KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI Bacillus sp. PADA MEDIA YANG DIBERI FeCl3 HASIL PAPARAN MEDAN MAGNET 0,2 mT (SKRIPSI)
Oleh YOVITA SELVIE PASARIBU
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017
ABSTRAK
KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI Bacillus sp. PADA MEDIA YANG DIBERI FeCl3 HASIL PAPARAN MEDAN MAGNET 0,2 mT
Oleh Yovita Selvie Pasaribu
Dalam bioteknologi, enzim banyak digunakan di sektor industri, kesehatan dan penelitian. Enzim dimanfaatkan karena berisfat efisien, selektif, mempercepat reaksi tanpa produk samping, dan ramah lingkungan. Salah satu enzim yang banyak digunakan dalam berbagai produk komersial adalah protease. Pemanfaatan mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat yang murah, dan lebih mudah diproduksi dalam skala besar. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakter enzim protease dari Bacillus sp. pada media yang diberi kandungan FeCl3 hasil paparan medan magnet 0,2 mT. Penelitian ini dilakukan secara bertahap. Tahap pertama, peremajaan biakan murni Bacillus sp.. Tahap kedua, produksi enzim protease pada media cair Mendels yang dimodifikasi dan diberi perlakuan medan magnet. Tahap ketiga, pengujian aktivitas protease. Tahap keempat, karakterisasi enzim protease meliputi suhu(25, 30, 35, 40, 45, 50 55, 60, 65, dan 70°C), pH(4,5,6,7,8,9,10,11,dan 12), ion logam(Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+dan Fe3+) dan inhibitor (EDTA) enzim, serta nilai Km dan Vmaks(0;0.5; 1; 1,5; 2; dan 2,5%). Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif. Hasil analisis menunjukkan enzim protease pada media perlakuan tanpa Fe menghasilkan aktivitas tertinggi pada pH 8, suhu 30oC, dengan penambahan aktivator Mn2+, dan Vmaks 0,28 U/ml, serta Km 4,60 U/ml. Enzim protease pada media perlakuan yang diberi Fe tanpa paparan medan magnet menghasilkan aktivitas tertinggi pada pH 8, suhu 30oC, dengan penambahan aktivator Mn2+, dan Vmaks 0,33 U/ml, serta Km 5,64 U/ml. Enzim protease pada media perlakuan yang diberi Fe hasil paparan medan magnet menghasilkan aktivitas tertinggi pada pH 9, suhu 55oC, dengan penambahan aktivator Mn2+, dan Vmaks 0,35 U/ml, serta Km 10,04 U/ml. Kata kunci : Bacillus sp, Enzim Protease, Medan Magnet 0,2mT, ion Fe.
ii
KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI Bacillus sp. PADA MEDIA YANG DIBERI FeCl3 HASIL PAPARAN MEDAN MAGNET 0,2 mT
Oleh Yovita Selvie Pasaribu
Skripsi Sebagai salah satu syarat mencapai gelar SARJANA SAINS
pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kotabumi, pada tanggal 3 Januari 1995. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara oleh pasangan Bapak Rofelen Pasaribu dan Ibu Rusweni Simanjuntak. Penulis mulai menempuh pendidikan pertamanya di Taman Kanak-Kanak Xaverius Kotabumi pada tahun 1999. Pada tahun 2001, penulis melanjutkan pendidikan di Sekolah Dasar Xaverius Kotabumi. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di Sekolah Menengah Pertama Xaverius Kotabumi pada tahun 2007. Pada tahun 2010, penulis melanjutkan pendidikannya di Sekolah Menengah Atas Fransiskus Bandar Lampung. Pada tahun 2013, penulis tercatat sebagai salah satu mahasiswa Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam di Universitas Lampung melalui Jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN). Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Mikrobiologi Umum, Mikrobiologi Pangan dan Industri, Fisiologi Mikroba, dan Mikrobiologi Lingkungan. Penulis juga aktif di Organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMBIO) FMIPA Unila sebagai Kepala Bidang Sains dan Teknologi pada tahun 2015-2016.
vi
Penulis melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Desa Pangkal Mas, Kecamatan Mesuji Timur, Kabupaten Mesuji pada Jnuari-Maret 2016 dan melaksanakan Kerja Praktik di Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi Serpong
pada
Juli-Agustus
2016
dengan
judul
“ISOLASI
DAN
KARAKTERISASI PARSIAL ISOLAT BAKTERI B1 DARI LUMPUR GOT
LIMBAH
PADEGLANG
PENGOLAHAN UNTUK
KELAPA
APLIKASI
SAWIT
BIODETERGEN
MALIMPING, DI
BADAN
PENGKAJIAN DAN PENERAPAN TEKNOLOGI ( BPPT ) SERPONG”.
vii
PERSEMBAHAN Dengan mencgucapkan rasa syukur kepada Allah atas segala limpahan Rahmat dan Kasih-Nya yang tak berkesudahan Dia berikan, Kupersembahkan karya kecilku ini untuk : Kedua orangtuaku tercinta yang senantiasa mengucap namaku dalam doa, mencurahkan kasih dan sayangnya untukku, serta selalu mendukung dan memotivasi dalam setiap langkahku, Serta adikku tersayang yang juga selalu memberikan semangat.
MOTTO “Janganlah kita jemu-jemu berbuat baik karena apabila sudah datang waktunya, kita akan menuai, jika kita tidak menjadi lemah.” (Galatia 6:9) “Mintalah, maka akan diberikan kepadamu; carilah, maka kamu akan mendapat; ketoklah, maka pintu akan dibukakan bagimu.” (Matius 7:7) "Not all of us can do great things. But we can do small things with great love." (Mother Teresa) “It is our choices that show what we truly are, far more than our abilities.” (J.K. Rowling)
SANWACANA
Puji dan syukur Penulis naikkan kepada Allah Bapa yang Maha Kuasa dan Maha Pengasih, serta AnakNya yang tunggal, Sang Mesias dan Juruselamat, Yesus Kristus. Penulis telah menyelesaikan skripsi dengan judul “KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI Bacillus sp. PADA MEDIA YANG KANDUNGAN FeCl3 DIPAPAR MEDAN MAGNET 0,2 mT” yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains di Universitas Lampung. Penelitian ini merupakan bagian dari proyek penelitian Bapak Dr. Sumardi, M.Si. tahun 2017.
Penghargaan dan ucapan terima kasih penulis haturkan kepada semua pihak yang telah berperan atas dorongan, bantuan, saran, kritik, dan bimbingannya sehingga skripsi ini dapat terselesaikan, antara lain kepada: 1. Kedua orang tuaku tercinta atas segala kasih sayang yang telah diberikan, doa yang terus dipanjatkan, serta tak henti-hentinya memberikan nasihat, semangat dan motivasi kepada penulis. 2.
Adikku Yoseph Gabryel Pasaribu, yang selalu memberikan semangat dan tempat untuk berbagi keluh kesah serta canda tawa. ix
3. Bapak Dr. Sumardi, M.Si. selaku Pembimbing 1 atas semua ilmu, bantuan, bimbingan, nasihat, saran, dan pengarahan, baik selama perkuliahan maupun dalam penyusunan skripsi. 4. Ibu Rochmah Agustrina, Ph.D. selaku Pembimbing 2 atas semua ilmu, bantuan, bimbingan, nasihat, saran, dan pengarahan, baik selama perkuliahan maupun penyusunan skripsi. 5. Ibu Dra. C.N Ekowati, M.Si. selaku Pembahas atas semua ilmu, bantuan, bimbingan, nasihat, saran, dan pengarahan, baik selama perkuliahan maupun penyusunan skripsi. 6. Ir. Zulkifli. M.Sc. selaku Pembimbing Akademik yang telah memberikan arahan dan motivasi selama perkuliahan maupun dalam penyusunan skripsi. 7.
Prof. Dr. Ir. Hasriadi Mat Akin, M.P. selaku Rektor Universitas Lampung.
8.
Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D. selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
9. Ibu Dra. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung. 10. Seluruh Dosen dan Staf Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung, terima kasih telah banyak memberikan ilmu pengetahuan selama perkuliahan. 11. Rekan seperjuangan selama penelitian Nuraeni Prija Agustina, terima kasih atas bantuan, kebersamaan dan kerjasamanya selama penelitian berlangsung. x
12. Sahabat-sahabatku Christina Agustin, Angela Chikita, Dea Gratia, Fransiska Waringgih, Regina Asri, Clarisa Yolanda, dan Febe Mariany, terima kasih telah menjadi partner terbaik, serta terima kasih atas doa, dukungan, dan semangat yang telah diberikan. 13. Mbak Shofi, Balqis Ananda Putri, Sarah Niati, Dea Putri Andeska, Lina Linda Wati, Fatmawati Putri, Hafiz Auzar, Nur Rohman, Hendra Verry Setyawan, dan Microholic 13 yang selama di perkuliahan selalu ada untuk membantu, memberi saran, kritik, motivasi, dan semangat, serta sudah memberikan kenangan indah di perkuliahan. 14. Teman-teman Biologi Angkatan 2013 atas keakraban, canda tawa, dukungan, dan kebersamaannya selama ini yang telah kalian berikan. 15. Microholic 14, Agung Setya Ningsih, dan Rosmaida Sinurat atas bantuan dan dukungan selama penelitian yang telah kalian berikan. 16. Seluruh kakak dan adik tingkat Jurusan Biologi FMIPA Unila yang tidak dapat disebutkan satu-persatu atas kebersamaannya di FMIPA, Universitas Lampung. 17. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu yang telah memberikan penulis dukungan, berbagai kritik dan saran, 18. Serta almamater Universitas Lampung yang tercinta.
Semoga segala kebaikan yang telah diberikan mendapat balasan kebaikan pula dari Allah. xi
Demikianlah, semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat dan pengetahuan baru kepada setiap orang yang membacanya.
Bandar Lampung, 04 April 2017
Yovita Selvie Pasaribu
xii
DAFTAR ISI
Halaman SAMPUL DEPAN ........................................................................................................ i ABSTRAK ................................................................................................................... ii HALAMAN JUDUL DALAM .................................................................................. iii HALAMAN PERSETUJUAN .................................................................................. iv HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................................... v RIWAYAT HIDUP .................................................................................................... vi HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................... vii MOTTO .................................................................................................................... viii SANWACANA ........................................................................................................... ix DAFTAR ISI ............................................................................................................. xiii DAFTAR TABEL ..................................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ xvi I.
PENDAHULUAN ................................................................................................ 1 A. B. C. D. E.
Latar Belakang ................................................................................................ 1 Tujuan Penelitian ............................................................................................ 4 Manfaat Penelitian .......................................................................................... 5 Kerangka Pemikiran........................................................................................ 5 Hipotesis ......................................................................................................... 7
xiii
II. TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................................... 8 A. Bacillus sp. ...................................................................................................... 8 B. Enzim Protease.............................................................................................. 10 1) Fungsi Enzim............................................................................................ 10 2) Protease .................................................................................................... 11 3) Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim .............................. 13 C. Medan Magnet .............................................................................................. 19 III.
METODE PENELITIAN .................................................................................. 25 A. Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................... 25 B. Alat dan Bahan .............................................................................................. 25 C. Metode Penelitian ......................................................................................... 26 D. Analisis Data ................................................................................................ 32 E. Diagram Alir ................................................................................................. 33
IV.
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 34 A. Bacillus sp. Penghasil Enzim Protease ........................................................... 34 B. pH Optimum Aktivitas Enzim Protease ......................................................... 37 C. Suhu Optimum Aktivitas Enzim Protease ...................................................... 39 D. Pengaruh Ion Logam dan Inhibitor Spesifik .................................................. 42 E. Kinetika Kimia Enzim Protease……………………………………………..45
V.
KESIMPULAN .................................................................................................. 47 A. Kesimpulan ..................................................................................................... 47 B. Saran ............................................................................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 48 LAMPIRAN .............................................................................................................. 54
xiv
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1. Perbandingan nilai Indeks Proteolitik dan Aktivitas Protease antar perlakuan…………………………………..............................................36
Tabel 2. Perbandingan nilai Km dan Vmaks antar perlakuan ...............................46
Tabel 3. Hasil Spektrofotometer Aktivitas Enzim Protease ..................................55
Tabel 4. Aktivitas Enzim Protease dalam Berbagai Variasi pH ...........................55 Tabel 5. Aktivitas Enzim Protease dalam Berbagai Variasi Suhu……………….55
Tabel 6. Aktivitas Enzim Protease dalam Berbagai Variasi Logam Konsentrasi 1mM.........................................................................................................56
Tabel 7. Aktivitas Enzim Protease dalam Berbagai Variasi Logam Konsentrasi 5mM.........................................................................................................56
xv
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzimatik ............................................. 14 Gambar 2. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzimatik .......................................... 16 Gambar 3. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik ............................................................................................. 18 Gambar 4. Hasil uji proteolitik pada media tanpa Fe ........................................... 34 Gambar 5. Hasil uji proteolitik pada media perlakuan dengan Fe tanpa paparan medan magnet ..................................................................................... 35 Gambar 6. Hasil uji proteolitik pada media perlakuan dengan Fe yang dipapar medan magnet ..................................................................................... 35 Gambar 7. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim protease ................................. 38 Gambar 8. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim protease ............................... 40 Gambar 9. Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik terhadap aktivitas enzim protease dalam konsentrasi 1mM …………………………...............43 Gambar 10. Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik terhadap aktivitas enzim protease dalam konsentrasi 5 mM……………………………….......43 Gambar 11. Km dan Vmaks dari enzim protease pada media perlakuan tanpa Fe ... 56 Gambar 12. Km dan Vmaks dari enzim preotease pada media perlakuan yang diberi Fe tanpa paparan medan magnet ......................................................... 57 Gambar 13. Km dan Vmaks dari enzim preotease pada media perlakuan yang diberi Fe hasil paparan medan magnet .......................................................... 57
xvi
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Penggunaan enzim dalam bioteknologi di sektor industri, kesehatan dan penelitian semakin banyak mendapat perhatian. Enzim banyak dimanfaatkan karena berisfat efisien, selektif, dapat mempercepat reaksi tanpa produk samping, dan ramah lingkungan. Enzim – enzim yang digunakan pada bioteknologi bidang pangan antara lain: amilase, invertase, glukosa-isomerase, papain, dan bromelin. Adapun enzim yang banyak digunakan dalam bioteknologi di bidang kesehatan antara lain: amilase, lipase, dan protease.
Salah satu enzim yang banyak digunakan dalam berbagai produk komersial adalah protease. Enzim protease dapat diperoleh dari berbagai sumber antara lain tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme. Mikroorganisme adalah organisme yang paling banyak digunakan sebagai sumber enzim dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Pemanfaatan mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat yang murah. Sehingga, lebih mudah diproduksi dalam skala besar dengan
2
hanya mengulas kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik, serta produksinya yang ekstrim (Kosim dan Putra, 2009).
Salah satu jenis bakteri yang digunakan untuk menghasilkan enzim protease yaitu Bacillus sp. Yusufa dkk., (2013) menunjukkan bahwa beberapa spesies Bacillus sp. memiliki kemampuan menghasilkan protease. Soeka dkk., (2011) membuktikan bahwa Bacillus licheniformis dapat menghasilkan enzim protease. Bacillus subtilis diketahui dapat menghasilkan enzim protease (Kosim dan Putra, 2009).
Kemampuan mikroba untuk memproduksi enzim dengan aktivitas yang tinggi dapat dicapai dengan melakukan optimasi terhadap mikroorganisme penghasil enzim tersebut (Mubarak, 2001). Selain optimasi pertumbuhan mikroorganisme, peningkatan produksi enzim dapat dilakukan juga dengan mengoptimasi komposisi dan kondisi medium antara lain: pH, suhu, sumber karbon dan nitrogen, atau dengan memberikan treatment tambahan.
Fitriani (2013), menunjukkan bahwa enzim protease dari Bacillus isolat B19 KUB BPPT memiliki karakter antara lain : pH optimum 9, suhu optimum 600C, ion logam yang dapat meningkatkan aktivitas enzim yaitu Na+, inhibitor enzim adalah EDTA dan PMSF, serta nilai Km dan Vmax enzim masingmasing secara berurutan adalah 0,021 mM dan 90,91 U/mg. Penelitian Nugroho (1999) pada karakter enzim protease yang dihasilkan dari Bacillus subtilis diperoleh karakter enzim yang aktivitasnya optimum pada pH 8,5 dan suhu 550C. Adapun karakter enzim protease dari Bacillus thermoglucosidasius (Fuad dkk., 2004) memiliki karakter antara lain: pH optimum 9, suhu optimum
3
850C, ion logam yang dapat meningkatkan aktivitas enzim yaitu Cu2+, dan inhibitornya enzim adalah EDTA. Yandri dkk., (2007) menunjukkan bahwa enzim protease yang dihasilkan dari Bacillus subtilis menunjukkan karakter optimum pada pH 7,5 dan suhu optimum 600C, serta memiliki nilai Km dan Vmaks masing-masing secara berurutan yaitu 6,48 mg/ml dan 3,26 U/ml.
Selain mempengaruhi komposisi dan kondisi medium pertumbuhan Bacillus sp., pemaparan medan magnet juga mampu meningkatkan aktivitas enzim. Penelitian Hozayn dkk., (2015) pada benih bawang yang diberi medan magnet menunjukkan adanya peningkatan laju perkecambahan dan pertumbuhan. Fenomena tersebut disebabkan karena medan magnet diduga dapat menyebabkan perubahan pada metabolisme sel. Pada mikroba, medan magnet diduga dapat mempengaruhi karakteristik pertumbuhan seperti kualitas mRNA, ekspresi gen, sintesis protein dan aktivitas enzim (Setyasih dkk., 2015).
Selfiana (2016) membuktikan bahwa medan magnet dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri dalam lingkungan cairan yang mengandung ion Fe dan Zn. Ion Fe dalam garam FeCl3 merupakan nutrisi penting untuk pertumbuhan hampir semua mikroorganisme. Fe juga berperan sebagai kofaktor dalam sejumlah enzim yang diperlukan untuk dalam proses-proses biokimia di sel, termasuk respirasi dan fotosintesis (Shiying dkk., 2011). Sebagai kofaktor, ion logam dapat berperan sebagai aktivator maupun inhibitor.
Ketika FeCl3 yang telah dipapar medan magnet ditambahkan dalam media pertumbuhan bakteri maka sifat kemagnetan yang tersimpan pada media
4
diduga akan mempengaruhi pertumbuhan bakteri yang ditumbuhkan pada media tersebut. Paparan medan magnet ELF memiliki efek reversibel pada ikatan N-H dan C-N dari ikatan peptida, dan mengubah struktur sekunder sel beta dan alfa-heliks dalam protein sebagai substrat. Akibatnya, terjadi pelepasan ikatan-ikatan penyusun protein dan terjadi perubahan pada struktur molekul (Ikehara, 2003). Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan tentang “Pengaruh Paparan Medan Magnet 0,2 mT Pada Ion Logam Fe dan Zn Terhadap Aktivitas Bacillus sp. dalam Menghasilkan Enzim Protease” oleh Selfiana (2016). Hasil penelitian tersebut membuktikan bahwa paparan medan magnet 0.2 mT selama 10 menit pada ion logam Fe dan Zn mempengaruhi aktivitas Bacillus sp. dalam menghasilkan enzim protease. Penambahan ion logam Fe dalam bentuk garam FeCl3 sebanyak 0.01% yang dipapar medan magnet 0.2 mT selama 10 menit menghasilkan aktivitas enzim tertinggi yaitu 0.06 U/ml.
Enzim protease hasil penelitian di atas belum dikarakterisasi. Karakterisasi perlu dilakukan untuk mengetahui pH dan suhu optimum, ion – ion logam yang mampu meningkatkan aktivitas enzim, serta kinetika kimia enzim protease yang optimal, sehingga diperoleh aktivitas enzim yang tinggi. Oleh karena itu penelitian karakterisasi enzim protease dari Bacillus sp. pada media yang kandungan FeCl3 dipapar medan magnet 0,2 mT perlu dilakukan.
B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakter enzim protease dari Bacillus sp. pada media yang kandungan FeCl3 dipapar medan magnet 0,2 mT.
5
Karakter yang diamati antara lain: suhu, pH, pengaruh terhadap ion – ion logam tertentu, dan kinetika kimia enzim.
C. Manfaat Penelitian Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini adalah diperolehnya informasi ilmiah mengenai karakter enzim protease dari Bacillus sp. pada media yang kandungan FeCl3 dipapar medan magnet 0,2 mT berdasarkan suhu, pH, dan pengaruh ion – ion logam sebagai aktivator atau inhibitor serta kinetika kimia enzim.
D. Kerangka Pemikiran Enzim protease dapat dihasilkan dari berbagai organisme seperti: bakteri, jamur, tumbuhan, hewan dan manusia. Protease yang dihasilkan dari berbagai bakteri kebanyakan bersifat basa dan netral . Mikroorganisme yang telah diketahui sebagai penghasil protease untuk aplikasi komersial salah satunya adalah Bacillus sp.
Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh lingkungan. Faktor lingkungan enzim dapat mempengaruhi stabilitas enzim sehingga lingkungan menjadi kendala yang sering dihadapi dalam industri. Kestabilan aktivitas katalitik suatu enzim tergantung pada konformasi protein-protein penyusunnya. Aktivitasnya katalistik, enzim bekerja optimal bila berada pada kondisi yang sesuai. Kondisi yang mempengaruhi aktivitas enzim, diantaranya: suhu, pH, ion logam, konsentrasi substrat, dan kecepatan kinetika enzim.
6
Ion Fe merupakan nutrisi penting bagi hampir semua mikroorganisme dalam pertumbuhan karena perananya sebagai kofaktor pada sejumlah enzim yang diperlukan untuk proses biokimia di dalam sel. Sebagai kofaktor, ion logam dapat berperan sebagai aktivator maupun inhibitor. Mekanisme ion logam Fe dalam meningkatkan aktivitas enzim melalui yaitu (a) menjadi bagian integral dari sisi aktif, (b) merubah konstanta keseimbangan dari reaksi enzimatis, (c) merubah muatan listrik, (d) mengusir ion inhibitor, (e) menukar ion yang kurang efektif pada sisi aktif enzim atau substrat
Ion Fe dalam garam FeCl3 bersifat ferromagnetik dan memiliki sifat kemagnetan yang mampu merubah arah gerakan momen-momen dipol saat dipapar medan magnet. Momen-momen dipol yang awalnya memiliki gerakan tidak searah berubah menjadi searah bila dipapar oleh medan magnet. Perubahan momen dipol ini diduga menyebabkan Fe lebih mudah diserap oleh bakteri.
Fe merupakan kofaktor yang berasosiasi dengan sitokrom dalam transfer elektron pada respirasi aerob. Penyerapan Fe dengan mudah oleh bakteri dapat meningkatkan ATP yang dihasilkan. Hal ini akan berpengaruh terhadap sintesis protein enzim akan meningkat. Peningkatan sintesis enzim dapat berpengaruh terhadap karakter spesifik enzim. Ketika FeCl3 yang telah dipapar medan magnet ditambahkan dalam media pertumbuhan bakteri, maka sifat kemagnetan yang tersimpan pada media diduga akan mempengaruhi pertumbuhan bakteri yang ditumbuhkan pada media tersebut.
7
E. Hipotesis Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah diperoleh pH buffer, suhu, inhibitor enzim, serta nilai Km dan Vmaks yang dapat memberikan aktivitas maksimum protease dari Bacillus sp. pada media yang diberi FeCl3 hasil paparan medan magnet 0,2 mT.
7
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Bacillus sp. Bacillus di alam dapat ditemukan di tanah, air, dan udara. Beberapa spesies Bacillus merupakan flora normal di dalam saluran intestin manusia (Pelczar dan Chan, 2005). Menurut Whitman dkk., (2009), klasifikasi Bacillus sp. adalah sebagai berikut ini : Kingdom
: Bacteria
Phylum
: Firmicutes
Class
: Bacili
Ordo
: Bacillales
Family
: Bacillaceae
Genus
: Bacillus
Spesies
: Bacillus sp.
Bacillus sp. adalah bakteri Gram positif yang berbentuk batang dan bersifat motil. Bacillus sp. mampu menghasilkan spora yang biasanya
9
resisten terhadap panas dan umumnya bersifat aerob. Meskipun demikian terdapat beberapa spesies yang ditemukan dalam tanah bersifat aerob. Bacillus sp. memiliki karakter yang unik, yaitu memiliki kemampuan membentuk endospora ketika berada pada kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan. Spora ini dapat bertahan sampai 60 tahun atau lebih pada kondisi lingkungan yang ekstrem. Setiap spesies Bacillus berbeda dalam penggunaan gula sebagai sumber energi karena sebagian Bacillus melakukan fermentasi dan sebagian tidak (Barrow dan Feltham, 2003; Pelczar dan Chan, 2005).
Claus dan Barkeley (2004) menjelaskan bahwa Bacillus mempunyai sifat fisiologis yang menarik karena setiap jenis Bacillus menunjukkan kemampuan yang berbeda-beda, diantaranya mampu : (1) mengdegradasi senyawa organik seperti protein, pati, selulosa, hidrokarbon, dan agar, (2) menghasilkan antibiotik; (3) berperan dalam nitrifikasi dan dentrifikasi; (4) mengikat nitrogen; (5) dan bersifat khemolitotrof, aerob, fakutatif anaerob, asidofilik, psikoprifilik, atau thermofilik.
Bacillus sp. mampu menghasilkan enzim ekstraseluler antara lain: protease, lipase, amilase, dan selulase sehingga dapat membantu proses pencernaan dalam tubuh hewan (Wongsa, 2007). Yusufa dkk., (2013) menunjukkan bahwa beberapa spesies Bacillus sp. memiliki aktivitas protease. Soeka dkk., (2011) membuktikan bahwa Bacillus licheniformis dapat menghasilkan enzim xilanase dan protease. Bacillus subtilis diketahui dapat menghasilkan enzim protease (Kosim dan Putra, 2009).
10
B. Enzim Protease 1) Fungsi Enzim Enzim adalah molekul biopolymer polypeptide yang tersusun dari rangkaian monomer asam amino dalam komposisi dan susunan yang teratur dan tetap. Sebagai biokatalis, enzim dapat meningkatkan laju reaksi berlipat kali dibandingkan reaksi kimia normal dengan spesifikasi yang tinggi. Dengan demikian, pemanfaatan enzim dapat memberikan keuntungan secara ekonomi tanpa merusak lingkungan. Enzim memiliki sifat antara lain: (1) bekerja secara spesifik, sehingga tidak memerlukan banyak proses; (2) dapat dimobilisasi dan digunakan beberapa kali; (3) dapat menguraikan limbah yang mengandung senyawa berbahaya; dan (4) secara alami dapat didekomposisi oleh dekomposer (Andualema dan Gessesse, 2012). Terdapat dua teori yang menjelaskan mekanisme kerja enzim sebagai katalis yaitu, Teori Kunci-Gembok (Lock and Key Theory) dan Teori Kecocokan Induksi (Induced Fit Theory). Menurut teori kunci-gembok, terjadinya reaksi antara substrat dengan enzim disebabkan oleh adanya kesesuaian bentuk ruang antara substrat dengan situs aktif (active site) enzim, dan sisi aktif enzim cenderung bersifat kaku. Substrat berperan sebagai kunci masuk ke dalam sisi aktif enzim, yang berperan sebagai gembok, sehingga terjadi kompleks enzim-substrat. Pada saat ikatan kompleks enzim
11
substrat terputus, produk hasil reaksi akan dilepas dan enzim akan kembali pada konfigurasi semula. Berbeda dengan teori kunci gembok, menurut teori kecocokan induksi reaksi antara enzim dengan substrat berlangsung karena adanya induksi substrat terhadap situs aktif enzim yang sedemikian rupa sehingga keduanya merupakan struktur yang komplemen atau saling melengkapi. Menurut teori ini situs aktif enzim tidak bersifat kaku, tetapi lebih fleksibel (Murray dkk., 2009).
2) Protease Protease merupakan enzim hidrolase yang berperan dalam reaksi pemecahan ikatan peptida pada molekul protein, menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, melalui reaksi hidrolisis pada ikatan peptide. Enzim ini mengkatalisis reaksi hidolisis, yaitu reaksi yang melibatkan unsur air pada ikatan spesifik suatu substrat (Rao dkk., 1998 ).
Enzim protease dapat dihasilkan dari berbagai organisme seperti: bakteri, jamur, tumbuhan, hewan dan manusia. Protease yang dihasilkan dari berbagai bakteri kebanyakan bersifat basa dan netral, sedangkan protease yang dihasilkan oleh berbagai jamur dapat bersifat asam, netral, dan basa (Rao dkk., 1998). Protease mikroba dapat diklasifikasikan sebagai protease serin (E.C. 3.4.21), protease sulfhydril (E.C.3.4.22), protease asam (E.C.3.4.23) dan metaloprotease (E.C.3.4.24). Beberapa mikroorganisme yang telah
12
diketahui sebagai penghasil protease untuk aplikasi komersial adalah Bacillus, Lactobacillus, Pyrococcus, Termonospora, Rhizopus, Mucor, Endothi, dan Aspergillus (Rao dkk., 1998 dan Ward dkk., 2009).
Seperti telah diuraikan di atas, salah satu sumber penghasil enzim protease yang banyak diteliti adalah bakteri. Pemilihan bakteri sebagai sumber enzim protease disebabkan beberapa alasan yaitu: a) bakteri lebih mudah tumbuh dengan kecepatan yang lebih cepat dibandingkan makhluk hidup lainnya. b) skala produksi enzim mudah ditingkatkan. c) biaya produksi enzim relatif rendah. d) kondisi produksi tidak tergantung pada musim dan waktu proses produksi enzim lebih pendek (Poernomo dan Purwanto, 2003). Bacillus menghasilkan protease untuk menguraikan protein dalam medium.
Dalam sektor industri protease dari Bacillus sp. banyak dimanfaatkan dalam produksi makanan, farmasi, bioremediasi serta dalam industri tekstil ( Luo, 2013). Rahayu dkk., ( 2013) menjelaskan bahwa enzim protease menghidrolisa noda protein pada pakaian sehingga kotoran yang mengandung protein seperti darah, lendir, keringat dan sebagainya akan mudah tercuci. Sementara itu, kotoran lainnya yang terikat pada protein juga menjadi lebih mudah dihilangkan. Protease yang terdapat pada
13
detergen biasanya bekerja pada pH alkali (7,5-9) dan suhu yang cukup tinggi (30-70 °C). Alkali protease ini digunakan pada detergen karena kemampuannya yang bersifat biodegradable dan dapat meningkatkan kerja dari detergen secara umum. Enzim protease sekarang digunakan sebagai pencuci sarang burung walet menggantikan bahan kimia hidrogen peroksida (H2O2) yang dikenal sebagai agen pemutih (bleaching) yang bersifat alami dan aman bagi tubuh.
3) Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh lingkungan. Faktor lingkungan enzim dapat mempengaruhi stabilitas enzim sehingga lingkungan menjadi kendala yang sering dihadapi dalam industri. Stabilitas enzim didefinisikan sebagai kestabilan aktivitas enzim selama disimpan dan digunakan, serta ketika bereaksi dengan senyawa yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu (asam, basa), dan bereaksi dalam kondisi temperatur dan pH ekstrim (Dosanjh dan Kaur, 2002).
Kestabilan aktivitas katalitik suatu enzim tergantung pada konformasi protein-protein penyusunnya. Aktivitasnya katalistik, enzim akan optimal bila berada pada kondisi yang sesuai. Kondisi yang mempengaruhi aktivitas enzim, diantaranya:
14
a) Temperatur Kecepatan reaksi enzimatis meningkat seiring dengan meningkatnya temperatur. Pengaruh meningkatnya temperatur akan menyebabkan energi kinetik molekul sehingga frekuensi tumbukan antar molekul substrat dengan enzim semakin tinggi. Selain itu, jika dikaitkan dengan struktur enzim yang berupa protein maka temperatur optimum merupakan batas yang memungkinkan struktur enzim tetap terjaga. Akibatnya perubahan temperatur akan menyebabkan perubahan struktur molekul enzim sehingga mempengaruhi aktivitas dan stabilitas enzim dan kecepatan reaksi. Pada temperatur yang lebih tinggi, kecepatan reaksi menurun karena terjadi gangguan terhadap konformasi atau bentuk molekul enzim (Amara dkk., 2009). Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzimatik disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzimatik (Mangunwidjaja dan Suryani, 1994).
Enzim protease yang dihasilkan oleh kelompok bakteri termofilik seperti Bacillus memiliki aktivitas optimum pada suhu antara 40ºC50ºC dengan menggunakan kasein sebagai substrat (Kosim dan Putra, 2010).
15
b) pH Setiap enzim memiliki pH optimum yang berbeda-beda. Kondisi pH yang ekstrim, terlalu asam atau terlalu basa menyebabkan enzim kehilangan aktivitas katalitiknya. Hal tersebut berhubungan dengan perubahan ionisasi gugus - gugus fungsionilnya. Enzim pada hakekatnya enzim adalah protein yang tersusun atas asam amino yang dapat melakukan ionisasi yaitu mengikat dan melepaskan proton atau ion hidrogen pada gugus amino, karboksil, dan gugus fungsionil lainnya.
Perubahan pH juga dapat mengakibatkan enzim mengalami denaturasi karena akibat adanya gangguan terhadap gugus ioniknya. Gugus ionik ini berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Enzim mempunyai aktivitas maksimum pada pH tertentu. Beberapa enzim bekerja maksimum pada kondisi asam, namun ada juga yang maksimum pada kondisi basa. Namun kebanyakan enzim bekerja maksimum pada pH netral (Hames dan Hooper, 2000). Di sekitar pH optimum enzim mempunyai stabilitas yang tinggi. Dalam hal ini, enzim yang sama sering kali memiliki pH optimum yang berbeda tergantung dari sumber enzim tersebut. Hubungan antara aktivitas enzimatik dengan pH secara umum disajikan pada Gambar 2.
16
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzimatik (Mangunwidjaja dan Suryani, 1994).
Berdasarkan gambar di atas dapat diketahui bahwa: (a) kurva aktivitas menunjukkan secara umum rentang nilai pH terhadap aktivitas enzim yang berbentuk lonceng, (b) pH optimum yang nilainya tergantung pada jenis enzim dan berbentuk puncak yang tajam, (c) beberapa enzim aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh nilai pH tertentu
Uji pH optimum untuk aktivitas enzim protease yang dihasilkan kelompok bakteri termofilik seperti Bacillus pada kisaran pada pH uji 7-10 didapat bahwa aktivitas tertinggi diperoleh pada pH 8 (Kosim dan Putra, 2010).
c) Logam, Aktivator, dan Inhibitor Aktivator merupakan suatu zat yang dapat mengaktifkan dan meningkatkan kerja enzim sedangkan inhibitor merupakan zat yang dapat menghambat kerja enzim. Inhibitor reversibel berikatan dengan enzim secara reversibel sehingga dapat dilepas kembali dengan proses dialisis atau dengan pengenceran
17
sehingga aktivitas enzimnya akan diperoleh kembali. Inhibitor irreversibel berikatan kuat dengan enzim dan tidak dapat dilepaskan dengan cara dialisis (Awaliatul, 2011). Beberapa ion logam yang dapat mempengaruhi aktivitas protease antara lain logam Cd2+ dan Hg2+ yang menghambat aktivitas protease (Naiola dan Widhyastuti, 2007), sementara beberapa logam lainnya justru merangsang aktivitas enzim protease diantaranya Ca, Mg, Zn dan Fe (Emmanuelle, 2013).
Mekanisme ion logam Fe dalam meningkatkan aktivitas enzim berlangsung melalui: (a) perannya sebagai bagian integral dari sisi aktif enzim, (b) mampu merubah konstanta keseimbangan dari reaksi enzimatis, (c) mampu merubah muatan listrik, (d) mengusir ion inhibitor, (e) mampu menukar ion yang kurang efektif pada sisi aktif enzim atau substrat (Baehaki dkk., 2012).
d) Konsentrasi Substrat Konsentrasi substrat mempengaruhi kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Pengaruh berbagai konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal dapat teramati jika konsentrasi enzim dijaga konstan seperti dapat dilihat pada Gambar 3.
18
Gambar 3. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1995).
Pada konsentrasi substrat yang amat rendah, kecepatan reaksipun amat rendah tetapi kecepatan reaksi akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat (Lehninger, 1995). e) Kecepatan Kinetika Enzim Hubungan antara kecepatan reaksi enzimatis dengan konsentrasi substrat bergantung pada afinitas enzim terhadap substrat tersebut (Ahmed dkk., 2011). Protease alkalin biasanya memiliki afinitas yang tinggi terhadap substrat kasein (Adinarayana dkk., 2003). Fitriani (2013) melaporkan bahwa, nilai Km dan Vmaks protease serin alkalin isolat B19 KUB BPPT CC fraksi dialisat dengan menggunakan kasein masing-masing adalah sebesar 0.021 mM dan 90.91 U/mg. Konsentrasi kasein sebesar 0.021 mM merupakan konsentrasi kasein yang dibutuhkan untuk tercapainya kecepatan reaksi sebesar setengah dari kecepatan maksimumnya (Vmaks). Nilai Vmaks yang tinggi menunjukkan laju reaksi juga semakin cepat (Yuningsih, 2006). Bila, nilai Km suatu enzim relatif kecil,
19
maka afinitas suatu enzim terhadap substrat kasein tinggi. Protease dari Bacillus subtilis memiliki nilai Km dan Vmaks sebesar 58 μM dan 148 U/mL pada substrat kasein (Ahmed dkk., 2011). C. Medan Magnet Medan magnet adalah daerah di sekitar magnet yang menyebabkan sebuah muatan yang bergerak di sekitarnya mengalami suatu gaya karena pengaruh magnet tersebut. Medan magnet tidak dapat dilihat, namun keberadaannya dapat dijelaskan dengan mengamati gejala – gejala pengaruhnya pada benda lain. Misalnya pada serbuk besi yang ditaburkan di sekitar magnet. Medan magnet dapat dinyatakan dengan menggunakan garis-garis induksi. Arah garis induksi magnet di suatu titik akan menyatakan arah medan magnet di titik tersebut (Aryono, 1980).
Gaya magnetik dapat ditimbulkan oleh arus listrik yang dialirkan pada kumparan kawat yang dililitkan secara rapat pada sebuah batang besi. Kumparan kawat yang dilaliri arus listrik tersebut kemudian disebut solenoida, yang dapat menimbulkan induksi magnetik. Induktansi solenoida bergantung pada sifat bahan (μ0), banyak nya lilitan (N) dan luas penampang (A). Menurut Ishag (2007) induksi magnetik adalah perubahan medan magnetik yang menimbulkan arus listrik, dan sebaliknya aliran arus listrik pada sebuah kawat juga dapat menimbulkan medan magnet. Besarnya medan magnet di sumbu pusat (titik O ) solenoid dapat dihitung dengan rumus berikut ini :
20
Keterangan: Β : Kuat medan magnet (T) µo : Permeabilitas ruang kosong (4π x 10−7) I : Kuat arus (A) N : jumlah lilitan l : panjang selenoida Bahan atau unsur yang berada di alam dibedakan ke dalam bahan atau unsur yang memiliki sifat kemagnetan feromagnetik, paramagnetik, dan diamagnetik, termasuk juga unsur-unsur hara penyusun jaringan makhluk hidup dan berbagai senyawa organik di dalam sitoplasma makhluk hidup (Reitz dkk., 1994). Haliday dan Resnick (2012), menjelaskan perbedaan sifat – sifat unsur paramagnetik, diamagnetik, dan ferromagnetik. Bahan paramagnetik, efek magnetik elektronnya saling meniadakan, gerakan spin dan lintasannya saling menghilangkan satu sama lain sehingga atom atau ion nya tidak bersifat magnetik, contohnya adalah pada gas – gas mulia seperti neon dan oksigen. Bahan diamagnetik dipengaruhi oleh keberadaan magnet luar. Keberadaan medan magnet luar akan mengubah laju orbital elektron diamagnetik sehingga menghasilkan perubahan orbital momen dipole yang berlawanan arah dengan arah medan magnet luar. Proses magnetisasi pada bahan diamagnetik terjadi karena adanya perubahan medan magnet dari tidak ada menjadi ada yang kemudian akan mengubah gerak elektron di dalam orbital – orbital atomnya sedemikian rupa sehingga arus orbitalnya menghasilkan medan magnet yang berlawanan arah dengan arah medan
21
magnet luar. Materi diamagnetik merupakan bahan yang memiliki kemampuan merespon gaya magnet (susepbilitas magnetic) rendah sehingga sifat magnetik bahan yang bersifat diamagnetik tidak signifikan seperti gas mulia (Ar, Ne, He), bahan alkali (Li, Na, K), kalsium, antimon, bishmuth, grafit, emas, perak, tembaga, hidrogen dan CO2 (Wiyanto, 2008). Ferromagnetik merupakan bahan yang tetap memiliki sifat kemagnetan walaupun bahan itu sudah tidak berada dalam pengaruh medan magnet luar. Contoh bahan yang bersifat ferromagnetik adalah besi (Fe), nikel (Ni), dan cobalt (Co) (Wiyanto, 2008).
Semua unsur yang terdapat di bumi, termasuk organel-organel dan molekul penyusun jaringan bakteri serta senyawa organik di dalam sitoplasma bakteri, secara kemagnetan dapat dibedakan menjadi unsur dengan sifat kemagnetan feromagnetik, paramagnetik dan diamagnetik. Organel-organel tersebut diduga terpengaruh polarisasi atau magnetisasinya oleh keberadaan medan magnet di sekitarnya. Medan magnet yang terdapat di sekitar organel yang mempunyai sifat kemagnitan paramagnetik dan feromagnetik dapat menyebabkan kedua unsur tersebut mengalami magnetisasi yang searah dengan arah gaya medan magnet tersebut, sedangkan bila medan magnet tersebut terdapat di sekitar unsur dengan sifat kemagnetan diamagnetik dapat menyebabkan unsur itu mengalami magnetisasi dengan arah yang berlawanan dengan arah gaya medan magnet yang mempengaruhinya itu (Reitz dkk., 1994).
22
Pengaruh medan magnet pada mikroba, diduga dapat mengubah karakteristik membran sel, mempengaruhi reproduksi sel, menyebabkan perubahan pada metabolisme sel serta mempengaruhi karakteristik pertumbuhan seperti kualitas mRNA, ekspresi gen, sintesis protein dan aktivitas enzim (Setyasih dkk., 2012). Medan magnet juga dapat memberikan pengaruh terhadap aktivitas enzim peroksidase, katalase and superokside dismutase (Lie, 2015).
Medan magnet dilaporkan dapat membunuh mikroba patogen yang terdapat di dalam bahan makanan seperti Salmonella typhimurium. Pemberian medan magnet berpengaruh langsung terhadap aktivitas metabolisme sel. Secara umum, medan magnet mempengaruhi arah migrasi dan mengubah laju pertumbuhan, mengubah aliran ionik yang melalui membran sehingga mengakibatkan perubahan kecepatan reproduksi sel (Sudarti dkk., 2014).
Kekuatan medan magnet yang diberikan pada bakteri harus tepat karena kuat medan magnet yang terlalu besar justru akan menghambat pertumbuhan bakteri. Penelitian terdahulu melaporkan bahwa pertumbuhan bakteri dihambat secara signifikan pada pemberian treatment medan magnet sebesar 150 G (Sutariningsih, 2007). Jika kuat medan magnet yang diberikan terlalu tinggi dan dalam paparan waktu yang tidak tepat akan menyebabkan metabolisme yang tidak menguntungkan bagi pertumbuhan sel atau menyebabkan perubahan pada struktur membran. Beberapa peneliti menduga bahwa tempat reaksi medan magnet dalam
23
sistem biologi adalah plasma elektromagnetik membran (Setyasih dkk., 2013).
Besi atau Fe adalah salah satu ion logam yang bersifat ferromagnetik, merupakan nutrisi penting untuk pertumbuhan optimal sel (Shiying dkk., 2011). Di dalam sel, Fe bertindak sebagai kofaktor beberapa enzim yang diperlukan dalam proses-proses biokimia selain sebagai dan merupakan bagian dari sitokrom yang penting dalam proses respirasi dan fotosintesis (Shiying dkk., 2011). FeCl3 juga berperan sebagai kofaktor yang dapat meningkatkan stabilitas Bacillus sp. dalam menghasilkan enzim protease (Adinaranaya dkk., 2003). Fe dalam bentuk Fe2+ lebih mudah dimanfaatkan oleh bakteri karena mudah larut dalam air. Penggunaan Fe dalam bentuk Fe3+ diubah terlebih dahulu menjadi Fe2+ dengan sisa energi yang telah digunakan untuk pertumbuhannya (Sutariningsih, 2007). Menurut Selfiana (2016), penambahan ion logam Fe dalam bentuk garam FeCl3 sebanyak 0.01% yang dipapar medan magnet 0.2 mT selama 10 menit meningkatkan aktivitas enzim hingga mencapai 0.06µ/ml. Menurut Emmanuelle (2013) Fe dapat merangsang aktivitas enzim protease.
Paparan medan magnet pada medium bakteri yang mengandung ion logam Fe, menyebabkan magnetisasi dalam medium tersebut hingga gerakan momen – momen dipol benda-benda yang termagnetisasi menjadi searah dengan arah medan magnet luar (Sipahutar, 2015). Perubahan arah momen
24
dipol ion Fe inilah yang diduga menyebabkan perubahan pada aktivitas enzim yang diproduksi oleh bakteri.
23
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian telah dilaksanakan pada Januari 2017 – April 2017 di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Botani FMIPA Unila.
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan antara lain: seperangkat alat gelas, Spectrophotometer UV , inkubator, shaker incubator, sentrifuse, laminar airflow, pH meter, spektrofotometer, dan kumparan medan magnet. Bahan yang digunakan antara lain: isolat bakteri Bacillus sp. koleksi laboratorium Mikrobiologi FMIPA UNILA; garam – garam aktivator protease yaitu: CaCl2, MnCl2, CuSO4, MgCl2, dan FeCl3, asam etilen diamintetraasetat (EDTA), dan fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF); media Mendels yang dimodifikasi dengan komposisi yang terdiri skim; 0,5 g; Yeast Extract 0,35 g; Triptone Water 0,35 g; NaCl 0,2 g; KH2PO4 0,245 g; MgSO4.7H2O 0,035 g; (NH4)2SO4 0,175 g dalam 100 mL aquades; dan FeCl3.
26
C. Metode Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif, untuk melihat karakteristik aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh Bacillus sp pada media yang mengandung FeCl3 hasil paparan medan magnet 0,2 mT. Aktivitas protease dihitung dalam satuan Protease Unit (PU) per ml ekstrak enzim. Satu unit protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu µmol tirosin per menit dan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 578nm. Karakter enzim protease yang diamati meliputi suhu, pH, aktivator dan inhibitor enzim, serta nilai kinetika enzim.
Prosedur kerja yang dilakukan sebagai berikut :
1.
Peremajaan Biakan Murni Bacillus sp. Biakan murni Bacillus sp. diinokulasikan pada media miring Mendel yang dimodifikasi secara goresan. Biakan diinkubasi pada suhu 37 ºC di dalam inkubator sampai berumur dua hari.
2.
Uji proteolitik pada media padat Mendels yang dimodifikasi FeCl3 yang telah dipapar medan magnet 0.2 mT selama 10 menit digunakan sebagai induktor pada media pertumbuhan. Uji proteolitik terdiri dari 3 perlakuan sebagai berikut: a. Perlakuan kontrol. Pada perlakuan kontrol, media padat Mendels yang dimodifikasi tidak diberi paparan medan magnet dan tidak diberi induktor.
27
b. Perlakuan negatif. Pada perlakuan negatif media padat Mendels yang dimodifikasi diberi induktor FeCl3. Baik media maupun induktor tidak dipapar medan magnet. c. Perlakuan positif. Pada perlakuan positif adalah media padat Mendels yang dimodifikasi diberi induktor FeCl3. FeCl3 dipapar medan magnet 0.2 mT selama 10 menit sebelum digunakan.
Pengamatan keberadaan zona jernih yang terbentuk di sekitar koloni bakteri dilakukan setelah kultur bakteri diinkubasi selama 10 dan 18 jam pada suhu 37ºC. Koloni bakteri dan zona bening yang terbentuk di sekitar koloni bakteri diukur diameternya dan selanjutnya ditentukan Indeks Proteolitik (IP) dengan persamaan sebagai berikut: IP =
3. Produksi Enzim Protease FeCl3 dipapar medan magnet 0,2 mT selama 10 menit. FeCl3 hasil paparan ditambahkan dalam median produksi enzim protease yaitu media cair Mendels yang dimodifikasi.
Produksi enzim protease dilakukan dengan menginokulasikan 5 ml starter Bacillus sp. pada 45 ml media cair Mendels yang dimodifikasi dengan perlakuan sebagai berikut:
28
a. Perlakuan kontrol. Pada perlakuan kontrol, media cair Mendels yang dimodifikasi tidak diberi paparan medan magnet dan tidak diberi induktor. b. Perlakuan negatif. Pada perlakuan negatif menggunakan media cair Mendels yang dimodifikasi diberi induktor FeCl3. Baik media maupun induktor tidak dipapar medan magnet. c. Perlakuan positif. Pada perlakuan positif menggunakan media cair Mendels yang dimodifikasi diberi induktor FeCl3. FeCl3 dipapar medan magnet 0.2 mT selama 10 menit sebelum digunakan.
Semua perlakuan kultur diinkubasi dalam inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 40ºC selama 24 jam yang disesuaikan dengan penelitian sebelumnya. Ekstrak enzim protease diperoleh dengan sentrifugasi terhadap kultur bakteri dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C
Enzim protease yang dihasilkan dalam media kultur Bacillus sp. diuji aktivitas proteasenya menggunakan spektrofotometer uv pada panjang gelombang 578 nm (Widowati, 2001). 4. Uji Aktivitas Protease Aktivitas protease diuji dengan mengukur kadar asam amino sebagai produk hidrolisis protein susu skim oleh enzim protease (Soeka dan Sulistiani, 2014).
29
Ekstrak kasar protease sebanyak 0,1 ml dicampurkan pada 0,5 ml substrak kasein. Kemudian buffer fosfat pH 7 0,01 M sebanyak 0,5 ml ditambahkan pada campuran tersebut, lalu campuran tersebut diinkubasi pada suhu 390C selama 10 menit. Kemudian TCA 0,1 M sebanyak 0,5 ml ditambahkan pada campuran tersebut, lalu diinkubasi pada suhu 390C selama 10 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatan dari campuran tersebut diambil sebanyak 0,375 ml kemudian ditambahkan 1,25 .l larutan Na2CO3 0,4 M dan pereaksi folin sebanyak 0,25 ml. Supernatan tersebut diinkubasi pada suhu 370C selama 20 menit (Bergmeyer dan Grassl, 1983).
Aktivitas protease ditentukan dengan cara mengukur Optical Density (OD) pada panjang gelombang 578 nm. Aktivitas protease pada blanko dilakukan dengan cara yang sama seperti untuk sampel lainnya namun, sampel protease diganti dengan aquades. Penentuan aktivitas nilai sampel standar juga dilakukan sama seperti untuk namun, sampel protease diganti dengan tirosin 5mM.
Aktivitas protease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml ekstrak enzim dengan mengikuti persamaan dibawah: PU=
x
Keterangan : PU : Unit Aktivitas Protease (Unit/ml) Asp : Nilai Absorbansi Sampel Ast : Nilai Absorbansi Strandar Abl : Nilai Absorbansi Blanko
30
T
: Waktu
4. Penentuan Karakter Enzim Protease a. Penentuan pH Optimum Aktivitas Enzim Protease Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan ekstrak kasar enzim dan 0,25% substrat kasein dinkubasi pada suhu 37oC dalam satu seri bufer 0,05M yang berbeda, yakni: pH 4,5 (buffer sitrat), pH 6,7 (buffer fosfat), pH 8,9 (buffer trisHCl), pH 10,11,12 (buffer glisin-NaOH). Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl (Soeka dan Sulistiani, 2014). b. Penentuan Suhu Optimum Aktivitas Enzim Protease Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan ekstrak kasar enzim dan 0,25% substrat kasein pada pH optimum. Dengan variasi suhu uji 25, 30, 35, 40, 45, 50 55, 60, 65, dan 70°C. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas enzim mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl (Soeka dan Sulistiani, 2014). Suhu yang menghasilkan enzim tertinggi menunjukkan suhu optimum. c. Pengujian Daya Hambat Inhibitor dan Berbagai Ion Logam Terhadap Aktivatas Enzim Protease Pengaruh ion logam Ca2+, Mn2+, Cu2+. Mg2+, Fe3+ sebagai aktivator yang digunakan dalam bentuk garam masing - masing secara berurutan adalah sebagai berikut: CaCl2, MnCl2, CuCl2, MgCl2, dan FeCl3. Senyawa inhibitor untuk aktivitas protease yang digunakan
31
adalah senyawa pengkelat ion logam yang, asam etilen diamintetraasetat (EDTA). Substrat enzim yang digunakan kasein 0,25% yang direaksikan dengan 1 mM dan 5mM ion logam aktivator dan senyawa inhibitor di atas. Enzim yang telah direaksikan dengan ion logam dan inhibitor diinkubasi selama 10 menit pada suhu dan pH optimum, kemudian dilakukan uji aktivitas enzim dengan metode Bergmeyer dan Grassl (1983) yang dimodifikasi. Hasil uji aktivitas protease kemudian dibandingkan dengan uji aktivitas protease pada sampel yang tidak mendapat penambahan logam (Baehaki, 2012 ; Wahyuntari dan Hendrawati 2012). d. Penentuan Nilai Km dan Vmaks Penentuan Km dan Vmaks dilakukan berdasarkan hasil uji aktivitas enzim mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl (1983 ) yang dimodifikasi pada suhu dan pH optimumnya dengan menggunakan variasi konsentrasi substrat kasein sebagai berikut: 0%, 0.5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% dan 3%. Nilai aktivitas protease yang diperoleh kemudian digunakan untuk membuat kurva hubungan antara konsentrasi kasein dan aktivitas spesifik enzim. Kemudian hasilnya dimasukkan dalam persamaan linear Lineweaver-Burk. Nilai Km dan Vmaks diperoleh dengan rumus (Wahyuntari dan Hendrawati 2012):
32
Keterangan: Vo
:kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S]
Vmaks
:kecepatan maksimum
Km
:tetapanMichaelis-Menten enzim bagi substrat tertentu
D. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.
33
E. Diagram Alir Peremajaan Kultur Bakteri dan Uji Proteolitik pada Media Mendels Padat Termodifikasi
Inokulasi Kultur Bakteri pada Media Mendels Cair Termodifikasi
Produksi Enzim Protease
Kontrol
Perlakuan(+)
Perlakuan(-)
-
-
Uji Aktivitas (Bergmeyer dan Grassl)
Karakterisasi Enzim Protease
Buffer Sitrat
Buffer Fosfat
Buffer Tris-HCl
Buffer Glicyn-NaOH
Suhu
Ion logam Ca2+, Mn2+, Cu2+. Mg2+, Fe3+ dan Inhibitor EDTA
Penentuan Nilai Km dan Vmaks
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan Enzim protease dari Bacillus sp. pada media yang diinduksi dengan FeCl3 yang di papar medan magnet 0,2 mT memiliki karakter: pH optimum 9, suhu optimum 55oC, sebagai aktivator Mn, inhibitor spesifik yaitu EDTA, serta nilai Km dan Vmaks yaitu 10,04 U/ml dan 0,35 U/ml.
B. Saran 1.
Hasil penelitian ini belum dapat diterapkan dalam bidang industri yang menggunakan enzim protease, karena nilai Km dan Vmaks masih menunjukkan afinitas yang rendah terhadap substrat.
2.
Perlu dilakukan elektoforesis pada enzim protease yang dihasilkan agar tidak terdapat kontaminan enzim lain didalam substrat, sehingga menghasilkan nilai Km dan Vmaks terbaik.
32
DAFTAR PUSTAKA
Adinarayana K, P Ellaiah and DS Prasad. 2003. Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis PE-1. American Association of Pharmaceutical Scientists Pharmceutical Sciences Technology. 4(4):440-448. Ahmed I, Zia MA and Iqbal HMN. 2011. Purification and kinetic parameters characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis through submerged fermentation technique. World Applied Sciences Journal. 12(6):751- 757. Amara AA, Salem SR, Shabeb MSA. 2009. The possibility to use bacterial protease and lipase as biodetergent. Global Journal Biotechnology Biochemistry. 4:104-114. Andualema, B. and A. Gessesse. 2012. Microbial lipases and their industrial applications: Review. Biotechnology. 11(3):100—118. Aryono, D. 1980. Listrik dan Magnet. Penerbit Alumni. Bandung. Baehaki A. 2012. Kolagenase Bacillus licheniformis F11 asal Palembang dan aplikasinya pada pembuatan peptida kolagen bioaktif.[tesis]. Bogor (ID) :Institut Pertanian Bogor. Barrow ,GI and RKA. Feltham, 2003. Cowan and Steel’s Manual for The Identification of Medical Bacteria. Cambridge University Press. United Kingdom. Bergmeyer, H.V. and Grassl. 1983. Method of Enzymatic Analisis 2. Verlag Chemia, Weinhein. Claus, D. and Berkeley, R. C. W., 2004. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.2. Williams and Wilkins. New York. Chantawannakul P. 2001. Characterization of proteases of Bacillus strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northen Thailand. Science Asia 28:241-248. Dosanjh, N. S., and Kaur, J.,(2002), Immobilization, Stability, and Esterification Studies of A Lipase from Bacillus sp., Journal Biotechnology and Applied Biochemistry, 36:7 – 12.
49
Emmanuelle, Amanda. 2013. Integrated Process Production and Extraction of the Fibrinolytic Protease from Bacillus sp. UFPEDA 485. Biochem Biotechnol (2013) 170:1676–1688. Farisna, ST. dan E. Zulaikha. 2015. Resistensi Bacillus Endogenik Kalimas Surabaya terhadap Logam Besi (Fe). Jurusan Biologi FMIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Fitriani, Sarah. 2013. Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Enzim Protease dari Isolat B19 KUB BPPT CC.[skripsi]. Bogor(ID) :Institut Pertanian Bogor. Fuad, Asrul Muhamad, Rini Rahmawati, dan Nisa Rachmania Mubarik. 2004. Produksi dan Karakterisasi Parsial Protease Alkali Termostabil Bacillus thermoglucosidasius AF-01. Jurnal Mikrobiologi Indonesia.9(1): 29-35. Guang-rong H, Wei L, Dai DH, and Wei-lian H. 2011. Purification and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus sp. Hu1, African Journal Biotechnology. 10:2476-2485. Haliday, D. dan Resnick, R.2012. Fisika. Erlangga. Jakarta. Hames, B.D. and Hooper, N.M. 2000. Biochemistry: The Instant Notes. SpringerVerlag. Hongkong. Hozayn. M. Amal A.A.EL- Mahdy, and Abdel-Rahman H.M.H.. 2015. Effect of Magnetic Field on Germination, Seedling Growth and Cytogenetic of Onion ( Allium cepa L.). African Journal of Agricultural Research. Vol. 10. No. 8. 849–857 . Ikehara, T., Yamaguchi, H., Hosokawa, K., Miyamoto,H., and Aizawa, K.. 2003. Effects of ELF Magnetic Fields on Membrane Protein Strucutre of Living HeLa Cells Studied by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Bioelectomagnetics 24(7): 457-464. Ishaq, M. 2007. Fisika Dasar: Elektrisitas dan Magnetisme. Graha Ilmu. Yogyakarta. Johnvesl. B, and Naik. G. R. 2001. Study on production of thermostable alkaline protease from thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. JB99 in a chemically defined medium, Journal. Process Biochemistry. 37: 139-144. Kosim, M., dan Putra, S. Y. 2009. Pengaruh Suhu pada Protease dari Bacillus subtilis. Prosiding Skripsi Semester Genap 2009-2010 SK - 091304. Kovacs, Phillip E., Richard L. Valentine, and Pedro J.J. Alvarez. 1997. The Effect of Static Magnetic Fields on Biological System : Implications for Enhanced Biodegradation. Critical Reviews in Environment Science and Technology 27(4): 319-382.
50
Kumar D and Bhalla TC. 2004. Purification and Characterization of a Small Size Protease from Bacillus sp. APR-4. Journal Experiment of Biology.42: 515517. Kristinawati, Andika. 2015. Pengaruh Lama Paparan Medan Magnet Extremly Low Frequency Terhadap pH dan Kadar Air Pada Proses Pembuatan Keju Jenis Cream Cheese.[skripsi]. Jember(ID) :Universitas Jember. Lehninger AL. 1995. Dasar-dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta. Lie, Jie. 2015. Study on the effect of magnetic field treatment of newly isolated Paenibacillus sp. Journal Botanical Studies. 56:2. Luo. Yi. 2013. Identification and Characterization of an Anti-fungi Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium Protease from the Bacillus subtilis Strain N7. Journal of Microbiology. 51(3):359–366 . Mangunwidjaja, D. dan Suryani, A., 1994, Teknologi Bioproses, Penebar Swadaya, Jakarta. Mubarak NR. 2001. Imobilisasi Protease Bacillus subtilis ATCC 6633 menggunakan Matriks Gel Poliakrilamida. Jurnal Hayati. 8(1): 11-14. Muchtadi, T.R. dan Sugiyono. 2013. Prinsip Proses dan Teknologi Pangan. Alfabeta. Bandung. Murray, R.K., Granner, D.K. and Victor, R.W. 2009. Biokimia. EGC-Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Nadeem, M., J.I. Qazi., Baig and Q.A.Syed. 2008. Effect of Medium Composition on Comercially Important Alkaline Protease Production by B. Licheniformis N-2. Journal Food Technology Biotechnology. 46(4): 388-394. Nadkarni R, Barkley S, dan Fradin C.2013. A Comparison of Methods to Measure the Magnetic Moment of Magnetotactic Bacteria through Analysis of Their Trajectories in External Magnetic Fields. Journal PLOS ONE. 8:12. Naiola E. dan N Widhyastuti. 2002. Isolasi, Seleksi dan Optimasi Produksi Protease dari Beberapa Isolat Bakteri. Berita Biologi. 6(3):467- 473. Naiola E. dan N Widhyastuti. 2007. Semi Purifikasi dan Karakterisasi Enzim Protease Bacillus sp. Berkala Penelitian Hayati. 13:51-56. Nugroho, Kristian. 1999. Produksi dan Karakterisasi Protease Bacillus subtilis DB 104 Rekombian Imobil Pada Media Limbah Cair Tahu.[skripsi]. Bogor(ID) :Institut Pertanian Bogor.
51
Nurhayati, Ninik and Sumaryanto, 2012. Protease production by Bacillus substilis ATCC 1633. Proceeding The Is' Conferece on Industrial Enzyme and Biotechnology. 201-205. Nurmalinda A, Periadnadi dan Nurmiati. 2013. Isolasi dan Karakterisasi Parsial Bakteri Indigenous Pemfermentasi dari Buah Durian (Durio zibethinus Murr.). Jurnal Biologi Universitas Andalas 2(1):8-13. Pelczar, M.J. dan Chan, E.C.S. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2. Terjemahan Hadieotomo dkk, RS., Imas, T., Tjitrosoepomo, SS., dan Angka, SL. . Penerbit Universitas Indonesia: Jakarta. Poedjiadi, Anna F.M., dan Titin Supriyantini. 2005. Dasar-dasar Biokimia. UIPress. Jakarta. Poernomo, A.T dan D.A. Purwanto. 2003. Uji aktifitas crude enzim proteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah. Jurnal Farmasi Airlangga. 3(3): 103-107. Rahayu S, MT Suhartono dan W Suryapratama. 2013. Formulasi larutan pencuci sarang burung wallet berbasis enzim keratinase dan reduktase dari Bacillus sp. Mts. insentif.ristek.go.id/petunjuk/BHN_2013/RT- 2013-0970.doc . (Diunduh 2 Juli 2016). Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, and Deshpande VV. 1998. Molecular and Biotechnological Aspecst of Microbial Proteases. Journal Microbiology Molecular 62: 1092 – 2172. Reitz, J.R., Mildford, F.J., dan Cristy, R.W. 1994. Dasar-dasar Teori Listrik Magnit. Institut Teknologi Bandung. Bandung. Sadeghi, A., Shahidi, F., Mortazavi, S.A. and Mahalati, N. 2008. Evaluation of Different Parameters Effect on Maltodextrin Production by α-amilase Termamyl 2-x. World Applied Sciences Journal. 3(1): 34-39. Selfiana, Indah. 2016. The Effect of Metal Ions Fe and Zn Exposed to Magnetic Field 0,2 mT on The Production of Protease in Bacillus sp..Prosiding USR International Seminar on Food Security. 2016(1):73-74. Setyasih, Nevi, R. Agustrina, T.T. Handayani dan E. Ernawiati. 2013. Pengaruh Medan Magnet 0,3 mT terhadap Stomata Daun Tanaman Tomat (Lycopersicum esculentum Mill.). Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung. Shiying, He, Y. Feng, H. Ren, dan Y. Zhang. 2011. The Impact of Iron Oxide Magnetic Nanoparticle on the Soil Bacterial Community. School of Biological Science and Medical Egineering. 11: 1408 – 1417.
52
Sipahutar, W.S. 2015. Efek Waktu Wet Milling dan Suhu Anneling Terhadap Sifat Fisis, Monostruktur dan Magnet Dari Flakes NdFeB. Prosiding Fisika Universitas Sumatra Utara. Soeka YS, Rahayu SH, Setianingrum N, Naiola E. 2011. Kemampuan Bacillus licheniformis dalam memproduksi enzim protease yang bersifat alkalin dan termofilik. Media Litbang Kes. 21: 89-95. Soeka, Y.S. dan Sulistiani. 2014. Karakterisasi Protease Bacillus subtilis A1 InaCC B398 Yang Diisolasi Dari Terasi Samarinda. Berita Biologi PuslitLIPI. 13(2). Sudarti, Nurhayati, E. Ruriani, dan V.T. Hersa. 2014. Prevalence of Salmonella Typhimurium on Gado-Gado Seasoning by Treatment of Extremely Low Frequency (ELF) Magnetic Field. Artikel-ELF-Salmonella. Jember University. Sutariningsih, Endang. 2012. Potensi Pengguna Magnetic Pengguna Fe dan Hg. Universitas Gajah Mada. Yogjakarta. Teufel P and Gotz F. 1993. Characterization of an extracellular metalloprotease with elastase activity from Staphylococcus epidermidis. Journal Bacteriology. 175(13):4218-4224. Trismilah dan Lutfi A. 2009. Membran polyethersulfone dan regenerated cellulose untuk ultrafiltrasi: Pengaruh pH terhadap proses ultrafiltrasi xilanase. Jurnal Sains Dan Teknologi Indonesia.11(2): 76-83. Vijayaraghavan, Ponnuswamy, Samuel Gnana, dan Prakash Vincent. 2013. A simple method for the detection of protease activity on agar plates using bromocresolgreen dye. Journal Biochemistry Technology. 4(3): 628-630. Wahyuntari B dan Hendrawati H.2012.Properties of an Extracellular Protease of Bacillus megaterium DSM 319 as Depilating Aid of Hides. Microbiology Indonesia 6(2). doi : 10.5454/mi.6.2.4. Ward OP, Rao MB, Kulkarni A. 2009. Proteases production. Journal Application Microbiology Industrial. 495-511. Whitman, W., Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N.R., Ludwig, W.,Rainey, F.A., and Schleifer, K.-H. 2009. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.3. Springer-Verlag. New York. Widowati, S., Sukarno, L., dan Raharto, P. 2000. Studi Pengaruh Penambahan Mineral terhadap Aktivitas Protease dari Bacillus circulans 9b3. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor. Winarno FG. 1995. Enzim Pangan. Gramedia. Jakarta.
53
Wiyanto. 2008. Elektromagnetika. Graha ilmu. Yogyakarta. Wongsa, P., S. Supotina, M. Isaka. 2007. Optimizaton of cultures conditions for production of the anti-tubercular alkaloid hirsutellon A by Trichoderma gelatinosum BCC 7579. Journal Applied Microbiology. 44(5) :531 – 537. Yandri A.S, Dian Herasari, dan Tati Suhartati. 2007. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Protease Termostabil Dari Bakteri Isolat Lokal Bacillus subtilis ITBCCB148. Jurnal Sains MIPA.13(2): 100-106. Yuningsih S. 2006. Isolasi dan pencirian protease dari bakteri isolat nato.[skripsi]. Bogor (ID):Institut Pertanian Bogor. Yusufa, Mohammad H., Masdiana C. Padaga, Dyah A., dan Octavianie. 2012. Identifikasi dan studi aktivitas protease Bacillus sp asal limbah cair rumah potong ayam tradisional sebagai kandidat penghasil biodeterjen. Universitas Brawijaya.
