1
KESTABILAN PEWARISAN GEN entC DAN pmsB PADA PADI TRANSGENIK GENERASI KETIGA (T2)
INDRA BAYU NAFARI
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
2
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa Kestabilan Pewarisan Gen entC Dan pmsB Pada Padi Transgenik Generasi Ketiga (T2) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Bogor, Februari 2006 Indra Bayu Nafari NIM G44101011
3
KESTABILAN PEWARISAN GEN entC DAN pmsB PADA PADI TRANSGENIK GENERASI KETIGA (T2)
INDRA BAYU NAFARI
Skripsi Sebagai salah satu syarat melaksanakan penelitian Untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
4 Judul skripsi : Kestabilan Pewarisan Gen entC Dan pmsB Pada Padi Transgenik Generasi Ketiga (T2) Nama : Indra Bayu Nafari NIM : G44101011
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof.Dr.H.Norman R.Azwar Ketua
Enung Sri Mulyaningsih SP, M.Si Anggota
Diketahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir.Yonny Koesmaryono,MS. NIP 131 473 999
Tanggal Lulus :
5
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... ii DAFTAR TABEL ............................................................................................ ii DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... ii PENDAHULUAN ...........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Transgenik ............................................................................... Interaksi Tanaman dan Patogen ............................................................. Penyakit Blas ......................................................................................... Asam Salisilat ........................................................................................ Southern Blot .......................................................................................... Gen hpt Penyandi Higromisin Fosfotransferase .....................................
2 3 3 4 5 6
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ........................................................................................ Metode Penelitian ..................................................................................
6 6
HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Higromisin ........................................................................................ Uji Hayati dengan Cendawan Blas ......................................................... Southern blot ...........................................................................................
10 10 12
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................
15
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... LAMPIRAN ....................................................................................................
15 18
6
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Peta plasmid oleh penyandi asam salsilat pmsB dan entC ......................... 1 2 Prosedur untuk mengembangkan tanaman padi transgenik .......................
2
3 Daun padi CO39 .........................................................................................
3
4 Daun yang terserang blas ...........................................................................
4
5 Proses infeksi konidia.................................................................................
4
6 komunikasi systemic acquired resistance (SAR) .......................................
5
7 Susunan perangkat bloting membran .........................................................
9
8 Daun yang tersisipi gen hpt mengalami nekrotik (kiri) dan yang tersisipi gen hpt ........................................................................................................
10
9 Hasil pengamatan uji higromisin................................................................
10
10 Hasil isolasi dan purifikasi DNA ...............................................................
13
11 Hasil pemotongan plasmid genom dengan enzim Hind III yang disusun antara DNA potongan dan DNA tidak dipotong ........................................
13
12 DNA fragmen hasil PCR yang digunakan sebagai probe ..........................
16
13 DNA genom hasil pemotongan setelah dielektroforesis selama 18 jam dan setelah proses transblot...............................................................................
13
14 Hasil foto southern dari membran ..............................................................
14
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil pengamatan uji skor blas padi pada daun 1 ...................................... 11 2 Hasil pengamatan uji skor blas padi pada daun 2 ......................................
11
3 Hasil pengamatan uji skor blas padi pada daun 3 ......................................
12
4 Data hasil Southern, uji higromisin dan uji blas untuk galur E.10.1.43.8 E.10.1.27.11, E.10.1.5.15, C.30.1.2.29, E.10.1.10.29................................
15
DAFTAR LAMPIRAN
7 Halaman 1 Data uji lapangan higromisin ..................................................................... 18 2 Jalur sintesis asam salisilat .........................................................................
20
3 Gambar plasmid pCAMBIA 1300 .............................................................
21
8 PRAKATA Alhamdulillah, segala puji hanyalah milik Allah Rabbul ‘Alamin yang telah memberikan rahmat dan karunia kepada penulis sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekular Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI mulai bulan Oktober hingga Desember 2005 dengan judul : Kestabilan Pewarisan Gen entC dan pmsB Pada Padi Transgenik Generasi Ketiga (T2). Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Prof.Dr.H.Norman R.Azwar selaku dosen pembimbing yang telah memberikan saran dan kritik serta arahannya, Ibu Enung Sri Mulyaningsih S.P, M.Si selaku pembimbing yang telah menerima dan membimbing penulis selama melakukan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada banyak pihak di Laboratorium Molekular Bioteknologi LIPI kepada Ibu Inez H.Loedin selaku Kepala Laboratorium Molekular Bioteknologi LIPI, para staf peneliti: Ibu Ami, Deswina, Syamsidah,Mas Satya, Sigit, Agus, dan kepada kakak kakak:Mbak Anky, Dwi, Carla, Yuli,Fatimah ,Cahya ,Eva, ,Sri ,Mas Opik ,Budi ,Dadang yang telah membantu kelancaran penelitian ini, juga kepada Widyo atas bantuan, pengertian dan dorongannya. Ucapan terima kasih yang terpenting kepada ibu dan bapak atas restu ,doa dan dukungan yang diberikan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Februari 2006
Indra Bayu Nafari
9
ABSTRAK INDRA BAYU NAFARI. Kestabilan Pewarisan Gen entC dan pmsB Pada Padi Transgenik Generasi Ketiga (T2). Dibimbing oleh NORMAN R.AZWAR dan ENUNG SRI MULYANINGSIH. Sejak abad 19 asam salisilat telah diidentifikasi dari tanaman tersebut sebagai zat aktif di dalam berbagai macam proses fisiologi, seperti penutupan stomata, pembentukan bunga, proses ketahanan terhadap panas dan berperanan penting dalam pertahanan terhadap serangan pathogen. Pada penelitian dilakukan uji hayati terhadap cendawan P.oryzae, analisis ketahanan higromisin sebagai gen penanda dan analisis Southern blot untuk melihat jumlah salinan dan integrasi gen penanda hpt maupun gen penyandi asam salisilat (pmsB dan entC ) Hasil yang didapat dari analisis molekular menunjukan gen higromisin 2 galur transgenik (E.10.1.27 dan E.10.1.43) terekspresi dengan baik dan pola segregasinya mengikuti hukum Mendel (3:1), sedangkan berdasarkan uji hayati dengan cendawan blas diperoleh satu galur unggulan tahan (E.10.1.5). Pengamatan tingkat ketahanan pada tanaman yang dapat dijadikan patokan adalah pengamatan padi daun pertama, sedangkan pada daun yang lebih muda tidak dapat dijadikan patokan. Hasil Southern menunjukan bahwa dengan menggunakan probe hpt terdapat jumlah salinan gen masing-masing 1, yaitu pada sub galur C.30.1.2.29, E.10.1.5.15, E.10.1.10.29, E.10.1.43.8 sedangkan dengan pmsB diperoleh 3 galur yaitu C.30.1.2.29, E.10.1.15 dan E.10.1.10.29 dengan jumlah salinan DNA masing-masing 1.
.
10
ABSTRACT INDRA BAYU NAFARI. The Stability of entC and pmsB Genes Inheritance From The Third Generation Transgenic Rice (T2). Under direction by NORMAN R.AZWAR and ENUNG SRI MULYANINGSIH. Since the 19th centuris, salicylic acid has been identified as an active compound responsible for numerous of biological activity such as closingopening movement of stomata, flower growth, heat resistance and induced systemic resistance from pathogen attack. Bioassay was done to P.oryzae fungus, higromycin bioassay as the marker gene and Southern blot analysis to check the copy number and integration of hpt or pmsB genes. The result from molecular analysis show 2 strain of transgenic plant (E.10.1.27 and E.10.1.43) was integrated by higromycin gene (hpt), the phenotype is expressed and segregation accordance to the Mendell law. From blast attack bioassay show one strain that has highest score in blast attack resistance (E.10.1.5). From field observation in blast attack scoring only the first leave from plant that can be used as standard, because the miscorrelation in data scoring from control and transgenic sample plant, that is the youngest leave (planula). From Southern blot molecular analysis show four sub strain (C.30.1.2.29, E.10.1.5.15, E.10.1.10.29, E.10.1.43.8) with one copy of hpt gene, and three sub strain show one copy integration of pmsB gene C.30.1.2.29, E.10.1.15 dan E.10.1.10.29.
11
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Samarinda pada tanggal 09 Januari 1984 dari Ayah Muhtadin Nafari dan Ibu Ernawati Said. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 1989 penulis lulus dari TK Cendrawasih Jaya Bekasi, kemudian masuk SD Negeri 1 Biak dan lulus pada tahun 1995, dilanjutkan ke SLTP Negeri 2 Jayapura hingga tahun 1998, dan kemudian masuk SMU PSKD 4 Jakarta Selatan hingga lulus pada tahun 2001. pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor pada program Studi Biokimia (Sekarang menjadi Departemen), Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam melalui jalur USMI .
12 PENDAHULUAN Pada abad ke 21 populasi penduduk dunia diperkirakan akan meningkat dengan dramatis. Seiring dengan keadaan tersebut maka diperlukan peningkatan dalam total produksi pangan dunia. Tetapi ketersediaan lahan produktif dan lingkungan agrikultural tidak akan dalam keadaan seimbang karena adanya kemajuan industrialisasi. Penggunaan pestisida dan pupuk yang mendorong revolusi hijau pada abad ke 20 mulai ditinggalkan karena ada kekhawatiran penumpukan bahan kimia di dalam tubuh yang mengakibatkan berbagai macam komplikasi penyakit antara lain alergi, kanker dan kerusakan syaraf. Perakitan tanaman transgenik secara bioteknologi diyakini memberi harapan masa depan bagi penyediaan pangan dan lingkungan alam yang bersih. Tanaman hasil rekayasa genetik yang diproduksi secara umum antara lain tomat Flavr Savr® yang tahan pemasakan, kacang kedelai tahan herbisida, jagung tahan hama serangga.. Di Indonesia tanaman padi transgenik telah diperoleh Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, salah satu tanaman transgenik tersebut adalah yang mengandung gen gen penyandi asam salisilat (entC dan pmsB) untuk ketahanan terhadap penyakit blas. Penyakit blas (Magnaporthe grisea/Pyricularia oryzae) merupakan salah satu penyakit utama padi yang diakibatkan oleh cendawan yang berasal dari famili ascomycetes. Menurut statistik penyakit tanaman ini telah memusnahkan beras yang cukup untuk dikonsumsi oleh 60 juta masyarakat dunia. Penyakit ini telah lama dilaporkan sebagai penyakit penting baik pada padi gogo maupun padi sawah diseluruh dunia. Berbagai usaha telah dilakukan untuk mencegah penyakit tanaman ini, antara lain dengan menggunakan fungisida anti blas, pupuk dengan kadar nitrogen tinggi dan varietas tanaman padi yang kebal terhadap serangan M. grisea, namun menurut penelitian tanaman padi dan jenis fungi ini telah berkembang bersama sama selama jutaan tahun sehingga fungi ini memiliki kemampuan yang sangat luar biasa dalam berevolusi dan menembus pertahanan yang dibangun oleh tanaman padi (Ou 1985) penyakit blas memiliki indikasi berupa bercak–bercak berwarna putih dan abu-abu pada daun. Bercak tersebut dapat berupa elips dengan warna bagian tengah abu abu keputihan dan bagian tepi coklat kemerahan sebagai tanda bahwa daun mengalami keadaan nekrotik. Penyakit ini dapat menyebabkan kerapuhan pada butiran beras
menginfeksi batang dan akar sehingga tanaman menjadi rapuh dan hancur pada seluruh permukaan daun yang berakibat produktivitas tanaman padi menurun. Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (2002), intensitas kerusakan tertinggi akibat blas di pulau Jawa dan luar Jawa adalah 12,75% (Jawa Barat) dan 32,75% (Riau). Kerugian akibat penyakit blas cukup besar dibandingkan dengan penyakit lainnya (Ou 1972.) Jika intensitas penyakit ini meningkat, stabilitas produksi yang tinggi akan terancam dan dapat mengganggu ketahanan pangan. Salah satu upaya yang dilakukan untuk mengatasi penyakit blas adalah dengan merakit tanaman yang tahan terhadap serangan cendawan melalui rekayasa DNA seperti yang dilakukan di Puslit Bioteknologi LIPI. Gen yang terkait dalam biosintesis asam salisilat ialah gen entC (yang di produksi oleh Escheria coli) dan pmsB ( asal Pseudomonas flourosens). Tanaman yang akan diuji pada penelitian ini merupakan turunan ke tiga (T2). Asam salisilat yang dihasilkan, menurut hasil penelitian terbaru dapat mengaktifkan suatu mekanisme sistem kekebalan tanaman terhadap patogen yang disebut ISR (induced systemic resistence) atau SAR (systemic acquired resistance) (Verberne et al. 2005). Transformasi kaset gen penyandi asam salisilat dilakukan melalui Agrobacterium tumefaciens dengan menyisipkan kaset tersebut (Gambar 1) pada vektor ganda pCAMBIA 1300 Pada penelitian ini akan dilakukan bioassay terhadap cendawan P. oryzae, analisis ketahanan higromisin sebagai gen penanda, analisis Southern blot untuk melihat jumlah salinan dan integrasi gen penanda hpt maupun gen penyandi asam salisilat (pmsB dan entC ) Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa pola segregasi gen hpt (penanda) pada generasi ketiga (T2) padi transgenik. Menguji ketahanan tanaman padi tersebut terhadap serangan blas. Mengetahui jumlah salinan gen pmsB dan hpt. Ekspresi gen gen penyandi asam salisilat berpengaruh meningkatkan mekanisme
Gambar 1. Peta plasmid kaset penyandi asam salisilat pmsB dan entC
13 ketahanan terhadap cendawan P. oryzae dibandingkan tanaman kontrol. Integrasi gen entC dan pmsB dan gen penanda hpt yang telah diintroduksi pada tanaman padi bersifat stabil pada generasi ketiga (T2) dan diwariskan pada turunanya.
TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Transgenik Sejak awal abad ke 20, identifikasi fungsi gen telah dilakukan dengan identifikasi genomik, proteomik dan metabolimik (Choi et al. 2005) semua data didapatkan dari studi yang terintegrasi dan teranalisis secara bioinformatik. Informasi genetik dari padi dan Arabidopsis diaplikasi ke dalam studi genom tanaman padi (Choi et al. 2005). Berbagai usaha telah dikembangkan untuk membantu perkembangan bioteknologi tanaman padi diantaranya pengembangan ESTs (experienced sequence tags), mikroaray dan sebagainya. Fungsi genomik telah dipelajari dalam skala besar dan beberapa tingkat ekspresi gen tertentu secara diferensial dalam berbagai tahap perkembangan genomik
Berbagai hasil studi dari struktur dan fungsi genom telah diaplikasi ke dalam bioteknologi terutama pertanian (Gambar 2). Istilah tanaman transgenik dalam pengertian luas dipakai untuk tanaman yang memiliki gen asing yang terintegrasi ke dalam genom tanaman dan gen tersebut berfungsi (Uchimiya et al. 1989 dalam Aswidinnoor 1995). Berbagai metode saat ini telah dikembangkan dan digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik baik melalui transformasi langsung maupun tidak langsung (Herman 1996). Transformasi secara langsung antara lain dengan elektroporasi, fusi dengan PEG (polietilen glikol), mikro injeksi dan penembakan DNA. Transformasi gen secara tidak langsung ialah melalui vektor A. tumefaciens. Perakitan tanaman padi transgenik dapat menggunakan gen gen yang berasal dari tanaman padi itu sendiri, atau dari sumber lainya (misalnya bakteri atau tanaman lain). Gen gen yang telah teridentifikasi dan terkarakterisasi kemudian ditransformasikan ke dalam kromosom tanaman padi.. Metode yang banyak digunakan adalah dengan Agrobacterium dan penembakan DNA (Choi et al. 2005).
Gambar 2. Prosedur untuk mengembangkan tanaman padi transgenik. (Choi et al. 2005)
14 Interaksi Tanaman dan Patogen Pemuliaan tanaman untuk ketahanan terhadap blas telah banyak dilakukan pada berbagai jenis tanaman padi. Hal ini dilakukan karena secara alami tidak menunjukan hasil yang menggembirakan dalam ketahanan terhadap semua ras cendawan ini. Menurut penelitian Departement of Plant Phatology, pertahanan yang dirangsang oleh asam salisilat dibantu oleh gen-gen yang menghasilkan asam salisilat (SA), asam jasmonik ( JA), etilen dan asam absisat (AA). Masing masing zat tersebut memiliki fungsi yang terkoordinasi untuk membentuk pertahanan padi terhadap serangan blas. Asam salisilat berfungsi sebagai inducer dan sebagai antioksidan yang melindungi padi dari stres oksidatif serta modul penyeimbang reaksi redox, asam jasmonik dan etilen muncul sebagai pemberi sinyal pada sistem pertahanan tanaman dengan mengaktifkan sintesis Allene oksida sintetase yang akan meningkatkan pertahanan padi pada cendawan. Gen lain yang diduga berperan dalam ketahanan tanaman padi terhadap cendawan M. grisea ialah gen Rir1b yang berasal dari jagung. Gen ini berperan dalam ketahanan tanaman padi terhadap zat hidrogen peroksida yang akan dihasilkan oleh cendawan, zat tersebut adalah pigmen flavonoid seperti antosianin ungu (Choi et al. 2005) Dalam usaha memerangi penyakit blas, para peneliti di seluruh dunia lebih berkonsentrasi dalam merakit varietas tanaman padi melalui bioteknologi dan rekayasa genetika dan terus mengadakan penelitian tentang susunan genom dari cendawan. Beberapa penelitian yang baru dilakukan dan dipublikasikan oleh Universitas Purdue Amerika Serikat menyebutkan bahwa ada suatu enzim di dalam padi yang berfungsi sebagai kunci dalam mengkoordinasikan serangan cendawan, yang disebut pathogenity mitogen-activated protein (MAP). Enzim ini memperantarai komunikasi molekuler antara tanaman padi dan cendawan (Zhao et al. 2005). Oleh karena itu cendawan dapat mengetahui cara yang diperlukan untuk menembus pertahanan yang dibentuk oleh tanaman padi dan berevolusi. Cendawan tersebut juga memiliki sejenis protein yang dapat berfungsi sebagai ”perasa” dan memberi tahu apakah tanaman padi tersebut merupakan inang yang baik dan bagaimana mengatasi pertahanan yang dibangun oleh tanaman itu. Beberapa peneliti juga mengungkapkan bahwa M. grisea hanya
memiliki perbedaan 40 juta pasang basa dalam susunan DNAnya dengan sepupunya Neurospora cassa (Dalke 2002) dengan demikian dari 2 jenis patogen tersebut akan diperoleh informasi bagaimana sistem patogen tersebut bekerja. Suatu penelitian yang baru saja dipublikasi oleh ARS Cereal Crops Research Unit, menyebutkan bahwa tanaman padi dan cendawan M. grisea telah berevolusi berdampingan sejak berjuta juta tahun lalu. Tanaman padi secara reflek melepaskan pertahanan jika ada gen yang menyadikan molekul atau protein patogen yang diproduksi oleh cendawan. Gen yang menyandikan pertahanan pada tanaman disebut gen R, sedangkan gen yang menyandikan penghasil zat patogen pada cendawan adalah gen Avr, tetapi masalahnya bahwa gen Avr sangat ”cocok” dengan gen R, gen Avr dapat mengirimkan sinyal dan ”mematikan” ekspresi gen R. Seperti yang terlihat pada Gambar 3. Daun dari varietas CO39 yang memiliki kekebalan terhadap patogenitas cendawan M. grisea karena dapat mematikan fungsi dari gen Avr cendawan. Kegiatan uji ketahanan dilakukan sebagai upaya dalam mengetahui tingkat ketahanan terhadap serangan pathogen. Pengujian dilakukan dengan cara menyemprotkan cairan konidia. Kemudian penilaian akan dilakukan dengan cara skoring. Tanaman yang dinilai tahan terhadap penyakit blas memiliki skor 1-3 sedangkan yang rentan memiliki skor 4-10 (IRTP 1988).
Gambar 3 . Daun padi CO39 , bintik hitam menunjukan sel M. grisea yang mati Penyakit Blas Penyakit blas yang disebabkan untuk cendawan (P. Oryzae cavara (anamorph) atau M. grisea (T.T Herbert)), merupakan salah satu penyakit tanaman padi yang sangat merugikan. Laporan terakhir menyebutkan cendawan ini telah mengakibatkan kerusakan pada tanaman padi yang cukup untuk dikonsumsi oleh kurang lebih 60 juta orang
15 (Choi 2005). Cendawan ini menyerang dan membentuk bercak pada daun, batang, malai, bunga dan biji. Cendawan ini menghasilkan konidiaspora yang pada tahap infeksi akan membentuk suatu struktur yang disebut appresorium yang berbentuk balon. Appresorium akan menembus permukaan daun dan berkembang menjadi besar seiring dengan bertambahnya jumlah spora, ketika appresorium pecah karena tekanan turgor yang terlalu tinggi (Gambar 4). Tekanan yang dihasilkan sangat besar, lebih besar 40 kali dari tekanan di dalam ban sepeda (Zhao 2005) Cendawan M. grisea juga menyerang berbagai macam tanaman Bercak pada pelepah daun jarang ditemukan. Bentuk khas bercak blas adalah elips yang kedua ujungnya kurang lebih runcing. Bercak yang telah berkembang pada bagian tepi berwarna coklat dan bagian tengah berwarna putih keabuan (Gambar 5). Dalam keadaan lembab bercak akan terus membesar terutama pada varietas peka (Amir dan Kardin 1991). Pada varietas padi peka, bercak tersebut dapat meluas dan bersatu sehingga akhirnya helai daun mengering dan mati. Pada padi yang tahan, gejala serangan hanya berupa bintik kecil berwarna coklat (Ou 1972). Spora cendawan secara alami menyebar mulai tengah malam karena adanya embun atau hujan (Hashioka 1963). M. grisea juga menyerang banyak tanaman lain selain padi. Penyebaran spora akan bertambah banyak sampai menjelang pagi hari dan berakhir pada saat terbit matahari. Pelepasan spora di daerah tropis dapat terjadi pula pada siang hari setelah turun hujan. Pada periode embun ini sangat berpengaruh terhadap pelepasan spora dan infeksi. Jika periode embun lebih lama, spora yang dilepaskan lebih banyak karena kelembaban akan bertambah sehingga infeksi yang terjadi semakin parah (IRRI 1975). Penyebaran spora dapat terjadi juga oleh angin, biji dan jerami sakit. Cendawan
Gambar 5.Proses infeksi konidia (Choi 2005)
Gambar 4. Daun yang terserang blas . Sumber: (Choi 2005) P. oryzae dapat bertahan dalam sisa jerami sakit dan gabah sakit selama lebih dari satu tahun pada suhu kamar. Sedangkan dalam bentuk miselia mampu bertahan sampai lebih dari tiga tahun (Amir dan Kardin 1991). Asam Salisilat (SA) Selama berabad abad telah diketahui bahwa mengunyah batang dari pohon willow (Sallix) dapat menghilangkan sakit kepala dan demam, dan pada abad ke 19 asam salisilat telah diidentifikasi dari tanaman tersebut sebagai zat aktif di dalam berbagai macam proses fisiologi, seperti penutupan stomata , pembentukan bunga , proses ketahanan terhadap panas dan berperanan penting dalam pertahanan terhadap serangan pathogen. Ketika tanaman dalam keadaan diserang oleh suatu patogen, maka tanaman akan bereaksi dengan mengeluarkan ekspresi nekrotik untuk mengurung dan mencegah sumber infeksi untuk menyebar luas. Kemudian tanaman akan mengaktifkan systemic acquired resistance (SAR) (Gambar 6), yang mekanisme lengkapnya masih menjadi misteri tetapi telah diketahui bahwa zat kimia yang mengaktifkan siklus ini adalah asam salisilat. Metabolisme asam salisilat diawali dengan pembentukan asam shikimat (Lampiran 2), penambahan gen entC dan pmsB, yang masing masing akan membetuk enzim isokorismat sintase dan isokrimat piruvat liase, yang memotong jalur lintasan metabolisme asam salisilat sehingga biosintesisnya lebih cepat dan efisien.
16
Gambar 6 . Jalur komunikasi systemic acquired resistance (SAR) yang diawali pengaktifan pada tahap signal oleh asam salisilat (SA).(Verberne 2005) Southern Blot Southern blot adalah teknik analisis molekular yang ditemukan pertama kali oleh Edward M.Southern pada tahun 1970 di Universitas Edinburgh. Southern blot telah lama dikenal sebagai salah satu landasan analisis DNA. Transfer Southern blot dan teknik hibridisasi yang berkaitan telah dimanfaatkan untuk memperoleh informasi tentang organisasi fisik sekuen tunggal dan ganda pada kompleks genom, mempercepat suksesnya percobaan kloning pada gen eukariot (Doel et al. 1977). Teknik Southern blot dapat digunakan dalam menganalisis keberadaan, jumlah salinan dari gen hasil transformasi pada tanaman transgenik. Apabila jumlah salinan gen transforman terlalu banyak pada genom maka kemungkinan akan terjadi proses silencing pada gen tertentu (Kumpala et al. 1998), namun apabila gen terkopi antara 1-10X kemungkinan tidak akan menimbulkan gene silencing pada gen gen lain (Christou et al. 2001) Istilah Southern blot sekarang digunakan untuk menggambarkan transfer DNA dari gel ke membran, yang pada mulanya dilakukan secara kapiler ke membran nitroselulosa
(Brown 2000). Transfer DNA dalam Southern blot dapat dilakukan pada beberapa tipe membran, buffer transfer dan metode transfer. Membran yang paling populer digunakan adalah membran nitroselulosa, nilon bermuatan positif dan nilon tidak bermuatan. Walaupun ketiga membran ini mempunyai sifat yang berbeda tetapi ketiganya dapat digunakan untuk berbagai macam aplikasi. Keuntungan utama membran nilon adalah relatif kuat dan dapat digunakan untuk hibridisasi lebih dari 10X, sedangkan membran nitroselulosa mudah robek tetapi memberikan background yang lebih jelas pada beberapa proses hibridisasi (Sambrook et al. 1989) Transfer DNA dari gel ke membran dapat dilakukan dengan menggunakan metode transfer kapiler, elektroforesis dan vacum. Transfer kapiler seperti yang digunakan oleh Southern (1975), menggunakan aliran larutan garam untuk menarik DNA ke membran dengan adanya gaya kapiler yang ditimbulkan bahan penyerap seperti kertas dan tisu. Transfer kapiler hingga saat ini masih populer digunakan karena selain caranya cukup mudah, biaya relatif murah efisiensinyapun cukup tinggi. Metoda ini memerlukan waktu transfer yang relatif lama (12-16 jam), yang membuat gel beresiko mengalami dehidrasi. Transfer elektroforesis pada mulanya dikembangkan untuk transfer protein, dapat menekan waktu kerja tetapi tidak berkerja dengan baik pada konsentrasi buffer garam yang tinggi sehingga kurang cocok dengan buffer nitroselulosa. Transfer vakum mungkin merupakan cara yang paling ideal dengan waktu yang relatif cukup singkat (1-2 jam) mampu mentransfer DNA lebih efisien dan memberikan signal hibridisasi dua sampai tiga kali lipat dibandingkan transfer DNA kapiler (Sambrook et al. 1989) Gen hpt Penyandi Higromisin Fosfotransferase Modifikasi tanaman secara potensial memberikan peningkatan substansial dalam praktek pertanian, kualitas makanan dan kesehatan manusia. Kesuksesan hal ini tergantung pada kemampuan mengintegrasikan gen asing ke tanaman inang dan efisiensi regenerasi dari sel-sel tertransformasi. Efisiensi transformasi yang rendah memerlukan gen marker penyeleksi untuk mengidentifikasi tanaman transgenik (Hare 2002). Penggunaan gen marker dalam proses transformasi bertujuan memberikan keuntungan selektif untuk sel-sel
17 tertransformasi, sehingga mereka tumbuh lebih cepat dan lebih baik serta membunuh sel-sel non transforman (Brasileiro & Aragao 2001) Efektifitas sistem ketahanan terhadap antibiotik tergantung terutama pada bahan seleksinya (selective agent) yang harus sepenuhnya menghambat pertumbuhan selsel yang tidak tertransformasi. Konsentrasi terendah dari bahan toxic harus dapat menekan pertumbuhan sel-sel non transforman, akan tetapi tidak memberikan efek yang merusak pada sel-sel yang tertransformasi (Rodriguez & Notternburg 2002) Gen-gen ketahanan terhadap antibiotik sebagai marka penyeleksi yang umum digunakan adalah neomisin fosfotransferase II (nptII) dan higromisin fosfotransferase (hpt). Higromisin biasanya lebih toksik dibandingkan kanamisin dan membunuh selsel sensitif lebih cepat (Rodriguez & Notternburg 2002) serta merupakan sistem marker ketahanan antibiotik yang lebih disukai untuk transformasi pada tanaman monokotiledon terutama gramineae (Bashir et al. 2004). Higromisin merupakan antibiotik aminoglikosida yang diproduksi dari Streptomyces hygroscopicus dan merupakan sistem marker penyeleksi yang sesuai untuk sistem tanaman dan hewan. Antibiotik ini menghambat sintesis protein dengan jalan mengganggu translokasi dan menyebabkan kesalahan translasi pada ribosom 80S (Bashir et al. 2004). Gen hpt penyandi higromisin fosfotransferase (hpt) juga dikenal sebagai aminoglykosida 4 - fosfotransferase (APH 4) dan dinotasikan dengan hpt, hph atau aphIV (Rodriguez & Notternburg 2002). Gen ini diisolasi dari Eschirichia coli. Enzim higromisin fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt, dapat mendetoksifikasi aminosiklitol antibiotik higromisin B (Rodriguez & Nottenburg 2002) dan mengkatalisis fosforilasi kelompok hydroksil dalam antibiotik higromisin sehingga membuatnya menjadi tidak aktif (Brasileiro & Aragao 2001).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan untuk isolasi DNA meliputi: daun tanaman padi, isolation buffer S (Tris-HCl pH 8.0 110 mM,EDTA 55 mM
pH 8.0 dan CTAB 1.1%);, N2 cair,buffer TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM dan EDTA 1 mM pH 8.0) kloroform:isoamylalkohol(24:1), isopropanol, etanol 70%, etanol 96%, buffer TE (Tris-HCL pH 8.0 10 mM dan EDTA pH 8.0 1 mM). Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis Southern blot ialah: Qiagen™ plasmid midi kit, Southern Alkphos kit, DNA tanaman, dH2O, agarose gel dan buffer Tris Boric Acid EDTA (TBE), ultra pure™ agarose. Bahan bahan yang digunakan untuk uji higromisin adalah: higromisin 5% ,air akuades steril dan gelatin 10%. Tanaman padi transgenik generasi ketiga (T3) sebanyak 17 galur dari cv Rojolele, kontrol Rojolele, cv Asahan dan cv Kencana Bali. Alat-alat yang digunakan antara lain: sarung tangan, seperangkat mikro pipet, freezer dan kulkas, nitogen cair, inkubator with shaker, sentrifuse mikro dan makro, rotator, gene quant, dry bath, water bath, vortex, vakum, seperangkat alat foto gel (Gel Doc UV), microwave, autoklaf, penggerus, , oven, UV cross linker, botol hibridisasi dan alat-alat lain yang digunakan dalam teknik Southern blot, alat penyemprot, gelas ”automizer”, kompresor dan alat penyemprot air (“Sprinkle irrigation”).
Metode Penelitian Penanaman Bibit Penanaman dilakukan terhadap 17 galur tanaman padi transgenik penyandi asam salisilat yang terseleksi dari tanaman cv Rojolele, 1 galur kontrol Rojolele (non transgenik),1 galur cv Asahan (kontrol positif tahan serangan blas) dan 1 galur cv Kencana Bali (kontrol negatif rentan serangan blas), akan ditanam dan digunakan dalam penelitian ini. Masing masing galur ditanam 10 bibit dengan 3 ulangan. Uji Higromisin Uji higromisin dilakukan dengan menggunakan larutan higromisin 5% dan larutan kontrol (tanpa higromisin), uji dilakukan pada daun padi stadia bibit, pada daun uji diberi 2 tanda berupa bundaran berdiameter 0,5 cm dengan menggunakan spidol pada pangkal daun dan tengah daun. Satu lingkaran ditetesi dengan larutan higromisin dan lingkaran lainya dengan larutan tanpa higromisin sebagai kontrol. Pengamatan terhadap daun dilakukan 3 hari setelah penetesan dengan mengamati gejala nekrotik pada lingkaran tersebut.
18 Produksi Cendawan M.grisea Media produksi OMA (Oatmeal Media Agar) dibuat dengan mencampurkan bahanbahan antara lain pati larut air (soluble starch) 2%, glukosa 1%, soybean meal 1.5%, CaCO3 0.3%, oatmeal 10 %, agar 2%, dan akuades, pH ditera hingga pH 7.0. Semua bahan dicampur hingga homogen, disterilisasi dengan autoklaf 121oC, 15 atm selama 15 menit, kemudian dituang ke cawan petri steril dengan volume masing-masing 30cm.
Uji Ketahanan Terhadap Blas Pengujian dilakukan tidak pada semua tanaman transgenik tetapi hanya yang tahan terhadap uji higromisin. Rancangan yang digunakan adalah acak lengkap (RAL) dengan 3 ulangan terdiri dari 10 bibit per ulangan. Data dianalisis menggunakan sidik ragam dengan tingkat kepercayaan 95%. Tanaman yang tahan terhadap serangan selanjutnya dianalisis dengan teknik Southern blot. Produksi Cendawan Pembuatan Inokulum. Isolat jamur P. oryzae ras 173 diperoleh dari koleksi laboratorium mikologi Balitpa Bogor. Biakan murni dikultur pada medium PDA dalam cawan petri selama 5 hari untuk memperbanyak koloni. Selanjutnya dilakukan sub kultur dari medium PDA (potato dextrose agar) ke medium OMA dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu kamar di dalam inkubator bercahaya. Pembuatan Suspensi Konidia Suspensi konidia dibuat dengan terlebih dahulu dilakukan penggosokan miselia yang tumbuh pada permukaan medium OMA (oatmeal agar). Penggosokan miselia dengan menggunakan kuas bulu gambar No. 10 dan air steril yang telah dibubuhi streptomicin 0.01 gr/liter air. Setelah miselia udara bersih terbuang selanjutnya biakan tersebut diletakan dalam inkubator selama 2 hari pada suhu kamar dan disinari lampu TL 10 W. Kemudian dilakukan penggosokan koloni untuk mendapatkan suspensi konidia. Penggosokan menggunakan kuas gambar No. 10 dan air steril yang dicampur dengan tween 20 sebanyak 0.02%. Suspensi yang didapat disaring dengan kain kasa dan ditampung dalam gelas erlenmeyer. Inokulasi. Inokulasi dilakukan setelah tanaman padi berumur 18 hari dengan cara menyemprotkan suspensi konidia dengan konsentrasi 2x105 konidium/ml dengan volume semprot 200 ml per ulangan.
Penyemprotan dilaksanakan di dalam rumah kaca yang telah dikondisikan agar kadar kelembapanya tinggi (90%). Dalam kamar kaca tersebut, pot-pot persemaian yang telah diinokulasi dengan isolat P. oryzae ditempatkan di atas meja kayu dan sekeliling dinding kamar kaca ditutup dengan kain blacu. Lantai diusahakan tetap lembab dengan membiarkan air tergenang dan pada bagian atas pot digantungkan alat penyemprot air (Sprinkle irrigation) yang menyemburkan air dalam bentuk embun. Penyemburan air berlangsung selama 24 jam setiap hari.Parameter yang diamati adalah menghitung jumlah bercak yang terjadi pada tiap daun tanaman serta menentukan kala kerusakan. Skala kerusakan menggunakan standar evaluasi Internasional Rice Testing Program (IRTP 1988) dengan kriteria sebagai berikut: Skala 0 = tidak ada bercak 1 = bercak sebesar ujung jarum 2 =bercak lebih besar dari ujung jarum 3 = bercak nekrotik abu-abu, bentuk bundar, agak lonjong, panjang 1-2 mm dan tepi coklat 4 = bercak khas blas, panjang 1-2 cm, luas daun terserang kurang dari 2% 5 =bercak khas blas, luas daun terserang kurang dari 10% 6 =bercak khas blas, luas daun terserang antara 11%-25% 7 =bercak khas blas, luas daun terserang 26%-50% 8 =bercak khas blas, luas daun terserang antara 51%-75% 9 = semua daun mati Perhitungan chi kuadrat: (Oi – Ei)2 σ = --------Ei Oi adalah nilai pengamatan fenotipe ke-i Ei adalah nilai harapan fenotipe ke-i Southern Blot Isolasi dan Purifikasi DNA.DNA untuk analisis Southern blot diisolasi dari daun tanaman padi masing masing 2 individu tanaman dari galur yang diuji sehingga total individu 16, yang diambil secara acak. Teknik isolasi menggunakan modifikasi metode CTAB. Daun sebanyak ±2 gram digerus dengan penambahan nitrogen cair ,dimasukan ke dalam tube 50 ml yang berisi 7 ml buffer S (650C) kemudian ditambahkan 7 ml SDS 20%. Masukan tube berisi daun ke dalam oven 65oC selama 1 jam dan sesekali
19 dihomogenkan. Selanjutnya ditambahkan 7 ml kloroform (setelah suhu larutan turun) dan diinkubasikan di atas rotator selama 15 menit kemudian disentrifuse 15 menit 6000 rpm, suhu 4oC. Supernatan dipisahkan ke tube baru dan ditambahkan 3,6 ml isopropanol lalu disentrifuse kembali pada 6000 rpm selama 30 menit. Supenatan dibuang dan pelet dicuci dengan alkohol 70% serta ditambahkan 7 ml ammonium asetat 7.5 M, tube dibolak-balikkan perlahan-lahan hingga terbentuk benang-benang DNA. Tabung disentrifuge selama 5 menit pada kecepatan 3000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Supernatan di buang dan pellet ditambahkan buffer TE pH 8 sebanyak 4 ml. Larutan dapat dipindahkan ke dalam 1,5 ml dan disimpan dalam suhu –20oC. Purifikasi DNA dilakukan dengan menambahkan fenol yang volumenya sama ke dalam tube dan sentrifuse pada 10000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas diambil dan ditambahkan kloroform: isopropanol (24 : 1) dan disentrifuse 10000 rpm selama 2 menit. Lapisan atas dipisahkan dan ditambahkan larutan ammonium asetat 7,5M sebanyak 0,5X volume total dan ditambahkan etanol absolut 2X volume total. Larutan dapat diinkubasi selama 18 jam pada suhu 45oC. Larutan kemudian disentrifuse pada 10000rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan etanol 70%. DNA dilarutkan dengan menggunakan TE pH 8 sebanyak 4 ml dan ditambahkan RNAse 10 ng/µL sebanyak 2µL. Untuk melihat hasil isolasi, sampel DNA dirunning dengan gel agarose 1%. Isolasi Plasmid untuk Probe. Isolat E.coli ,yang mengandung plasmid pCAMBIA 1300 tersisipi gen entC dan pmsB (pSA), diambil dan ditumbuhkan dalam media LB cair 100ml yang ditambahkan 10mg/L tetrasiklin dan 50mg/L kanamycin dan diinkubasi dengan shaker 200 rpm pada suhu 37oC selama 18 jam. DNA diisolasi menggunakan Qiagen™ plasmid midi untuk volume medium (midi-prep). Kultur cair bakteri akan disentrifuse pada 6000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4oC. Pelet diambil dan ditambahkan 4 ml buffer P1, 4 ml buffer P2 dicampur perlahan. Tambahkan 4 ml buffer P3 dan inkubasi di es selama 15 menit kemudian disentrifuse selama 30 menit pada 13000 rpm dengan suhu 4oC. Supernatan dipindahkan ke tube 1,5 ml dan disentrifuse pada set sama seperti sebelumnya sekali lagi. QIAGEN-tip 100 dibersihkan dengan 4 ml buffer QBT dan biarkan mengalir sesuai gaya gravitasi. Masukkan supernatan dan biarkan DNA
terikat dalam QIAGEN-tip 100 kemudian QIAGEN-tip 100 dicuci dengan menggunakan 2 X 10 ml buffer QC dan larutkan DNA yang tersaring dalam QIAGEN-tip 100 dengan buffer QF. Presipitasi DNA dilakukan dengan menambahkan 3.5 ml isopropanol dan disentrifuse pada 11000 rpm pada suhu 4oC. Pelet dicuci dengan 70% etanol dan dikeringanginkan. Setelah kering pelet dilarutkan dengan 500µL buffer TE pH 8. hasil PCR selanjutnya dirunning dalam agarose gel elektroforesis 1%. DNA plasmid hasil isolasi selanjutya digunakan sebagai probe. Probe dipersiapkan dengan cara melakukan PCR (polymerase chain reaction). Teknik PCR ini berguna untuk mengamplifikasi DNA target. DNA target yang akan diamplifikasi adalah hpt dan pmsB. Volume yang dibutuhkan untuk 1X reaksi adalah 25µL dengan komposisi sebagai berikut: 1X buffer PCR yang mengandung Mg, dNTP 0,05mM, enzim taq polymerase 0,05µL, primer hpt forward (5’GATGCCTCCGCTCGAAGTA GGG3’) dan hpt reverse (5’GCATCTCCCGCCC GTGACAC3’), 1µL DNA plasmid hasil isolasi dan air hingga volume reaksi mencapai 25µL. Reaksi yang sama juga berlaku untuk PCR gen pmsB, dan posisi hpt forward dan hpt reverse diganti dengan pmsB forward dan reverse. Kondisi PCR untuk gen hpt adalah satu siklus denaturasi (95oC selama 10 menit) dan 35 siklus amplifikasi (denaturasi 95oC selama 1 menit,annealing 55oC selama 1 menit, sintesis 72oC 1 menit) dan 72oC kemudian 4oC. Kondisi yang sama berlaku untuk amplifikasi gen pmsB. Pita hasil PCR dipotong dari gel dan dipurifikasi menggunakan metode sephaglass brad kit. Cara kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut: gel ditimbang (berat tube kosong ditimbang terlebih dahulu) dan ditambahkan dengan larutan gel solubilizer (5µL GAA 50% dan gel solubilizer). Volume larutan diberikan sesuai dengan berat gel. Jika berat gel ≤250mg maka volume yang ditambahkan adalah 250µL, jika berat gel ≥250µL maka penambahan larutan gel adalah sebanyak berat gel tersebut. Larutan diinkubasi pada suhu 60oC sampai semua gel larut. Lalu sephaglas ditambahkan sebanyak 1/50 jumlah gel solubilazer dan disentrifuse selama 10 menit pada 6000 rpm suhu 4oC. Supernatan dibuang dan ditambahkan wash buffer sebanyak 8X jumlah sephaglass lalu dibuang. Pelet dikeringanginkan dan kemudian ditambahkan elution buffer lalu disentrifuse pada 12000 rpm 15 menit suhu
20 4oC. Supernatan siap dipindahkan ke tube baru. Konsentrasi DNA hasil isolasi dapat diukur dengan elektroforesis gel 1% dengan menggunakan larutan DNA standar yang telah diketahui konsentrasinya (50ng/µL, 100 ng/µL, 200ng/µL dan 300ng/µL) atau dengan menggunakan metode gene quant. Persiapan Membran. DNA genomik tanaman hasil isolasi dengan kualitas baik selanjutnya dipotong dengan menggunakan enzim restriksi. Untuk DNA pelacak (probe) hpt maka DNA genom dipotong dengan menggunakan enzim Hind III sedangkan untuk pelacak pmsB DNA genom dipotong dengan menggunakan enzim Nco I. Proses pemotongan genom dilakukan pada suhu 37 o C selama 18 jam. DNA yang telah dipotong selanjutnya dirunning pada gel agarose 0,8% dalam buffer TBE 0,5X. Running DNA dalam gel dilakukan selama 15 menit dan dicuci dengan air selama 15 menit. Gel hasil staining diamati dibawah sinar UV. Blotting. Gel dicuci dengan dH2O selama 5 menit, direndam dalam larutan depurinasi selama 15 menit, dicuci dengan dH2O selama 20 menit, direndam dalam larutan denaturasi selama 20 menit yang dilakukan 2x, cuci dengan dH2O selama 20 menit, rendam dalam larutan netralisasi selama 20 menit yang dilakukan 2x. Kertas saring Whatman disiapkan 2 lembar, lembar ke-1 seluas gel, yang dibasahi dengan larutan SSC 2x, lembar ke-2 untuk lapisan dasar, dipotong berlebih selebar tray, panjangnya sampai menjulur ke dasar tray, pasang diatas tray lalu basahi kertas dengan larutan SSC 20x. Peralatan disusun seperti pada Gambar 7. Blotting dilakukan selama 20 jam. Membran diangkat dan direndam dalam larutan SSC 2x selama 1 menit, lalu dikeringanginkan. Gel yang telah di blotting kemudian distaining dalam EtBr 7% selama 10 menit di rotator, lalu dicuci dengan dH2O selama 10 menit. Kemudian gel diamati dibawah sinar UV, kegiatan ini dilakukan untuk melihat efisiensi transfer DNA ke membran. Membran kemudian dipaparkan di UV dengan menggunakan UV Crosslinker dengan energi = 120.000 joule, selama 5 menit (imobilisasi). Selanjutnya membran siap untuk dihibridisasi dengan probe.
Gambar 7.
Susunan perangkat blotting membran Hibridisasi. Tujuannya adalah untuk menghibrid pasangan homolog DNA probe dengan DNA genomik. Pelabelan dilakukan mengikuti prosedur Alkhpos Southern kit. Bufer hibridisasi dari kit dibuat sebanyak 100 ml, tambahkan NaCl sebanyak 2,92 gr dan blocking reagent sebanyak 4 gr (w/v) campurkan secara perlahan dengan stirer selama 1-2 jam. Membran dipotong untuk memisahkan lambda Hind III dan sampel Nco I. Masing masing 30 ml buffer hibridisasi dimasukkan ke dalam botol hibridisasi, untuk membran yang akan diprobe dengan pmsB dan hpt. Pemanasan awal dilakukan selama kurang lebih 2 jam dengan suhu 55oC. Pelabelan probe dilakukan dengan cara memanaskan DNA probe yang konsentrasinya 100 ng/µL dalam air mendidih selama menit kemudian disimpan dalam es segera, setelah itu DNA fragmen dicampurkan 10µL reaction buffer, labelling reagent 2µL dan crosslink 10µL. kemudian dibiarkan dalam suhu 37 oC selama 30 menit. Selanjutnya DNA probe yang telah dilabel dimasukkan ke dalam botol hibridisasi yang berisikan larutan hibridisasi dan membran dan diinkubasi dalam oven pada suhu 55oC selama 18 jam. Deteksi. Membran hasil hibridisasi dicuci dengan menggunakan primary wash buffer (MgCl2 1M, NaH2PO4 pH 7 0.5M, urea 120 gr, SDS 1 gr, NaCl 8,7 gr, blocking reagent 2 gr) sebanyak 500 ml yang ditambahkan ke dalam tabung hibridisasi dan inkubasikan pada 55oC selama 10 menit kemudian lakukan sekali lagi pada suhu ruang. Membran dicuci dengan secondary wash buffer (tris base 1M dan NaCl 2M) sebanyak 500 ml selama 10 menit. Membran kemudian diletakkan dalam plastik dan diteteskan larutan deteksi CDP star ke permukaan DNA membran secara merata. Kemudian membran diexpose dengan kertas film selama 2 jam (pemasangan membran dan foto dilakukan dalam ruang gelap). Hasil dari transfer mebran dapat terlihat pada foto. Processing film dilakukan dalam ruang
21 gelap. Film direndam dalam larutan developer (ilford rapid fixer) selama 5 menit lalu film direndam dalam larutan stopper (air) selama 40 detik, terakhir film direndam dalam larutan fixer (ilford ilfotec lc 29) selama 4 menit HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Higromisin Uji higromisin merupakan tahap analisis awal menseleksi galur-galur untuk menduga keberadaan gen entC dan pmsB karena gengen tersebut berada dalam daerah T-DNA. Uji higromisin dilakukan saat tanaman berumur ±2 minggu. Gen hpt adalah penyandi sintesis antibiotik higromisin. Gen hpt disisipkan bersamaan dengan kaset entC dan pmsB yang berfungsi sebagai penanda, sehingga dapat segera dilakukan analasis awal untuk membedakan tanaman transgenik dan non transgenik berdasarkan gen penanda tersebut (Wang et al. 1997). Hasil pengamatan dipaparkan pada Gambar 9 dan contoh kondisi daun pada Gambar 8. Hasil pengujian menunjukan bahwa pada lingkaran daun yang ditetesi larutan higromisin akan menunjukan gejala nekrotik apabila tanaman tersebut tidak mengandung gen penanda hpt Sedangkan pada daun yang tanamanya diduga mengandung gen hpt, lingkaran tersebut tetap segar. Hal ini disebabkan karena tanaman tersebut mampu mendegradasi antibiotik hpt sehingga menjadi tidak toksik bagi tanaman tersebut Hasil pengamatan selanjutnya diuji dengan chi kuadrat untuk melihat pola segregasi gen hpt tersebut. Diharapkan gen hpt dapat tersegregasi secara Mendelian (3:1) sehingga gen tersebut dapat terus diwariskan pada turunanya. Diharapkan pula keberadaan gen penanda ini selalu disertai oleh gen-gen target (pmsB dan entC) karena gen-gen tersebut berada dalam satu T-DNA. Daerah T-DNA ini akan masuk ke dalam genom tanaman. Berdasarkan data tersebut didapatkan 2 galur yang bersegregasi secara Mendelian berdasarkan uji chi kuadrat dan dinyatakan secara ekspresif gen hpt yang mensintesis higromisin berhasil terintegrasi ke dalam genom kedua tanaman tersebut yaitu galur E 10.1.27 dan E 10.1.43 dengan jumlah tanaman yang tahan masing masing sebanyak 20 dan 18 tanaman
Gambar 8 Daun yang tersisipi gen hpt mengalami nekrotik (kiri) dan yang tersisipi gen hpt (kanan) E.10.1.27 E.10.1.43 35
C.30.1.2 E.10.1.5
30
E.10.1.1 25
E 27.1.1 E.10.1..34
20 X kuadrat
E 12.12 15
B 11.1.73 E.10.1.10
10
3, 3,84
E.10.1.13
84 5
B 8.1.31 E 24.1.2
0 3
B 11.123
hari pengamatan
B27.1.15 B 11.1.62 B 2.1.2
. Gambar 9 . Hasil pengamatan uji higromisin Uji Hayati dengan Cendawan Blas Uji hayati dengan cendawan blas (M.grisea) ini dilakukan terutama pada galur galur yang tahan terhadap higromisin namun beberapa galur lain hasil transformasi tetap disertakan. Pengujian dilakukan saat tanaman berumur 21 hari. Hasil pengamatan yang dilakukan setelah 3 hari inokulasi tersaji pada tabel-tabel di bawah Pada Tabel 1 terlihat bahwa pada daun pertama (planula) sub galur E.10.1.5 menunjukkan ketahanan terhadap serangan blas. Jumlah tanaman yang tahan sebanyak 22 individu. Perhitungan statistik memiliki Ehitung yang lebih kecil dari Xtabel sehingga data yang diamati sesuai dengan nisbah 3:1 (Mendelian). Sedangkan pada semua kontrol c.v Rojolele (kontrol isogenik), c.v Asahan (kontrol tahan) dan c.v Kencana Bali (kontrol
22 peka) (Loedin, 2005) menunjukkan skor yang tinggi dengan jumlah individu yang terinfeksi banyak, sehingga tergolongkan tidak tahan Percobaan ini menggunakan galur blas yang bersifat super virulen (galur 173) dan terbanyak menyerang pertanaman padi di Indonesia. Lingkungan percobaan telah cukup optimum bagi pertumbuhan cendawan sehingga dapat menyebar dan menyerang tanaman secara maksimal. Diduga pula pada daun pertama ini proses sintesis dari asam salisilatnya belum berjalan dengan normal dan dan maksimal sehingga asam salisilat yang dihasilkan belum cukup melindungi tanaman dari serangan blas
23
Tabel 1 . Skoring gejala blas pada daun pertama (planula) GALUR TANAMAN
E 10.1.27 E 10.1.43 E 10.1.5 E 10.1.1 E 10.1.34 E 10.1.10 E 10.1.13 Asahan Rojolele Kencana bali
JUMLAH TANAMAN YANG TAHAN
JUMLAH TANAMAN YANG RENTAN
(O – E)2 = X2 E
X tabel (α 0.05)
5 0 22 8 0 1 0 8 0 0
25 30 8 22 30 29 30 22 30 30
13.6 22.5 0.01 9.3 22.5 20.5 22.5
3.84
Keterangan : bold adalah galur tahan terhadap serangan blas Hipotesis : Ho : Data yang diamati sesuai dengan nisbah 3:1 H1 : Data yang diamati tidak sesuai dengan nisbah 3:1 Jika nilai X2 hitung < X tabel (db = 1, α 0.05 = 3.84) maka terima H0 yang berarti rasio segregasinya adalah 3:1.
, sedangkan pada sub galur transgenik E.10.1.5 diduga memiliki kemampuan dalam mensintesis asam salisilat dengan sempurna sejak daun pertama muncul. Pada hasil pengamatan daun ke-2 terlihat bahwa sub galur E.10 1.5 masih menunjukkan tingkat ketahanan terhadap blas, walaupun dengan jumlah tanaman tahan menurun menjadi 14 tanaman (Tabel 2). Selanjutnya setelah diuji dengan chi kuadrat jumlah populasi tersebut masih menunjukan segregasi Mendel (3:1). Akan tetapi pada daun kedua ini beberapa .kontrol telah menunjukan ketahanan terhadap serangan blas yaitu pada kontrol Tabel 2 .Hasil skoring gejala blas pada daun 2 GALUR TANAMAN E 10.1.27 E 10.1.43 E 10.1.5 E 10.1.1 E 10.1.34 E 10.1.10 E 10.1.13 Asahan Rojolele Kencana bali
Rojolele dan Asahan. Fenomena yang terjadi diduga bahwa semua tanaman mulai mensintesis asam salisilat lebih tinggi sebagai upaya pertahanan diri. Hasil ini kurang dapat menggambarkan tingkat ketahanan antara tanaman transgenik dan kontrol Fenomena yang terlihat pada pengamatan sebelumnya juga terjadi pada pengamatan daun ke-3 (daun yang lebih muda). Berdasarkan data Tabel 3 tidak dapat dilihat tingkat ketahanan yang sebenarnya. Diduga karena pada daun yang lebih muda ini tanaman mulai meningkatkan lagi produksi asam salisilatnya sebagai upaya pertahanan diri. Dengan demikian ini adalah suatu kejadian fisiologi alami pada tanaman, dimana
JUMLAH TANAMAN YANG TAHAN
JUMLAH TANAMAN YANG RENTAN
(O – E)2 = X2 E
5 0 22 8 0 1 0 8 0 0
25 30 8 22 30 29 30 22 30 30
13.6 22.5 0.01 9.3 22.5 20.5 22.5
X tabel (α 0.05)
3.84
24
saat ada serangan tanaman mulai mengaktifkan signal signal perlindungan diri agar tanaman mampu bertahan hidup Pada daun ke-3 ini semua sampel daun tanaman transgenik, daun kontrol, kecuali kontrol peka Kencana Bali, menunjukan tingkat ketahanan yang sama terhadap penyakit blas. Berdasarkan bioassay tersebut terlihat bahwa galur E.10.1.5 merupakan kandidat transgenik unggul terhadap serangan blas, berdasarkan analisis uji khikuadrat dari data bioassay yang didapat pada daun 1. Kemudian seiring dengan perkembangan tanaman dan adanya serangan blas maka tanaman mulai meningkatkan produksi asam salisilat untuk pertahanan dirinya. Sehingga pada daun ke-2, ke-3 atau mungkin daun yang lebih muda lainya tidak dapat menggambarkan lagi tingkat ketahanan terhadap serangan blas, yang terkait dengan pembentukan asam salisilat.Diduga pada galur E.10.1.5 karena merupakan tanaman transgenik maka sintesis asam salisilat lebih cepat dibandingkan dengan kontrol, karena pada tanaman transgenik jalur metabolisme pembentukan asam salisilat adalah memotong jalur metabolisme alaminya. Sehingga produksi asam salisilat pada tanaman transgenik menjadi lebih cepat. Analisis bioassay dilakukan berdasarkan Segregasi Mendel. Karena sifat dari setiap ekspresi yang diamati adalah satu (higromisin dan tahan blas) maka termasuk ke dalam monohibrid (Jusuf 2001). Maka secara hitungan matematis perbandingan sifat resesif (non transgenik) dan kodominan (transgenik) berdasar percobaan Mendel adalah 3 : 1 (Loedin 2005)
Southern Blot Tanaman yang terseleksi berdasarkan uji higromisin dan bioassay selanjutnya dianalisis molekular dengan Southern blot. DNA diisolasi dari daun. Analisis Southern blot bertujuan untuk melihat integrasi kaset gen gen yang terkait dalam sintesis asam salisilat dan gen penanda hpt ke dalam genom tanaman / inti sel tanaman (Loedin 2005). Sebelum dilakukan analisis Southern blot beberapa hal penting perlu diperhatikan agar diperoleh hasil yang baik. Hal hal tersebut diantaranya adalah persiapan DNA genom tanaman. DNA yang diisolasi harus memiliki kualitas yang baik yaitu murni dan tidak rusak. DNA yang diperoleh dapat dimurnikan menggunakan fenol untuk menghilangkan makromolekul yang berupa protein selain itu digunakan kloroform untuk mendegradasi lemak. Selain harus murni DNA juga tidak rusak / degradasi. Karena DNA rusak akan membentuk banyak potongan pita, begitu pula jika DNA dengan kualitas baik dipotong dengan enzim restriksi akan terlihat smear. Hasil isolasi dan pemurnian dapat terlihat pada Gambar 10. Pemotongan DNA genom, DNA dengan kualitas baik selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi untuk tujuan hibridisasi dengan menggunakan probe hpt maka genom dipotong dengan menggunakan enzim Hind III. Enzim ini hanya akan memotong 1 kali potongan/pita yang akan muncul pada daerah T-DNA sehingga diharapkan jumlah yang akan muncul adalah jumlah salinan DNA hpt. Untuk strategi lainya, DNA yang sama juga dipotong dengan menggunakan enzim Nco I
Tabel 3. Hasil skoring gejala blas pada daun 3 GALUR TANAMAN
E 10.1.27 E 10.1.43 E 10.1.5 E 10.1.1 E 10.1.34 E 10.1.10 E 10.1.13 Asahan Rojolele Kencana bali
JUMLAH TANAMAN YANG TAHAN
JUMLAH TANAMAN YANG RENTAN
(O – E)2 = X2 E
25 18 22 28 21 25 21 22 24 12
5 12 8 2 9 5 9 8 6 18
0.28 0.9 0.01 1.34 0.1 0.28 0.1
X tabel (α 0.05)
3.84
25
pengerjaan yang dilakukan telah cukup baik. Hal ini didasarkan pada pita DNA dari lambda dan kontrol positif yang muncul. Dari foto hasil Southern blot (Gambar 14) didapatkan beberapa pita DNA tanaman transgenik yang menunjukan keberadaan gen hpt, yaitu pada galur C.30.1.2.29, E.10.1.5.15, E.10.1.27.11, E.10.1.43.8 dan dengan probe pmsB pada
Gambar 10. Hasil isolasi dan purifikasi DNA dan hasil potongan ini akan dihibridisasi dengan probe pmsB. DNA hasil potongan tersaji pada Gambar 11. Probe hpt dan pmsB diperoleh dari hasil amplifikasi DNA plasmid. Probe hpt berukuran 429 bp dan probe pmsB berukuran 335 bp. DNA probe dapat dilihat pada Gambar 12. Proses transfer DNA ke membran (blotting) juga merupakan hal yang penting dan menentukan keberhasilan Southern blot. Hal yang perlu diperhatikan adalah membran tidak bergelembung pada saat blotting. Jika hal tersebut terjadi maka DNA tidak akan tertransfer sempurna ke dalam membran akibatnya pembacaan hasil Southern blot menjadi kurang jelas. Dengan demikian saat meletakkan membran di atas gel harus hati hati. Pengecekan keberhasilan transfer DNA dapat dilakukan dengan membandingkan kembali kondisi DNA dalam gel sebelum proses blotting dan setelah proses. Hasil kegiatan blotting dapat dilihat pada Gambar 13. Hibridisasi adalah langkah penyatuan antara DNA probe dengan genom yang telah dipotong. Pada saat hibridisasi, DNA probe akan menyatu dengan DNA genom apabila pada DNA genom terdapat pasangan DNA tersebut (baik hpt dam pmsB) hal yang perlu diperhatikan saat hibridisasi adalah dilakukanya pre-hibridisasi, ini adalah strategi yang harus dilakukan untuk menghilangkan background pada hasil foto. Dengan prehibridisasi ini, maka diharapkan hanya DNA yang benar benar bertemu pasangan yang akan muncul pada saat dilakukan deteksi. Deteksi membran yang dilakukan dengan menggunakan CDP star kit bersifat non radioaktif. Dengan larutan CDP ini DNA yang terhibrid akan mmberikan pendaran, dan pendaran akan ditangkap oleh lapisan film. Berdasar hasil Southern blot (Gambar 14) yang diperoleh terlihat bahwa teknik
Gambar 11.Hasil pemotongan plasmid genom dengan enzim Hind III yang disusun antara DNA potongan dan DNA tidak dipotong
Gambar 12. DNA fragmen hasil PCR yang digunakan sebagai probe
Gambar 13. DNA genom hasil pemotongan setelah dielektroforesis selama 18 jam (kiri) dan setelah proses transblot (kanan)
26
Gambar 14. Hasil foto Souther blot dari membran galur C.30.1.2.29 ,E.10.1.15 dan E.10.1.10.29. Pita pita yang dihasilkan masing masing galur tersebut berjumlah 1. Dengan demikian diduga jumlah salinan gen hpt dan pmsB yang terintegrasi ke dalam genom adalah satu salinan. Jumlah salinan yang demikian adalah yang diharapkan. Sehingga bila terjadi perubahan tingkat ekspresi, jika dibandingkan dengan kontrol, baik pada hasil uji higromisin dan ketahanan terhadap cendawan blas, diduga karena pengaruh dan integrasi gen gen yang ditransformasikan. Hal ini juga menunjukan kelebihan transformasi menggunakan bakteri Agrobakterium. Jumlah dan letak kopi/salinan dalam genom sangat berperan dalam ekspresi dari gen target atau gen di dalam genom itu. Apabila jumlah salinan gen terlalu banyak tersalin di dalam genom maka kemungkinan akan menyebabkan gene silencing dari ekspresi gen target dan gen lainya (Kumpatla 1998), namun apabila gen terkopi ke dalam genom dalam jumlah yang sedikit (1-10 salinan) maka kemungkinan tidak akan menimbulkan gene silencing (Christou 2001). Dari hasil Southern blot pada galur C.30.1.2.29 dan E.10.1.5.15 dan menunjukan keberadaan gen target pmsB dan gen penanda
hpt. Diduga daerah T-DNA dari tanaman A.tumefasiens terintegrasi lengkap ke dalam gen tanaman. Sedangkan pada galur E.10.1.27.11 dan E.10.1.43.8 hanya menunjukan pita hpt. diduga wilayah T-DNA tidak terintegrasi secara lengkap ke dalam genom tanaman. Begitu juga dengan galur E.10.1.27.11 dan E.10.1.43.8 hanya menunjukan pita hpt. diduga wilayah T-DNA tidak terintegrasi secara lengkap ke dalam genom tanaman. Begitu juga dengan galur E.10.1.10.29 yang hanya menunjukan pita pmsB. Apabila hasil data Southern blot, uji higromisin dan uji ketahanan blas digabungkan terhadap 5 galur tersebut diperoleh data rangkuman seperti tersaji pada Tabel 4. Dari data diatas diperoleh bahwa galur E.10.1.43.8 dan E.10.1.27.11 memiliki ketahanan terhadap higromisin dan ini terbukti pula dengan hasil Southern blot yang didapatkan yang menunjukan pita hpt. Tetapi galur ini tidak tahan terhadap blas dan berdasarkan hasil Souhern galur ini tidak menunjukan keberadaan gen pmsB. Galur E.10.1.5.15 memiliki ketahanan terhadap serangan blas dan hal ini berkorelasi dengan hasil Southern blot yang diprobe dengan
27
pmsB, tetapi sebaliknya galur ini tidak memiliki ketahanan terhadap uji higromisin walau pada hasil Southern blot menunjukan keberadaan gen hpt. Fenomena ini diduga disebabkan karena posisi T-DNA yang terintegrasi ke dalam genom, tepat pada posisi dimana ekspresi dari gen hpt tidak dapat berlangsung meskipun gen tersebut ada di dalam tanaman (gene silencing / pembungkaman gen) (Kumpatla 1998). Pada galur C.30.1.2.29 dan E.10.1.10.29 juga terjadi hal yang sama, dimana gen hpt/pmsB tidak dapat terekspresi yang berdasarkan uji hayati blas dan higromisin gen tersebut tidak terekspresi, berlawanan dengan hasil Southern blot yang didapatkan. Proses pembungkaman gen disebabkan oleh banyak faktor, seperti adanya gugus metil pada daerah gen terintegrasi, adanya gen lain dari tanaman yang akan menyebabkan gene silencing pada gen transforman (Kumpatla 1998) Tabel 4. Hubungan antara data hasil Southern blot, uji higromisin dan uji hayati blas untuk galur E.10.1.43.8,E.10.1.27.11 ,E.10.1.5.15 ,C.30.1.2.29, E.10.1.10.29, No.
Galur
hpt
pmsB -
Ujij blas -
Uji higromisin +
1
E.10.1.43.8
+
2
E.10.1.27.11
+
-
-
+
3 4
E.10.1.5.15
+
+
+
-
C.30.1.2.29
+
+
-
-
5
E.10.1.10.29
-
+
-
-
SIMPULAN DAN SARAN simpulan Gen higromisin 2 galur transgenik (E.10.1.27 dan E.10.1.43) terekspresi dengan baik dan pola segregasinya mengikuti hukum Mendel (3:1), sedangkan berdasarkan uji hayati dengan cendawan blas diperoleh satu galur unggulan tahan (E.10.1.5). Pengamatan tingkat ketahanan pada tanaman yang dapat dijadikan patokan adalah pengamatan padi daun pertama, sedangkan pada daun yang lebih muda tidak dapat dijadikan patokan. Hasil Southern blot menunjukan bahwa dengan menggunakan probe hpt terdapat jumlah salinan gen masing-masing 1, yaitu pada sub galur C.30.1.2.29, E.10.1.5.15, E.10.1.10.29, E.10.1.43.8 sedangkan dengan pmsB diperoleh 3 galur yaitu C.30.1.2.29, E.10.1.15 dan E.10.1.10.29
dengan jumlah salinan DNA masing-masing 1. Saran Perlu diteliti efek dari sintesis asam salisilat yang di percepat dan diperbanyak terhadap fungsi metabolisme lainya. Analisis lanjutan pada generasi selanjutnya perlu dilakukan untuk menguji kestabilan pewarisan dan ekspresi gen peyandi asam salisilat entC dan pmsB
DAFTAR PUSTAKA Amir M ,Kardin MK. 1991. Pengendalian penyakit jamur. Di dalam Buku 3, Bogor: Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Aswidinnoor H. 1995. Transformasi gen: sumber baru keragaman gGenetik dalam pemuliaan. Zuriat, 6 (2). Baharsjah S, Kasryno F, Darmawani D. H. 1988. Kedudukan padi dalam perekonomian Indonesia. Bogor: Badan Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Bashir K, Rafiq M, Fatima T, Husnain T, Riazuddin S. 2004. Hygromycin based selection of transformants in a local inbred line of Zea mays (L). Pakistan Journal of Biological Sciences. 7(3):318-323 Biro Pusat Statistik. 2002. Luas dan Intensitas Serangan Organisme Pengganggu Tanaman dan Bencana Alam Padi, Palawija, dan Sayuran di Jawa. Jakarta: Biro Pusat Statistik. Brasileiro ACM, Aragao FJL. 2001. Marker genes for in vitro selection of transgenic plants. J. Plant Biotechnology. 3(3) : 113-121 Brown T. 2000. Analysis of DNA Sequences by Blotting and Hybridization. Di dalam Current Protocol in Molecular Biology.USA: John Wiley and sons. Cummins J. 2005. GM rice in India. http:/ /www.warda .cgiar.org /newsletter/ no%203 /trackingdown.html.[18 September 2005] Choi YD and Jong-JC. 2005. The current status of GMOs development. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/qu
28
ery.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&l ist_uids=10632579&dopt=Abstract.[20 Januari 2006] Christou P. Ford TL ,Kofron M 1991. Production of transgenic rice (Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Biotechnology. 9:957-966. Doel MT, Houghton M, Cook EA ,Carey NH. 1977. The presence of ovalbumin mRNA coding sequences in multiple restriction of chicken DNA. Nucl.Acids Res. 4:3701-3713 Hashioka Y. 1963. Effects of Environmental Factors on Developments of Causal Fungus, Infection, Disease Developments and Epidemiology in Rice Blast Disease. http:/ /www.warda .cgiar.org.[20 Januari 2006] IRRI. 1975. Research High Lights for 1974. Los Banos :International Rice Research Institute,. IRTP. 1988. Standard Evaluation System for Rice. Los Banos: International Rice Testing Program. Hare PD, Chua NM. 2002. Excision of selectable marker genes from transgenic plant. Nature Biotechnology. 20:575-580 Herman M. 1996. Rekayasa genetika untuk perbaikan tanaman. Bul. Agro. Bio .1(1):24-34 Kumpatla SP, Hall TC. 1998. Organizational complexityof a rice transgene locus susceptible to methylation-based silencing.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=P ubMed&list_uids=10632579&dopt=Ab stract.[20 Januari 2006] Loedin HS, Mulyaningsih ES, Purwantomo S, Meiyer AH. 2005. Transformation of Aromatic Indonesian Rice and Upland Rice with Anti Fungal Genes for Blast and Sheath Blight Tolerance. Cibinong:Puslit Bioteknoligi LIPI Ou SH. 1985. Rice Disease. Commonwealth Mycological . England: Kew Survey Institute,
Rodriguez RC, Nottenburg C. 2003. Antibiotic resistance genes and their use in genetic transformation especially in plants. CAMBIA. http : www. cambiaip. org/ whitepapers/ Transgenic/ Ab_resistance /books / whole.pdf [18 September 2005] Sambrook J, Fritsch EF ,Maniatis T. 1989. Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd edition.. England: Cold Spring Harbor Laboratory Press Semangun H. 1990. Penyakit-penyakit tanaman pangan di Indonesia., Yogyakarta: Gadjah Mada Press. Southern EM. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Mol.Biol. 98:503 Van LLC. 1985. Pathogenesis-related protein. Plant Mol. Biol. 4: 111-1166. Verberne MC, Rob V, John FB, Jesus Mercado- Blanco and Huub JM Linthorst. 2005. Overproduction of salicilyc acid in Plants by bacterial transgenes enhances pathogen resistance. : http://biotech.nature.com .[20 Januari 2006] Wang M-B ,Peter MW. 1997. A rapid and simple method of assaying plants transformed with hygromycin or PPT resistance genes. Plant Mol. Biol 15:209-215 Zhao X et al. 2005. A mitogen-activated protein kinase cascade regulating infection-related morphogenesis in Magnaporthe grisea http : //biotech.nature.com. [20 Januari 2006]
29
Lampiran 1. Data uji lapangan higromisin GALUR TANAMAN
+ E 10.1.27 E 10.1.43 C 30.1.2
E 10.1.5 E 10.1.1
3,2,19 18,14,7,6 21,22,30,27,2 5,,11,12 ,16,20,17,18,1 ,2 3,16,17,11,25, 28,21,24 ,30 16,20,7,4,38,2 9,28,27,22
E 27.1.1
22,14
E 10.1.34
17,12,14,4
E 12.1.2
24,22,23,21,2 5,12,19 ,16,5,8,9 25,28,27,26,1 3
B 11.1.73 E 10.1.10 B 10.1.13 B 8.1.31 E 24.1.2 B 11.1.23 B 27.1.15
TAHAN
(O – E)2 = E X2
20 18 7
0.28 1.6 11.4
4,1,9,18,19,14,26, 2,10,7,6 27,29 ,1,20,12
4
25.6
17,18,13,12,11,14 15,5,6,3 ,8,9 ,1,23 ,10,2,21,25 21,26,27,19,20 10,9,8,7 ,6,5,4,3,2 ,1,23,25 ,28,11 ,12,13 ,15,16 17,18 23,60,23,11,16,18 28,29,21 ,19 ,22,25,13,15 ,20,8,7,5,16,3 ,10,2,9 30,29,28,27,26,11 14,15,3,2 ,17,16,7 4,10
4
21.5
3
25.6
4
25.6
5
17.8
24,23,21,12,16,18 22,29,11,14 ,1,4,7,8 ,15,19,20,2 ,13,5,6,9,10 10,7,1,29,5,12,10, 8,6,4,18,16, 1 27,30,22,20,17,18 25,26,21 ,12,5,7,2 ,28,16,15 11,19,20,28,29,1, 2,7,8
2
30.04
11
6.4
2
30.0
11
14.4
11,19,20,28,29,1 ,2,7,8
6
14.4
18,20,11,15,26,24 29,28,25,2 ,22,,10,7 ,3,4
7
11.4
4,10,8,15,14,11,1 8 ,17,19,16,24,25,2 7,28,21
4
14.4
SIFAT TEREKSPRESI NEKROTIK
9,5,3,20,21,12 ,3,13 29,19,11,13,6, 5,10 14,12,26,27,3 0,21,24,3 ,10,9 14,12,26,27,3 0,21,24 ,3,10,9 26,30,4,3,10,7 ,11,15 ,16,19,20 9,12,7,6,20,13 ,12,23,29
++ 10,8,9,12,17 16,11,1,2,9 4,16,19
X tabel (α 0.05)
+++ 6,4 14
3,5
3.84
3.84
30 B 11.1.62
1
23,22,21,28,14 ,15,19,18,14,16
B 2.1.2
24,26,27,29 ,30,11 ,12,5,4,3,6 ,7,8 3,5,9,10,1 ,5,4,13,12 ,11,1,18,19 ,20,25,23, 22,21,36,27 ,28,29,30
2,9,10,8,6,4,7,16, 24
3
25.6
1
34.8
Keterangan : Hipotesis : Ho : Data yang diamati sesuai dengan nisbah 3:1 H1 : Data yang diamati tidak sesuai dengan nisbah 3:1 Jika nilai X2 hitung < X tabel (db = 1, α 0.05 = 3.84) maka terima H0 yang berarti rasio segregasinya adalah 3:1.
Lampiran 2. Jalur metabolisme asam salisilat OH
Shikimic acid
CO O H
O
local and systemic induction of PR proteins and resistance
O
HO HO OH
β-O-D Glucosylsalicylic acid CO O H
CO O H
EntC CO O H
O OH
Chorismic acid
CO O H
CO O H
OH
PmsB
Esherichia coli
O
Isochorismate synthase
Isochorismic a c id
CO O H
CO O H
OH
Pseudomonas fluorescens Salicylic Isochorismate pyruvat lyase COOH
NH2
L-
trans-Cinnamic acid
Lampiran 3. Peta dari plasmid pCAMBIA 1300
Benzoic a c id
31
Bst XI (8716)
EcoR I (1) Sac I (11) Kpn I (17) Sma I (19) lacZ alpha BamH I (22) Xba I (28) Sal I (34) Pst I (44) Sph I (50) Hind III (52) T-Border (right)
CaMV35S promoter Sph I (389)
Xho I (7929)
hygromycin (R)
Xho I (6835)
CaMV35S polyA T-Border (left)
pVS1 sta
pCAMBIA1300
8958 bp
Sac II (6317)
kanamycin (R)
Nhe I (3392)
pBR322 ori pBR322 bom
pCAMBIA1300 situs enzim restriksi A|GATCT BglII: 0 sites TCTAG|A G|GTNACC CCANTG|G C|CATGG NcoI: 0 sites GGTAC|C A|CTAGT SpeI: 0 sites TGATC|A G|GATCC BamHI: 1 site CCTAG|G CCANNNNN|NTGG BstXI: 1 site GGTN|NNNNNACC G|AATTC EcoRI: 1 site CTTAA|G A|AGCTT HindIII: 1 site TTCGA|A GGTAC|C KpnI: 1 site C|CATGG G|CTAGC NheI: 1 site CGATC|G CTGCA|G PstI: 1 site G|ACGTC GAGCT|C SacI: 1 site C|TCGAG CCGC|GG SacII: 1 site GG|CGCC G|TCGAC SalI: 1 site CAGCT|G CCC|GGG SmaI: 1 site GGG|CCC T|CTAGA XbaI: 1 site AGATC|T GCATG|C SphI: 2 sites C|GTACG C|TCGAG XhoI: 2 sites GAGCT|C
BstEII: 0 sites
pVS1 rep
