DOLNÍ LABE HORNÍ LABE Proasellus cox.

Tab. 5:

ODRA

0,002

DYJE

0,008 0,008 0,018 0,023 0,058 0,067 0,025 0,020 0,010 0,023 0,022 0,244

0,020 0,022 0,059 0,067 0,023 0,020 0,012 0,023 0,021 0,247

MOR.

0,018 0,020 0,035 0,063 0,070 0,037 0,033 0,023 0,036 0,033 0,246

S. LABE OHŘE

D. VLT. H. VLT. BER.

0,023 0,022 0,035

0,058 0,059 0,063 0,053

0,053 0,054 0,014 0,016 0,024 0,020 0,010 0,251

0,068 0,056 0,056 0,059 0,058 0,054 0,247

0,067 0,067 0,070 0,054 0,068 0,059 0,061 0,069 0,064 0,056 0,247

0,025 0,023 0,037 0,014 0,056 0,059 0,016 0,025 0,017 0,015 0,250

VÁH

0,020 0,020 0,033 0,016 0,056 0,061 0,016 0,022 0,017 0,016 0,246

D. LABE H. LABE P. cox.

0,010 0,012 0,023 0,024 0,059 0,069 0,025 0,022 0,024 0,023 0,245

0,023 0,023 0,036 0,020 0,058 0,064 0,017 0,017 0,024 0,021 0,248

0,022 0,021 0,033 0,010 0,054 0,056 0,015 0,016 0,023 0,021

0,244 0,247 0,246 0,251 0,247 0,247 0,250 0,246 0,245 0,248 0,251

0,251

Tato tabulka značí odhadovanou střední vzdálenost uvnitř jednotlivých geografických skupin, tak jak jsou tyto skupiny definovány v kapitole 3.1 této práce a také na obrázku 14. DYJE

MORAVA

0,010

0,028

VÁH

D. VLTAVA H. VLTAVA BEROUN. ST. LABE OHRE

0,011

0,074

0,077

0,016

0,017

D. LABE

0,017

H. LABE

0,018

0,012

Z tabulek 4 a 5 je možné vyčíst mimo jiné to, že geografické skupiny „Horní Vltava“ a „Berounka“ jsou více vzdáleny od ostatních a zároveň mají nejvyšší míru vnitřní heterogenity. Je to dáno výskytem haplotypů spadajících do Trans-alpinské linie.

Tab. 6:

Tato tabulka značí odhadovanou střední vzdálenost mezi jednotlivými haplotypy, které byly pojmenovány na základě haplotypových sítí znázorněných na obrázcích 11 a 13. "A" Skupina haplotypů "A" Skupina haplotypů "E" Skupina haplotypů "C" Skupina haplotypů "B" Skupina haplotypů "D" Skupina haplotypů "F" Skupina haplotypů "I" Proasellus cox.

0,038 0,029 0,020 0,030 0,040 0,128 0,246

"E" "C" 0,038 0,029 0,035 0,035 0,039 0,027 0,040 0,016 0,046 0,041 0,130 0,124 0,255 0,252

"B" 0,020 0,039 0,027

"D" 0,030 0,040 0,016 0,028

"F" 0,040 0,046 0,041 0,039 0,042

"I" 0,128 0,130 0,124 0,131 0,132 0,113

0,028 0,039 0,042 0,131 0,132 0,113 0,246 0,247 0,243 0,240

P. c. 0,246 0,255 0,252 0,246 0,247 0,243 0,240

Jednotlivé skupiny haplotypů v tabulce 6 byly určeny na základě fylogenetických analýz při tvorbě haplotypových sítí (obr 11 a 13). Skupiny, které spojují větší počet haplotypů (8 až 72) jsou skupiny „A“, „B“, „C“ a „I“. Z těchto čtyř skupin jsou si nejbližší skupiny „A“ a „B“. Stejný výsledek je patrný také na haplotypových sítích. Naopak velmi

- 63 -

vzdálené jsou haplotypy ze skupiny „I“, což jsou haplotypy spadající do Trans-alpinské linie. Průměrná vzdálenost haplotypů skupiny „I“ od všech ostatních (mimo outgroup) je 0,126 ± 0,013, což je stejná hodnota (přesně 0,124 ± 0,013), jaká vyšla také v celoevropské fylogeografické studii (Verovnik et al. 2005). Kombinací dvou metod pro odhad časové divergence (viz metody kapitola 3.4. této práce) bylo odhadnuto stáří divergence haplotypů skupiny „I“ a ostatních haplotypů z této studie na 5,2 ± 0,5 miliónů let. Průměrná vzdálenost skupiny „C“ od zbylých dvou nejpočetnějších skupin haplotypů Hlavní evropské genealogické linie („A“ a „B“) je 0,028 ± 0,001. Převedeno na čas je to 1,2 ± 0,25 miliónů let. Stáří divergence skupin, ve kterých je jen jeden jedinec („D“, „E“ a „F“) jsou přibližně 1,5 až 2 milióny let. Vzdálenost mezi skupinami haplotypů „A“ a „B“ je podobná vzdálenostem mezi jejich vnitřními podskupinami, pohybuje se mezi 0,014 až 0,020 (tabulky 7 a 8). Tyto jednotlivé větve se od sebe oddělily zhruba před 0,5 až 0,7 ± 0,1 milióny let.

Tab. 7:

Tato tabulka značí odhadovanou střední vzdálenost mezi jednotlivými podvětvemi skupiny haplotypů „A“, tak jak jsou definovány na obr. 11 a 13

"A1" větev "A1" větev "A3" větev "A2" průměr

Tab. 9:

0,014 0,016

"A3" 0,014

"A2" 0,016 0,017

0,017 0,016 ± 0,002

Tab. 8:

Tato tabulka značí odhadovanou střední vzdálenost mezi jednotlivými podvětvemi skupiny haplotypů „B“, tak jak jsou definovány na obr. 11 a 13 "B3"

větev "B3" větev "B2" větev "B1" průměr

0,014 0,020

"B2" 0,014

"B1" 0,020 0,017

0,017 0,017 ± 0,003

Tato tabulka značí hodnotu odhadované střední vzdálenosti uvnitř všech jednotlivých skupiny a podskupin haplotypů. Dále značí počty haplotypů v jednotlivých skupinách a množství jedinců, kteří do těchto skupin spadají. Pokud skupina čítá jen jednoho jedince není možné hodnotu střední vzdálenosti vypočítat. Hodnota vzdálenosti pod políčkem celkem je výsledná průměrná vzdálenost mezi všemi analyzovanými sekvencemi.

Skupiny haplotypů "A1" "A2" "A3" "B1" "B2" "B3" "C" "D" "E" "F" "I" Celkem Počet jedinců 72 1 4 3 11 2 35 1 1 1 8 139 Počet haplotypů ve skupině 18 1 3 2 6 2 15 1 1 1 5 55 Vnitro-skupinová vzdálenost 0,0021 n. 0,0024 0,0021 0,0020 0,0161 0,0023 n. n. n. 0,0106 0,0164

Poslední tabulka (9) znázorňuje počty jednotlivců ve všech skupinách haplotypů, jejich vnitřní genetické vzdálenosti a počet haplotypů, které se ve skupině vyskytují. Všechny

- 64 -

skupiny jsou poměrně silně homogenní, což je dáno tím, že haplotypy byly seskupovány v jemné škále na úrovni jednotlivých vnitřních větví nikoli ve větších celcích. Celkový poměr nukleotidů genu COI byl přibližně 63% A-T párů ku 27% C-G párům. V sekvenci dlouhé 630 nukleotidů bylo celkem 109 (17,3%) variabilních pozic. Mezi 139 jednotlivci ze 62 lokalit se vyskytovalo 55 různých haplotypů

4.3. Genetické rozdíly mezi populacemi Analýza molekulární variance rozdělila variabilitu použitých vzorků mezi hlavními povodími, mezi skupinami v rámci hlavních povodí a uvnitř těchto skupin (viz tabulka ...). Největší podíl z molekulární variability v našich vzorcích připadá na variabilitu uvnitř skupin (63 %), variabilita mezi hlavními povodími představuje 24 % celkové variability. Komponenty variability Mezi hlavními povodími Mezi skupinami v rámci hlavních povodí Uvnitř skupin *** p < 0,001 ** p < 0,05

df. 2 8

% variability F-statistika 23,99 Φ CT = 0,240 ** 13,07 Φ SC = 0,172 ** Φ ST = 0,371 ***

128 62,93

Párové rozdíly mezi populacemi (viz tabulka) ukazují, že statisticky průkaznější rozdíly jsou mezi populací Odra a zbytkem populací, a mezi populacemi Morava a Dyje a zbytkem populací. Tab. 10:

Hodnoty FST mezi populacemi (distanční metoda: Pairwise difference), statisticky významné hodnoty (p < 0,05) jsou vyznačeny tučně.

. 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Odra Morava Dyje Váh Střední Labe Dolní Labe Horní Vltava Berounka Horní Labe Ohře/Bílina Dolní Vltava

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0.130 0.202 0.576 0.583 0.732 0.429 0.635 0.726 0.680 0.810

0.065 -0.090 0.405 0.320 0.268 0.395 0.356 0.289 0.381

0.017 0.450 0.468 0.463 0.628 0.465 0.394 0.524

0.341 0.236 0.020 0.157 0.410 0.217 0.481

0.020 0.276 0.394 0.054 -0.023 0.030

0.112 0.225 0.288 -0.041 0.299

-0.110 0.179 0.119 0.125

0.270 0.222 0.193

0.098 -0.166

10

0.110

- 65 -

5. Diskuse Zkoumaný soubor dat čítající 139 sekvencí genu COI berušky vodní (Asellus aquaticus) vykazuje poměrně velkou heterogenitu haplotypů na malém geografickém měřítku. Toto tvrzení, ale nemůže být správně interpretováno, pokud není zasazeno do rámce větší geografické oblasti. Díky celo-evropské fylogeografické studii slovinských vědců (Verovnik et al. 2005) je toto srovnání možné. Jak je probíráno v úvodu práce, glaciální cykly měly výrazný vliv na současnou distribuci organismů na evropském kontinentě (Hewitt 1996, Taberlet et al. 1998). Tyto cykly ovlivňovaly jak distribuci organismů, tak jejích působením vznikaly různé genealogické linie, které se od sebe v průběhu času geneticky vzdalovaly. Během nepříznivých podmínek se druhy stahovaly do refugií, která fungovala jako místa, kde bylo možné dlouhodobě uchovávat dostatečnou efektivní velikost populace. V refugiích měly druhy stabilní populaci v průběhu příznivých i nepříznivých období (Bennett & Provan 2008). Díky tomu si populace v refugiích dlouhodobě udržely vysokou míru genetické variability a působením genetického driftu se jim nadále zvyšovala. Refugia tak fungují jako místa, kde druhy přežívají nepříznivá období a současně i jako centra genetické diverzity (Hewitt 2000, 2004). Pokud bychom tyto pravidla promítnuli do situace zjištěné u berušky vodní, můžeme hlavní refugium nalézt v Dinárském krasu a na řece Drávě ve Slovinsku (Verovnik et al. 2003, 2004, Prevorčnik et al. 2009). Verovnik et al. (2005) odhaduje, že do této oblasti mířila prvotní kolonizace z východu před 8 až 12 miliony let. V této oblasti se dnes vyskytuje největší množství haplotypů, které jsou od sebe vzdáleny mnohdy několik milionů let. Dinárský kras jako refugium podporují výzkumy zaměřené i na různé jiné druhy korýšů (Sket 1999, Trontelj et al. 2005). V této krasové oblasti mohlo docházet k opakovaným epizodám dlouhodobé izolace různých jeskynních populací, které se pak v průběhu geologického vývoje mohli opět vrátit na povrch. Odhad doby kdy beruška vodní kolonizovala zbytek Evropy, je však poněkud složitější otázka. Tato diplomová práce však předkládá data, která tuto otázku možná více objasní. Při pohledu na podrobnější strukturu jednotlivých hlavních genealogických linií berušky vodní v Evropě zjistíme, že poloha dinárského refugia spíše než pravé refugium představuje jeho severní hranici. Od tohoto území směrem na jih měla kolonizace jiný

- 66 -

charakter než směrem na sever. Je možné, že toto území není refugium samo o sobě jako spíše severní hranicí balkánského makro–refugia, tedy severním okrajem areálu rozšíření berušky v dobách glaciálů. Díky tomu, že tato lokalita umožňuje druhům lokální izolaci (Sket 1999) zvyšuje a zároveň uchovává genetickou heterogenitu. Vraťme se ale ke zmíněnému rozdílu jižních a severních oblastí. Verovnik et al. (2005) vypočítal, že jako první se oddělila Balkánská skupina, ta má mnoho velmi vzdálených haplotypů a lokálních, které se nevyskytují nikde jinde. Tomu odpovídá odhad, že na tomto místě přežívají berušky už dlouhou dobu, tedy přibližně 4 až 8 milionů let. Následně se oddělila Trans-alpinská větev. Jejíž vnitřní struktura je ukázaná na obrázku 10. Na síti je patrné větší množství dlouhých větví, které mají na konci skupinu nedávno oddělených haplotypů. To znamená, že dané haplotypy jsou již dlouho na stejné lokalitě, kde postupně diverzifikují (Walker & Avise 1998). Oproti tomu haplotypy Trans-alpinské skupiny, které byly objeveny na území ČR, jsou na krátkých větvích nebo v samotném centru této sítě (Obr. 10). To značí, že tuto lokalitu obsadili teprve nedávno. Většina ostatních haplotypů Transalpinské skupiny se drží schématu: Jedna dlouhá větev a na jejím konci haplotypy pouze z jedné lokality. Tento charakter má také několik haplotyů spadajících do Hlavní evropské linie. Na sítí Hlavní evropské linie (obr. 11) je vidět několik bazálně se oddělujících dlouhých větví. Tyto haplotypy lokalizované pouze v jižním Slovinsku, Chorvatsku a středním Balkáně mají opět charakter dlouhé větve se starou lokální populací. To poukazuje na starodávnou prePleistocenní kolonizaci těchto území (Verovnik et al. 2004). Zajímavý okamžik nastává, pokud se podíváme na sever od dinárského a drávského refugia. Tuto situaci nejlépe dokumentuje obrázek 12. Síť na tomto obrázku spojuje sekvence ze třech různých studií (tato diplomová práce, Verovnik et al. 2005, Eroukhmanoff et al. 2009b). Síť má jen krátké větve a na nich leží skupiny haplotypů z geograficky rozsáhlého regionu. Ve dvou případech dokonce sdílejí jedinci z mnoha set kilometrů vzdálených populací naprosto stejné haplotypy (západní Čechy – střední Francie, střední Čechy – jižní Švédsko). To může znamenat, že kolonizace tohoto rozsáhlého území severně od Dinárského krasu proběhla v mnohem nedávnější době, než tomu bylo u kolonizace směrem na jih (Bohonak & Jenkins 2003). Je možné, dokonce pravděpodobné, že tato kolonizace proběhla po konci posledního glaciálu, i když s jistotou se to tvrdit nedá. Verovnik et al. (2005) tuto možnost nevylučuje, avšak v jeho práci není z oblasti střední a severní Evropy mnoho vzorků. Po doplnění dalších sekvencí se tento scénář zdá být mnohem pravděpodobnější. Jsou zde ovšem dvě skupiny haplotypů, které se této představě mírně vymykají. Jedná se o dva

- 67 -

haplotypy označené na obrázku 11 kódy „WA“ a „F“. Tyto haplotypy jsou od sítě odděleny úplně bazálně, což značí starší dobu jejich oddělení a zároveň se nevyskytují u Dinárského krasu. Haplotyp „WA“ z práce Verovnik et al. (2005) byl nalezen v holandských Ardenách a haplotyp „F“ byl nalezen v jižních Čechách. Tyto dva haplotypy jsou zvláštní i tím, že na jejich větvi či v blízkosti jejich větve není žádný haplotyp, který by se vyskytoval v blízkosti lokality na řece Drávě nebo v Dinárském krasu. S velkou pravděpodobností se jedná o relikty předešlé kolonizační vlny, která přečkala glaciál v některém severním kryptickém mikrorefugiu (Provan & Bennett 2008). Stewart & Lister (2001) v jednom z pilotních článků o kryptických severních refugiích právě o oblasti Belgie a Nizozemska hovoří ve spojitosti s potenciálním výskytem těchto kryptických refugií. O oblasti jižních Čech se literatura nezmiňuje, nicméně to tuto možnost nevylučuje. Druhé dva unikátní a vzdálené haplotypy objevené na území ČR („D“ a „E“) mají u sebe na společné větvi příbuzný haplotyp z území poblíž předpokládaného refugia, proto mohou být jak pozůstatky předchozí kolonizace, tak příslušníky té současné. Lokality, kde byly tyto tři neobvyklé haplotypy odebrány, leží v jižní polovině České republiky, ale jejich geografické umístění je spíše náhodné a neukazuje na žádnou lokalitu nebo habitat, jako na možné kryptické refugium. Tímto tedy můžeme odpovědět na jednu z pokládaných otázek: S velkou pravděpodobností bylo území střední a severní Evropy kolonizováno zaprvé ve více fázích a zadruhé poslední fáze kolonizace proběhla nedávno možná dokonce až na konci posledního glaciálu, přibližně před 18 tisící lety (Ehlers & Gibbard 2008). Zdá se, že berušky reagovaly na glaciál kontrakcí severních částí svého areálu rozšíření a stahovali se, jak do jižních makrorefugií na Balkánském a Apeninském poloostrově, tak asi také do severního kryptického refugia v holandských Ardenách (Verovnik et al. 2005). Expanse pak probíhala především ze severního okraje balkánského refugia, tedy z Dinárského krasu a řeky Drávy, a zároveň v menší míře i z apeninského refugia, což dokazuje přítomnost Trans-alpinské linie v jihozápadních a jižních Čechách a na střední Moravě. Další zajímavý moment expanse směrem na sever, je její charakter. Rozsáhlé území střední a severní Evropy vykazuje poměrně vysokou heterogenitu, přitom ale sdílí stejné skupiny haplotypů. Hlavní tři skupiny haplotypů, vyskytující se na území ČR („A“, „B“ a „C“) jsou starší než, aby se mohly vyvinout v průběhu posledního glaciálu. Podle substituční rychlosti genu COI (Ketmaier et al. 2003) bylo odhadnuto stáří těchto linií na 0,5 až 1,2 milionů let. Nabízí se tedy vysvětlení, že kolonizace probíhala pomalým typem zvaným Falanga (Hewitt 1996, 2004). Tedy způsobem, kdy už existující genetickou heterogenitu

- 68 -

předávala mateřská populace na populaci dceřinou. Celá kolonizovaná severní oblast tak sdílí větší množství starých linií, které mají původ v jižním refugiu. Drobný regionální charakter, který můžeme pozorovat na území ČR díky této diplomové práci, mohl vzniknout při zabírání volného prostoru jednotlivými pod-liniemi, které existovaly už v mateřské populaci. Toto tvrzení lze podložit faktem, že kromě jediného haplotypu „F“ mají všechny skupiny haplotypů na území ČR (A až E) blízkého příbuzného či dokonce totožný haplotyp z oblasti slovinských refugií, nebo z jejich blízkého okolí. Kdyby region střední a severní Evropy kolonizovalo v nedávné době jen malé množství geneticky homogenních jedinců, tedy typ kolonizace zvaný Pionýr byla by výsledná populace v Evropě také homogenní (Hewitt 1996, 2004). Alternativně se přítomnost těchto přibližně milion let starých linií dá vysvětlit tvrzením, že vznikly přímo na místě. K žádným kontrakcím do jižních refugií v průběhu Pleistocénu nedocházelo a populace se stáhly maximálně do lokálních mikro-refugií. Proti tomuto tvrzení ovšem stojí dvě skutečnosti. První, tedy blízká příbuznost jižních haplotypů už byla zmíněna. Druhé proti tvrzení ukazuje obrázek 12. Situace kdy se blízce příbuzné a dokonce i totožné haplotypy vyskytují napříč velkým územím Evropy, nenasvědčuje tomu, že by vznikaly každý zvlášť v rámci různých regiónů. Na základě jemného měřítka vnitřní haplotypové struktury může být diskutována schopnost disperse berušky vodní. Pohled na obrázek 13 vyjeví o těchto schopnostech mnoho. Zajímavým místem je hranice mezi povodími Dyje a Labe, zde je vidět, že tři jedinci z jinak výhradně labské skupiny, překročili hranici mezi povodími a stejně tak tři jedinci z jinak výhradně moravské skupiny také překročili hranici v opačném směru. Hranice mezi povodími Dyje a Labe není rozdělena žádnými vysokými horskými hřbety, přesto však jsou jednotlivé řeky odděleny suchou zemí. Tyto oblasti na hranicích povodí, však naznačují, že berušky nějakým způsobem hranici jsou schopny překonat. Za jakých okolností se to děje, v jakém období a vývojovém stádiu berušky migrují, není zatím objasněno. Podobná situace je vidět také u jednotlivců z Trans-alpinské linie, která se vyskytuje v pěti lokalitách v jiho-západních a jižních Čechách. Je velmi pravděpodobné, že na toto území migrovaly směrem od svého distribučního centra tedy z Alp. Tudíž opět musely překonat hranici mezi povodími (z povodí Dunaje do povodí Vltavy). Jak hluboko do území Čech tato linie zasahuje, není příliš jasné z důvodu malé hustoty vzorkování v této oblasti. Odhalené haplotypy se však stejně jako na hranici mezi Labem a Dyjí nacházejí hlavně v horních tocích a hlouběji do povodí se nešíří. Je tedy možné, že barierou pro šíření berušek není ani tak vzdálenost nebo bariera terestrického

- 69 -

prostředí, ale spíše vnitrodruhová kompetice, která udržuje jednotlivé linie na stejné lokalitě (Townsend et al. 2008). Berušky se zjednodušeně řečeno nemohou šířit tam, kde už sídlí jiné jejich populace. Zde je důležité představit další výsledek celo-evropské fylogeografické studie. Verovnik et al. (2005) kromě mitochondriálního genu COI sekvenovali také jaderný gen 28S, který rozdělil evropskou populaci berušek jen na dvě skupiny. Jednu lokální v Dinárském krasu, druhou spojující celý zbytek kontinentu. To znamená, že probíhá genetický tok mezi populacemi v rámci celé Evropy. Poměrně záhadná je přítomnost jedinců z Trans-alpinské linie, kteří se vyskytli v lokalitě „Království“ v povodí řeky Moravy. Všichni tři objevení jedinci sdíleli stejný haplotyp, který byl shodný ještě s dalším jedincem. Ten byl ale odebrán v jiho-západních Čechách z povodí Berounky tedy přibližně z 300 km vzdálenosti. Celá řeka Morava je přitom genetický velmi homogenní a teto haplotyp se nevyskytoval v žádné jiné moravské lokalitě i když jich bylo v okruhu 30 kilometrů vzorkováno dalších šest proti i po proudu řeky Moravy. Je těžké si představit, že by berušky migrovali 300 kilometrů a nezaložili po cestě žádnou jinou populaci, i když je možné, že jen náhodou tyto stopy unikly našemu vzorkování. Není vyloučeno, že na takovou vzdálenost opravdu nějakým způsobem berušky překonali sami a nezanechali žádnou stopu. Jako pravděpodobnější scénář se jeví možnost událost náhodné introdukce. Skutečnost se ze současných dat dá pouze odhadovat. Poslední kladenou otázkou, bylo rozdělení habitatů mezi tůněmi a toky, na tuto otázku již zazněla odpověď v kapitole Výsledky. Je však na místě zde zmínit výzkum, který se již dříve zabýval stejnou otázkou a došel ke stejnému výsledku. Skupina švédských vědců (Eroukhmanoff et al. 2009b) v této práci již mnohokrát zmiňovaná, poměřovala z různých hledisek dva jasně morfologicky odlišné ekotypy berušky, které se v jiho-švédských jezerech adaptovaly na různé predátory. Pokusy vzájemného křížení prokázaly dědičnost fenotypových vlastností. Přesto se návaznost habitatu na příslušnost k haplotypům genu COI neprokázala. Stejně jako v současné diplomové práci byla distribuce jednotlivých ekotypů na haplotypové síti genu COI čistě náhodná (Obr. 16)

- 70 -

Obr. 17:

Obrázek dokumentuje náhodnou distribuci v rámci haplotypové sítě genu COI u dvou ekotypů berušek vodních z jiho-švedských jezer specializovaných na život v rákosu (Reed – sytější barva) a v parožnatce (Stonewort – světlejší barva). Stejné sekvence byly použity i v této práci k vytvoření haplotypové sítě na obr. 12. Převzato z Eroukhmanoff et al. (2009b).

- 71 -

6. Závěr Hlavní cílem této práce bylo vytvořit podrobnou fylogeografickou studii zaměřenou na berušku vodní v malém prostorovém měřítku. Sladkovodní biotop je vhodným prostředím pro studium schopnosti disperse a vlivu nespojitosti prostředí na genetickou strukturu organismů, které tento biotop obývají. Regionem, na který byla tato studie zaměřena, bylo zvoleno území České republiky, které je z hydrologického hlediska charakteristické svou příslušností ke třem velkým evropským povodím, tedy povodí Labe, Dunaje a Odry. Na tomto území

byl

osekvenován mitochondriální gen pro cytochrom oxidázu podjednotky I (COI) celkem ze 139 jedinců z 62 lokalit. Doplňkově byly také sekvenovány mitochondriální geny pro ribozomální podjednotky 12S a 16S. Těchto genů bylo, ale osekvenováno příliš malé množství, takže neposkytly, žádné zásadní informace. Získané sekvence genu COI byly dále kombinovány s volně dostupnými sekvencemi ze dvou dalších studií zaměřených na berušku vodní. (Verovnik et al. 2005, Eroukhmanoff et al. 2009b) Díky těmto sekvencím bylo možné propojit výsledky této regionální studie s širším rámcem celo-evropského fylogeografického kontextu. Jako hlavní výsledek lze označit zjištění přítomnosti hybridní zóny (Hewitt 1996, 2000), která se nachází na území jižních a jiho-západních Čech a vzniká křížením Hlavní evropské genealogické linie a pěti zástupců Trans-alpínské genealogické linie. Tyto linie se od sebe oddělili přibližně před 5 milióny let (Verovnik et al. 2005). Území ČR je tedy jednoznačně kolonizováno minimálně ze dvou mateřských linií. Většina z 55 haplotypů genu COI odebraných na území ČR spadá do Hlavní evropské genealogické linie, která se od ostatních evropských genealogických linií liší svou vnitřní genetickou strukturou. Struktura této linie totiž naznačuje poměrně nedávný průběh kolonizace západní, střední a severní Evropy (možná na konci posledního glaciálu před 18 tisíci let). Tato kolonizace probíhala způsobem zvaným Falanga tedy postupným rozšiřováním velkého počtu geneticky diverzifikovaných jedinců najednou, nikoli pouze malou skupinou pionýrských jedinců. To mělo za následek obsazení Evropy velkým množstvím různých haplotypových skupin které se od sebe oddělily mezi 0,5 – 1,2 miliony let. Tyto různé skupiny haplotypů však jsou sdíleny geograficky i velmi vzdálenými jedinci. Naproti tomu zbývající hlavní genealogické linie, které se nacházejí v jižních oblastech Evropy, mají vnitřní haplotypy výrazně lokální a vzájemně genetický velmi vzdálenější.

- 72 -

Genetická struktura Hlavní evropské linie, naznačuje nedávný průběh kolonizace. Současně ukazuje, že berušky reagují na klimatické změny klasickým „contractionexpansion“ modelem (Taberlet et al. 1998). S tím, že severní hranice, kde ještě berušky přežívají průběh glaciálu, je na území Slovinska, tam je také lokalizováno centrum jejich genetické diversity. Několik jedinců, kteří spadají do Hlavní evropské genealogické linie, vykazuje unikátní bazální haplotypy. Což může znamenat to, že tito jedinci jsou pozůstatky starší vlny expanze. Ti se v průběhu glaciálu nestáhli do jižního refugia, ale jen do severního kryptického refugia v holandských Ardenách (Stewart & Lister 2001). Tyto populace mohou sloužit jako doklad opakovaných kontrakcí a expanzí. Vnitřní pod-linie Hlavní evropské skupiny se nacházejí také na území ČR, kde tvoří tři geograficky oddělené celky, jejichž okrajové oblasti se mezi sebou mírně kříží. Haplotypové skupiny dělí Českou republiku zhruba na oblast dolního a středního toku Labe, na oblast horního toku Labe a povodí Vltavy a na oblast Moravy. Na hranici povodí mezi Dyjí a Labem dochází k míchání těchto haplotypů. Z obou těchto skupin haplotypů se tři sekvenovaní jedinci vyskytli v druhém povodí než zbytek jejich příbuzných. Tato skutečnost tvoří předpoklad, že hranice mezi povodími nečiní pro berušky vodní příliš významnou překážku. Jejich schopnost disperse je tedy poměrně vysoká. Díky tomu, že dokážou obývat lotické (tok) i lentické (stojatá voda – tůň) biotopy, není jejích prostředí tolik nespojité. To dokazuje i přítomnost již zmíněné hybridní zóny mezi dvěma hlavními genealogickými liniemi. Posledním zjištěním je nezávislost výskytu haplotypů v návaznosti na typ lentického nebo lotického habitatu. Haplotypy z obou těchto habitatů se v haplotypové síti vyskytovaly naprosto náhodně a neukazovali žádnou závislost.

- 73 -

Literatura Abellán P., Millán A. and Ribera I. (2009): Parallel habitatdriven differences in the phylogeographical structure of two independent lineages of Mediterranean saline water beetles. Molecular Ecology 18: 3885–3902 Allen P.A. (2008): From landscapes into geological history. Nature 451: 274–276 Arakelova K.S. (2001): The evaluation of individual production and scope for growth in aquatic sow bugs (Asellus aquaticus). Aquatic Ecology 35: 31–42 Ashcroft M.B. (2010): Identifying refugia from climate change. Journal of Biogeography 37: 1407–1413 Avise J.C. (1998): The history and purview of phylogeography: a personal reflection. Molecular Ecology 7: 371–379 Bandelt H.-J., Forster P. and Röhl A. (1999) Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Molecular Biology and Evolution 16: 37–48 Barradas-Ortiz C., Briones-Fourzán P. and Lozano-Alvarez E. (2003): Seasonal reproduction and feeding ecology of giant isopods Bathynomus giganteus from the continental slope of the Yucatán peninsula. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers 50: 495–513 Bennett K.D., Tzedakis P.C. and Willis K.J. (1991): Quaternary refugia of north European trees. Journal of Biogeography 18: 103–115 Bennett K.D. and Provan J. (2008): What do we mean by ‘refugia’? Quaternary Science Reviews 27: 2449–2455 Bilton D.T., Freeland J.R. and Okamura B. (2001): Dispersal in freshwater invertebrates. Annual Review of Ecology and Systematics 32: 159–181 Bohonak A.J. (1999): Dispersal, gene flow, and population structure. Quarterly Review of Biology 74: 21–45 Bohonak A. J. and Jenkins D. G. (2003): Ecological and evolutionary significance of dispersal by freshwater invertebrates. Ekology Letters 6: 783–796 Bowler D.E. and Benton T.G. (2005): Causes and consequences of animal dispersal strategies: relating individual behaviour to spatial dynamics. Biological Review 80: 205–225

- 74 -

Braconnot P., Marzin C., Grégoire L., Mosquet E. and Marti O. (2008): Monsoon response to changes in Earth's orbital parameters: comparisons between simulations of the Eemian and of the Holocene. Climate of the Past 4: 281–294 Brendonck L. and Riddoch B.J. (1999): Wind-borne short-range egg dispersal in anostracans (Crustacea: Branchiopoda). Biological Journal of the Linnean Society 67: 87–95 Brendonck L. and De Meester L. (2003): Egg banks in freshwater zooplankton: evolutionary and ecological archives in the sediment. Hydrobiologia 491: 65–84 Cáceres C.E. (1997): Dormancy in invertebrates. Invertebrate Biology 116: 371–383 Cañedo-Argueelles M. and Rieradevall M. (2011): Early succession of the macroinvertebrate community in a shallow lake: Response to changes in the habitat condition. Limnologica 41: 363–370 Costa F.O., deWaard J.R., Boutillier J., Ratnasingham S., Dooh R.T., Hajibabaei M. and Hebert P.D.N. (2007): Biological identifications through DNA barcodes: the case of the Crustacea. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 64: 272–295 Dansgaard W., Johnsen S.J., Clausen H.B., Dahl-Jensen D., Gundestrup N.S., Hammer C.U., Hvidberg C.S., Steffensen J.P., Sveinjörnsdottir A.E., Jouzel J. and Bond G. (1993): Evidence for general instability of past climate from a 250-kyr ice-core record. Nature 364: 218–220 Dalén L., Fuglei E., Hersteinsson P., Kapel C.M.O., Roth J.D., Samelius G., Tannerfeld M. and Angerbjörn A. (2005): Population history and genetic structure of a circumpolar species: the Arctic fox. Biological Journal of the Linnean Society 84: 79–89 Driscoll N.W. and Haug G.H. (1998): A short circuit in thermohaline circulation: A cause for northern hemisphere Glaciation? Science 282: 436–438 Ehlers J., Astakhov V., Gibbard P.L., Mangerud J. and Svendsen J.I. (2007a): MidQuaternary in Eurasia. In: Encyclopedia of Quaternary Science II (Elias S. A. edit.) 1036–1043 Ehlers J., Astakhov V., Gibbard P.L., Mangerud J. and Svendsen J.I. (2007b): Late Pleistocene Glaciations in Europe. In: Encyclopedia of Quaternary Science II (Elias S. A. edit.) 1085–1095 Ehlers J. and Gibbard P.L. (2008): Extent and chronology of Quaternary glaciation. Episodes 31: 211–218

- 75 -

Eroukhmanoff F., Hargeby A. and Svensson E.I. (2009a): Rapid adaptive divergence between ecotypes of an aquatic isopod inferred from FST-QST analysis. Molecular Ecology 18: 4912–4923 Eroukhmanoff F., Hargeby A., Nowshiravani-Arnberg N., Hellgren O., Bensch S. and Svensson E.I. (2009b): Parallelism and historical contingency during rapid ecotype divergence in an isopod. Journal of Evolutionary Biology 22: 1098–1110 Excoffier L. and Lischer H.E.L. (2010): Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources 10: 564-567 Fairbanks R.G. (1989): A 17 000-year glacio-eustatic sea level record: influence of glacial melting rates on the Younger Dryas event and deep-ocean circulation. Nature 342: 637–42 Figuerola J., Green A.J. and Michot T.C. (2005): Invertebrate eggs can fly: evidence of waterfowl-mediated gene flow in aquatic invertebrates. American Naturalist 165: 274–280 Flegr J. (2005): Evoluční Biologie. ISBN: 80-200-1270-2 pp.560 Folmer O., Blafl M., Hoeh W., Lutz R. and Vrijenhoek R., (1994): DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidace subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 294–299 Forster P., Torroni A., Renfrew C. and Röhl A. (2001): Phylogenetic star contraction applied to Asian and Papuan mtDNA evolution. Molecular Biology and Evolution 18: 1864–1881 Guidetti R., Boschini D., Rebecchi L. and Bertolani R. (2006): Encystment processes and the “Matrioshka-like“ stage in a moss-dwelling and in a limnic species of eutardigrades (Tardigrada). Hydrobiologia 558: 9–21 Hall T.A. (1999): BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: 95–98 Hairston N.G.Jr., Van Bunt R.A., Kearns C.M. and Engstrom D.R. (1995): Age and survivorship of diapausing eggs in a sediment egg bank. Ekology 76: 1706–1711 Hairston N.G.Jr. (1996): Zooplankton egg banks as biotic reservoirs in changing environments. Limnology and Oceanography 41: 1087–1092 Hargeby A. (1990): Macrophyte associated invertebrates and the effect of habitat permanence. Oikos 57: 338–346

- 76 -

Hargeby A., Johansson J. and Ahnesjo J. (2004): Habitat-specific pigmentation in a freshwater isopod: adaptive evolution over a small spatiotemporal scale. Evolution 58: 81–94 Hargeby A., Stoltz J. and Johansson J. (2005): Locally differentiated cryptic pigmentation in the freshwater isopod Asellus aquaticus. Journal of Evolutionary Biology 18: 713– 721 Hays J.D., Imbrie J. and Shackleton N.J. (1976): Variations in the Earth’s orbit: pacemaker of the ice ages. Science 194: 1121–1131 Heaney L.R., Walsh J.S.Jr. and Peterson A.T. (2005): The roles of geological history and colonization abilities in genetic differentiation between mammalian populations in the Philippine archipelago. Journal of Biogeography 32: 229–247 Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L. and deWaard J.R. (2003): Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society. Series B 270: 313–321 Hewitt G. M. (1996):Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and speciation. Biological Journal of the Linnean Society 58: 247–276 Hewitt G. M. (1999): Post-glacial re-colonization of European biota. Biological Journal of the Linnean Society 68: 87–112 Hewitt G.M. (2000): The genetic legacy of the Quaternary ice ages. Nature 405: 907–913 Hewitt G.M. (2001): Speciation, hybrid zones and phylogeography – or seeing genes in space and time. Molecular Ecology 10: 537–549 Hewitt G.M. (2003): Ice Ages: their impact on species distributions and evolution. In: Evolution of planet earth (Rothschild L.J. and Lister A.M. edit.) 339–361 Hewitt G.M. (2004): Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B 359: 183–195 Hewitt G.M. (2011): Quaternary phylogeography: the roots of hybrid zones. Genetica 139: 617–638 Hodges K.M., Rowell D.M. and Keogh J.S. (2007): Remarkably different phylogeographic structure in two closely related lizard species in a zone of sympatry in south-eastern Australia. Journal of Zoology 272: 64–72 Huntley B. and Webb T.III. (1989): Migration: species' response to climatic variations caused by changes in the earth's orbit. Journa of Biogeography 16: 5–19

- 77 -

Kelly L.C., Bilton D.T. and Rundle S.D. (2001): Population structure and dispersal in the Canary Island caddisfly Mesophylax aspersus (Trichoptera: Limnephilidae). Heredity 86: 370–377 Ketmaier V., Argano R. and Caccone A. (2003): Phylogeography and molecular rates of subterranean aquatic stenasellid isopods with a peri-Thyrrenian distribution. Molecular Ecology 12: 547–555 Kimura M. (1980): A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16: 111–120 Lellák J., Kořínek V., Fott J., Kořínková J. a Punčochář P. (1972): Biologie vodních živočichů. Univerzita Karlova – Praha pp. 220 Lisiecki L.E. and Raymo M.E. (2005): A Pliocene-Pleistocene stack of 57 globally distributed benthic δ18O records. Paleoceanography 20: PA1003 Ložek V. (1999): Ochranářské otázky ve světle vývoje přírody. Ochrana přírody 54: pp. 49 Marten A., Brändle M. and Brandl R. (2006): Habitat type predicts genetic population differentiation in freshwater invertebrates. Molecular Ecology 15: 2643–2651 Martin J.W. and Davis G.E. (2001): An Updated Classification of the Recent Crustacea. Los Angeles: Natural History Museum of Los Angeles County ISSN: 1-891276-27-1 pp. 132 Matasová K. (2011):Sezónní variabilita aktivity a promorenosti patogenem v populacích raka pruhovaného – Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta Univerzita Karlova v Praze pp. 54 Miller M.P., Blinn D.W. and Keim P. (2002): Correlations between observed dispersal capabilities and patterns of genetic differentiation in populations of four aquatic insect species from the Arizona White Mountains, USA. Freshwater Biology 47: 1660–1673 Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G. and Erlich H. (1986): Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 51: 263–273 Murphy P.M. and Learner M.A. (1982): The life history and production of Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda) in the River Ely, South Wales. Freshwater Biology 12: 435–444 Panov V.E., Krylov P.I. and Riccardi N. (2004): Role of diapause in dispersal and invasion success by aquatic invertebrates. Journal of Limnology 63: 56–69

- 78 -

Papadopoulou A., Bergsten J., Fujisawa T., Monaghan M.T., Barraclough T.G. and Vogler A.P. (2008): Speciation and DNA barcodes: testing the effects of dispersal on the formation of discrete sequence clusters. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B 363: 2987–2996 Papadopoulou A., Anastasiou I., Keskin B. and Vogler A.P. (2009): Comparative phylogeography of tenebrionid beetles in the Aegean archipelago: the effect of dispersal ability and habitat preference. Molecular Ecology 18: 2503–2517 Petit R.J., Aguinagalde I., Beaulieu Jacques-L., Bittkau C., Brewer S., Cheddadi R., Ennos R., Fineschi S., Grivet D., Lascoux M., Mohanty A., Müller-Starck G., Demesure-Musch B., Palmé A., Martín J.P., Rendell S. and Vendramin G.G. (2003): Glacial refugia: hotspots but not melting pots of genetic diversity. Science 300: 1563–1565 Polzin T. and Daneschmand S.V. (2003): On Steiner trees and minimum spanning trees in hypergraphs. Operations Research Letters 31: 12–20 Prentice I.C., Bartlcin P.J. and Webb T.III. (1991): Vegetation and climate change in eastern north America since the last glacial maximum. Ecology 72: 2038–2056 Prevorčnik S., Jugovic J. & Sket B. (2009): Geography of morphological differentiation in Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda: Asellidae) Journal of Zooogical Systematics and Evolutionary Research 47: 124 – 131 Protas M.E., Trontelj P. and Patel N.H. (2011): Genetic basis of eye and pigment loss in the cave crustacean, Asellus aquaticus. Proceedings of the National academy of sciences of the USA 108: 5702–5707 Provan J. and Bennett K.D. (2008): Phylogeographic insights into cryptic glacial refugia Trends Ecology & Evolution 23: 564–571 Raymo M.E. and Huybers P. (2008): Unlocking the mysteries of the ice ages. Nature 451: 284–285 Ribera I. and Vogler A.P. (2000): Habitat type as a determinant of species range sizes: the example of lotic-lentic differences in aquatic Coleoptera. Biological Journal of the Linnean Society 71: 33–52 Ribera I., Barraclough T.G. and Vogler A.P. (2001): The effect of habitat type on speciation rates and range movements in aquatic beetles: inferences from species-level phylogenies. Molecular Ecology 10: 721–735 Ribera I., Foster G.N. and Vogler A.P. (2003): Does habitat use explain large scale species richness patterns of aquatic beetles in Europe? Ecography 26: 145–152

- 79 -

Schmitt T. (2007): Molecular biogeography of Europe: Pleistocene cycles and postglacial trends. Frontiers in Zoology 4: 11 Short A.E.Z. and Caterino M.S. (2009): On the validity of habitat as a predictor of genetic structure in aquatic systems: a comparative study using California water beetles. Molecular Ecology 18: 403–414 Sket B. (1999): The nature of biodiversity in hypogean waters and how it is endangered. Biodiversity and Conservation 8: 1319–1338 Spahni R., Chappellaz J., Stocker T.F., Loulergue L., Hausammann G., Kawamura K., Flückiger J., Schwander J., Raynaud D., Masson-Delmotte V. and Jouzel J. (2005): Atmospheric methane and nitrous oxide of the Late Pleistocene from Antarctic ice cores. Science 310: 1317–1321 Stewart J.R. and Lister A.M. (2001): Cryptic northern refugia and the origins of the modern biota. TRENDS in Ecology & Evolution 16: 608–613 Stewart J.R., Lister A.M., Barnes I. and Dalén L. (2010): Refugia revisited: individualistic responses of species in space and time. Proceedings of the Royal Society. Series B 277: 661–671 Swenson N.G. and Howard D.J. (2005): Clustering of contact zones, hybrid zones, and phylogeographic breaks in North America. American Naturalist 166: 581–591 Taberlet P., Fumagalli L., Vust-Saucy Anne-G. and Cosson Jean-F. (1998): Comparative phylogeography and postglacial colonisation routes in Europe. Molecular Ecology 7: 27–36 Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M. and Kumar S. (2011): MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731–2739 Thiéry A. (1997): Horizontal distribution and abundance of cysts of several large branchiopods in temporary pool and ditch sediments. Hydrobiologia 359: 177–189 Townsend C.R., Begon M. and Harper J.L. (2008): Essentials of ecology. ISBN: 978-1-4051-5658-5 pp. 510 Trontelj P., Machino Y. and Sket B. (2005): Phylogenetic and phylogeographic relationships in the crayfish genus Austropotamobius inferred from mitochondrial COI gene sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution 34: 212–226 Turk S., Sket B. and Sarbu S. (1996): Comparison between some epigean and hypogean populations of Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda: Asellidae). Hydrobiologia 337: 161–170.

- 80 -

Verovnik R., Sket B., Prevorcnik S. and Trontelj P. (2003): Random amplified polymorphic DNA diversity among surface and subterranean populations of Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda). Genetica 119: 155–165. Verovnik R., Sket B. and Trontelj P. (2004): Phylogeography of subterranean and surface populations of water lice Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda). Molecular Ecology, 13: 1519 – 1532 Verovnik R., Sket B. and Trontelj P. (2005): The colonization of Europe by the freshwater crustacean Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda) proceeded from ancient refugia and was directed by habitat connectivity. Molecular Ecology 14: 4355 – 4369 Walker D. and Avise J.C. (1998): Principles of phylogeography as illustrated by freshwater and terrestrial turtles in the southeastern United States. Annual Review of Ecology and Systematics 29: 23–58 Webb T. and Bartlein P.J. (1992): Global changes during the last 3 million years: Climatic controls and biotic responses. Annual Review of Ecology and Systematics 23: 141–173 Williams D.D. and Williams N.E. (1993): The upstream/downstream movement paradox of lotic invertebrates: quantitative evidence from a Welsh mountain stream. Freshwater Biology 30: 199–218 Williams P., Whitfield M. and Biggs J. (2008): How can we make new ponds biodiverse? A case study monitoried over 7 years. Hydrobiologia 597: 137–148 Willis K.J., Rudner E. and Sümegi P. (2000): The full-glacial forests of central and southeastern Europe. Quaternary Research 53: 203–213 Wilson G.D.F. (2008): Global diversity of Isopod crustaceans (Crustacea: Isopoda) in freshwater. Hydrobiologia 595: 231–240 Zachos J.C., Pagani M., Sloan L., Thomas E. and Billups K. (2001): Trends, rhythms, and aberrations in global climate 65 Ma to present. Science 292: 686–693 Zachos J.C., Dickens G.R. and Zeebe R.E. (2008): An early Cenozoic perspective on greenhouse warming and carbon-cycle dynamics. Nature 451: 279–283

- 81 -

Přílohy

Tato haplotypoví síť ukazujerozmístění všech jednotlivých názvů haplotypů. Následující tabulka udává přehled všech odebíraných populací.

- 82 -

- 83 -

N49 31.030 E17 17.474

N49 30.580 E17 17.426 N49 21.402 E17 20.539 N49 42.330 E17 06.305

N49 42.204 E17 08.896

Království 00

Království 3

Království 5 Včelín 1 Litovel 1

Střeň 3

369

103

104 107 110

111

Horka 1

N49 30.645 E17 17.956

Lednice 2 Kančí obora 1 Filena 1 Filena 2

89 91 101 102

113

N48 48.649 E16 47.568 N48 46.772 E16 52.466 N49 15.816 E17 28.897 N49 16.006 E17 28.874

Lednice 1

88

Střeň 6

N48 56.694 E16 35.725 N48 54.588 E16 34.397

Plačkův les 1 Mošovský luh 2

84 87

112

Dyje

N48 56.901 E16 35.997

Plačkův les 2

83

N49 39.270 E17 11.640

N49 40.760 E17 09.703

N48 48.263 E16 47.308

Střední labe Dyje

Přerov n. Labem 4 N50 09.797 E14 49.713 Drnholec 2 N48 50.967 E16 29.057

326 82

Morava

Morava

Morava

Morava Morava Morava

Morava

Morava

Dyje Dyje Morava Morava

Dyje

Dyje Dyje

Střední Labe tůň Střední Labe tůň Střední Labe tůň

Černínovsko 1 N50 17.219 E14 30.359 Černínovsko 2 N50 17.138 E14 30.482 Přerov n. Labem 2 N50 10.077 E14 48.824

76 77 79

Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová

tůň tůň tůň tůň

2.4.2007 2.4.2007

tůň

2.4.2007

tůň tůň

1.4.2007 1.4.2007 2.4.2007

1.4.2007

Veronika Sacherová

Veronika Sacherová

Veronika Sacherová

Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová

Veronika Sacherová

21.4.2010 Antonín Střížek

tůň tůň tůň

tůň

tůň

29.3.2007 Veronika Sacherová

tůň 29.3.2007 29.3.2007 31.3.2007 31.3.2007

28.3.2007 Veronika Sacherová 28.3.2007 Veronika Sacherová

28.3.2007 Veronika Sacherová

2.10.2009 Jan Špaček 28.3.2007 Veronika Sacherová

23.3.2007 Veronika Sacherová 24.3.2007 Veronika Sacherová 24.3.2007 Veronika Sacherová

23.3.2007 Veronika Sacherová

tůň tůň

tůň

tůň tůň

Střední Labe tůň

N50 20.295 E14 29.209

Úpor 2

74

Kód Název lokality GPS Skupina Habitat Datum Odebral vzorku Kolesa 1 N50 04.941 E15 28.869 Střední Labe tůň 21.3.2007 Veronika Sacherová 71 72 Záboří n. Labem 3 N50 01.395 E15 20.142 Střední Labe tůň 21.3.2007 Veronika Sacherová 73 Záboří n. Labem 4 N50 01.487 E15 20.342 Střední Labe tůň 21.3.2007 Veronika Sacherová

Kód Haplotyp Haplotyp Haplotyp Izolátu COI 16S 12S 74 Cd 75 Ca 91 Cj 92 Ca 77 Ce 16Sd 78 B2a 16Sa 82 B2c 83 B2f 87 B2a 88 B2d 211 B2a 49 A1b 50 A1b 51 A1a 52 A1a 53 A1a 59 16Sb 60 A1b 16Sb 12Sb 61 A1a 62 A1a 63 A1a 67 A1a 99 A1p 101 A1a 102 A1a 265 A1a 266 Ia 273 A1a 104 Ia 106 Ia 111 A1a 117 A1f 118 A1f 119 16Sb 12Sa 120 A1f 16Sb 12Sa 121 A1a 122 A1a 123 A1a 124 A1a

- 84 -

N50 09.171 E16 03.844 N48 44.304 E16 53.012 N48 44.302 E16 53.314 N49 43.238 E18 07.175 N49 42.685 E18 06.097

N49 51.787 E16 55.229 N49 53.027 E16 55.443

N50 18.566 E14 35.289 N50 31.003 E14 08.794

N50 24.298 E14 06.772 N50 05.867 E15 09.783

N50 06.983 E15 10.167 N50 07.120 E15 10.361

Týniště 1 Břeclav 3 Břeclav 1 Studénka 4 Studénka 6

Zábřeh 5 Zábřeh 1

Liblice 1

Liblice 2 Terezín 1

Budyně 1 Libický luh 6

Libický luh 3 Libický luh 4

Mydlovary 2

127 205 206 223 224

231 233

253

254 255

256 263

259 260

262

Soutok 30

N50 07.493 E16 11.377

Častolovice 1

123

281

N49 39.197 E17 57.683

Suchdol 4

225

Lovčice 1

N49 45.788 E18 10.979 N49 39.046 E17 57.759

Polanská niva 2 Suchdol 5

221 116

264

N49 45.579 E18 10.850

Polanská niva 9

115

N48 42.440 E16 56.219

N50 10.141 E15 23.129

N50 10.092 E14 55.026

N50 18.568 E14 35.090

N49 45.815 E18 11.058

Polanská niva 8

N49 45.815 E18 11.058

GPS

220

Kód Název lokality vzorku 114 Polanská niva 8 Veronika Sacherová

Odebral

19.4.2008 Martin Krajíček 19.4.2008 Martin Krajíček 15.4.2009 Antonín Střížek 15.4.2009 Antonín Střížek 16.4.2009 Antonín Střížek 16.4.2009 Antonín Střížek 18.4.2009 Veronika Sacherová

tůň tůň tůň

Morava Morava Dolní Labe Dolní Labe tůň Ohře a Bílina tůň Ohře a Bílina tůň Střední Labe tůň

Dyje

21.4.2009 Veronika Sacherová 24.4.2009 Antonín Střížek

tůň tůň

18.4.2009 Veronika Sacherová

Střední Labe tůň Horní Labe

18.4.2009 Markéta Pešková 18.4.2009 Markéta Pešková

Střední Labe tůň Střední Labe tůň

Veronika Sacherová Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek

13.4.2007 15.4.2008 15.4.2008 18.4.2008 18.4.2008

tůň tůň tůň tůň tůň

Horní Labe Dyje Dyje Odra Odra

13.4.2007 Veronika Sacherová

tůň

18.4.2008 Antonín Střížek

tůň

Veronika Sacherová

18.4.2008 Antonín Střížek 3.4.2007 Veronika Sacherová

3.4.2007

18.4.2008 Antonín Střížek

3.4.2007

Datum

tůň tůň

tůň

tůň

tůň

Habitat

Horní Labe

Odra

Odra Odra

Odra

Odra

Odra

Skupina

Kód Haplotyp Haplotyp Haplotyp Izolátu COI 16S 12S 125 A1d 16Sc 12Sc 126 A1d 16Sc 12Sc 271 A1c 272 A1c 127 A1c 128 A1d 197 A1c 129 A1h 130 A1e 141 A1g 142 A1b 133 Ca 134 Ca 136 Cl 175 A1q 178 A1a 199 A1c 139 A1i 140 A1c 144 A1a 145 A1a 146 A1a 1 B2a 2 Ca 3 B2a 5 B1b 6 B1b 7 Cm 17 Ca 18 Ca 12 Cf 13 Cf 14 Ca 15 Ci 16 B1a 19 Cb 20 Cb 31 A1a 32 A1a

- 85 -

Horní Vltava Horní Vltava Horní Vltava Horní Vltava Horní Vltava Horní Vltava

N49 29.721 E15 56.613

N48 51.179 E14 54.687

N49 46.551 E15 01.717

N50 29.441 E14 36.129 N49 04.002 E18 00.946

N49 04.724 E15 27.189

N49 24.661 E16 37.651

N49 22.635 E16 00.964

N49 19.924 E16 26.414

N49 04.858 E15 23.960

Tvrdonice 4

Tvrdonice 5 Morava 2 Morava 1

Bohdalovsky 1

Halámky 1

Halámky 2 N48 51.091 E14 54.528 Borkovická blata 1 N49 13.773 E14 37.668 Tušť 1 N48 53.228 E14 53.599

N48 53.675 E14 53.126 N49 04.807 E14 45.341

Tvrdonice 9 Tvrdonice 11

Tušť 2 Lužnice

Sázava 2

Kokořínsko 9 Vlára 1

Vápovka 1

Býkovka 1

Oslava 1

Lubě 1

Volfířovský 1

292 294

285

286 290 291

297

301

302 303 304

305 306

308

309 312

313

314

318

319

321

N48 43.517 E16 59.513 N48 47.914 E17 04.909 N48 47.147 E17 05.292

N48 43.400 E16 59.381

N48 46.141 E17 03.066 N48 44.113 E17 01.248

N48 39.982 E16 57.676

Soutok 3

97

25.4.2009 Antonín Střížek 25.4.2009 Antonín Střížek 25.4.2009 Antonín Střížek 25.4.2009 Antonín Střížek

tůň tůň tůň tok

Dyje

Dyje

Dyje

Dyje

tok

tok

tok

tok

tok

tůň tok

Dolní Labe Váh Dyje

tok

tůň tok

tůň tůň tůň

tůň

Markéta Pešková

6.10.2009 Petr Komzák

9.10.2009 Petr Komzák

21.9.2009 Petr Komzák

8.10.2009 Petr Komzák

6.10.2009 Petr Komzák

Petr J. Juračka 24.9.2009 Petr Komzák

Eva Kozubíková

1.6.2009 Markéta Pešková 30.5.2009 Markéta Pešková

1.6.2009 Markéta Pešková 31.5.2009 Markéta Pešková 1.6.2009 Markéta Pešková

1.6.2009

14.8.2009 Eva Kozubíková

25.4.2009 Antonín Střížek 25.4.2009 Antonín Střížek

tůň tok

tok

30.3.2007 Veronika Sacherová

tůň

Odebral

24.4.2009 Antonín Střížek

Datum

tůň

Habitat

Dolní Vltava

Dyje

Dyje Morava Morava

Dyje

Dyje Dyje

Dyje

Dyje

Skupina

N48 41.914 E16 56.733

GPS

Kód Název lokality vzorku 282 Soutok 31

Kód Haplotyp Haplotyp Haplotyp Izolátu COI 16S 12S 33 A1a 34 A1a 93 A1a 94 A1n 44 A1a 45 A1a 46 A1o 35 A1o 36 A1o 37 Da 40 A1j 41 A1a 42 A1a 269 Co 270 Ea 147 Ch 16Sd 12Sd 148 12Sd 150 Ch 152 Ic 153 Ch 154 Fa 156 Id 157 Ie 158 A1r 227 Ca 228 Cc 230 B3b 231 A1a 232 A2a 233 A3a 234 A3a 235 A1m 236 A1a 237 A1b 238 A1m 201 A1a 202 A1a 203 Ca 204 Ca

- 86 -

N49 24.331 E17 00.994

N49 59.560 E15 38.430

N50 09.414 E14 40.257 N49 57.376 E15 27.535 N49 48.684 E16 29.257

N50 14.124 E15 30.742 N50 32.506 E13 38.783

N49 53.178 E16 15.537 N50 16.298 E14 09.586 N49 48.902 E16 56.273

N49 34.193 E15 56.274

N50 03.000 E12 58.854

N50 04.740 E13 11.571 N49 39.456 E13 15.307 N49 34.442 E13 20.698 N49 36.062 E13 52.327

Brodečka 1

Jeníkovický 1

Svémyslický 1 Strakočský 1 Mikulečský 1

Kralický 1 Most 1

Loučná 1 Bakovský 1 Háj 1

Staviště 1

Toužim 1

Vladař 1 Radbůza 1 Úhlava 1 Rožmitál 1

327

328 329 330

332 336

341 347 385

403

406

407 408 409 411

N49 08.012 E15 27.388

GPS

324

Kód Název lokality vzorku 322 Myslůvka 1 tok

tok

Habitat

Odebral

Berounka Berounka Berounka Horní Vltava

Berounka tůň tok tok tok

tůň

tok

26.4.2011 1.5.2011 1.5.2011 1.5.2011

Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek

26.4.2011 Antonín Střížek

22.7.2010 Eva Kozubíková

3.9.2009 Jan Špaček 2.10.2008 Markéta Pešková 25.4.2010 Antonín Střížek

Střední Labe tok Dolní Vltava tok Morava tůň Dolní Vltava

1.10.2009 Jan Špaček 11.11.2009 Jan Špaček

2.10.2009 Jan Špaček 8.10.2009 Jan Špaček 10.9.2009 Jan Špaček

8.10.2009 Jan Špaček

9.10.2009 Petr Komzák

6.10.2009 Petr Komzák

Datum

Horní Labe tok Ohře a Bílina tok

Střední Labe tok Střední Labe tok Horní Labe tok

Střední Labe tok

Morava

Dyje

Skupina

Kód Haplotyp Haplotyp Haplotyp Izolátu COI 16S 12S 205 A3b 206 A3c 207 A1a 208 A1a 213 Cg 214 Ch 215 B2e 218 B2b 219 A1l 220 A1a 224 Cb 239 Ca 240 B2a 242 A1a 243 Cn 267 A1k 268 A1a 263 A1b 264 Ca 251 Cm 252 Ck 254 Cm 256 Ib 257 Ia 261 B3a