KAJIAN MOLEKULER BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT 9A HASIL ISOLASI DARI KOLON SAPI BALI MELALUI ANALISIS GEN 16S rRNA
SKRIPSI
Diajukan untuk Melengkapi Tugas-Tugas dan Memenuhi Persyaratan untuk Mencapai Gelar Sarjana Kedokteran Hewan
Diajukan oleh Dewa Gede Agung Widyadnyana NIM. 1109005079
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015
Setelah mempelajari dan menguji dengan sungguh-sungguh kami berpendapat bahwa tulisan ini baik ruang lingkup maupun kualitasnya dapat diajukan sebagai skripsi untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan.
Ditetapkan di .................................. tanggal ................................
Panitia Penguji:
Dr. drh. I Wayan Suardana, M. Si. Ketua
Dr. dr. I Dewa Made Sukrama, M.Si., Sp.MK. Sekretaris
drh. Tjokorda Sari Nindhia, S.KH, M.P. Anggota
Dr. drh. I Nengah Kerta Besung, M.Si. Anggota
Luh Ade Wilan Krisna, S.Si., M.Ked. Anggota
KAJIAN MOLEKULER BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT 9A HASIL ISOLASI DARI KOLON SAPI BALI MELALUI ANALISIS GEN 16S rRNA
SKRIPSI Diajukan untuk Melengkapi Tugas-Tugas dan Memenuhi Persyaratan untuk Mencapai Gelar Sarjana Kedokteran Hewan Oleh Dewa Gede Agung Widyadnyana NIM. 1109005079 Menyetujui/Mengesahkah: Pembimbing II
Pembimbing I
Dr. drh. I Wayan Suardana, M. Si. NIP. 197000122 199512 1 001
Dr. dr. I Dewa Made Sukrama, M.Si., Sp.MK. NIP. 19581010 198702 1 001
DEKAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA
Dr. drh. Nyoman Adi Suratma, M.P. NIP. 19600305 198703 1 001 Tanggal Lulus:
ABSTRAK
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang mampu memfermentasi laktosa dan menghasilkan asam laktat sebagai produk utamanya. BAL berpotensi dalam memproduksi bakteriosin dan bersifat probiotik. Sapi bali yang memiliki banyak keunggulan salah satunya mampu memanfaatkan hijauan yang kurang bergizi, dan mempunyai daya cerna yang baik terhadap pakan, sehingga diharapkan dapat ditemukan BAL yang memiliki keunggulan dalam saluran pencernaan sapi bali. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antimikroba BAL isolat 9A asal kolon sapi bali sehingga bisa di manfaatkan sebagai kandidat probiotik serta untuk mengetahui analisis susunan nukleotida dan gambaran phylogenetic tree bakteri asam laktat isolat 9A. Penelitian diawali dengan kultivasi isolat BAL sebagai hasil penelitian sebelumnya dengan menumbuhkan pada media MRS broth, uji katalase dan pewarnaan Gram. Isolat BAL yang sudah terkonfirmasi dilanjutkan dengan uji aktivitas antimikroba, dengan bakteri pathogen (E. coli dan S. aureus) kemudian dilanjutkan analisis molekuler dengan amplifikasi gen 16S rRNA dengan primer B27F dan U1492R, yang selanjutnya dilakukan sekuensing dan hasil sekuensing di analisis dengan program MEGA 4.0. Hasil penelitian menunjukkan uji aktivitas antimikroba bakteri asam laktat isolat 9A menghambat pertumbuhan S. aureus yang paling tinggi 61,47%, terendah 37.56% dengan rata-rata 50.35%, dan tidak terjadi penghambatan pada pertumbuhan E. coli, dan BAL isolat 9A teridentifikasi sebagai Streptococcus bovis dengan similaritas 99% dan berada satu kluster dengan Streptococcus bovis dengan nilai bootstrap sebesar 100. Kata kunci: Bakteri asam laktat, kolon sapi bali, aktivitas antimikroba, gen 16S rRNA
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ..........................................................................................i LEMBAR PENGESAHAN ..............................................................................ii RIWAYAT HIDUP ..........................................................................................iv ABSTRAK .........................................................................................................v ABSTRACT ......................................................................................................vi UCAPAN TERIMAKASIH............................................................................vii DAFTAR ISI.....................................................................................................ix DAFTAR GAMBAR........................................................................................xi DAFTAR TABEL ...........................................................................................xii BAB I PENDAHULUAN..................................................................................1 1.1 Latar Belakang.....................................................................................1 1.2 Rumusan Masalah................................................................................3 1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................3 1.4 Manfaat Penelitian ...............................................................................3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................4 2.1 Bakteri Asam Laktat ............................................................................4 2.2 Bakteri Asam Laktat dalam Saluran Pencernaan.................................6 2.3 Aktivitas Antibakteri Bakteri Asam Laktat .........................................6 2.4 Sapi Bali...............................................................................................7 2.5 Analisis Molekuler...............................................................................8 2.5.1 Identifikasi Molekuler Gen 16S rRNA ...................................8 2.5.2 Polymerase Chain Reaction (PCR).........................................9 2.5.3 Elektroforesis ..........................................................................9 2.5.4 Sekuensing ............................................................................10 2.5.5 Program BLAST ...................................................................10 2.6 Kerangka Konsep...............................................................................11 BAB III MATERI DAN METODE ...............................................................12 3.1 Bahan yang Digunakan......................................................................12 3.2 Peralatan yang Digunakan .................................................................12 3.3 Prosedur Penelitian ............................................................................12 3.3.1 Penumbuhan Bakteri .............................................................12 3.3.2 Uji Katalase ..........................................................................13 3.3.3 Pewarnaan Gram ...................................................................13 3.3.4 Uji Aktivitas Antimikroba Bakteri Asam Laktat Isolat 9A...13 3.3.5 Analisis Molekuler ................................................................14 a. Isolasi DNA Genom BAL................................................14 b. Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan Metode PCR ..........15 c. Elektroforesis dengan Agarose 1,5% ...............................16 d. Sekuensing .......................................................................16 3.4 Analisis Data......................................................................................16
x
3.5 Waktu dan Lokasi Penulisan .............................................................16 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................18 4.1 Hasil...................................................................................................18 4.1.1 Kultivasi Bakteri Asam Laktat Isolat 9A ..............................18 4.1.2 Uji Aktivitas Antimikroba.....................................................18 4.1.3 Identifikasi Gen 16S dengan PCR dan Elektroforesis .........19 4.1.4 Susunan Nukleotida...............................................................20 4.1.5 Hasil Analisis Sekuensing DNA ...........................................20 4.2 Pembahasan .......................................................................................28 BAB V SIMPULAN DAN SARAN................................................................33 5.1 Simpulan ............................................................................................33 5.2 Saran ..................................................................................................33 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................34
xi
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Uji daya hambat BAL isolat 9A terhadap bakteri patogen .................19 Tabel 2. Similarity isolat 9A dibandingkan dengan isolat BAL yang di akses dari Genebank NCBI...........................................................................27
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Kerangka konsep penelitian ............................................................11 Gambar 2. Hasil pewarnaan Gram bakteri asam laktat isolat 9A dengan perbesaran 1000X...........................................................................18 Gambar 3. Ketahanan BAL isolat 9A terhadap bakteri pathogen E. coli (A) dan S. aureus (B)............................................................................19 Gambar 4. Amplifikasi gen 16S rRNA BAL. Isolat. 9A hasil isolasi kolon sapi bali dengan Primer B27F dan U1492R pada agarose 1%. M: Marker 1kb. DNA ladder, 1: Isolat 9A.....................................20 Gambar 5. Alignment urutan basa DNA pengkode 16S rRNA isolate BAL 9A dengan bakteri asam laktat dari Genbank.................................26 Gambar 6. Pohon filogenetik berdasarkan sekuen penyandi 16S rRNA bakteri asam laktat isolat 9A ..........................................................28
xiii
