KERAGAMAN BLOOD DISEASE BACTERIUM DAN BAKTERI ENDOFIT PADA BEBERAPA VARIETAS PISANG TERINFEKSI BERDASARKAN ANALISIS DENGAN PCR-SSCP Diversity of Blood Disease Bacterium and Endophytic Bacterium in Some Varieties of Infected Banana Based on PCR-SSCP Analysis Salim Widono dan Hadiwiyono
ABSTRACT
B
lood Disease Bacterium (BDB) is devastating pathogen on banana in Indonesia. In the fields, the disease incidence can reach over 80%. Many aspects of the disease are still poorly understood, including the diversity of the pathogen and endophytic bacteria in association with infected banana. So far the pathogen is difficult to isolate from all parts of banana aside from the bunch due to heavy contaminated by complex endophytic bacteria. A research had been employed through culturable independent approach using analysis of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), to study the diversity of BDB and endophytic bacterium from some varieties of banana infected by the pathogen. The result showed that BDB from some banana varieties was not diverse and so was the endophyitic bacterium. Key words : banana, Blood Disease Bacterium, endophytic bacteria, PCR-SSCP
PENDAHULUAN Penyakit darah yang disebabkan oleh Blood Disease Bacterium (BDB), merupakan penyakit yang sangat merugikan pada pertanaman pisang di Indonesia. Pada tahun 1920-an, penyakit ini dilaporkan masih terbatas di Kepulauan Celebes atau Sulawesi Selatan (Eden-Green, 1994), sekarang penyakit telah tersebar pada tidak kurang dari 27 propinsi di Indonesia (Anonymous, 2006; Subandiyah et al., 2006). Di kebun, patogen ini dapat menyebabkan kamatian tanaman lebih dari 80% (Supriadi, 2005). Banyak orang mengasumsikan bahwa penyakit darah pisang disebabkan oleh patogen yang sama dengan penyebab penyakit Moko di Amerika Selatan dan Bugtok di Filipina, yaitu oleh Ralstonia solanacearum ras 2. Namun kenyataannya bahwa baik secara fenotipe maupun genotipe BDB berbeda dengan R. slanacearun ras 2 tersebut, sehingga identifikasi lebih lanjut dan pengusulan nama baru diperlukan (Fegan, 2005; Supriadi, 2005). Berbagai aspek penyakit masih sedikit diketahui, termasuk keragaman patogen dan
bakteri endofit yang berasosiasi dengan tanaman terinfeksi. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan analisis keragaman BDB dan bakteri endofit pada beberapa varietas pisang terinfeksi melalui pendekatan taktergantung pada kemampuan patogen dibiakkan in vitro, yaitu malalui polymerase chain reaction dan single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP).
BAHAN DAN METODE Ekstraksi DNA. DNA BDB dan bakteri endofit dari tanaman sakit diekstraksi menggunakan micro-Lysis Kit menurut Hadiwiyono et al. (2006). Jaringan sakit ukuran 2x5x15 mm dimasukkan pada 5 mL air steril, kemudian dibiarkan selama satu malam. Sebanyak 1 mL suspensi ooze bakteri yang diperoleh disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang, kemudian diresuspensi lagi dengan 1 mL air steril, lalu disentrifugasi lagi dengan kecepatan dan lama waktu yang sama. Setelah itu, pelet diberi 20 ?L larutan
Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret, Surakarta Keragaman Blood Disease Bacterium dan Bakteri Endofit pada Beberapa Varietas Pisang Terinfeksi ............. ( Salim Widono dan Hadiwiyono)
39
microLysis Kit, dan kemudiaan dilisis pada mesin Thermocycle Bio RadTM. Amplifikasi DNA . Amplifikasi DNA BDB menggunakan primer spesifik BDB 121F dan 121 R. Sedangkan amplifikasi DNA bakteri endofit menggunakan primer V4-V5, com1 dan com2. PCR menggunakan Mega Mixe Royal (MicrozoneTM) pada
Hasil SSCP terhadap amplikon PCR dengan primer spesifik 121 dari enam amplikon BDB dari varietas yang berbeda (Gambar 2) menunjukkan bahwa pola fragmen DNA yang diperoleh tidak berbeda. Ini berarti bahwa BDB antarvarietas tidak berbeda berdasarkan analisa dengan SSCP. Ab
Kk
Rb
Ka
Cv
Pk
volume 25 ?L. Program PCR untuk amplifikasi DNA BDB menurut Fegan (2006), sedangan untuk bakteri endofit menurut Peters et al. (2003). Analisis PCR-SSCP. Kegiatan ini dikembangkan menurut Peters et al. (2003) melalui pemanasan 95 oC selama 3 menit terhadap amplikon yang telah dicampur dengan larutan pemberat DNA yang terdiri dari 95% formamide, 10 mM NaOH, 20mM EDTA, 0.02% Boromophenole blue, dan 0.02 Xylen cyanole dengan komposisi sama. Untuk meningkatkan stabilitas pemisahan DNA ganda menjadi untaian tunggal digunakan enzim eksonuklease. Visualisasi DNA fragmen . Kegiatan ini dikerjakan dengan polyacrilamide gel electrophoresis 8% menggunakan pewarnaan perak nitrat. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 75 volt selama 135 menit dengan menggunakan Mini Vertical Electrophoresis (BioRadTM).
Gambar 2. Pola Single-DNA hasil Analisis Keragaman BDB melalui PCR-SSCP dengan Primer spesifik 121 pada enam varietas pisang Ab: Kepok Abu; Kk: Kepok Kuning; Rb: Raja Bandung; Ar: Kepok Arab; Cv: Cavendish; dan Pk: Pisang Kecut Hasil penelitian menunjukkan bahwa deteksi BDB dengan PCR menggunakan primer 121 dapat mendeteksi BDB dari semua varietas tanaman sakit. Ini menunnjukkan bahwa PCR sebagai instrumen deteksi cukup sensitif untuk deteksi BDB dibandingkan dengan
HASIL DAN PEMBAHASAN
deteksi secara konvensional menggunakan medium biakan. Menurut Louws et al. (1999) metode deteksi BDB dengan PCR merupakan metode yang sensitif. Cara ini tidak saja mendekteksi sel yang aktif tetapi juga sel patogen pada stadia tidak aktif atau pada stadia hidup
Hasil amplifikasi melalui PCR dengan primer spesifik BDB 121 diperoleh hasil seperti disajikan pada Gambar 1. Amplikon hasil PCR ini selanjutnya dilakukan SSCP untuk mengetahui kemungkinan ada keragaman antarisolat dari varietas yang berbeda tersebut.
tetapi tidak dapat dibiakkan (viable but not culturable). Hasil analisis SSCP menunjukkan bahwa BDB antarvarietas pisang terinfeksi tidak berbeda. Tampaknya BDB antarvarietas yang berbeda, tidak beragam. Telah terbukti bahwa analisis SSCP merupakan alat yang sangat kuat untuk studi keragaman genetika mikrob. Oleh karena kelebihannya, analisis SSCP sering digunakan untuk melacak terjadinya mutasi (Kong et al., 2000; GarciaVazquez et al., 2006). Kong et al. (2004) menyampaikan bahwa analisis SSCP merupakan alat yang sangat efektif dan efisien untuk identifikasi. Sebelum digunakan untuk SSCP, hasil amplifikasi DNA dengan primer universal V4-V5 terhadap empat varietas pisang terinfeksi BDB divisualisasi dengan elektroforesis dengan pewarnaan ethidium bromide.
Gambar 1. DNA apmp likon dari enam isolat BDB varietas yang berbeda; Ab: Kepok Abu; Kk: Kepok Kuning; Rb: Raja Bandung; Ar: Kepok Arab; Cv: Cavendish; Pk: Pisang Kecut; K+: Kontrol pisitif; K-: Kontrol negatif; dan M: marker
Adapun hasil yang diperoleh seperti disajikan pada Gambar 3. Hasil ini menunjukkan bahwa yang muncul dengan jelas hanya satu fragmen yang memiliki posisi dengan fragmen BDB. Hasil tersebut menunjukkan bahwa populasi patogen sangat dominan pada tanaman terinfeksi, sedangkan bakteri endofit tidak tampak.
40
Agrosains 12(2): 39-43, 2010
Dipahami bahwa tumbuhan sangat mempengaruhi ketahanan hidup, pertumbuhan, dan aktifitas mikroorganisme di dalam rizosfer, filoplane, dan endosfer, sebagai akibat stadia perkembangan tumbuhan, bagian jaringan yang diuji, spesies dan kultivar tumbuhan, serta kondisi lingkungan (Duineveld et al., 2001). Haffmann (2001) menjelaskan bahwa populasi total bakteri endofit
Gambar 3. Amplikon PCR dengan primer V4-V5 dari emp at verietas pisang terinfeksi Ab: Kepok Abu; KK: Kepok Kuning; Rb: Raja Bandung; Ka: Kepok Arab Selanjutnya amplikon tersebut digunakan untuk analisis keragaman komunitas bakteri dengan metode SSCP. SSCP dilakukan dengan dua metode yaitu tanpa dan dengan enzim eksonuklease. Hasil analisis SSCP menunjukkan bahwa analisis SSCP tanpa dan dengan eksonuklease tidak terlalu banyak berbeda. Namun demikian apabila diperhatikan, hasil SSCP yang menggunakan enzim eksonuklease lebih jelas dibandingkan dengan tanpa eksonuklease. Secara umum hasil SSCP menunjukkan bahwa komunitas bakteri endofit antarvarietas pisang yang terinfeksi tidak tanpak berbeda, hanya sepasang fragmen DNA yang tampak jelas terpisah yang merupakan DNA milik BDB, sedangkan yang lain kurang jelas. Namun demikian, apabila diperhatikan tampak ada fragmenfragmen yang terbentuk yang dapat diduga merupakan milik bakteri tertentu (Gambar 4).
yang ada dalam tanaman tergantung pada spesies, genotipe tanaman, jaringan tanaman, stadia pertumbuhan, dan kondisi lingkungan. Hal ini dapat dipahami bahwa baik kondisi lingungan tanah maupun udara akan menentukan keragaman bakteri endofit. Hasil penelitian Misaghi & Donndelinger (1990) menunjukkan bahwa kultivar mempengaruhi populasi dan agihan bakteri endofit dalam tanaman. Kegiatan ini merupakan penelitian pertama untuk studi keragaman BDB maupun komunitas bakteri endofit pada pisang. Metode PCR-SSCP digunakan pada penelitian ini. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PCRSSCP merupakan teknik yang sangat berguna untuk studi keragaman patogen dan komunitas mikroorganisme dalam tanaman. PCR-SSCP merupakan salah satu alternatif yang dapat dipilih untuk analisis komunitas mikrob termasuk bakteri endofit (Lee at al., 1996; Saito et al., 2007; Schweiger & Tebbe, 1998), disamping PCRRISA (Saito et al., 2007; Slawomir et al., 2010), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) (Araujo et al., 2002; Reiter et al. 2006; Saito et al., 2007), dan terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) (Blackwood et al., 2007; Saito et al., 2007).
KESIMPULAN Berdasarkan hasil alalisis dengan PCR-SSCP dapat diambil kesimpulan bahwa BDB dan struktur komunitas bakteri endofit antarvarietas terinfeksi tidak berbeda. Eksonuklease pada SSCP dapat meningkatkan kualitas visualisasi DNA amplikon hasil PCR.
Gambar 4. PCR-SSCP dengan primer V4-V5 dari empat varietas pisang sakit Ab: Kepok Abu; KK: Kepok Kuning; Rb: Raja Bandung; Ka: Kepok Arab
Keragaman Blood Disease Bacterium dan Bakteri Endofit pada Beberapa Varietas Pisang Terinfeksi ............. ( Salim Widono dan Hadiwiyono)
41
DAFTAR PUSTAKA Anonymous. 2006. Pola Penyebaran OPT pada Tanaman Buah. Direktorat Jenderal Hortikultura. Jakarta.
Accessed on 30 December 2006. Araujo, W.L., J. Marcon, W. Maccheroni Jr., J.D. van Elsas, J.W.L. van Vuurde, & J.L. Azzevedo. 2002. Diversity of Endophytic bacterial population and their interaction with Xylella fastidiosa in Citruss plants. Appl. Environ. Microbiol. 68(10):49064914. Blackwood, C. B., T. Marsh, S. H. Kim, and E. A. Paul. 2003. Terminal restriction fragment length polymorphism data analysis for quantitative comparison of microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 69:926-932. Slawomir, C., T. Pokoj, & E. Klimiuk. 2010. CultivationDependent and -Independent Characterization
Garcia-Vazquez, E. P. Alvarez, P. Lopes, N. Karaiskao, J. Perez, A. Teia, J. L. Martinez, L. Gomes, & C. Triantaphyllidis. 2006. PCR-SSCP of 16S rRNA gene, a simple methodology for spcies identification of fis eggs and larvae. Scientia Marina 70:13-21. Hadiwiyono, S. Subandiyah, C. Sumardijono, J. Widada, & M. Fegan. 2006. Detection of blood disease bacterium using polymerase chain reaction with Microlysis Kit for DNA template preparation. Makalah Seminar Nasional Hasil Pertanian. UGM. Jogjakarta. Hoffmann, A., T. Thimm. M. Droge, E. R.B. Moore, J.C. Munch, and C.C Tebbe. 1998. intergenic transfer of conjugative and mobilizable plasmids harbored by Echerichia coli in the gut of soil microarthopod Folsomia candida (Collembola). Appl. Environ. Microbiol. 64:2652-2659.
of Microbial Community Producing Polyhydroxyalkanoates from Raw Glycerol. J. Microbiol. Biotechnol. 20(5), 853-861
Kadin Indonesia. 2006. Opportunity for Investment. http://www.kadin. indonesia.org.id Accessed: 20th May 2008.
Duineveld, B.M., G.A. Kowalchuk, A. Kelizer, J.D. van Elsas, & J.A. van Ween. 2001. Analysis of bacterial communities in the rhizosphere of chrysan-
Kong, P. L. Rubio, M.L. Polek, & B.W. Falk. 2000. Population strukture and genetic diversity within California Citrus Tristeza Virus (CTV) isolates. Virus
themum via denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-implied 16S rRNA as well as DNA fragments coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microb. 67(1):172-178. Eden-Green, S.J. 1994. Diversity of Pseudomonas solanacearum and related bacteria in South East Asia: new direction for Moko Disease. Pp.35-57 in : A.C. Hayward and G.L Hartman (eds) Bcaterial Wilt: the Disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. CAB International, UK. Fegan, M. 2005. Bacterial wilt diseases of banana: evalution and ecology. Pp.379-386 in: C. Allen, P. Prior, & A.C. Hayward (eds). Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. APS Press. St. Paul, Minnesota. Fegan, M. 2006. Bacterial Wilt Diagnostics Manual (unpublished: by permission).
42
Gene 21:139-145. Kong, P., C.X. Hong, P.W. Tooley, K. Ivors, M. Garbelotto, & P.A. Richarson. 2004. Rapid identification of Phytophthora ramorum using PCRSSCP analysis of ribosomal DNA ITS-1. Letters in Appl. Microbiol. 38:433-439. Lee, K.D., Y. Bai, D. Smith, H.S. Han, & Supanjani. 2005. Isolation of plant growth-promoting enophytic bacteria from been Nodules. Res. J. Agric. Biol. Sci. 1(3):232-236. Louws, F.J., J.L. W. Raemaker, and F.J. de Brujin. 1999. The three Ds of PCR-based genome analysis of Phytobacteria: Diversity, Detection, and Diagnosis. Ann. Rev. Phytopathol. 37:81-125. Misaghi, I.J. & C.R. Donndelinger. 1990. Endophytic bacteria in symptom-free plants. Phytopathology 80(9):808-811.
Agrosains 12(2): 39-43, 2010
Peters, S., S. Koschinsky, Fransky, F. Schweieger & C.C. Tebbe. 2000. Succession of microbial communities during hot composting as detected by PCRsingle-srand-conformation-based gentic profiles of small-subunit rRNA genes. Appl. Environ. Microbiol. 66(3):930-936. Reiter, B., U. Pfeifer, H. Schwab, & A. Sessitsch (2002). Response of endophityc bacteria communities in potato plants to infection with Erwinia carotovora sub. sp. atroseptica. Appl. Environ. Microbiol. 68:2261-22-68. Saito, A., S. Ikeda, C. Noritake, M. Akasaka, K. Fujishiro, K. Ando, & K. Minamisawa. 2007. Evaluation of microbial diversity using ribosomal intergenic spacer analysis. Bisebutsu Seitai 22:59-71
phism for 16S rRNA genebased microbial community analysis. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4870-4876. Subandiyah, S., Hadiwiyono, E. Nur, A. Wibowo, M. Fegan, & P. Taylor. 2006. Survival of blood disease bacterium of banana soil. Pp.76-77 in: Proceeding of the 11st International conference on Plant Ptahogenic bacteria. 10th to 14th July 2006. Royal College of Physicians of Edinbrgh, Edinburgh, Scotland United Kingdom. Supriadi. 2005. Present status of blood disease in Indonesia. Pp. 395-404 in: C. Allen, P. Prior, & A.C. Hayward (eds). Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. APS Press. St. Paul, Minnesota.
Schwieger, F. & C.C. Tebbe. 1998. A new approach to utilize PCR-single-strand conformation polymor-
Keragaman Blood Disease Bacterium dan Bakteri Endofit pada Beberapa Varietas Pisang Terinfeksi ............. ( Salim Widono dan Hadiwiyono)
43
