Klonális szelekció a follikuláris lymphomák csontvelői terjedése során Doktori értekezés
Dr. Bognár Ágnes Semmelweis Egyetem Patológiai Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Szepesi Ágota egyetemi adjunktus, PhD Hivatalos bírálók: Dr. Masszi Tamás főorvos, PhD Dr. Tarkovács Gábor egyetemi docens, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Lakatos Péter egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kovács Gábor egyetemi docens, PhD Dr. László Terézia egyetemi adjunktus, PhD
Budapest 2006.
TARTALOMJEGYZÉK 1. 2. 3.
ÖSSZEFOGLALÁS .................................................................................... 3 ABSTRACT ................................................................................................ 4 IRODALMI ÁTTEKINTÉS........................................................................... 5 3.1 Bevezetés ............................................................................................ 5 3.2 A follikuláris lymphoma pathológiai jellemzői ....................................... 7 3.2.1 A follikuláris lymphoma szövettani jellemzői ................................. 7 3.2.2 A follikuláris lymphoma immunhisztológiai jellemzői ..................... 9 3.2.3 A follikuláris lymphoma pathogenetikaiai jellemzői ..................... 10 3.2.4 A follikuláris lymphoma csontvelői manifesztációja..................... 14 4. CÉLKITŰZÉSEK ...................................................................................... 16 5. ANYAG ÉS MÓDSZER ............................................................................ 17 5.1 Beteganyag........................................................................................ 17 5.2 Immunhisztokémiai értékelés ............................................................. 17 5.3 Molekuláris vizsgálatok ...................................................................... 17 5.3.1 DNS izolálás ............................................................................... 18 5.3.2 Az IgH gén PCR amplifikációja ( Biopsziás mintapárok klonalitásának igazolása) .......................................................................... 18 5.3.3 Az IgH gének klónozása ............................................................. 20 5.3.4 Klónszelekció .............................................................................. 22 5.3.5 Az IgH klónok szekvenálása ....................................................... 23 5.3.6 Az IgVH gének szekvencia és filogenetikai analízise.................. 24 6. EREDMÉNYEK ........................................................................................ 26 6.1 A nyirokcsomói és csontvelői minták morfológiai összehasonlítása .. 26 6.2 Immunfenotípus vizsgálat .................................................................. 29 6.3 Az IgVH gének szekvencia analízise ................................................. 33 6.3.1 Szomatikus mutációk vizsgálata ................................................. 34 6.4 A filogenetikai fák vizsgálata .............................................................. 35 7. MEGBESZÉLÉS....................................................................................... 39 8. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..................................................................... 44 9. IRODALOMJEGYZÉK.............................................................................. 46 10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE....................................................... 53 11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...................................................................... 54
–2–
1.
ÖSSZEFOGLALÁS
A follikuláris lymphoma egy relatíve indolens B-sejtes non-Hodgkin lymphoma, melynek klinikai lefolyása során az esetek 50-80 százalékában csontvelői érintettség is kialakul. A follikuláris lymphoma tumorsejtjeire intraklonális divergencia jellemző, vagyis a daganat heterogén, az ősi tumorklónból mutációk révén további szubklónok fejlődnek ki. Tanulmányunkban célul tűztük ki, hogy a follikuláris lymphoma csontvelői manifesztációja során megvizsgáljuk, milyen mechanizmussal jön létre a csontvelői
érintettség,
Vizsgálataink
során
és
mely
21
tumorklónok
follikuláris
infiltrálják
lymphomával
a
csontvelőt.
diagnosztizált
beteg
nyirokcsomói és csontvelői mintáinak morfológiai és immunhisztokémiai (bcl-2, CD10, Ki67, p53) összehasonlító elemzését végeztük el. A tumorklónok azonosítására és követésére az immunglobulin nehézlánc gén variábilis régiójának (IgVH) szomatikus mutációs mintázatát használtuk; 3 kiemelt esetben az IgVH gén PCR amplifikációját, klónozását, szekvenálását, majd a kapott szekvenciák alapján a tumorklónok származási analízisét hajtottuk végre. Eredményeink szerint a csontvelői és nyirokcsomói minták szövettani differenciáltsági foka, immunfenotípusa, és az IgVH gén mutációs mintázata az esetek nagy részében eltérő, ami arra utal, hogy a klonális szelekció fontos szerepet játszik a tumor csontvelői terjedése során. A származási fák struktúrája alapján megállapítottuk, hogy a nyirokcsomót és a csontvelőt különböző tumor-szubklónok népesítik be, és a csontvelő infiltráció a follikuláris lymphoma klonális fejlődésének különböző pontjain jöhet létre. A csontvelői érintettség kialakításában heterogén tumorsejt populáció vesz részt; egyfelől egy
korai
nyirokcsomói
származású,
nyirokcsomó-független
származású
szubklónok
által
csoport,
másrészt
létrehozott
egy
populáció.
Eredményeink továbbá arra utalnak, hogy a csontvelő a nyirokcsomói csíracentrumokhoz hasonló mikrokörnyezetet biztosít, ahol a tumorsejtek képesek megőrizni biológiai sajátosságaikat.
–3–
2.
ABSTRACT
Clonal selection in the bone marrow involvement of follicular lymphoma To characterize the pathways of bone marrow involvement of follicular lymphoma, we performed morphological and immunophenotypical analysis of tumor cells from lymph nodes and corresponding bone marrows in 21 patients with FL. In three cases, genealogical trees were constructed based on the immunoglobulin heavy chain gene variable region (IgVH) sequences of tumor clones from lymph nodes and bone marrows. Results showed that follicular lymphomas within the bone marrows display identical or lower cytological grades than in the lymph nodes. In the majority of cases, different proportion of tumor cells expressed bcl-2, CD10 and Ki67 in lymph nodes and bone marrows. Tumor cells in the bone marrow showed ongoing somatic hypermutation of the IgVH genes; the distribution of these mutations was highly consistent with antigen selection. The topology of the genealogical trees revealed that different subclones populate the lymph nodes and bone marrow, and bone marrow infiltration may occur at different points of the clonal evolution of follicular lymphoma. Early descendants of the original tumor clone and derivatives of diversified tumor clones may invade the bone marrow. These results suggest that the bone marrow involvement of follicular lymphoma is associated with intensive clonal selection of tumor cells, and the bone marrow provides a microenvironment similar to the germinal centers of lymph nodes, where tumor cells retain their biological nature.
–4–
3.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
3.1 Bevezetés A follikuláris lymphoma (FL) a nyugat-európai országokban és az Egyesült Államokban a leggyakrabban előforduló felnőttkori lymphoma, mely a non-Hodgkin lymphomák 35-40 százalékát, az alacsony malignitású (low-grade) B-sejtes lymphomák 75-80 százalékát teszi ki. 1,2,3,4 Előfordulási frekvenciája 4 eset / 100.000 személy évente.5 A diagnózistól való átlagos túlélési idő 8-10 év. 1,2,3,4
Megjelenése elsősorban a felnőttkorban jellemző, 59 éves átlagéletkorral,
és nőkben majdnem kétszer olyan gyakori, mint férfiakban. 20 éves kor alatt előfordulása nagyon ritka; a gyermekkori betegek elsősorban fiúk, gyakran alacsony stádiumú fej-nyaki érintettséggel. 6 A betegek többségének a diagnózis idején a fájdalmatlan nyirokcsomó megnagyobbodástól eltekintve nincs más tünete, ugyanakkor betegségük közel 80 százalékban már előrehaladott klinikai stádiumba (Ann Arbour stage III-IV.) tartozik, s csak jóval kisebb hányaduk van I. vagy II. stádiumban a diagnózis felállításakor.6,7
A
betegség
érintheti
a
perifériás,
mediasztinális
és
retroperitoneális nyirokcsomókat, továbbá a lépet (az esetek 40 százalékában) és a májat (az esetek 50 százalékában); a csontvelő érintettség az esetek 6080 százalékában igazolható. Más szervek érintettsége is előfordul, de többnyire csak disszeminált nodális érintettség mellett. Nagyon ritka az extranodális-, extramedulláris megjelenés, B tünetek és emelkedett laktát dehidrogenáz szintek az esetek csupán 20 százalékában fordulnak elő. A FL szövettani osztályozása (grading) szoros összefüggést mutat a betegség klinikai prognózisával.8,9 A FL-ák közel 90 százaléka grade I. és grade II. csoportokba sorolható, melyeknek klinikai lefolyása indolens, a grade III. FL azonban többnyire agresszív viselkedésű megbetegedés.6
A FL-ák mintegy 30-50
százalékában a betegség agresszív klinikai viselkedésű diffúz nagy B-sejtes lymphomába, vagy ritkábban akut leukémiába transzformálódik. A betegség indolens lefolyása ellenére kezelése nem teljesen megoldott, mely részben annak köszönhető, hogy klinikai megjelenésekor az esetek nagy
–5–
részében már kiterjedt folyamatról van szó,20 mely leggyakrabban a csontvelőt érinti. Az irodalmi adatok alapján a tumorsejtek migrálnak a nyirokcsomók egyes follikulusai, a follikulusok és interfollikuláris terek között, illetve az egyes nyirokcsomók között. A szomszédos CG-okra való terjedéskor és a távoli nyirokcsomók infiltrációjakor a FL növekedési mintázata, immunfenotípusa, és az eredeti tumorklón hipermutációs aktivitása megtartott.10,17,18 Kevésbé ismertek azonban annak részletei, hogy a tumor csontvelői érintettsége milyen mechanizmussal alakul ki.
–6–
3.2 A follikuláris lymphoma pathológiai jellemzői 3.2.1
A follikuláris lymphoma szövettani jellemzői
A FL a nyirokcsomó centrum germinativumát (CG) kitöltő és abban nodulusokat formáló B-sejtes tumor.1,5,6 Az esetek túlnyomó részére a follikuláris morfológiai mintázat jellemző, mely a másodlagos nyirokszervek reaktív csíracentrumainak szerkezetéhez hasonlít (1.A ábra). A neoplasztikus follikulusok sokszor nem jól körülírtak, és hiányozhat a köpenysejtes zóna. A follikulusok gyakran szorosan egymás mellett helyezkednek el, ami miatt a noduláris szerkezet elmosódottá válhat, és sem a polarizáció, sem a jellegzetes „csillagos égbolt” mintázat nem figyelhető meg. Diffúz területek fordulhatnak elő, gyakran sclerosissal kísérten. A szövettani mintázat a follikuláris területek arányának megfelelően lehet follikuláris (> 75% follikuláris), follikuláris és diffúz (25-75% follikuláris), vagy diffúz (< 25% follikuláris).6 Az interfollikuláris érintettség is gyakori, és az interfollikuláris területeken megjelenő tumorsejtek általában kisebbek, mint a follikulusokban elhelyezkedők és a sejtmagok kevésbé változatos morfológiát mutatnak. A tumor citológiai felépítését tekintve a fiziológiás CG-k szövettani összetételéhez hasonló, ennek megfelelően a normál és reaktív T-sejtek, follikuláris dendritikus sejtek (FDC) és a kevés makrofág mellett a két domináns, tumorsejt-típus −centrociták és centroblastok− keveréke alkotja. 6,22,23
A centrociták kis-közepes méretű, hosszúkás, hasadt, szabálytalan
sejtmaggal, indentált nukleolusszal rendelkező, világos citoplazmájú sejtek. A nagyobb méretű centroblastok nagy, kerek vagy ovális sejtmaggal, keskeny bazofil citoplazmával, valamint vakuolizált kromatinnal és 1-3 prominens perifériás nukleolusszal rendelkeznek (1.B ábra). 1,5,6,24,25
–7–
A
B
1. ábra: A FL szövettani mintázata és jellemző sejtjei A: A FL a csíracentrumból kiinduló, noduláris szerkezetű tumor. B: Citológiailag kis heterokromatinizált, indentált maggal rendelkező centrociták és nagy, bazofil citoplazmával, laza kromatinnal és prominens nukleoluszokkal rendelkező centroblastok alkotják a tumort.
A tumorsejtek ezen két formája eltérő arányban építheti fel a tumormasszát különböző betegekben, sőt akár ugyanazon beteg különböző helyen lokalizált tumoraiban is.
A nagy nagyítású (40x) látóterenként megfigyelhető
centroblastok száma alapján a WHO szövettani osztályozása három csoportba sorolja a FL-kat: 1,5 •
grade I. (korábban follikuláris kissejtes lymphoma)
•
grade II. (korábban follikuláris kevert sejtes lymphoma) 6 – 15 centroblast
•
grade III. (korában follikuláris nagysejtes lymphoma)
<5
> 15
centroblast
centroblast
A szövettani grade és a betegség klinikai prognózisa a FL esetén szoros összefüggést mutat. A WHO klasszifikáció alapján a betegek körülbelül 90 százaléka a grade I. és II. stádiumba sorolható, míg körülbelül 10 százalékuk a grade III. stádiumba tartozik. A grade I-II. klinikai lefolyása indolens, és kedvezőbb, mint a grade III.-nak, mely gyakran agresszívvé válik. 6 A betegség lefolyása és progressziója során az alacsonyabb grade-be sorolt esetek magasabb grade-be alakulhatnak át. A FL az esetek 25-35 százalékában magas
malignitású
diffúz
nagy –8–
B-sejtes
lymphomába
(DLBL)
transzformálódhat,24,25 ilyenkor a tumorszövet elveszti follikuláris növekedési mintázatát és a tumort kizárólag centroblastok vagy immunoblastok alkotják. A szövettani transzformáció a klinikai kép progressziójával és a túlélési idő jelentős csökkenésével jár.4,26
3.2.2
A follikuláris lymphoma immunhisztológiai jellemzői
A többi lymphomához hasonlóan a FL fenotípusa is tükrözi azon normál lymphoid sejt fenotípusát, amelyből származik; sejtfelszíni Ig-t expresszál, általában IgM-t, de ritkábban IgD, IgG és IgA is jelen lehet. Expresszálódnak a B-sejt asszociált antigének (CD19+, CD20+, CD22+ és CD79a+), a tumorok többsége CD10 pozitív, és a CD10 expresszió gyakran erősebb a follikulusokban, mint az interfollikulárisan elhelyezkedő tumorsejtekben. A sejtek CD5 és CD43 negatívak, CD43 pozitivitás csak a grade III. FL ritka eseteiben fordul elő. A tumorsejtek expresszálják a BCL-6 nukleáris fehérjét is.1,5 A follikuláris területeken CD21, CD23 pozitív FDC-k sűrű hálózatai figyelhetőek meg.13,14,27,28 Differenciál diagnosztikai szempontból különös problémát jelent a follikuláris hiperpláziától való elkülönítésük, melyben azonban a FDC-k detektálása segítséget nyújthat.12,14 Az esetek többségében expresszálódik a BCL-2 fehérje, ami hasznos segítséget nyújt a neoplasztikus és reaktív follikulusok elkülönítésében, mivel a normál CG-k mindig BCL-2 negatívak.12,14 Az LFA-1 (CD11a/CD18) a kezdeti diagnózis idején gyakrabban van jelen (az esetek 60-90 %-ában), mint relapszuskor.29,30,31 Más adhéziós molekulák, mint a CD44, az intercelluláris adhéziós molekula-1 (CD54), az L-selectin (CD62L), és az LFA-3 (CD58) a vizsgált esetek felében figyelhető meg.22,29,32,33 Irodalmi adatok alapján a FL proliferációs rátája Ki-67 jelöléssel alacsony, körülbelül 3%, s a proliferáció elsősorban a nagy sejtekre jellemző. 1,5
–9–
3.2.3
A follikuláris lymphoma pathogenetikaiai jellemzői
A FL-k legjellemzőbb pathogenetikai vonása a t(14;18)(q32;q21) transzlokáció, mely az esetek mintegy 85-95 százalékában mutatható ki.10,11,18,34,35 A transzlokáció során során a 18-as kromoszómán elhelyezkedő BCL-2 gén egy része a 14-es kromoszómán található Ig nehézlánc génhez kapcsolódik
(2.
A
ábra).
kapcsolódás
következtében
a
BCL-2
gén
expressziójának regulációja az Ig gének “enhancer” régiójának irányítása alá kerül, ami a bcl-2 fehérje fokozott expressziójához vezet. A transzlokációt hordozó sejtekben az emelkedett bcl-2 szint gátolja az apoptózist, és ez a tumorsejtek
életidejének
kialakulásában.
meghosszabbításával
18 (q21) bcl-2 onkogén
5’
exon 1
exon 2
5’
szerepet
játszik
az
FL
12,18,35,36,37
exon 1
MBR
3’
exon 3
exon 2
14 (q32) IgH gén
mcr
5’
exon 3
JH
JH
JH2
Cμ
JHn
Cμ
3’
3’
t(14;18)(q32;q21) bcl-2/JH génfúzió
2. ábra: A BCL-2/JH génfúzió kialakulásának sematikus ábrázolása A transzlokáció során a 18. kromoszómán elhelyezkedő BCL-2 onkogén egyesül a 14. kromoszóma IgH gén JH- vagy C-génszegmentjével. A kapcsolódás következtében a BCL-2 onkogén regulációja az IgH gén enhancer régiója alá kerül, ami az antiapoptotikus bcl-2 protein fokozott expressziójához vezet.
A t(14;18) transzlokációt hordozó sejtek egészséges, nem tumoros egyénekben is előfordulhatnak.1 Ez a tény, valamint az, hogy a FL-k egy része nem képes bcl-2 onkoproteint, sőt mRNS-t sem expresszálni,38 valamint a FLban előforduló másodlagos genetikai léziók jelenléte arra utal, hogy a BCL-2 – 10 –
onkogén transzlokációja esetlegesen nem elégséges feltétele a CG B-sejtjeinek malignus sejtekké válásához illetve a malignus állapot fenntartásához.10,36.39,40 A bcl-2 onkoprotein túlexpressziója azonban képes kivédeni a negatív szelekciót és az apoptózist −amely fiziológiásan a nyirokcsomók CG-aiban végbemegy−, így az egyébként halálra ítélt sejtek élettartamát képes megnövelni, ami ezen genetikailag instabil sejtekben másodlagos genetikai léziók felhalmozódását teszi lehetővé. A FL-ban szenvedő betegek 90 százalékában a t(14;18) transzlokáción kívül további citogenetikai eltérések mutathatók ki. A FL tumorigenezise során kialakuló genetikai léziók sokfélék lehetnek, a t(14;18) transzlokációval koexpresszált citogenetikai eltérések különböző mechanizmusokat feltételeznek.43 Az X, a 3., 5., 7., 8., 9., 12., 17., 18., 20. és 21. kromoszómák triszómiája, a 6q23-t és 6q25-27-t érintő deléciók, valamint az Xp22, 1p21-22, 1p36, 3q21-27, 7q32 és 10q23-35 kromoszómák különböző citogenetikai léziói fordulnak elő.39,40,41,42,43 A több mint hat kromoszóma eltérést hordozó esetekben, vagy azokban, amelyekben a 6q23-26 és 17p deléció fordul elő, a klinikai prognózis előnytelen, a diffúz nagy B sejtes lymphomába történő transzformáció gyakori.43 A FL-k körülbelül 25-30 százaléka diffúz nagy B-sejtes lymphomába progrediál a tumorfejlődés során. A szövettani képben kialakuló változások a klinikai
viselkedés
akcelerációjával
és
addicionális
genetikai
léziók
megjelenésével járnak; a folyamat során a p53 tumorszuppresszor gén és a cmyc onkogén gyakran érintettek.38,42,44 Mutációik valószínűleg függetlenek egymástól, de mégsem található olyan szövettanilag transzformált eset, amelyikben ne volna mindkét eltérés detektálható.38 A nyirokcsomói csíracentrum a fiziológiás B-sejt érés, az antigén-antitest találkozás és az antigénszelekció színhelye (3. ábra).
– 11 –
NYIROKCSOMÓ centrum germinativum
CSONTVELŐ
PERIFÉRIA keringő B-sejtek
FL
memória B-sejt
lymphoblast
centrocita B1 centroblast
FDC
sötét zóna plazmasejt
világos zóna
FDC
marginális zóna
“virgin” B-sejt
“ongoing” mutáció
antigén szelekció
elkötelezett B-sejt
3. ábra: A B-sejt differenciálódás folyamatának sematikus ábrázolása. Az Ig gének rekombinációja a B-sejt differenciálódás legkorábbi stádiumában, a csontvelőben zajlik. A B-sejtek további érésük során a nyirokcsomó csíracentrumaiba vándorolnak (centroblasttá, centrocitává alakulnak), majd ebből a heterogén sejtpopulációból antigén szelekció hatására memóriasejtek vagy plazmasejtek alakulnak ki. A follikuláris lymphoma az antigén-szelektált, IgH génjeikben szomatikus mutációkat hordozó centroblastok és centrociták daganatos megbetegedése.
Az ellenanyagok affinitásérése során a follikulusok B-sejtjei számos genetikai változáson esnek át: végbemegy az immunglobulin nehézlánc gének véletlenszerű átrendeződése, és szomatikus mutációk jönnek létre (4. ábra). Mivel az IgH génátrendeződés a B-sejt érés korai stádiumában megtörténik, a B-sejt differenciáció egyes lépései az IgH gén szerveződése alapján jól nyomon követhetőek. Az antigénnel még nem találkozott csontvelői B-sejtek („virgin” Bsejtek) átrendeződött IgH génjében szomatikus mutáció nem zajlik, így az expresszált VH gén szekvenciája megegyezik a csíravonalbeli gén VH szekvenciájával.5
A
B-sejtek
további
érésük
során
a
nyirokcsomó
csíracentrumába vándorolnak, ahol antigén hatására az átrendeződött IgH génben random módon szomatikus mutációk zajlanak.
18,45,45,46
Az érés ezen
stádiumában folyamatos jellegű, „ongoing” szomatikus mutáció zajlik, melynek következtében intraklonális divergencia alakul ki, vagyis a B-sejt populáció
– 12 –
heterogénné válik.18,19,45 Ezen heterogén sejtpopulációból az antigén szelekció hatására memóriasejtek vagy plazmasejtek alakulnak ki.46,48,48 Az antigénszelektált sejtekre jellemző, hogy a szomatikus mutációk elsősorban az antigén kötődéséért felelős régiókat (complementary determining region - CDR) érintik.45,50,50 A FL tumorsejtjeinek folyamatos mutációs aktivitása, az „ongoing” mutáció a CG follikuláris B-sejtjeinek jellemzője.4,15,16,18 VH
JH
D
5'
C
5’
3'
3' Leader
FR1
CDR1
FR2
CDR2
szomatikus
FR3
FR4
CDR3
hipermutáció
5'
3'
5'
3'
5'
3' CDR1
CDR2
intraklonális divergencia 4. ábra: A B-sejt érés során kialakuló genetikai változások sematikus ábrázolása Az IgH génátrendeződés a B-sejtek érésének korai stádiumában, a csontvelőben zajlik. A további differenciáció során, a CG-ban antigén hatásra „ongoing” szomatikus mutáció zajlik, mely intraklonális divergenciát, vagyis heterogén B-sejt populációt eredményez. Az antigénszelektált sejtekre jellemző, hogy a szomatikus mutációk elsősorban az antigén kötődéséért felelős régiókat (CDR) érintik.
A CG-ok neoplasztikussá vált B-sejtjeinek folyamatos mutációs aktivitása a sejtek genetikailag instabil állapotát eredményezi, melynek következtében a FL sejtek időről-időre megváltoznak, és az immunglobulin gének „ongoing” mutációival párhuzamosan a felszínükön expresszált immunglobulin szerkezete
– 13 –
is megváltozhat.
Addicionális genetikai léziók akkumulálódhatnak, amelyek
befolyásolhatják a tumorsejtek növekedési képességét, a tumor hisztológiai és klinikai természetét, valamint kezelésre adott válaszát is.4,24,25,26,52
3.2.4
A follikuláris lymphoma csontvelői manifesztációja
A FL-knál a diagnózis felállításakor az esetek körülbelül 40 százalékában azonosítható csontvelői érintettség, amely a betegség progressziójával akár a 80 százalékot is elérheti. A korai csontvelői érintettség jellemzően noduláris mintázatú, elsősorban a csont peritrabekuláris régióira terjed ki (5.A ábra). A csontvelői infiltrátumok domináló sejtei a centrociták (5.B ábra). A betegség progressziójával a csontvelői infiltráció az intertrabekuláris tereket is beszűrheti (6.A ábra), ritka előrehaladott esetekben diffúz infiltrációs mintázat figyelhető meg (6.B ábra). A csontvelői érintettség megítélése sok esetben nehézséget okoz, legcélravezetőbb módja a csontvelő aspirációs és biopsziás mintájának együttes
morfológiai,
áramláscitometriai
és
molekuláris
vizsgálata.
Az
infiltrátumok peritrabekuláris kötöttsége miatt sokszor nagyon alacsony a tumorsejtek száma a csontvelői aspirációs mintában, és ezért citológiai vizsgálattal
és
áramláscitometriai
mérésekkel
nem
azonosíthatóak.
A
csontbiopsziás mintáknál álnegatív eredményt okozhat, hogy a biopsziás eszköz elkerüli a nodularis infiltrátumokat.43 A csontvelői infiltrátumok is a FL-ra jellemző antigénexpressziós profilt mutatják: CD20, CD10, bcl-2, bcl-6 pozítívak, ami differenciál-diagnosztikai elkülönítésükben is fontos szerepet játszik.13,14,21 A csontvelőt érintő −akár minimális− infiltráció kimutatásában és azonosításában segítséget nyújt a csontbiopsziás mintán elvégzett CD20 immunhisztokémiai reakció. (6.A,B ábra). A csontvelő lymphomás érintettségének igazolásához a CD19, CD10 koexpressziót és a lymphoid sejtek könnyűlánc-restrikcióját vagy klonális Ig génátrendeződést is igazolni kell.43
– 14 –
A
B
5. ábra: A FL csontvelői manifesztációja A: A korai csontvelői infiltráció noduláris, jellemzően a peritrabekuláris területeket érinti. B: A csontvelői infiltrátumokat elsősorban centrociták alkotják.
C
D
6. ábra: A FL csontvelői CD20 immunhisztokémiai reakcióval A : A csontvelői érintettség a betegség progressziójával az intertrabekuláris terekre is kiterjedhet. B: Ritka előrehaladott esetekben a csontvelői infiltráció diffúz megjelenésű.
– 15 –
4.
CÉLKITŰZÉSEK
Mivel a FL csontvelői érintettségének kialakulási mechanizmusának részleteire
vonatkozóan
kevés
ismeret
áll
rendelkezésre,
ezért
tanulmányunkban a következők meghatározását tűztük ki célul: •
Ugyanaz-e
a
tumorsejtek
jellegzetessége
(morfológia,
fenotípus,
genotípus) a csontvelőben, mint a nyirokcsomóban? •
Mely tumorklónok infiltrálják a csontvelőt a FL csontvelői terjedése kapcsán?
•
Igazolható-e klonális szelekció a csontvelői infiltráció során?
•
Folyamatos-e a nyirokcsomói klónok csontvelőbe terjedése?
•
A nyirokcsomói tumorklón fejlődésének melyik fázisában terjed a csontvelőbe?
Vizsgálataink során a kapott eredmények alapján a további kérdések merültek fel: •
Történik-e migráció a nyirokcsomó és csontvelő között?
•
Szükséges-e a nyirokcsomói érintettség a csontvelői manifesztáció létrejöttéhez?
– 16 –
5.
ANYAG ÉS MÓDSZER
5.1 Beteganyag Vizsgálatainkhoz huszonegy kezeletlen beteg nyirokcsomói és csontvelői biopsziás, valamint
csontvelő aspirátum mintáit használtuk, akiknél a
Semmelweis Egyetem I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetében illetve
az
Országos
Onkológia
Intézetben
FL-t
diagnosztizáltak.
A
mintaválasztás a molekuláris vizsgálatokra alkalmas frissen fagyasztott biopsziás minták megléte alapján történt. A nyirokcsomói és csontvelői mintavétel minden esetben a diagnosztikus és staging eljárások részét képezte. A diagnózis minden esetben hisztopatológiai, immunfenotípus és molekuláris biológiai
vizsgálatokon
alapult,
a
WHO
lymphoma
klasszifikációjának
megfelelően.6,7
5.2 Immunhisztokémiai értékelés A tumorsejtek fenotípusát immunhisztokémiai jelöléssel határoztuk meg, paraffinos nyirokcsomói szövettani blokkokból és dekalcifikált csontvelői biopsziás mintákból. A festést a háromlépéses avidin-biotin immunperoxidáz módszerrel végeztük.53 Vizsgálatainkhoz a CD20, bcl-2, Ki67 (DAKO, Carpinteria, CA, USA), CD10 (Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, England) és p53 (DAKO) monoklonális antitesteket használtuk. A follikuláris dentritikus sejtek detektálását CD21 (Novocastra) és CD23 (Novocastra) antitestekkel végeztük.
5.3 Molekuláris vizsgálatok A tumorklónok azonosítására és követésére az immunglobulin nehézlánc gén szomatikus mutációs mintázatát használtuk; három kiemelt esetben az
– 17 –
IgVH gén PCR amplifikációját, klónozását, szekvenálását, majd a kapott szekvenciák alapján a tumorklónok származási analízisét hajtottuk végre.
5.3.1
DNS izolálás
Natív szövetmintákból telített NaCl felhasználásával, kisózásos módszerrel nyertünk genomikus DNS-t.54 A fagyasztott metszeteket maglízis pufferben (10 mM Tris-HCl, 400mM NaCl és 2mM EDTA ; 200 μl nátrium-dodecil szulfát [SDS]) szuszpendáltuk, melyhez proteináz-K oldatot (1mg proteináz-K, 1% SDS és 2mM EDTA) adtunk.
Ezt követően az elegyet egy éjszakán át 37°C-on
emésztettük, telített NaCl oldattal ráztuk, majd 20 percen át 2500 rpm fordulatszámon centrifugáltuk.
A felülúszóhoz kétszeres volumenű abszolút
alkoholt adtunk, majd a DNS precipitátumot kétszer mostuk 70%-os etanolban. A szövetmintákból izolált DNS koncentrációját 260 nm hullámhosszon határoztuk meg fotométer (Gene Quant II, Pharmacia Biotech, Cambridge, UK) segítségével. A DNS tartalom meghatározása után a mintákat TE pufferben (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA), 4°C-on tároltuk.
5.3.2
Az IgH gén PCR amplifikációja ( Biopsziás mintapárok klonalitásának igazolása)
A PCR amplifikációt az IgH génen IgVH géncsalád specifikus szenz primerrel, és a konszenzus JH antiszensz primerrel végeztük el. A csíravonalbeli IgH gén variábilis régiókat a szekvenciabeli hasonlóságok alapján 6 géncsaládba (VH1-VH6) sorolják. Az egyes VH géncsaládok tagjai több mint 80 százalékos hasonlóságot mutatnak, míg az eltérőek kevesebb, mint 70 százalékot. Az IgH génátrenndeződést követően is, az IgH gén a VH géncsaládoknak csak egyik egyik tagját hordozza, így adott minta vizsgálata esetén mind a hat lehetséges sense primerrel elvégezve a PCR amplifikációt, megtudhatjuk, hogy melyik VH géncsalád tagját hordozza a gén. A VH specifikus sense primer az 1. framework (FR) régióbra esik, míg a konszenzus antisense primer a 4. FR régióba, ami az IgH variábilis régió kapcsolási részének felel meg (JH). Az IgH – 18 –
gén ily módon való használata alkalmas az egy adott betegből származó nyirokcsomói és csontvelői mintapár klonális kapcsolatának igazolására is. Abban az esetben, ha a VH-D-JH rekombináció egy adott beteg mintapárjaiban megegyezik, tehát azonos az immunglobulin nehézlánc gén, az a nyirokcsomói és csontvelői tumor közös klonális eredetére utal (7. ábra).
VH gének
5’
JH gének
D gének
3’
5’
5’
C μ gén
3’ Lead
FR
CDR1
FR
CDR2
FR
CDR3 FR
3’
VH1 antisense primer (JH specifikus)
VH2 sense primerek (IgVH 1-6 géncsaládokra specifikus)
VH3 VH4 VH5 VH6 PCR termékek
7. ábra IgH gének PCR amplifikációja A PCR amplifikációhoz az IgH gén FR1 régiójában elhelyezkedő IgVH1-6 géncsaládokra specifikus szenz primert, és az FR4 régóra tervezett konszenzus JH antiszensz primert használtuk. Mind a hat sense primerrel 1-1 PCR amplifikációt elvégezve választ kapunk arra, hogy melyik VH géncsalád tagját hordozza a gén. A VH-D-JH rekombináció meghatározása a nyirokcsomói és csontvelői mintapárok klonális kapcsolatának igazolására is alkalmas.
A nyirokcsomói és csontvelői biopsziás minták IgH génjeinek PCR amplifikációjához sense primerként az IgH gén FR1 régiójára tervezett, IgVH 1-6 géncsaládokra specifikus leader primereket (VH1-FR1 : 5’-GGC CTC AGT GAA GGT CTC CTG CAA G-3’, VH2-FR1 : 5’-GTC TGG TCC TAC GCT GGT GAA ACC C-3’, VH3-FR1 : 5’-CTG GGG GGT CCC TGA GAC TCT CCT G-3’, VH4FR1 : 5’-CTT CGG AGA CCC TGT CCC TCA CCT G-3’, VH5-FR1 : 5’-CGG GGA GTC TCT GAA GAT CTC CTG T-3’, VH6-FR1 : 5’-TCG CAG ACC CTC TCA CTC ACC TGT G-3’) használtuk. A konszenzus antisense primer a FR4
– 19 –
régióra tervezett JH consensus: 5' – CTT ACC TGA GGA GAC GGT GAC C - 3' volt.555 A PCR reakciók kivitelezéséhez 25 μl végtérfogatban 100 ng DNS templátot használtunk, 10 pM sense és antisense primer, 2 mM dNTP, 10x PCR Gold Buffer, 25 mM MgCl2 és 0,75 U AmpliTaq Gold polimeráz jelenlétében.
A reakciók Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR készülékben
zajlottak, az alábbiak szerint: kezdeti denaturáláció 95°C 10 perc, denaturáláció 95°C 30 másodperc, annealing 59°C 30 másodperc, extenzió 72°C 50 másodpercig, 35 cikluson keresztül. Az amplifikálást követően a polimeráz láncreakció
termékeinek
detektálása
agaróz-gélelektroforézissel
történt,
etidium-bromid jelölés mellett, 2%-os agaróz gélben (100 ml 1xTAE puffer). Futtató pufferként TAE oldatot használtunk (10x TAE törzsoldat: 0,4 M TRIS; 0,2 M ecetsav; 0,01M EDTA). A vizsgálat alkalmas az egy adott betegből származó nyirokcsomói és csontvelői biopsziás minta klonális kapcsolatának igazolására is. Abban az esetben, ha a VH-D-JH rekombináció egy adott beteg mintapárjaiban megegyezik, tehát azonos az immunglobulin nehézlánc gén, az a nyirokcsomói és csontvelői tumor közös klonális eredetére utal.
5.3.3
Az IgH gének klónozása
Az Ig VH-D-JH gének klónozását TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USA) segítségével végeztük el. A PCR termékeket pCR®2.1-TOPO® Vector-ba ligáltuk, majd One Shot® E. coli sejteket transzformáltunk
a
gyártó
tranzformációt használ. A
utasításai
szerint.
Ez
a
módszer
kémiai
Taq polimeráz templát független terminális
transzferáz aktivitása révén a PCR termékek 3’ végéhez egy dezoxiadenozin (A) nukleotidot illeszt. A pCR®2.1-TOPO® Vector egy linearizált vektor (8. ábra), melynek 3’ végén egy túllógó dezoxitimidin (T) nukleotid található, amely így biztosítja a vektor és a PCR termék megfelelő összekapcsolódását. A transzformálást követően a sejteket kanamycint és X-gal-t tartalmazó, LB agar táptalajra szélesztettük. Mivel a vektor Kanamycin rezisztencia gént hordoz, – 20 –
csak azok a sejtek képesek a túlélésre és képeznek telepeket, amelyek a plazmidot tartalmazzák. A 24-48 óra 37 °C-os inkubációt követően a táptalajon kék és fehér telepek jelennek meg. Ha a plazmidba nem épült be az inzert, akkor a baktérium bontani képes az X-gal-t, és a lezajló színreakció következtében a telepek kék színűek lesznek. Amennyiben az inzert beépült, a β-galaktozidáz enzimet kódoló lac gén működésképtelenné válik, így az X-gal-t bontani nem képes baktériumok fehér telepeket alkotnak.
– 21 –
CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTC CTT TGT CGA TAC TGG TAC TAA TGC GGT TCG AAC CAT CGC TCG AGC CTA GGT GAT GTA ACG GCC GCC AGT GTG CTG GAA TTC GCC CTT CAT TGC CGG CGG TCA CAC GAC CTT AAG CGG GAA
PCR termék
AAG GGC GAA TTC TGC TTC CCG CTT AAG ACG
AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG CCC TAT TCT ATA GGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA AGC GGG ATA AGT GAG TCG TAT TAC AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC TCA CTC AGC ATA ATG TTA AGT GAC CGG CAG CAA AAT GTT GCA GCA CTG ACC CTT TTG
8. ábra: A klónozáshoz használt pCR®2.1-TOPO® Vector sematikus ábrája A pCR®2.1-TOPO® Vector egy linearizált vektor, mely Kanamycin rezisztencia gént hordoz, így kanamycint és X-gal-t tartalmazó táptalajon való tenyésztést követően kék-fehér színszelekció alapján kiválaszthatóak azok a telepek, amelyekben a baktériumok hordozzák a megfelelő helyre beépült inzertet. A fehér telepekből az M13 forward és reverz primerek segítségével, közvetlen PCR amplifikációval végeztük a klónszelekciót.
5.3.4
Klónszelekció
A klónszelekciót a fehér telepekből M13 forward (5’-CTG GCC GTC GTT TTA C-3’) és M13 reverz primerek (5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’) segítségével, közvetlen PCR amplifikációval végeztük. A PCR reakciók kivitelezését 25μl végtérfogatban 10 pM sense és antisense primer, 2 mM NTP, 10x PCR Gold Buffer, 25 mM MgCl2 és 0,75 U AmpliTaq Gold polimeráz (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) jelenlétében végeztük el, a PCR elegybe steril kaccsal közvetlenül a táptalajról a megfelelő inzertet tartalmazó 11 különböző baktérium telepet oltottunk.
A reakciók Perkin-Elmer 2400
GeneAmp
az
PCR
készülékben
zajlottak,
alábbiak
szerint:
kezdeti
denaturáláció 95°C 1 perc, denaturáláció 95°C 1 perc, annealing 59°C 1 perc, extenzió 72°C 1perc, 25 cikluson keresztül. Az amplifikálást követően a – 22 –
polimeráz láncreakció termékeinek detektálása agaróz-gélelektroforézissel történt, ethidium-bromid jelölés mellett, 2%-os agaróz gélben (100 ml 1xTAE puffer). Futtató pufferként TAE oldatot használtunk (10x TAE törzsoldat: 0,4 M TRIS, 0,2 M ecetsav, 0,01M EDTA). A migrációs mintázat detektálását Eagleeye géldokumentációs rendszerrel (Stratagene, USA) végeztük el. A három kiválasztott mintapár mindegyike esetén 20-20 nyirokcsomóból és csontvelőből származó klón PCR amplifikációját végeztük el.
5.3.5
Az IgH klónok szekvenálása
A klónozott, megtisztított PCR termékek szekvenálását a Sanger-féle didezoxi módszerrel végeztük.56 A PCR termékek tisztítását High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA), illetve Montage PCR Centrifugal Filter Device (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) használatával végeztük el, a gyártók utasításai szerint. Ezzel a lépéssel eltávolítottuk a reakcióelegyből az előző PCR reakcióban feleslegben maradt
reakciókomponenseket
(primerek,
dNTP),
amelyek
a
további
lépésekben szükségtelenek és zavaróak lettek volna. A tisztítási folyamatot követően a PCR termékeket ismét agaróz gélelektroforézissel futtattuk, hogy meglétüket ellenőrizzük. A szekvenciák meghatározását cycle sequencing reakció segítségével végeztük el, melyhez BigDye Terminator 3.1 kit-et használtunk (Applied Biosystems). A cycle sequencing reakciók kivitelezéséhez 1μl BigDye Terminator-t (tartalmazza a reakcióhoz szükséges enzimet, dezoxi és didezoxi mukleotidokat), 1μl BigDye puffert, 1μl M13 sense vagy M13 antisense primert és 2 μl tisztított PCR terméket használtunk. A szekvenáló reakciót PTC-150Minicycler (MJ Research, USA) PCR készülékben végeztük, az alábbiak szerint : kezdeti denaturáció 2 perc, denaturáció 94°C-on 30 másodperc, annealing 51°C 15 másodperc, extenzió 60°C 4 perc, 25 cikluson keresztül. A cycle sequencing termékeket Dye Ex 2.0 kit-tel (Quiagen, USA) végeztük el a gyártó utasításainak megfelelően. Erre a lépésre azért volt szükség, hogy eltávolítsuk a reakcióelegyből az cycle sequencing során feleslegben maradt – 23 –
fluoreszcens jelölésű reakciókomponenseket, melyek a szekvenciák leolvasását zavarják a kapilláris elektroforézis során. A kapilláris elektroforézist és a szekvenciák leolvasását az ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) segítségével végeztük el. A folyamat összefoglaló vázlatát a 9. ábra mutatja be.
VH
D
JH
FR1
FL sejtek
DNS izolálás
JH
PCR amplifikáció
Klónozás
Szekvenálás
9. ábra: A mutációs analízis módszerének összefoglaló vázlata A tumormintákból való DNS izolálást követően az IgH gén PCR amplifikációját, majd a klónozott termékeket mutációs mintázatának meghatározása céljából kapilláris elektroforézist végeztünk.
5.3.6
Az IgVH gének szekvencia és filogenetikai analízise
A három kiemelt esetben mintánként (a nyirokcsomói és csontvelői mintákon is), egymástól független baktérium telepekből származó, körülbelül 20-20 IgVH gén klón szekvencia analízisét végeztük el. A megfelelő IgVH csíravonal szekvenciákat az IMGT/V-Quest (International imMunoGeneTics information System, http://imgt.cines.fr) és az NCBI/Ig BLAST adatbázisok segítségével azonosítottuk. A B-sejt érés során az Ig-ok szekezeti sokféleségének kialakulásához az Ig génátrendeződésen kívül hozzájárul az antigén stimulációt követően végbemenő, az Ig variábilis régióit érintő szomatikus hipermutáció jelensége is, mely fontos szerepet játszik az ellenanyagok affinitásérésében.57 Az antigénnel való első találkozáskor a B-sejtek kiválogatása a mutálatlan felszíni IgV régiók kötődési specificitása alapján történik meg, véletlenszerűen. Az ismételt antigén behatások
következtében
az
antitest
variábilis
régiójában
szomatikus
pontmutációk halmozódnak fel, és több „fordulónyi” antigén szelekciót és
– 24 –
mutációt követően csak az adott antigénhez leginkább illeszkedő antitesttel rendelkező B-sejtek reagálnak.58 Pozitív vagy negatív szelekciós hatás hiányában a génen a mutációk véletlenszerűen jönnek létre, és az aminosav cserét létrehozó missense (Rreplacement) mutációk, valamint az aminosav cserét nem okozó néma (Ssilent) mutációk egyenletes eloszlásban helyezkednek el a kódoló szekvencián. Azonban az antigén szelektált antitestekről kimutatták, hogy nagyobb számban tartalmaznak R mutációkat az IgV gének antigén kötődéséért felelős (CDR) régióiban, mint a „framework” (FR) régiókban, ahol az S mutációk száma lehet több. A magas R : S mutációs arány az „affinitás-érett” IgV gének CDR szekvenciáira jellemző, mivel géntermékei pozitív szelekciós hatás alatt állnak, a legjobban illeszkedő antitest előállítása érdekében. Ezzel ellenkezőleg, az alacsony R : S mutációs arány az FR szekvenciák jellemzője, mert ezeknek szerkezetük megtartására van szükségük, hogy az antigén kötő CDR régióknak stabil „állványzatot” biztosítsanak.60 A Chang és Casali által javasolt binomiális disztribúciós modellt használtuk annak megállapítására, hogy az antigén kötődéséért felelős (CDR) régiókat érintő R mutációk többletének vagy az FR régiókban előforduló S mutációk hiányának előfordulása a véletlennek tudható be, vagy antigén szelekciós hatásra jött létre. 60 A DNASTAR Meg Align szoftver (DNASTAR Inc., Madison, USA) ClustalW módszerének segítségével végeztük el a párhuzamos szekvencia analíziseket és az egyes esetekből származó nyirokcsomói és csontvelői szubklónok klonális kapcsolatát ábrázoló filogenetikai fák megszerkesztését.
– 25 –
6.
EREDMÉNYEK
6.1 A nyirokcsomói és csontvelői minták morfológiai összehasonlítása 21 kezeletelen FL-ás beteg nyirokcsomói és a hozzájuk tartozó csontvelői
biopsziás
mintáiban
a
tumorsejtek
szövettani
növekedési
mintázatának és citológiai grade-jének összehasonlítását végeztük el, a WHO kritériumok alapján6 (1. táblázat). 13 esetben follikuláris mintázatot, 7 esetben follikuláris és diffúz mintázatot, 1 esetben pedig diffúz növekedési mintázatot találtunk a nyirokcsomói szövettani mintákban. A párhuzamos csontvelői biopsziás mintákban, 14 esetben paratrabekuláris infiltrációt, 7 esetben paratrabekuláris és
follikuláris
infiltrációt
azonosítottunk
(10.ábra).
Kizárólag
follikuláris
mintázatot egyik csontvelői infiltrátum esetében sem figyeltünk meg. Nem találtunk
összefüggést
a
nyirokcsomók
és
a
párhuzamos
csontvelői
infiltrátumok tumorsejtejeinek szövettani növekedési mintázata között.
B
A
10. ábra: A biopsziás szövettani minták növekedési mintázata Az esetek többségében a nyirokcsomói minták (A) növekedési mintázata follikuláris, a csontvelői mintáké (B) paratrabekuláris volt.
– 26 –
1. táblázat
Esetszám
21 FL-ás eset nyirokcsomói és csontvelői mintájának szövettani mintázata és immunfenotípusa Szövettani Grading bcl-2 (%) CD10 (%) Ki67 (%) mintázat
p53 (%)
NYCS
CSV
NYCS
CSV
NYCS
CSV
NYCS
CSV
NYCS
CSV
NYCS
CSV
1
F
PT
1
1
100
100
100
−
10
−
−
−
2
F
PT
1
1
100
100
100
−
−
−
−
−
3
F/D
PT/F
1
1
100
100
20
10
−
−
−
−
4
F
PT/F
1
1
100
100
100
−
5
−
1
−
5
F
PT
1
1
100
100
100
100
20
−
5
−
6
F/D
PT
1
1
100
100
100
100
10
−
−
−
7
F
PT/F
1
1
100
100
−
−
−
−
NA
−
8
F/D
PT
1
1
100
100
−
−
15
−
NA
−
9
F/D
PT
1
1
50
100
−
100
70
−
−
−
10
D
PT
1
1
100
100
−
−
−
−
1
−
11
F
PT
1
1
100
100
100
1
5
NA
−
−
12
F
PT/F
2
2
100
100
100
100
10
10
1
−
13
F
PT
2
1
100
50
100
−
10
−
10
−
14
F
PT/F
2
1
100
100
100
10
5
−
2
−
15
F
PT
2
1
100
100
100
−
20
−
10
−
16
F
PT
3
2
100
100
100
50
25
10
10
2
17
F/D
PT/F
3
2
100
100
−
−
20
20
−
−
18
F
PT
3
1
100
100
100
−
20
−
5
−
19
F/D
PT/F
3
1
100
100
100
−
15
−
2
−
20
F
PT
3
1
100
100
100
−
20
2
10
−
21
F/D
PT
3
1
100
100
100
−
30
−
15
−
Az összes nyirokcsomói és csontvelői mintában CD21, CD23 pozitív follikuláris dendritikus sejtek voltak jelen. F: follikuláris, PT: paratrabekuláris, : negatív, D: diffúz, NA: nincs adat.
– 27 –
A
tumorminták
szövettani
klasszifikációját
WHO
ajánlásának
megfelelően, a centrociták és centroblastok aránya alapján határoztuk meg, 10 neoplasztikus follikulus abszolút centroblast száma alapján, nagy (40X) nagyítású látóterenként kifejezve. 11 esetben mind a nyirokcsomói, mind a párhuzamos csontvelői minták FL sejtjeit a szövettani klasszifikáció alapján a grade I. csoportba soroltuk. 4 esetben a nyirokcsomó tumorsejtjei grade II., míg a párhuzamos csontvelői minták tumorsejtjei vagy grade I. (3 esetben) vagy grade II. (1 esetben) csoportba tartoztak. 6 esetben a nyirokcsomói minták sejtjei a grade III. osztályozásba estek, azonban az összes párhuzamos csontvelői infiltrátum grade-je ennél alacsonyabb volt (2 esetben grade II., 4 esetben grade I.). Elmondható tehát, hogy a nyirokcsomói minták szövettani grade-je vagy megegyezett, vagy magasabb volt, mint a párhuzamos csontvelői infiltrátumé; érdekes módon, nem találtunk olyan esetet, ahol a csontvelői minta
grade-je magasabb lett volna, mint a párhuzamos
nyirokcsomói mintáé (11.ábra).
A
B
11. ábra: A biopsziás szövettani minták növekedési mintázata A szövettani vizsgálat során a csontvelői minta (B) minden esetben a nyirokcsomóival (A) egyező, vagy annál alacsonyabb grade-ű volt, vagyis érettebb sejtek alkották.
– 28 –
6.2 Immunfenotípus vizsgálat A
tumorsejtek
immunfenotípus
profilját
különböző
antigének
expressziójával jellemeztük (bcl-2, CD10, Ki67, p53) (1. táblázat). A diagnosztikus eljárás részeként a mintákon CD20 jelölést is végeztünk, amely minden nyirokcsomói és csontvelői minta esetén pozitív festődést mutatott. Bcl-2 jelöléssel minden nyirokcsomói és párhuzamos csontvelői mintában a tumorsejtjek nagy mértékű pozitivitását figyeltük meg (12.ábra). Két mintapár kivételével a nyirokcsomói és csontvelői minták is 100 százalékos pozitivitást mutattak. (A 9. esetben a nyirokocsomói, a 13. esetben a csontvelői minta pozitivitása 50 százalékos volt, a megfelelő mintapárokban itt is 100 százalékos festődés volt megfigyelhető.).
A
B
12. ábra: A biopsziás szövettani minták bcl-2 jelöléssel Bcl-2 jelöléssel a nyirokcsomói (A) és párhuzamos csontvelői (B) minták mindegyikében a tumorsejtjek nagy mértékű pozitivitását figyeltük meg.
A sejtek CD10 pozitivitása a különböző mintapárok esetén nagy eltéréseket mutatott, összességében elmondható, hogy a nyirokcsomói mintákban több tumorsejt mutatott CD10 expressziót, mint a párhuzamos csontvelői mintákban, egy mintapár kivételével, ahol csontvelői minta CD10 pozitív, a nyirokcsomói CD10 negatív volt (9. minta).
– 29 –
A
B
12. ábra: A biopsziás szövettani minták CD10 jelöléssel CD10 jelöléssel a nyirokcsomói mintákban több tumorsejtet találtunk pozitív jelölődésűnek (A), mint a párhuzamos csontvelői mintákban (B).
Ki67 festéssel kevesebb csontvelői, mint nyirokcsomói mintában találtunk pozitív sejteket (13. ábra). 4 mintapárban a nyirokcsomói és csontvelői tumorsejtek is Ki67 negatívak voltak (2., 3., 7., 10. eset), a többi esetben a nyirokcsomói minták Ki67 pozitivitást mutattak, a csontvelői minták közül 4 volt pozitív (ezekben az esetekben a Ki67 expresszió a nyirokcsomói mintákéval megegyező, vagy annál kisebb volt), egy esetben nem állt rendelkezésre adat, a többi eset Ki67 negatív volt. p53 jelöléssel a nyirokcsomói minták közül 12 esetben találtunk pozitivitást, 6 esetben negativitást, 2 esetben nem állt rendelkezésünkre adat. A párhuzamos csontvelői minták 1 esetet kivéve p53 negatívak voltak (14. ábra). A follikuláris dendritikus sejtek (FDC) jelenlétét CD21 és CD23 jelöléssel igazoltuk az összes nyirokcsomói és csontvelői minta esetében. A csontvelői minták esetén mind a paratrabekuláris, mind a follikuláris infiltrátumok tartalmaztak follikuláris dendritikus sejteket (15. ábra).
– 30 –
B
A
13. ábra: A biopsziás szövettani minták Ki67 jelöléssel Ki67 jelöléssel több nyirokcsomói (A) mintát találtunk pozitívnak, mint csontvelőit (B), és azokban az esetekben, ahol a csontvelő pozitív jelölődésű volt, a Ki67 expresszió a nyirokcsomói mintákénál alacsonybb vagy azzal megegyező volt.
A
B
14. ábra: A biopsziás szövettani minták p53 jelöléssel p53 jelöléssel a 21 nyirokcsomói minta közül 12 mutatott pozitivitást (A), a csontvelői minták közül csak egy esetben találtunk alacsony p53 expressziót, a többi negatív volt (B).
– 31 –
A
B
15. ábra: A biopsziás szövettani minták CD23 jelöléssel CD23 jelöléssel az összes nyirokcsomói (A) és csontvelői (B) minta pozitivitást mutatott, mely a follikuláris dendritikus sejtek (FDC) jelenlétét mutatja.
– 32 –
6.3 Az IgVH gének szekvencia analízise A FL nyirokcsomói és csontvelői minták klonális kapcsolatának igazolására, és a csontvelői tumorsejtek mutációs mintázatának jellemzésére 3 FL-ás esetben az IgVH gén szekvencia analízisét végeztük el (12., 14., 21. eset). A 3 esetet a minták citológiai grade-jének figyelembevételével választottuk ki. A 12. esetben a nyirokcsomói és a párhuzamos csontvelői minta grade-jei megegyeztek (mindkét esetben grade II.), a 14. esetben a két minta 1 grade-del tért el egymástól (nyirokcsomó: grade III., csontvelő: grade II.), a 21. esetben a párhuzamos minták között 2 grade különbség volt (nyirokcsomó: grade III., csontvelő: grade I.). Az Ig VH-D-JH gének PCR amplifikációját követően a PCR termékek klónozását és a megfelelő klónok szekvenálását végeztük el. A VH-D-JH génátrendeződés az egyes esetek nyirokcsomói és párhuzamos csontvelői klónjaiban egymással megegyező volt, ami a nyirokcsomói és csontvelői tumorklónok közös klonális eredetét igazolja (7. ábra). Mindhárom esetben a IgH gén variábilis régió VH3 géncsaládok tagjai vettek részt a rekombinációban. Az IgVH gén régiók szekvencia analíziséhez az egyes esetekhez tartozó legközelebbi germline IgVH gén szekvenciák azonosítását az IMGT/V-Quest és az NCBI/Ig BLAST adatbázisok segítségével kerestük meg. Minden általunk talált szekvenciához megkerestettük a szóbajöhető germline szekvenciákat, és azt a germline szekvenciát választottuk ki az egyes eseteinkhez tartozó legközelebbi germline szekvenciának, amelyiket a program a legtöbb, általunk beadott szekvenciához felajánlott. Az egyes esetek IgVH gén régióinak szekvenciái
változó
számú
eltérő
mutációkat
hordoztak
a
germline
szekvenciákhoz képest (számuk 1 és 13 között változott), és a mutációk mindhárom
nyirokcsomói-csontvelői
mintapár
esetében
a
szekvenciák
intraklonális diverzitását okozták. Mindhárom esetben, minden szekvenciavariáns
pontmutáció
eredményeként
jött
létre,
melyek
potenciálisan
működőképes géneket eredményeztek. A legközelebbi csíravonal géneket, a mutációs frekvencia tartományokat és a megosztott mutációk számát a
– 33 –
nyirokcsomói és csontvelői klónok IgVH gén szekvenciáiban a 2. táblázat mutatja be részletesen. 2. táblázat: A nyirokcsomói és csontvelői tumorklónok IgVH génjeinek szekvencia analízise
Mutációs frekvenciák* (%)
IgVH gén
Esetszám
Megosztott mutációk száma †
NYCS
CSV
NYCS
CSV
NYCS+CSV
12
VH3-53
13-14,4
12,6-14,4
33
33
32
14
VH3-21
8-10,4
7,3-9,4
23
18
18
21
VH3-7
8.3-10,4
9-13,5
21
0
0
IgVH gén az egyes esetekhez tartozó gemline géneket jelöli, hivatalos számozásuk szerint. Mindhárom esetben az IgH gén variábilis régió VH3 géncsalád tagjai vettek részt a rekombinációban, elnevezésük ennek megfelelően a VH3- előtagot kapja. *A mutációs frekvencia az összes nukleotid számának és a mutációk számának aránya. † Az összes jelzett klónban egyformán előforduló mutációk számát jelenti.
6.3.1 Annak
Szomatikus mutációk vizsgálata
megállapítására,
hogy
a
FL
nyirokcsomói
és
csontvelői
tumorsejtjek az antigén szelekcióra vonatkozóan pozitív szelekciós hatásnak voltak-e kitéve, és az összetartozó nyirokcsomói és csontvelői minták tumorsejtjeinek antigén szelekciós mintázatának összehasonlítására, a három kiválasztott FL-ás eset IgVH gén szekvenciának szomatikus mutációs elemzését végeztük el. A mutáció analízist összesen 53 nyirokcsomói és 57 csontvelői szekvencián hajtottuk végre, a Chang és Casali képlet alkalmazásával.60 Eredményeinket a 3. táblázat és az 16. ábra mutatja be. (A részleteket az ábramagyarázat tartalmazza.) Az 53 nyirokcsomóból amplifikált és 51 csontvelőből származó IgVH szekvencia esetén a binomiális disztribúciós modell szignifikánsan kevesebb (P<0,05) R mutációt mutatott ki az FR régiókban, és többet a CDR régiókban, mint amennyi csupán a véletlennek köszönhetően várható lett volna. A fennmaradó 6 csontvelői szekvencia (12. eset: B1,2,7,10,14 ; 14. eset: B17) esetén a CDR régiókban található mutációk random eloszlást mutattak. Összességében elmondható, hogy az 57 csontvelői – 34 –
mintából 51-ben a CDR régiók több R mutációt, az FR régiók pedig kevesebb R mutációt hordoztak, mint amennyi a véletlen valószínűség alapján várható lett volna ezekben a szekvenciákban, ami azt jelzi, hogy ezekben a klónokban antigén szelekció zajlott. 3. táblázat
A szomatikus mutációk eloszlásának elemzése az IgVH génen
CDR
FR
Esetszám
Minta
R
várható R*
S
R
várható R*
S
12
NYCS
8-10
4,46-4,94
5-6
14-18
23,22-26,35
9-7
CSV
8-9
4,23-4,82
6-7
12-19
22,6-25,73
9-7
NYCS
8
2,85-3,72
2-4
6-8
14,28-18,63
7-11
CSV
6-9
2,6-3,35
2-4
6-10
13,04-16,76
5-10
NYCS
8
2,97-3,72
0-2
8-10
14,28-18,63
7-10
CSV
8-13
3,22-4,84
0-4
5-13
16,14-24,22
5-13
14
21
*A binomiális disztribúciós modellnek megfelelően várható, véletlenül bekövetkező R mutációk száma. CDR: complementary determining regions; FR framework; R: replacement=missense mutációk; S: silent=néma mutációk
6.4 A filogenetikai fák vizsgálata Az IgVH gén ongoing szomatikus hipermutációs aktivitását használtuk ki, hogy
kimutassuk
a
klonális
szelekció
meglétét
a
FL
csontvelői
manifesztációjában, és jellemezzük a csontvelői infiltráció kialakulási útvonalait. Az ongoing szomatikus hipermutációt markerként használtuk a csontvelői érintettség klonális evolúciójának követésében.18,61 A nyirokcsomókból és csontvelőkből származó IgVH gén szekvenciák alapján a három vizsgált esetben (12., 14., és 21. eset) filogenetikai fákat szerkesztettünk. Az elemzésbe a legközelebbi germline géneket is bevontunk. A DNASTAR Meg Align szoftver (DNASTAR Inc.) segítségével szerkesztettük
– 35 –
meg az IgVH gén szekvenciák filogenetikai fáit, a ClustalW módszerrel nyert többszörös szekvencia illesztések alapján (16. ábra). A nyirokcsomókból és csontvelőkből nyert IgVH gén szekvenciák mind különböztek egymástól, egy esetet kivéve; a 14. esetben 10 nyirokcsomói (N2,3,5,7,9,13-17) és két csontvelői klón (C8,9) azonos szekvenciával rendelkezett (16.B ábra). Mindhárom esetben, a nyirokcsomói és csontvelői klónok közös fát alkottak, melyben a germline gén az összes tumorklón legősibb közös progenitorának adódott. A filogenetikai fák topológiája alapján a nyirokcsomói és csontvelői klónok közös ősökből származó kohezív csoportokat alkotnak. Ezek a közös ősök nem jelennek meg a fán azonosított klónokként, hanem elágazódási pontokként szerepelnek, melyek egy-egy lépcsőt képviselnek a diverzifikáció folyamatában. A csontvelői klónok mindhárom esetben két csoportot hoztak létre: az egyik csoport közvetlenül a legősibb közös progenitorból származott (12. eset: C3-6,9,12,13,15,19,20;
14.eset : C13,17; 21. eset: C1-6,8,11-17), a másik
csoport klónjai egy nyirokcsomói és csontvelői közös ős leszármazottai voltak (12. eset: C1,2,7,8,10,11,14,16-18;
14. eset: C1-12,14-16,18-20; 21. eset:
C7,9,10). A csontvelői klónok szekvenciáiban a megosztott mutációk száma 233 között változott. A nyirokcsomói klónok mindhárom esetben kohezív csoportokat alkottak, a megosztott mutációk száma 23-33 volt. A nyirokcsomói és csontvelői klónok – eltérő számban – szintén tartalmaztak megosztott mutációkat, jelezve, hogy a nyirokcsomói és csontvelői tumor klónok egy közös ős leszármazottai. Mivel mindegyik vizsgált esetben az összes daganatos klón hordozott megosztott mutációkat, a közös ős nyirokcsomói vagy csontvelői eredete nem volt pontosan meghatározható a filogenetikai fa alapján.
– 36 –
– 37 –
16. ábra: A tumorklónok származási analízise A három kiválasztott FL-ás eset nyirokcsomói és párhuzamos csontvelői mintáiból származó IgVH gén szekvenciák alapján filogenetikai fákat szerkesztettünk. A származási fákat a DNASTAR MegAlign szoftver segítségével, a ClustalW módszerrel nyert párhuzamos szekvencia analízisek alapján szerkesztettük meg. A filogenetikai fákat minhárom esetnél az adott eset összes nyirokcsomói és csontvelői klónjának szekvenciái és a legközelebbi germline szekvencia felhasználásával építettük fel. A MegAlign szoftver minden klónt végpontként kezelt, és ez alapján alakította ki a fákat, ezért néhány módosítást kézzel végeztünk el. Abban az esetben, ha két klón mutációs eltérései csak a megosztott mutációkon felüli mutációkból származtak, akkor a kevesebb mutációt tartalmazó klónt (vagyis amely csak olyan mutációkat tartalmazott, amelyek a másik klónban is jelen voltak) a több mutációt tartalmazó klón őseként tüntettük fel. Az A, B és C ábra a 12.,14., és 21. eset származási fáit mutatja. A germline géneket sárga, a nyirokcsomói klónokat kék, a csontvelőieket rózsaszín dobozokban tüntettük fel. Ezen kívül a nyirokcsomói klónokat „N”-el, a csontvelőieket „C”-vel jelöltük és a betűjelet követően a klónok számait tüntettük fel. Amennyiben két vagy több klón egyazon szekvenciavariánsnak felelt meg, közös dobozba kerültek. A dobozok jobb felső sarkában látható négyzetek színe a CDR-ekre vonatkozó mutációeloszlásra, a jobb alsó sarokban található négyzetek színe a FR-ekre vonatkozó mutációeloszlásra vonatkozik, a Chang-Casali képletnek60 megfelelően. A piros négyzetek az antigén szelekció meglétét jelölik, a fehér négyzetek a mutációk random eloszlását jelzik. Az alsó skálák az IgVH gén szekvenciákban talált mutációk számát mutatják, és így az egyes klónok germline géntől való távolságát is megjelenítik.
– 38 –
7. A
follikuláris
útvonalának
MEGBESZÉLÉS
lymphoma
tanulmányozása
csontvelői
céljából
FL-ás
érintettségének betegek
kialakulási
nyirokcsomói
és
párhuzamos csontvelői mintáinak morfológiai és immunfenotípusos vizsgálatát végeztük el, valamint a mintákból származó IgVH gének mutációs analízisét hajtottuk végre. Eredményeink azt mutatják, hogy a FL sejtek citológiai gradeje, immunfenotípusa, és IgVH génjeik mutációs mintázata a nyirokcsomói és csontvelői tumormintákban gyakran eltérő, ami azt jelzi, hogy a FL csontvelői infiltrációjának kialakulásában a tumorklónok klonális szelekciója fontos szerepet
játszik.
Eredményeink
azt
igazolják,
hogy
a
csontvelő
a
nyirokcsomóéhoz hasonló mikrokörnyezetet biztosít, ahol a tumorsejtek megtartják IgVH génjeik ongoing mutációs jellegét, és a mutációk eloszlása arra utal, hogy a sejtek antigén szelekción estek át. Morfológiai összehasonlító vizsgálatunk során úgy találtuk, hogy a magasabb citológiai grade-ű nyirokcsomói mintákhoz tartozó csontvelői infiltrátumok grade-je az esetek nagy részében alacsonyabb a párhuzamos nyirokcsomói mintákénál. Ezek az eredmények egybehangzóak korábbi kutatások eredményeivel, melyek azt mutatják, hogy a FL csontvelői aggregátumait elsősorban kis centrociták alkotják, és csak ritkán fordulnak elő bennük centroblastok, még azokban az esetekben is, ahol a nyirokcsomót nagy számú centrocita építi fel.13,14 A centrociták túlsúlyát a csontvelőben immunhisztokémiai vizsgálataink is alátámasztják. Ki67 és p53 jelöléssel kevesebb tumorsejt mutatkozott pozitív festődésűnek a csontvelőben, mint a nyirokcsomóban, azzal egybehanzóan, miszerint a proliferációs aktivitás és a p53 pozitivitás a tumor grade-del összefüggést mutat.9,62 Ezen kívül, a csontvelői tumorsejtek ritkábban expresszáltak CD10-et, mint a nyirokcsomóiak. Mindezek az eredmények azt az elgondolást támasztják alá, mely szerint a csontvelői infiltrátumok általában alacsonyabb grade-ű FL-át képviselnek, mint a párhuzamos nyirokcsomói minták sejtei, és arra utalnak, hogy a csontvelői infiltráció kialakításában különböző fenotípusú klónok vesznek részt.
– 39 –
A
csontvelői
infiltrátumokban
megfigyelhető
kis,
centrocita-szerű
tumorsejtek intenzív klonális szelekciója azonban arra utalhat, hogy a FL interfollikuláris kompartmentje – mely szintén kis, centrocita-szerű sejtekből épül fel – gyakran terjed ki a csontvelőre.64 Saját eredményeink és irodalmi adatok igazolják, hogy a csontvelő mikrokörnyezete jobban hasonlít a nyirokcsomói follikulus környezetére, mint a parakortikális területére.13,14 A csontvelő tumorsejtjei CD21 és CD23 pozitív FDC-k közé ágyazódnak mind a paratrabekuláris, mind a follikuláris infiltrátumokban, hasonlóan a nyirokcsomói FL alapszerkezetéhez. A FDC-k jelenléte a csontvelő infiltrációban azt jelzi, hogy
a
FDC-k
a
FL
mikrokörnyezetének
nélkülözhetetlen
elemei,
feltételezhetően azért, mert a tumoros- nem tumoros sejtek kölcsönhatásai a tumoros B-sejtek apoptózisát meggátolják, és biztosítják a tumorsejtek túléléséhez szükséges antigén stimulust. 65 A tumorsejtek IgVH génjeiben zajló ongoing jellegű szomatikus hipermutáció a FL jól ismert jellegzetessége.15 Eredményeink alapján az IgVH gének ongoing szomatikus hipermutációja a csontvelői érintettség sejtjeinek is sajátja, a nyirokcsomóhoz hasonlóan. A csontvelői és nyirokcsomói klónok mutációs frekvenciája gyakorlatilag azonos tartományba esik, azonban a nyirokcsomói és csontvelői klónok intraklonális divergenciája nem egyezett, ami azt jelzi, hogy a szomatikus hipermutációs aktivitás a két helyen egymástól függetlenül működik. Az IgVH génekben található mutációs eloszlás, mind a csontvelőben, mind a nyirokcsomóban arra utalt, hogy a sejteken antigén szelekció zajlott. Ezek az eredmények szintén alátámasztják az elképzelést, miszerint a csontvelő olyan mikokörnyezetet biztosít, ahol a FL sejtek megőrzik biológiai sajátosságaikat. A FL sejtjeinek IgVH génjeiben leírt intraklonális divergencia alapján feltételezhető,16,61,66,67 hogy az ongoing szomatikus hipermutációs aktivitás a lymphoma kialakulása során megtartott.17 Ennek megfelelően, a különböző tumorklónok IgVH gén szekvenciái információt nyújthatnak a FL klonális evolúciójával kapcsolatosan.19,61,67 Annak érdekében, hogy további betekintést nyerhessünk a FL csontvelői érintettségének klonális szelekciós folyamatába és a klonális fejlődésbe, válogatott FL-ás esetek nyirokcsomói és párhuzamos
– 40 –
csontvelői biopsziás mintáiból nyert IgVH gén szekvenciák származási analízisét végeztük el. A filogenetikai fák mindhárom esetben kimutattak egy olyan csontvelői klónokból álló homogén csoportot, mely a származási fán korai leágazást ad. Ezek a csontvelői clusterek nem tartalmaztak nyirokcsomóból származó klónokat, ami azt jelzi, hogy a csonvelői infiltráció egy részének kialakulása a FL klonális evolúciójának korai eseménye, amely valószínűleg a nyirokcsomói tumorklónoktól függetlenül fejlődik ki. Ezek az eredmények nagyban alátámasztják azt az elképzelést, miszerint a FL szubklónjai esetleg elsődlegesen
a
csontvelőben
fejlődnek
ki,
és
ezek
a
klónok
nem
„metasztatizálnak” a nyirokcsomóba. Az eltérő klonotípusú tumorklónok fejlődése a nyirokcsomóban és a csontvelőben egybehanzik azzal a korábban leírt eredménnyel, mely szerint a FL-t két különböző klón alkotja és a klonális szelekció legalább két sejtcsoportban zajlik párhuzamosan. 61 A FL klonális terjedése során nagyfokú tumorsejt migráció jellemző a nyirokcsomói follikulusok, valamint a follikulusok és az interfollikuláris terek között.17,18,64 Vizsgálataink során bizonyítékot találtunk arra vonatkozóan, hogy a tumorsejtek migrálnak a nyirokcsomó és a csontvelő között ; a 14. esetben azonos tumorklónokat találtunk a nyirokcsomóban és a csontvelőben. Sajnálatosan, a származási fák alapján a migráció iránya nem állapítható meg. Nem azonosítottunk olyan IgVH gén szekvenciákat, amelyekben a mutációs mintázat arra utalna, hogy egy nyirokcsomói klón közvetlenül egy csontvelői klónból fejlődött volna ki, vagy fordítva, és a nyirokcsomói és csontvelői klónok nagy része nem azonosított közös ősöktől származott. Ezek alapján, elméletileg, a migráció mindkét irányban végbemehet. Egy korábbi hipotézis szerint a t(14 ;18) transzlokáció a D-JH vagy a VH DJH összekapcsolódás
hibájának
következtében
alakul
ki,
és
a
FL
lymphomagenezis kiindulópontjának tekinthető.10,36 A t(14 ;18) transzlokációt hordozó
pre-neoplasztikus
B-sejtek
bekerülnek
a
keringésbe,
és
a
nyirokcsomókba jutnak, ahol egy további genetikai behatás éri a sejtet –az FDC-ken keresztül történő antigén stimuláció révén– , melynek következtében neoplasztikus transzformáció következik be. 36, 45 ,61, 68
– 41 –
Egy másik feltevés szerint a FL kialakulása más útonvonalon zajlik. Jäger és mtsi -a t(14 ;18) töréspont szekvenciáknál jelenlévő error-prone templát függő nukleotid inzerciók alapján- azt a lehetőséget vetették fel, mely szerint a FL a nyirokcsomókban lévő post-follikuláris B-sejtekből fejlődik ki, a VD-J rekombináció és a szomatikus hipermutáció hibájának következtében.69 A csontvelő infiltráció kialakulásának magyarázatára Ghia és mtsi. az úgynevezett „importing modell”-t javasolták, melynek alapján a „nyirokcsomótapasztalt” FL sejtek magukkal hozzák a nyirokcsomóból azt a mikrokörnyezetet (FDC,
CD4
T-sejtek),
amely
elősegíti
a
tumorsejtek
növekedését
a
csontvelőben.27 Jelen tanulmányunk eredményei a FL csontvelői érintettségének pathogenezisébe engednek betekintést, és kialakulási útvonalaira vonatkozóan szolgálnak új megfigyelésekkel. Jelen vizsgálatunk eredményei arra utalnak, hogy a csontvelői infiltráció egy alternatív útvonalon keresztül jön létre. Abból, hogy a csontvelőben olyan tumorklónokat sikerült azonosítanunk, amelyek
nem
nyirokcsomói
eredetű
klónok
leszármazottai,
arra
következtethetünk, hogy a t(14;18) transzlokációt hordozó, keringő preneoplasztikus B-sejtek a csontvelőbe kerülhetnek (homing), vagy hogy esetleg nem is jutnak a keringésbe, hanem a csontvelőben maradnak. Ezeket a preneoplasztikus B-sejteket a csontvelőben jelen lévő FDC-ken keresztül antigén stimulus érheti, melynek eredményeként tumorsejtekké válnak. Kapasi és mtsi.70 szerint a csontvelőben FDC prekurzorok vannak jelen, és lehetséges, hogy az itt fejlődő pre-neoplaasztikus B-sejtek valamilyen módon indukálják vagy aktiválják őket, melynek következtében képesekké válnak a tumorsejtekké való transzformációra és a tumorsejtek túléléséhez szükséges mikrokörnyezet kialakítására (17.ábra).
– 42 –
CSONTVELŐ
NYIROKCSOMÓ
Pre-neoplasztikus B-sejt [ t(14;18) pozitív ] akiváció
FDC prekurzor
Antigén által mediált klonális szelekció
Follikuláris dendritikus sejt (FDC)
FDC
FL sejtek
FL sejtek
17. ábra: A FL csontvelői érintettségének kialakulási útvonala sematikusan A csontvelőbenben a B-sejtek nomál érése során a hibás VDJ rekombináció következtében t(14;18 )transzlokációt hozdozó, pre-neoplasztikus B-sejtek jönnek létre. Ezek a keringésen keresztül vagy a nyirokcsomóba kerülnek és FDC sejteken keresztül antigén által mediált klonális szelekció megy végbe, vagy a csontvelőben maradnak, ahol jelen vannak a FDC-k prekurzorai, melyeken keresztül ugyanez a folyamat végbemehet; így alakulnak ki a FL tumorsejtek. A nyirokcsomó tumorsejtjei a keringésen keresztül visszavándorolhatnak a csontvelőbe, ahol így heterogén populációt hoznak létre: nyirokcsomói származású és nyirokcsomótól független szubklónok egyaránt jelen vannak.
Eredményeink alapján, összefoglalva elmondható, hogy a FL csontvelői érintettségének kialakulásában a tumorsejtek klonális szelekciója fontos szerepet játszik. A csontvelő infiltrációt heterogén tumorsejt populáció alkotja, kialakulása a klonális evolúció különböző pontjain mehet végbe. A csontvelő olyan mikrokörnyezetet biztosít a FL sejtek számára, ahol azok biológiai jellege és
az
IgVH
gének
ongoing
hipermutációs
aktivitása
a
nyirokcsomói
tumorsejtekével megegyező. A FL csontvelői érintettségének kialakulására vonatkozó új elképzelésünk, mely arra utal, hogy a nyirokcsomói és csontvelői tumorsejtek klonális szelekciója különböző útvonalakon keresztül mehet végbe, magyarázatul szolgál a FL megjelenésének szisztémás természetére, valamint arra vonatkozóan is, hogy miért van gyakran a korai stádiumban lévő, alacsony tumor terhelésű betegeknek csontvelő infiltrációja.21
– 43 –
8.
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
antisense: 3’ primer bcl-2:
a 18-as kromoszómán kódolt onkoprotein
bcl-6:
a 3-as kromoszómán kódolt onkoprotein
BLAST:
Basic Local Alignment Search Tool
Cµ:
az immunglobulin nehézlánc gén konstitutív szakasza
CD:
„cluster of differentiation”, sejtdifferenciálódási immunológiai markerek
CDR:
antigén kötődésért / komplementaritásért felelős régió
CG:
centrum germinativum
c-myc:
onkogén
DLBL:
diffúz nagy B-sejtes lymphoma
DNS:
dezoxi-ribonukleinsav
dNTP:
dezoxi-nukleotidtrifoszfát
E. coli:
Escherichia coli
EDTA:
etilén-diamin-tetraecetsav
FDC:
follikuláris dendritikus sejt
FL:
follikuláris lymphoma
forward:
3’ primer
FR:
framework /szerkezeti régió
Ig:
immunglobulin
IgD:
immunglobulin izotípus
IgH:
immunglobiln nehézlánc gén
IgM:
immunglobulin izotípus
IgVH:
immunglobulin nehézlánc gén variábilis régió
IMGT:
International imMunoGeneTics information System
JH:
joining régió, az IgH kapcsolódási szakasza
lac:
β-galaktozidáz enzimet kódoló gén
LFA-1:
lymphocyte function-associated antigen 1
LFA-3:
lymphocyte function-associated antigen 1
– 44 –
MgCl2:
magnézium-klorid
NaCl:
nátrium-klorid
NCBI:
National Center for Biotechnology Information
p53:
tumorszuppresszor gén
PCR:
polimeráz láncreakció
R:
aminosav cserét létrehozó (replacement) mutáció
reverz:
5’ primer
S:
aminosav cserét nem okozó néma (silent) mutáció
sense:
5’ primer
SDS:
nátrium-dodecil-szulfát
TAE:
tris-(hidroximetil)-aminometán, ecetsav, EDTA keveréke
Taq:
Thermus aquaticus
TE:
tris-HCl és EDTA keveréke
Tris-HCl:
tris-(hidroximetil)-aminometán
szabad
bázisának
és
sójának
keveréke U:
nemzetközi egység
VH-D-JH:
az Ig gén variábilis, diverzitás és kapcsolódási régióinak egymás mellé kapcsolódása
WHO:
World Health Organization (Egészségügyi Világszervezet)
X-Gal:
5-brom-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
– 45 –
9.
IRODALOMJEGYZÉK
1. Harris NL, Jaffe ES, Stein H, Banks PM, Chan JK, Cleary ML, Delsol G, De Wolf-Peeters C, Falini B, Gatter KC. A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group. Blood 1994; 84: 1361-92. 2. Jones SE, Fuks Z, Bull M, Kadin ME, Dorfman RF, Kaplan HS, Rosenberg SA, Kim H. Non-Hodgkin's lymphomas. IV. Clinicopathologic correlation in 405 cases. Cancer 1973; 31: 806-23. 3. Horning SJ. Natural history of and therapy for the indolent non-Hodgkin's lymphomas. Semin Oncol 1993; 20: 75-88. 4. Hubbard SM, Chabner BA, Jr DeVita VT, Simon R, Berard CW, Jones RB, Garvin AJ, Canellos GP, Osborne CK, Young RC. Histologic progression in non-Hodgkin's lymphoma. Blood 1982; 59: 258-264. 5. Armitage JO, Cavalli F, Longo DL: Text atlas of lymphomas. Martin Dunitz Ltd., London, UK, 1999. 6. Jaffe ES, Harris NL, Harold S, Vardiman JW, eds. World Health Organization Classification of Tumours, Pathology & Genetics, Tumours of Haematopoetic and Lymphoid Tissues. Lyon, France, IARC Press, 2001; 162-167. 7. Mann RB, Berard CW. Criteria for the cytologic subclassification of follicular lymphomas: a proposed alternative method. Hematol Oncol 1983; 1: 187-92. 8. Bastion Y, Berger F, Bryon PA, Felman P, Ffrench M, Coiffier B. Follicular lymphomas: assessment of prognostic factors in 127 patients followed for 10 years. Ann Oncol 1991; 2: 123-9. 9. Martin AR, Weisenburger DD, Chan WC, Ruby EI, Anderson JR, Vose JM, Bierman PJ, Bast MA, Daley DT, Armitage JO. Prognostic value of cellular proliferation and histologic grade in follicular lymphoma. Blood 1995; 85: 3671-8. 10. Cong P, Raffeld M, Teruya-Feldstein J, Sorbara L, Pittaluga S, Jaffe ES. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood 2002; 99: 3376-82. – 46 –
11. Weiss LM, Warnke RA, Sklar J, Cleary ML. Molecular analysis of the t(14;18) chromosomal translocation in malignant lymphomas. N Engl J Med. 1987; 317(19):1185-9. 12. Chao DT, Korsmeyer SJ. BCL-2 family: regulators of cell death. Annu Rev Immunol. 1998;16:395-419. 13. West
RB,
Warnke
RA,
Natkunam
Y.
The
usefulness
of
immunohistochemistry in the diagnosis of follicular lymphoma in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol 2002; 117: 636-43. 14. Torlakovic E, Torlakovic G, Brunning RD. Follicular pattern of bone marrow involvement by follicular lymphoma. Am J Clin Pathol 2002; 118: 780-6. 15. Klein U, Goossens T, Fischer M, Kanzler H, Braeuninger A, Rajewsky K, Kuppers R. Somatic hypermutation in normal and transformed human B cells. Immunol Rev 1998; 162: 261-80. 16. Levy S, Mendel E, Kon S, Avnur Z, Levy R. Mutational hot spots in Ig V region genes of human follicular lymphomas. J Exp Med 1988; 168: 475-89. 17. Aarts WM, Bende RJ, Bossenbroek JG, Pals ST, van Noesel CJ. Variable heavy-chain gene analysis of follicular lymphomas: subclone selection rather than clonal evolution over time. Blood 2001; 98: 238-40. 18. Oeschger S, Brauninger A, Kuppers R, Hansmann ML. Tumor cell dissemination in follicular lymphoma. Blood 2002; 99: 2192-8. 19. Levy R, Levy S, Cleary ML, Carroll W, Kon S, Bird J, Sklar J. Somatic mutation in human B-cell tumors. Immunol Rev 1987; 96: 43-58. 20. Federico M, Vitolo U, Zinzani PL, Chisesi T, Clo V, Bellesi G, Magagnoli M, Liberati M, Boccomini C, Niscola P, Pavone V, Cuneo A, Santini G, Brugiatelli M, Baldini L, Rigacci L, Resegotti L. Prognosis of follicular lymphoma: a predictive model based on a retrospective analysis of 987 cases. Intergruppo Italiano Linfomi. Blood 2000; 95: 783-9. 21. Canioni D, Brice P, Lepage E, Chababi M, Meignin V, Salles B, Xerri L, Peaud PY, Rousselot P, Peuchmaur M, Solal-Celigny P, Brousse N. The Groupe d'Etude des Lymphomes Folliculaires Bone marrow histological patterns can predict survival of patients with grade 1 or 2 follicular
– 47 –
lymphoma: a study from the Groupe d'Etude des Lymphomes Folliculaires. Br J Haematol 2004; 126: 364-71. 22. Freedman AS, Munro JM, Morimoto C, McIntyre BW, Rhynhart K, Lee N, Nadler LM. Follicular non-Hodgkin's lymphoma cell adhesion to normal germinal centers and neoplastic follicles involves very late antigen-4 and vascular cell adhesion molecule-1. Blood 1992; 79(1):206-12. 23. Stein H, Gerdes J, Mason DY. The normal and malignant germinal centre. Clin Haematol 1982; 11(3):531-59. Review. 24. Cullen MH, Lister TA, Brearley RI, Shand WS, Stansfeld AG. Histological transformation of non-Hodgkin's lymphoma: a prospective study. Cancer 1979; 44(2):645-51. 25. Garvin AJ, Simon RM, Osborne CK, Merrill J, Young RC, Berard CW. An autopsy study of histologic progression in non-Hodgkin's lymphomas. 192 cases from the National Cancer Institute. Cancer 1983; 52(3):393-8. 26. Oviatt DL, Cousar JB, Collins RD, Flexner JM, Stein RS. Malignant lymphomas of follicular center cell origin in humans. V. Incidence, clinical features, and prognostic implications of transformation of small cleaved cell nodular lymphoma. Cancer 1984; 53(5):1109-14. 27. Ghia P, Granziero L, Chilosi M, Caligaris-Cappio F. Chronic B cell malignancies and bone marrow microenvironment. Semin Cancer Biol 2002; 12: 149-55. 28. Petrasch S, Stein H, Kosco MH, Brittinger G. Follicular dendritic cells in nonHodgkin lymphomas: localisation, characterisation and pathophysiological aspects. Eur J Cancer 1991; 27(8):1052-6. Review. 29. Angelopoulou MK, Kontopidou FN, Pangalis GA. Adhesion molecules in Bchronic lymphoproliferative disorders. Semin Hematol 1999; 36(2):178-97. Review. 30. Greeve J, Philipsen A, Krause K, Klapper W, Heidorn K, Castle BE, Janda J, Marcu KB, Parwaresch R. Expression of activation-induced cytidine deaminase in human B-cell non-Hodgkin lymphomas. Blood 2003; 101(9):3574-80.
– 48 –
31. Detry G, Drenou B, Ferrant A, Theate I, Michaux L, Scheiff JM, Latinne D, Leveugle P, Mazzon AM, Deneys V. Tracking the follicular lymphoma cells in flow cytometry: characterisation of a new useful antibody combination. Eur J Haematol 2004; 73(5):325-31. 32. Maio
M,
Pinto
A,
Carbone
A,
et
al.
Differential
expresison
of
CD54/intercellular adhesion molecule-1 in myeloid leukemias and in lymphoprolioferative disorders. Blood 1990; 76:783-90. 33. Picker LJ, Medeiros LJ, Weiss LM, et al. Expression of lymphocyte homing receptor antigen in non-Hodgkin's lymphoma. Am J Pathol 1988; 130:496504. 34. Hockenbery D, Nunez G, Milliman C, Schreiber RD, Korsmeyer SJ. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature 1990; 348(6299):334-6. 35. Tsujimoto Y, Cossman J, Jaffe E, Croce CM.Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma. Science 1985; 228(4706):1440-3. 36. Tsujimoto Y, Gorham J, Cossman J, Jaffe E, Croce CM. The t(14, 18) chromosome translocations involved in B-cell neoplasms result from mistakes in VDJ joining. Science 1985; 229: 1390-3. 37. Tsujimoto Y, Croce CM. Analysis of the structure, transcripts, and protein products of bcl-2, the gene involved in human follicular lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A 1986;83(14): 5214-8. 38. Sander CA, Yano T, Clark HM, Harris C, Longo DL, Jaffe ES, Raffeld M. p53 mutation is associated with progression in follicular lymphomas. Blood 1993; 82(7): 1994-2004. 39. Richardson ME, Chen QG, Filippa DA, Offit K, Hampton A, Koduru PR, Jhanwar SC, Lieberman PH, Clarkson BD, Chaganti RS. Intermediate- to high-grade histology of lymphomas carrying t(14;18) is associated with additional nonrandom chromosome changes. Blood 1987; 70(2): 444-7. 40. Armitage JO, Sanger WG, Weisenburger DD, Harrington DS, Linder J, Bierman PJ, Vose JM, Purtilo DT. Correlation of secondary cytogenetic abnormalities with histologic appearance in non-Hodgkin's lymphomas bearing t(14;18)(q32;q21). J Natl Cancer Inst 1988; 80(8): 576-80.
– 49 –
41. Yunis JJ, Frizzera G, Oken MM, McKenna J, Theologides A, Arnesen M. Multiple recurrent genomic defects in follicular lymphoma. A possible model for cancer. N Engl J Med 1987; 316(2): 79-84. 42. Lo Coco F, Gaidano G, Louie DC, Offit K, Chaganti RS, Dalla-Favera R. p53 mutations are associated with histologic transformation of follicular lymphoma. Blood 1993; 82(8): 2289-95. 43. Matolcsy A, Udvardy M, Kopper L. Hematológiai betegségek atlasza, 263267. oldal. Medicina könyvkiadó Rt., Budapest 2006. 44. Yano T, Jaffe ES, Longo DL, Raffeld M. MYC rearrangements in histologically progressed follicular lymphomas. Blood 1992; 80(3): 758-67. 45. Bahler DW, Levy R. Clonal evolution of a follicular lymphoma: evidence for antigen selection. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 6770-4. 46. Berek C, Berger A, Apel M. Maturation of the immune response in germinal centers. Cell 1991; 67(6): 1121-9. 47. Liu YJ, Joshua DE, Williams GT, Smith CA, Gordon J, MacLennan IC. Mechanism of antigen-driven selection in germinal centres. Nature 1989; 342(6252): 929-31. 48. Gray D, Bergthorsdottir S, van Essen D, Wykes M, Poudrier J, Siepmann K.Observations on memory B-cell development. Semin Immunol 1997; 9(4): 249-54. Review. 49. McHeyzer-Williams LJ, McHeyzer-Williams MG. Antigen-specific memory B cell development. Annu Rev Immunol 2005; 23: 487-513. Review. 50. Both GW, Taylor L, Pollard JW, Steele EJ. Distribution of mutations around rearranged heavy-chain antibody variable-region genes. Mol Cell Biol 1990; 10(10): 5187-96. 51. Stamatopoulos K, Kosmas C, Belessi C, Stavroyianni N, Kyriazopoulos P, Papadaki T. Molecular insights into the immunopathogenesis of follicular lymphoma. Immunol Today 2000; 21(6): 298-305. Review. 52. Szereday Z, Csernus B, Nagy M, Laszlo T, Warnke RA, Matolcsy A. Somatic mutation of the 5' noncoding region of the BCL-6 gene is associated with intraclonal diversity and clonal selection in histological transformation of follicular lymphoma. Am J Pathol 2000; 156(3) :1017-24.
– 50 –
53. Bindl JM, Warnke RA. Advantages of detecting monoclonal antibody binding to tissue sections with biotin and avidin reagents in Coplin jars. Am J Clin Pathol 1986; 85: 490-3. 54. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988; 16: 1215. 55. Deane M, Norton JD. Immunoglobulin heavy chain variable region family usage is independent of tumor cell phenotype in human B lineage leukemias. Eur J Immunol 1990; 20: 2209-17. 56. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74(12): 5463-7. 57. Gergely János, Erdei Anna: Immunbiológia. Medicina, Budapest, 2000. 58. Manser T. Evolution of antibody structure during the immune response. The differentiative potential of a single B lymphocyte. J Exp Med 1989; 170(4): 211-30. 59. Weiss U, Rajewsky K. The repertoire of somatic antibody mutants accumulating in the memory compartment after primary immunization is restricted through affinity maturation and mirrors that expressed in the secondary response. J Exp Med 1990; 172(6): 1681-9. 60. Chang B, Casali P. The CDR1 sequences of a major proportion of human germline Ig VH genes are inherently susceptible to amino acid replacement. Immunol Today 1994; 15: 367-73. 61. Zelenetz AD, Chen TT, Levy R. Clonal expansion in follicular lymphoma occurs subsequent to antigenic selection. J Exp Med 1992; 176: 1137-1148. 62. Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker HH, Schwab U, Stein H. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 1984; 133: 1710-5. 63. Silvestrini R, Costa A, Giardini R, Boracchi P, Del Bino G, Marubini E, Rilke F. Prognostic implications of cell kinetics, histopathology and pathologic stage in non-Hodgkin's lymphomas. Hematol Oncol 1989; 7(6):411-22.
– 51 –
64. Dogan A, Du MQ, Aiello A, Diss TC, Ye HT, Pan LX, Isaacson PG. Follicular lymphomas contain a clonally linked but phenotypically distinct neoplastic Bcell population in the interfollicular zone. Blood 1998; 91: 4708-14. 65. Ghia P, Caligaris-Cappio F. The indispensable role of microenvironment in the natural history of low-grade B-cell neoplasms. Adv Cancer Res 2000; 79: 157-73. 66. Zhu D, Hawkins RE, Hamblin TJ, Stevenson FK. Clonal history of a human follicular lymphoma as revealed in the immunoglobulin variable region genes. Br J Haematol 1994; 86: 505-12. 67. Ottensmeier CH, Thompsett AR, Zhu D, Wilkins BS, Sweetenham JW, Stevenson FK. Analysis of VH genes in follicular and diffuse lymphoma shows ongoing somatic mutation and multiple isotype transcripts in early disease with changes during disease progression. Blood 1998; 91: 4292-9. 68. Bertoli LF, Kubagawa H, Borzillo GV, Burrows PD, Schreeder MT, Carroll AJ, Cooper MD. Bone marrow origin of a B-cell lymphoma. Blood 1988; 72: 94-101. 69. Jäger U, Böcskör S, Le T, Mitterbauer G, Bolz I, Chott A, Kneba M, Mannhalter C, Nadel B. Follicular lymphomas' BCL-2/IgH junctions contain templated nucleotide insertions: novel insights into the mechanism of t(14;18) translocation. Blood 2000; 95: 3520-9. 70. Kapasi ZF, Qin D, Kerr WG, Kosco-Vilbois MH, Shultz LD, Tew JG, Szakal AK. Follicular dendritic cell (FDC) precursors in primary lymphoid tissues. J Immunol 1998; 160: 1078-84.
– 52 –
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
Az értekezés témájában megjelent közlemények Á Bognár, B Csernus, Cs Bödör, L Reiniger, Á Szepesi, E Tóth, L Kopper, A Matolcsy: Clonal Selection int he bone marrow infiltration of follicular lymphoma. Leukemia 19: 1656-1662, 2005. (IF: 5,81)
B Csernus, B Timár, Z Fülöp, Á Bognár , Á Szepesi, T László, P Jáksó, R Warnke, L Kopper , A Matolcsy: Mutational analysis of IgVH and BCL-6 genes suggests thymic B-cell origin of mediastinal (thymic ) B-cell lymphoma. Leukemia & Lymphoma 45 (10), 2105-2110, 2004. (IF: 1,147)
B Timár, Z Fülöp, B Csernus ,C Angster , Á Bognár , Á Szepesi , L Kopper , A Matolcsy: Relationship between the mutational status of VH genes and pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma in Richer’s syndrome. Leukemia 18: 326-330, 2004. (IF: 5,81) Egyéb témában megjelent közlemények L Reiniger,Cs Bodor , Á Bognár, Z Balogh, J Csomor, Á Szepesi, L Kopper, A Matolcsy. Richter's and prolymphocytic transformation of chronic lymphocytic leukemia are associated with high mRNA expression of activation-induced cytidine deaminase and aberrant somatic hypermutation. Leukemia.: 20(6): 1089-95, 2006. (IF: 5,81) Cs Bödör, Á Bognár, L Reiniger, Á Szepesi, E Tóth, L Kopper, A Matolcsy: Aberrant somatic Hypermutation and expression of activation-induced cytidine deaminase, RNA in mediastinal large B-cell lymphoma. British Journal of Haematology 129: 373-376, 2005. (IF: 3,195)
– 53 –
11. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Ezúton szeretném megköszönni Dr. Kopper Lászlónak, a Semmelweis Egyetem I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet igazgatójának, hogy PhD tanulmányaimat intézetében végezhettem. Köszönettel tartozom laborvezetőnknek, Dr. Matolcsy Andrásnak, lelkes támogatásáért,
munkám
gondos
irányításáért,
türelméért,
tanácsaiért.
Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Szepesi Ágotának, aki őszinte véleményével segítette munkámat, és mindig hozzájárult ügyeim gördülékeny menetéhez. Szeretném megköszönni Dr. Csomor Juditnak az építő beszélgetéseket és az „anyai“ gondoskodást. Bárányné Pallag Adriennek
és Lengyel Anikónak lelkiismeretes
laboratóriumi munkájáért tartozom köszönettel. Köszönöm a szakmai és emberi támogatást, az együtt töltött vidám perceket barátaimnak és kollégáimnak, Dr. Reiniger Lillának, Bödör Csabának, Dr. Angster Christinenek, Dr. Fülöp Zsoltnak, Dr. Timár Botondnak, Dr. Csernus Balázsnak. Köszönöm szüleimnek, hogy gyökereket és szárnykat adtak, és bíztak bennem, hogy jól használom őket, és köszönöm férjemnek, aki feltétel nélkül hisz bennem és döntéseimben.
– 54 –
