Jednohostitelská trypanosomatida ploštic a jejich vývoj

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra parazitologie

Jednohostitelská trypanosomatida ploštic a jejich vývoj Bakalářská práce

Helena Klepetková

Školitel: RNDr. Jan Votýpka, PhD. 2008

Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli RNDr. Janu Votýpkovi, PhD. za věnovaný čas, cenné rady a připomínky, které mi pomohly dokončit tuto práci.

2

Obsah 1 Abstrakt (Abstract)

4

2 Úvod

5

3 Charakteristika trypanosomatid

6

4 Morfologická stádia

8

4.1 Klasická taxonomie a její problematika 5 Přehled rodů čeledi Trypanosomatidae

11 12

5.1 Rody jednohostitelské

12

5.2 Rody dvouhostitelské

15

6 Ploštice jako hostitelé jednohostitelských trypanosomatid 6.1 Přenos jednohostitelských trypanosomatid mezi plošticemi

17 19

6.1.1 Pseudocysty

19

6.1.2 Nákaza z prostředí kontaminovaného infekčními stádii

22

6.1.3 Kanibalismus

23

6.1.4 Koprofágie

24

6.1.5 Transovariální přenos

25

6.1.6 Infekce z kořisti

25

6.2 Přenos jednohostitelských trypanosomatid u ostatního hmyzu

26

7 Závěr

28

8 Použitá literatura

29

Příloha

3

1 Abstrakt Prvoci ze skupiny Kinetoplastida jsou charakterizováni přítomností jedné, značně velké mitochondrie obsahující množství DNA tvořící organelu kinetoplast. Existující taxonomie této skupiny je založena na morfologii a životních cyklech. Tradičně se tato skupina rozděluje do dvou čeledí: Trypanosomatidae a Bodonidae. Parazitičtí zástupci patří především k jednobičíkatým

trypanosomatidům,

u

kterých

nenalezneme

volně

žijící

druhy.

Dvouhostitelské rody jsou známy jako původci závažných chorob člověka, domácích a volně žijících zvířat i rostlin. Esenciální součástí životního cyklu je u jedno i vícehostitelských druhů bezobratlý živočich, který slouží jako přenašeč nebo jako jediný hostitel. Práce se zabývá výskytem jednohostitelských trypanosomatid u ploštic, životními cykly a způsobem jejich přenosu mezi hostiteli.

Klíčová slova: Trypanosomatidae, Kinetoplastida, přenos, hmyz, Hemiptera

Abstract Kinetoplastida are a group of protozoa characterized by the presence of large mitochondrion with DNA formating the kinetoplast. The existing taxonomy of the group is based mainly on morphology and life cycles and traditionally is subdivided into two families: Trypanosomatidae and Bodonidae. The parasitic kinetoplastids belong largely to the uniflagellate Trypanosomatidae, with no free-living members. Dixenous species are best known as the causative agents of important diseases of humans, domestic and wild animals, as well as crops. Invertabrate hosts are an essential element of trypanosomatids life cycle – for some genera serve as vector and for the rest as the only host. This work deals with occurence of monoxenous trypanosomatids in hemipteron bugs, life cycles and mode of their transmission.

Key words: Trypanosomatidae, Kinetoplastida, transmission, insect, Hemiptera

4

2 Úvod Prvoci z čeledi Trypanosomatidae jsou velice pozoruhodnou skupinou čistě parazitických protist. Samotná podstata a existence eukaryotických buněk s sebou přínáší řadu problémů a tyto organismy na ně vynalezly velice zajímavá a mnohdy originální řešení. Jedná se např. o unikátní strukturu mitochondrie, RNA editing, atypická lokalizace glykolytických enzymů do jediné organely atd. Podle životního cyklu můžeme rozlišit rody jednohostitelské nebo dvouhostitelské. Spektrum jejich hostitelů patří k nejširším mezi parazitickými eukaryoty. Veřejnosti jsou známy jako původci závažných onemocnění člověka a jeho domestikovaných zvířat. Spavá a Chagasova nemoc (rod Trypanosoma) a leishmaniózy (rod Leishmania) zabíjejí a oslabují stovky tisíc lidí na celém světě. Značné ekonomické ztráty v chovech zvířat způsobují nemoci nagana, surra, murrina a dourina (rod Trypanosoma). Výše zmíněné dvouhostitelské rody jsou proto intenzivně studovány po dlouhou dobu, zatímco rod Phytomonas začal přitahovat pozornost teprve nedávno, a to jako parazit důležitých zemědělských plodin. Jinak je tomu u jednohostitelských druhů napadajících hmyz a další bezobratlé, které byly po dlouhou dobu opomíjeny. Tyto organismy je však nutné zahrnout do výzkumu, jelikož mohou hrát s největší pravděpodobností klíčovou roli při objasnění fylogeneze celé skupiny, a také by mohly vnést světlo do otázek týkajících se vzniku dvouhostitelských životních cyklů. Mohou se též využít jako modelové organismy při studiu rozličných buněčných procesů. S jejich pomocí je možné studovat biodiverzitu či otázky hostitelských specifit a ekologické valence. Přítomnost těchto parazitů se do dnešní doby zjišťovala jenom u nepatrného zlomku hmyzích druhů a navíc pouze z omezeného počtu lokalit. Každá nová studie zaměřená na jednohostitelská trypanosomatida však přináší další poznatky a popisy nových druhů. O diverzitě jednohostitelských trypanosomatid se mnoho neví, avšak odhaduje se, že bude ohromná. Nejinak je tomu se znalostí zeměpisného rozšíření, hostitelské specifity a fylogeneze. Ani životní cykly těchto parazitů nejsou dostatečně objasněny. Zajímavá může být tvorba odolných stádií, které zaujímají důležitou roli při přenosu parazita v populacích hostitele. Pseudocysty jsou doposud popsány u dvou rodů – Leptomonas a Blastocrithidia. Další mechanismy přenosu v populacích hmyzu zahrnují kontaminaci prostředí trusem s infekčními

bičíkovci,

koprofágii

a kanibalismus.

Detailních

ekologických

studií

zabývajících se touto problematikou však není mnoho. Neobjasněný též zůstává vliv na hostitelský organismus a případná patogenita.

5

3 Charakteristika trypanosomatid Kinetoplastida jsou početnou skupinou protist vyskytujících se v přírodě buď jako volně žijící konzumenti bakterií ve sladké i mořské vodě, nebo jako paraziti rostlin a živočichů včetně člověka. Společně s euglenidy a diplonemidy jsou kinetoplastida zařazovány do exkavátního kmene Euglenozoa (Cavalier-Smith, 1981). Představují velmi starobylou linii eukaryot a jedny z prvních organismů, u kterých se objevila mitochondrie. Třída Kinetoplastea (Cavalier-Smith, 1981) – ekvivalentem je řád Kinetoplastida (Honigberg, 1963) – se podle morfologických kritérií dělí na dvě čeledi: Bodonidae a Trypanosomatidae. Do čeledi Bodonidae patří prvoci vázaní převážně na vodní prostředí. Mají dva heterodynamické bičíky a nalezneme u nich několik typů životních strategií. Jedná se o volně žijící (Bodo, Parabodo) až parazitické druhy, nacházející se na kůži či žábrách ryb (Ichtyobodo), ve vnitřních orgánech ryb a bezobratlých (Cryptobia), nebo v krevním oběhu ryb – pijavkami přenášený rod Trypanoplasma. Druhá čeleď Trypanosomatidae je tvořena pouze parazitickými organismy s jedním bičíkem. Jako hostitel může sloužit obratlovec, bezobratlý živočich nebo rostlina. Podle životního cyklu je můžeme rozdělit na rody jednohostitelské (Blastocrithidia, Crithidia,

Herpetomonas,

Leptomonas,

Rhynchoidomonas,

Sergeia

a

Wallaceina)

a dvouhostitelské (Endotrypanum, Leishmania, Phytomonas a Trypanosoma). Esenciální součástí všech vývojových cyklů je přítomnost bezobratlého hostitele, který slouží buď jako jediný hostitel nebo jako přenašeč. Na základě molekulárně-fylogenetických analýz založených na sekvenčních datech (18S rRNA a některé proteiny) byla vytvořena nová klasifikace. Třída Kinetoplastea se nyní rozděluje na dvě podtřídy: Prokinetoplastina (zahrnující bazální druhy Ichtyobodo a Perkinsiella) a Metakinetoplastina, která obsahuje řád Trypanosomatida společně se třemi novými řády: Eubodonida, Parabodonida a Neobodonida (Moreira a kol., 2004; Simpson a kol., 2006). Organismy patřící dříve do čeledi Bodonidae se tak rozpadly do několika skupin. S bývalou čeledí Trypanosomatidae koresponduje řád Trypanosomatida. Zajímavé je postavení této skupiny uvnitř ostatních metakinetoplastid. Fylogeneze dle SSU rRNA naznačuje bazální oddělení trypanosomatid od apikálních bodonidů (Moreira a kol., 2004). Fylogenetické stromy vycházející z proteinových sekvencí (HSP90) svědčí o ukotvení uvnitř metakinetoplastid (Simpson a kol., 2004). Klíčovým organismem pro pochopení evoluce trypanosomatid je jejich blízce příbuzný druh Bodo saltans (Eubodonida) (Blom a kol., 1998). Unikátní organelou kinetoplastid je kinetoplast, podle kterého dostala tato skupina své jméno. Je to složitá struktura, která má většinou tvar disku a je uložena při bázi bičíku

6

v jediné velké mitochondrii. Kinetoplastová DNA (kDNA) je strukturálně nejkomplexnější mitochondriální DNA v přírodě. Je tvořena ohromnou sítí propojených kroužků dvojího typu – maxikroužků a minikroužků. Počet maxikroužků se pohybuje v desítkách na buňku (každý o velikosti 20 – 40 kb), zatímco minikroužky jsou přítomny v počtu několika tisíc, z nichž každý má velikost 0,5 – 10 kb (Lukeš a kol., 2002). Velikost a počet kroužků jsou závislé na druhu (Lukeš a Votýpka, 2000). Modelovým organismem pro studium kDNA je druh Crithidia fasciculata, u nějž se kinetoplastová síť skládá z 25 maxikroužků a 5 000 minikroužků (Shapiro a Englund, 1995). Maxikroužky jsou homogenní v nukleotidové sekvenci a nesou geny, které kódují mitochondriální rRNA, a geny pro podjednotky některých proteinů důležitých v transportu elektronů a syntéze ATP. Některé geny jsou však pozměněny, a aby vznikla funkční mRNA, musí dojít k posttranskripční úpravě, což zahrnuje inzerci a deleci uridinu ve specifických místech transkriptu. V tomto procesu, nazývaném RNA editing, se uplatňují malé molekuly guide RNA (gRNA), kódováné ve značně heterogenních minikroužcích (shrnul Lukeš a kol., 2005). Ve spojení s mitochondrií se v energetickém metabolismu uplatňuje další jedinečná organela, tzv. glykosom. Jedná se o modifikovaný peroxisom, ve kterém jsou lokalizovány některé enzymy glykolytického řetězce. Nachází se zde však i jiné enzymy zodpovědné za fixaci oxidu uhličitého, biosyntézu pyrimidinů, β-oxidaci mastných kyselin a syntézu etherových lipidů. V buňkách těchto prvoků byl poprvé objeven acidokalcisom (Vercesi a kol., 1994). Je to organela bohatá na vápník a polyfosfát, pomocí níž se uskutečňuje homeostáze vápníku a intracelulárního pH a osmoregulace. Dále slouží pro uskladnění hořčíku, sodíku, draslíku, zinku, železa a bazických aminokyselin (Docampo a kol., 2005). V elektronovém mikroskopu je často pozorovatelný výrazný povrchový plášť neboli glykokalyx, jež je vytvořen z glykoproteinů nebo glykolipidů. Dalším rozlišovacím znakem je cytoskelet tvořený kortikálními mikrotubuly, které vyztužují cytoplasmatickou membránu a pomáhají tak udržet tvar buňky. Toto vyztužení chybí v oblasti flagelární kapsy, což je pravděpodobně jediné místo, kde dochází k endocytóze i exocytóze makromolekul a k tvorbě plasmatické membrány nebo vkládání nových komponent. Skrz flagelární kapsu vybíhá z buňky bičík. Ten může obsahovat mřížovitou paraxiální tyčinku, přes jejíž krátký výběžek je uskutečněno připojení na axonemální mikrotubuly bičíku. Někdy se může vytvořit undulující membrána nebo se bičík může přeměnit na orgán přichycení k povrchům hostitele (Tieszen a kol., 1986; Schaub a kol., 1992). Zajímavá je též skutečnost, že někteří zástupci jednohostitelských trypanosomatid obsahují v cytoplasmě endosymbiotické bakterie, u kterých byla prokázána příbuznost 7

s druhem Bordetella bronchiseptica ze skupiny β proteobakterií (Du a kol., 1994a). Endosymbionti jsou v buňce lokalizováni poblíž jádra a zpravidla v počtu jediné bakterie (de Souza a Motta, 1999), což naznačuje, že svoje dělení synchronizuje s dělením hostitele. Její role spočívá v syntéze esenciálních živin pro trypanosomatida – obzvláště hemin (Roitman a Camargo, 1985). Při použití antibiotik při kultivaci trypanosomatid jsou tyto bakterie eliminovány a v kultuře se dále množí pouze aposymbiotičtí bičíkovci. Prostorové studie trypanosomatid prokázaly úzkou asociaci glykosomů s endosymbionty. Tyto bakterie pravděpodobně přijímají energii v podobě části ATP vyprodukované hostitelskou buňkou, protože postrádají funkční enzymy dýchacího řetězce (Motta a kol., 1997). Přítomnost těchto symbiontů má vliv nejen na metabolismus, ale i na morfologii buněk jednohostitelských trypanosomatid – odlišují se totiž absencí paraflagelární tyče (Freymüller a Camargo, 1981), což je struktura zodpovědná za interakce mezi parazitem a hostitelem (Tetley a Vickerman, 1985 cit.dle Gadelha a kol., 2005). I přesto jsou však bičíkovci hostící symbiotické bakterie schopní přichytit se k hostitelským strukturám (Fampa a kol., 2003). Pozdější ultrastrukturální studie u druhu Crithidia deanei, který patří mezi symbiontní trypanosomatida, paraflagelární tyč objevila, ovšem ve značně redukované formě (Gadelha a kol., 2005).

4 Morfologická stádia Během svého životního cyklu procházejí trypanosomatida různými morfologickými stádii. Tato stádia se dříve pojmenovávala podle rodu, pro který byla charakteristická – např. leptomonádové stádium pro promastigota podle rodu Leptomonas, leishmaniové stádium podle rodu Leishmania pro amastigota, epimastigot se označoval podle rodu Crithidia stádium crithidiové, atd. V současnosti se při morfologických popisech buněk vychází z pozice kinetoplastu, průběhu bičíku a tvaru buňky (Hoare a Wallace, 1966). Rozlišují se tedy stádia amastigota, promastigota, choanomastigota, endomastigota, paramastigota, opisthomastigota, epimastigota a trypomastigota. Stádium amastigota má kulovitý tvar a velice krátký bičík lehce vyčnívající z periflagelární kapsy. Prodloužená buňka je typická pro promastigota, bičík je protažený dopředu a volně vybíhá z flagelární kapsy a kinetoplast s kinetosomem je umístěn anteriorně k jádru. Choanomastigot se vyznačuje tvarem ječného zrnka s velkým kinetoplastem uloženým vedle jádra, flagelární kapsa je široká a trychtýřovitě tvarovaná. U endomastigota je periflagelární kapsa svinutá okolo jádra a bičík nevybíhá z buňky. U paramastigotního stádia leží kinetosom a kinetoplast vedle jádra. Jedná se o meziformu promastigota a opisthomastigota. Pokud se tyto organely nachází za jádrem (vzhledem k přednímu konci buňky), jedná se pak o opisthomastigota, u kterého probíhá 8

bičík dlouhou flagelární kapsou procházející skrz celou buňku. Pokud je kinetosom a kinetoplast umístěn mezi jádrem a předním koncem buňky a tvoří se krátká undulující membrána, pak se toto stádium nazývá epimastigot. Trypomastigotní stádium je charakteristické tvorbou undulující membrány. Ta probíhá po celé délce buňky a kinetosom s kinetoplastem leží u zadního konce (Vickerman, 2000) (viz obr. 1). V trávicím traktu hostitele se většina výše zmíněných morfotypů může nacházet ve dvou stavech. Volně pohybliví bičíkovci se označují jako nektomonády. Naopak haptomonády jsou kompaktní formy, které jsou pomocí bičíku přichycené ke stěně střeva. V kutikulární vrstvě předního a zadního střeva hmyzu dochází k adhezi pomocí hemidesmosomů (Tieszen a kol., 1986). Přichycení ve střední části střeva je komplikováno přítomností peritrofické matrix u dvoukřídlých nebo extracelulární vrstvy u ploštic, které často brání průniku parazitů. Schaub a kol. (1992) klasifikovali čtyři možnosti přichycení bičíkovce ve střední části střeva: (1) ukotvení pomocí nemodifikovaného bičíku mezi mikrovily (např. u B. gerridis) (Tiezsen a kol., 1983 cit.dle Schaub a kol., 1992); (2) rozsáhlé připevnění expandované cytoplasmy bičíku mezi mikrovily. Tento typ adheze byl pozorován u C. flexonema v Malphigických trubicích Gerris odontogaster (Tieszen a Molyneux, 1989a) nebo u B. triatomae ve středím střevu ploštice Triatoma infestans (Jensen a kol., 1990). Další typ uchycení (3) je korelován s vývojem přichycovacích plaků, kdy se vytvoří rozsáhlá oblast těsných buněčných spojů mezi expandovanými bičíky a mikrovily (např. C. flexonema) (Tieszen a Molyneux, 1989a). Poslední způsob (4) přichycení parazita zahrnuje kontakt pomocí zvrásněných povrchů samotného bičíkovce a hostitelské buňky. Tento typ interakce byl pozorován poprvé u B. triatomae (Schaub a kol., 1992). Možné je též přichycení pseudocyst k bičíku mateřské buňky pomocí struktury podobné desmosomům (Romeiro a kol., 2000) (viz též obr. 1). U jednohostitelských trypanosomatid se vyskytují všechna uvedená morfostádia. Amastigotní forma se často objevuje jako tzv. pseudocysta se zvrásněným povrchem, ale bez typické cystové stěny. Toto stádium nalezneme u rodů Leptomonas, Blastocrithidia a Rhynchoidomonas. Promastigot je charakteristický pro rod Leptomonas a Sergeia, ale během svého životního cyklu ho vytvářejí i rody Herpetomonas a Wallaceina. Pro rod Wallaceina je však příznačná endomastigotní forma. Rod Crithidia je charakterizován stádiem choanomastigota. Epimastigota nalezneme u rodů Blastocrithidia, pro který je typický, Crithidia a Rhynchoidomonas. Rod Rhynchoidomonas vytváří během svého životního cyklu především

trypanomastigotní

stádia

s

undulující

membránou.

Opisthomastigoty a

paramastigoty nalezneme pouze u rodu Herpetomonas (shrnuto dle Vickerman, 2000).

9

Obr. 1. Morfologie trypanosomatid: fk, flagelární kapsa; kp, kinetoplast; tv, trávicí vakuola; es, endosymbiotická bakterie. (a) Leptomonas oncopelti1 promastigot s flagelárními pseudocystami; (b) Herpetomonas muscarum promastigot; (c) H. muscarum opisthomastigot; (d) Crithidia fasciculata choanomastigot v nektomonádové formě; (e) C. fasciculata choanomastigot v haptomonádové formě; (f) C. oncopelti s endosymbionty; (g) Blastocrithidia familiaris epimastigot s pseudocystami; (h) Leishmania major promastigot; (i) L. major amastigot; (j) Phytomonas elmassiani promastigot, několikanásobné dělení u stádia v latexu rostliny; (k) Rhynchoidomonas drosophilae trypomastigot; (l) Endotrypanum schaudini epimastigot v červené krvince lenochoda; (m) Trypanosoma grayi trypomastigot z krve krokodýla; (n) T. cyclops trypomastigot z krve makaka; (o) T. cyclops epimastigot s pigmentem v trávicí vakuole; (p) T. musculi trypomastigot z lidské krve; (r) T. dionisii trypomastigot z krve netopýra; (s) T. vivax trypomastigot a (t) T. congolense trypomastigot, oba z krve dobytka; (u) T. brucei trypomastigot, štíhlá krevní forma; (v) T. brucei trypomastigot, krátká krevní forma; (w) T. evansi trypomastigot z krve velblouda; (x) T. suis trypomastigot z krve prasete. (převzato z Vickerman, 1990)

1

Ve smyslu L. oncopeltoides dle Podlipaev, 1990.

10

4.1 Klasická taxonomie a její problematika Klasická taxonomie trypanosomatid je založena právě na omezeném počtu jednotlivých morfologických stádiích, která jsou charakteristická pro jednotlivé rody. Jako je tvar buňky, její rozměry a vzájemná poloha jádra a kinetoplastu (Hoare a Wallace, 1966). Navíc tyto morfotypy mohou být modifikovány různými vlivy prostředí nebo zavedením do kultury (Podlipaev, 2000; Yurchenko a kol., 2006a; Svobodová a kol., 2007). Determinace druhů by však neměla být svázána tímto nedostatkem morfologických znaků, které navíc mohou být značně variabilní. Wallace a kol. (1983) navrhli využití biochemických, nutričních a ultrastrukturních rozdílů. Pozdější výzkumy se již zaměřily na identifikaci rozdílů v biochemických znacích, včetně složení polysacharidů na povrchu buňky (Abreu Filho a kol., 2001), sialidázy (d´Ávila-Levy a kol., 2004), proteolytických enzymů (Santos a kol., 2005) a počtu a velikosti acidokalcisomů (Miranda a kol., 2004). Některé tyto charakteristiky se mohou využít k rozpoznání druhů a mnoho dnešních popisů je založeno na jednom nebo na kombinaci více kritérií, ale nelze je využít pro determinaci rodu. Lepší schopnost rozlišení na úrovni rodů však vykazují mnohé molekulární znaky (markery). Využívají se sekvenční data úseků DNA, jako jsou sekvence malé ribozomální podjednotky 18S rRNA, 5S rRNA a pro kinetoplastida specifická SL RNA, což je malý úsek DNA, který se uplatňuje při trans sestřihu (trans splicing) (Podlipaev a kol., 2004; Westenberger a kol., 2004). Dále se využívají geny kódující proteiny pro glykosomální glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (gGAPDH) a pro cytosolické proteiny teplotního šoku (cHSP-70 a cHSP-90) (např. Simpson a kol., 2004; Yurchenko a kol., 2008). Spolu s využitím polymerázové řetězové reakce (PCR) poskytují sekvenační metody vynikající nástroj k detekci, rozlišení a identifikaci parazitů včetně tzv. barcoding metody (Maslov a kol., 2007). Na základě využití těchto metod vzniklo značné množství nesrovnalostí mezi klasifikací založenou na morfologii a molekulárními analýzami, a proto bude třeba důkladné revize současné taxonomie trypanosomatid. Jako příklad může být uveden případ nově popsaných druhů z Ekvádoru a Kostariky, které byly na základě morfologie předběžně přirazeny k rodu Leptomonas, avšak fylogenetická data prokázala blízkou příbuznost s crithidiemi (Yurchenko a kol., 2008). Molekulární analýzy odhalily, že čtyři hlavní rody jednohostitelských trypanosomatid (Blastocrithidia, Crithidia, Herpetomonas a Leptomonas) jsou polyfyletické (Du a kol., 1994b; Hollar a kol., 1998; Yurchenko a kol., 2006a; Svobodová a kol., 2007). Avšak nově se objevilo několik větších monofyletických skupin a je tedy možné, že by z těchto skupin mohly být v budoucnosti vytvořeny nové taxony definované sjednocením molekulárních 11

a dalších kritérií včetně morfologie. Jedním z hlavních seskupení jsou organismy tvořící tzv. pomalu se vyvíjející větev (SE, slowly-evolving), u kterých se odráží relativně pomalá míra divergence v sekvenci genu malé ribosomální podjednotky (Hollar a kol., 1998). Z fylogenetických analýz založených na sekvencích genu pro GAPDH též vyplývá, že tato pomalu se vyvíjející skupina se dále rozděluje na větev tvořenou rodem Leishmania s jejich nejbližším druhem Leptomonas costaricensis a větev tvořenou některými zástupci jednohostitelských trypanosomatid (Yurchenko a kol., 2006b). Další zajímavostí je pozice trypanosomatid obsahujících endosymbiotické bakterie (některé druhy rodů Blastocrithidia, Crithidia a Herpetomonas). Tvoří totiž samostatnou monofyletickou jednotku (Du a kol., 1994b; Hollar a kol., 1998).

5 Přehled rodů čeledi Trypanosomatidae Čeleď Trypanosomatidae zahrnuje přes 900 pojmenovaných druhů, které se rozčleňují do jedenácti rodů (Podlipaev, 1990; Svobodová a kol., 2007). Pro všechny tyto parazity je nezbytná přítomnost bezobratlých v životním cyklu, v němž zastupuje roli jediného hostitele (monoxenní rody) nebo přenašeče (rody dixenní). Taxonomický systém trypanosomatid je extrémně konzervovaný. Z jedenácti existujících rodů jich bylo 8 popsáno před rokem 1909, jeden rod v roce 1959 (Laird, 1959 cit.dle Podlipaev, 1990), další rod v roce 1990 (Podlipaev a kol., 1990) a poslední v roce 2007 (Svobodová a kol., 2007). Pro úplnost jsou v tomto přehledu zahrnuty i rod dvouhostitelské.

5.1 Rody jednohostitelské Typické pro rod Blastocrithidia Laird, 1959 je tvorba epimastigotů vyskytujících se v haptomonádové i nektomonádové formě. Podobně jako u rodu Leptomonas se u některých druhů mohou tvořit amastigotní pseudocysty (tzv. straphangery). Tito parazité se nacházejí ve střevě, popřípadě ve slinných žlázách (B. oxycareni) (Wallace, 1966). Napadají zástupce hmyzu z řádů Diptera, Hemiptera, Siphonaptera a Hymenoptera a klíšťata (Ixodidae). U druhů blastocrithidií izolovaných z klíšťat (B. haemaphysalidis a B. hyalommae) byl popsán transovariální přenos (Wallace, 1966). Typovým druhem, který byl popsán v Indii, je B. gerridis z ploštice Gerris fossarum Patton, 1908 (Podlipaev, 1990). Může se nacházet i u dalších druhů hemipterních čeledí (Gerridae a Veliidae), kde pokrývá povrch střeva haptomonádovou

formou.

Některé

blastocritihidie

mohou

obsahovat

bakteriální

endosymbionty (např. B. culicis, B. leptocoridis), avšak aposymbiotické druhy je obtížné

12

udržet v kontinuální kultuře. Jako zajímavost je možné zmínit skutečnost, že druh B. triatomae je patogenní pro ploštici Triatoma infestans, přenašeče Chagasovy choroby, a proto se uvažovalo o možném použití v biologické kontrole této ploštice (Schaub, 1994). Rod Crithidia Leger, 1902 je charakterizován choanomastigotní formou, která tvarem připomíná ječné zrnko. Mohou se vyskytovat v haptomonádové i nektomonádové fázi. Obsahují arginázu a arginosukcinátlyázu, avšak postrádají arginindeiminázu. Tyto druhy mohou vylučovat buď močovinu nebo amoniak v závislosti na tom, zda je v kultivačním médiu přítomen arginin nebo citrulin (Yoshida a Camargo, 1978). Ve Francii byl popsán typový druh C. fasciculata Leger, 1902 z komára Anopheles maculipennis (Podlipaev, 1990). Tito parazité se nacházejí ve střevě hmyzu z řádu Diptera, Hemiptera, Trichoptera a Hymenoptera (Podlipaev 1990). Crithidie se snadno množí v kultuře a pokud se jedná o smíšenou kulturu, rychle přerůstají ostatní trypanosomatida. V experimentálních studiích se nejčastěji využívají C. fasciculata a C. luciliae (parazit bzučivkovitých a mouchovitých), protože tyto druhy byly popsány na základě nutričních požadavků. Některé druhy mohou obsahovat endosymbiotické bakterie (např. C. oncopelti). Většina crithidií je nepatogenních, ale C. bombi je organismus ovlivňující velikost populací u čmeláků. Šíření parazitů mezi koloniemi se uskutečňuje skrze společné zdroje pylu a nektaru (Durrer a Schmid-Hempel, 1994). U rodu Herpetomonas Kent, 1880 je typické promastigotní stádium, ale mohou se vyskytovat i opisthomastigoti a paramastigoti. Za hostitele slouží především hmyz z řádů Diptera a Hemiptera (Podlipaev, 1990), v nichž jsou lokalizováni převážně v trávicí trubici. U larev mouchy domácí (Musca domestica) může do hemocoelu invadovat druh H. muscarum (Wallace, 1966). Z enzymů ornithinového cyklu je vždy přítomna arginindeimináza a chybí argináza. Exkrečním produktem je pouze amoniak (Yoshida a Camargo, 1978). Typovým organismem je H. muscarum izolovaný z mouchy domácí (Musca domestica). Tento druh byl porvé popsán v USA jako Bodo muscarum Leidy, 1856 (Podlipaev, 1990). Pod tímto názvem se však skrývaly dva rozdílné organismy, a proto byly odděleny do dvou poddruhů – H. muscarum muscarum a H. muscarum ingenoplastis (Rogers a Wallace, 1971). Odlišují se od sebe typem kinetoplastu a tím, zda obsahují endosymbiotické bakterie. H. m. muscarum neobsahuje bakteriální endosymbionty a vyznačuje se přítomností kinetoplastu typu A (Vickerman a Preston, 1976), což je kompaktní masa kDNA oddělená od mitochondriální opouzdřené kapsy. Naopak H. m. ingenoplastis obsahuje symbionty a je přítomný kinetoplast typu B. Kinetoplast typu B je častý u trypanosomatid se symbiotickými bakteriemi a jedná se o volně sbalenou kDNA zcela vyplňující mitochondriální kapsuli. Pravděpodobně se tedy 13

jedná

o

dva

samostatné

druhy.

Bylo

prokázáno,

že

endosymbionty

obsahující

trypanosomatida tvoří samostatnou monofyletickou větev na fylogenetických stromech (Hollar a kol., 1998), zatímco H. m. muscarum neobsahující bakterie má jinou topologii a s ostatními herpetomonádami tvoří jinou větev. Také z porovnání jejich proteolytických enzymů vyplývá, že se jedná o odlišné druhy s rozdílným metabolismem (Santos a kol., 2005). Opisthomastigotní stádia jsou produkována ve stacionární fázi růstu kultury v podmínkách, které nejsou optimální (např. vyšší teplota, zvýšené pH a osmolalita) a zpravidla nejsou schopny dělení. Avšak studium opisthomastigotů u H. roitmani prokázalo, že tato stádia se dokáží množit pomocí podélného dělení (Faria-e-Silva a kol., 1996). Rod Leptomonas Kent, 1880 vykazuje značnou heterogenitu. Jde o nejpočetnější skupinu jednohostitelských trypanosomatid, zahrnuje 69 popsaných druhů (Podlipaev, 1990), ale jenom 15 z nich se považuje za spolehlivé (Podlipaev, 2000). Tyto organismy parazitují převážně ve střevě a přidružených orgánech hmyzu z řádů Hemiptera, Diptera, Hymenoptera, Blattoidea, Lepidoptera, Siphonaptera, Anoplura a Orthoptera. Některé druhy byly nalezeny i v jiných bezobratlých, a dokonce i v nálevnících. Tento rod se vyznačuje přítomností arginázy z enzymů ornithinového cyklu. Mohou vylučovat močovinu nebo amoniak (Yoshida a Camargo, 1978). Typový druh L. buetschlii Kent, 1880 byl popsán v Evropě z hlístice Tobrilus

gracilis

(Podlipaev,

1990),

avšak

tento

popis

je

jedinou

zmínkou

o trypanosomatidech v hlísticích a nikdy se jej nepodařilo znovu nalézt. Dominantní životní formou jsou promastigoti. Mohou se vyskytovat ve volné nektomonádové a přichycené haptomonádové formě. Dále se mohou objevit amastigotní stádia a pseudocysty. Některé druhy (např. L. oncopelti a L. wallacei) produkují amastigotní pseudocysty, které zůstávají připojené k bičíku mateřské buňky (McGhee a Hanson, 1962; Romeiro a kol., 2000). Podobně je to i u rodu Blastocrithidia. Paraziti blech L. ctenocephali a L. pulexsimulantis a parazit L. oncopelti z ploštice mají nejlépe prozkoumané životní cykly (McGhee a Hanson, 1962; Molyneux a kol., 1981; Beard a kol., 1989). Jedním z mála patogenních druhů je L. bombycis, kterého nalezneme v hemocoelu larev bource morušového (Aratake a Kayamura, 1977 cit.dle Abe, 1980). V

životním

cyklu

rodu

Rhynchoidomonas

Patton,

1910

dominuje

forma

trypanomastigota, kde se nenachází výrazná undulující membrána jako je tomu u rodu Trypanosoma. Mohou se objevit stádia epimastigotní a amastigotní. Zástupce nalezneme ve střevě a často i v Malphigických trubicích svých hostitelů z řádu Diptera a Lepidoptera (Podlipaev, 1990). V roce 1910 byl v Indii popsán typový druh R. luciliae z mouchy Lucilia serenissima. Byl též nalezen v Malphigických trubicích dalších zástupců čeledí 14

bzučivkovitých a mouchovitých. Zatím bylo popsáno 6 druhů, ale žádný nebyl dosud kultivován. Studován byl pouze jeden zástupce R. operophterae z můry Operophtera brumata (Page a kol. 1986 cit.dle Vickerman, 2000). Rod Sergeia (Svobodová a kol., 2007) byl popsán na základě molekulárněbiologických a fylogenetických analýz. Životní formou jsou promastigoti, jejichž povrch je zřetelně stočený a u některých buněk může být i rýhovaný. Charakteristická je přítomnost paraxiální tyče ve flagelární kapse, na základě tohoto znaku je tento druh odlišitelný od ostatních trypanosomatid. Typovým organismem je Sergeia podlipaevi izolovaný z tiplíka Culicoides festivipennis, který byl chycen v Milovickém lese na Jižní Moravě. Rod Wallaceina Podlipaev, Frolov & Kolesnikov, 1990 nom. nov pro Proteomonas Podlipaev, Frolov & Kolesnikov, 1990 je charakterizován stádiem endomastigota, který má dlouhou stočenou flagelární kapsu. Na základě tohoto morfologického znaku přesunul Podlipaev a kol. (1990) dva druhy crithidií z ploštic do rodu Proteomonas, ale toto rodové jméno už bylo obsazeno kryptomonádním bičíkovcem Proteomonas Hill a Weetherbee, 1986. Proto bylo navrženo nové jméno Wallaceina na památku F. G. Wallace. V životním cyklu se mohou objevit i formy promastigota nebo choanomastigota. Jedná se o parazity dipterního a hemipterního hmyzu. Typový organismus W. inconstans byl izolován z ploštice Calocoris sexguttatus na severozápadě Ruska (region Pskov) (Podlipaev a kol., 1990).

5.2 Rody dvouhostitelské Rod Endotrypanum Mesnil & Brimont, 1908 zahrnuje jediné známé druhy trypanosomatid, které jsou schopné napadat erytrocyty. Během životního cyklu se vytváří forma trypanomastigota a epimastigota, jež nalezneme uvnitř erytrocytů chudozobých savců. Promastigotní a amastigotní stádia se nalézají v přenašeči, kterým je flebotomus. Typovým druhem je Endotrypanum schaudini z lenochoda Choleopus didactylus, avšak tento parazit byl nalezen i v brazilském druhu lenochoda Bradypus. Ze stejného hostitele byl popsán i druhý druh E. monterogei Shaw, 1969, ale zdá se, že podle sérologické a izoenzymové charakteristiky i hustoty DNA se jedná o ten samý druh (Croft a kol., 1980). Zástupci rodu Leishmania (Ross, 1903 emend. Saf´janova, 1982) tráví část svého životního cyklu ve střevě flebotomů, kde se množí promastigotní stádia, a zbývající část cyklu je dokončena v savčích mononukleárních fagocytech, ve kterých se nachází pouze amastigoti. Přenos se uskutečňuje při sání na obratlovčím hostiteli, kdy přenašeč injikuje do rány infekční metacyklické promastigoty. To je zapříčiněno mj. i zničením stomodeální valvy, jež indukují

15

paraziti (Volf a kol., 2004). Typovým druhem je L. donovani (Laveran a Mesnil, 1903) Ross, 1903, původce lidské viscerální leishmaniózy (kala azar), jehož amastigoti se množí v makrofázích ve slezině, játrech nebo kostní dřeni. Ve Starém Světě slouží jako vektor zástupci rodu Phlebotomus (Diptera: Psychodidae; Phlebotominae) a v Novém Světě rod Lutzomyia. Rozlišují se tři podrody lišící se svým rozšířením a spektrem definitivních hostitelů. Leishmania a Viannia využívají jako definitivního hostitele savce z řádů primátů, hlodavců, šelem, chudozobých, damanů a vačnatců. Parazité, kteří napadají některé druhy plazů, patří do podrodu Sauroleishmania. Leishmánie jsou významní původci chorob (leishmanióz) v tropech i subtropech. Může se jednat o antroponózy i zoonózy, jako rezervoáry v přírodě slouží psi, damani, různí hlodavci a další savci. Rod Phytomonas Donovan, 1909 je typický promastigotními formami se stočeným tělem. V rámci svého životního cyklu je tento parazit přenášen do rostlin fytofágními plošticemi. Byla zaznamenána i přítomnost amastigotů, ale jejich role v životním cyklu není zcela jasná. Typovým organismem je Phytomonas davidi Lafont, 1909, izolovaný z latexu pryšce Euphorbia pilulifera. Jako přenašeč slouží ploštice Stenocephalus agilis z čeledi Coreidae. Z hlediska patologie se tento rod rozděluje na několik skupin. V latexu rostlin převážně ze skupin Euphorbiaceae a Asclepiadaceae, dále Apocynaceae, Cecropiaceae, Asteraceae, Moraceae, Urticacea a Sapotaceae žijí paraziti nepatogenní pro své hostitele (nezpůsobují jejich chřadnutí). Výjimku tvoří P. davidi z manioku. Jejich přenašeči jsou ploštice čeledí Coreidae a Lygeidae. Fytomonády, které napadají u rostlinného hostitele sítkovice, jsou velice patogenní a způsobují vážná onemocnění rostlin, kdy dochází k vadnutí až úhynu hostitele. To je pravděpodobně způsobeno přerušením proudu fotoasimilátů. Jako hostitelé jim slouží rostliny z čeledí Arecaceae, Rubiaceae a Zingiberaceae a jsou přenášeny plošticemi rodu Lincus. Je to například P. staheli u kokosových palem a P. leptovasorum napadající kávovník. Další skupina parazitů je vázaná na plody a není schopná napadat jiné části rostlinného hostitele. Byli izolováni z plodů čeledí Anacardiaceae, Oxalidaceae, Passifloraceae, Punicaceae, Rosaceae, Rutaceae, Solanaceae a Poaceae. Některé studie však ukázaly, že v plodech se mohou vyskytovat i zástupci rodu Leptomonas, Crithidia a Herpetomonas (Conchon a kol., 1989; Catarino a kol., 2001). Kupodivu žádný druh Phytomonas nemá symbionty, přesto však nevyžadují při kultivaci hemin jako růstový faktor. Rod Trypanosoma Gruby, 1843 zahrnuje ve svém životním cyklu formy trypanomastigota a epimastigota, zřídka se vyskytují stádia amastigota a promastigota. Zástupci tohoto rodu jsou parazité všech tříd obratlovců, kde je nalezneme v krvi nebo v tkáňovém moku. Některé se mohou nacházet i v prostředí uvnitř buňky (T. cruzi). Přenašeči 16

jsou krevsající bezobratlí živočichové, avšak jako vektor může vyjímečně sloužit i obratlovec (upír). Druhy parazitující u žraloků, kostnatých ryb, některých obojživelníků a želv jsou přenášeny pijavkami. Jejich vývojový cyklus je ukončen tvorbou metacyklických infekčních stádií, která migrují do chobotku pijavky, odkud jsou přenesena na definitivního hostitele. Naopak

krevsající

členovci

slouží

jako

přenašeči

trypanosom

suchozemských

studenokrevných i teplokrevných organismů. Typovým druhem je pijavkou přenášená T. rotatorium Mayer, 1843, parazitující v žábách (Podlipaev, 1990). Rod Trypanosoma se rozděluje do několika podrodů (Duttonella, Megatrypanum, Nannomonas, Pycnomonas, Schizotrypanum, Tejeraia, Trypanozoon). Klasifikace různých druhů do těchto podrodů je založena na jejich fyziologii, morfologii a biologii.

6 Ploštice jako hostitelé jednohostitelských trypanosomatid Přibližně z více než milionu popsaných druhů hmyzu bylo parazitology prozkoumáno mezi 2 000 - 2 500 druhů na přítomnost jednohostitelských trypanosomatid a v 550 z nich byli tyto organismy nalezeny (Podlipaev, 2001). Podle nových studií (viz dále) je diverzita této skupiny nečekaně veliká, a tak větší část druhů stále čeká na své objevení. Distribuce parazitů mezi hostitelskými taxony je velice nerovnoměrná. Většina popsaných nebo nalezených, ale zatím nedeterminovaných jednohostitelských druhů čeledi Trypanosomatidae se vyskytuje u řádů dvoukřídlých (Diptera) nebo ploštic (Hemiptera). Blechy (Siphonaptera) jsou dalším často parazitovaným řádem. Bylo odhadnuto, že pouhých 500-600 druhů hemipterního hmyzu z celkového počtu 23 000 popsaných zástupců bylo vyšetřeno jako případní hostitelé monoxenních parazitů (Teixeira a kol., 2000). Asi ve 150 druzích ploštic, což činí 25-30 %, byli tito bičíkovci objeveni (Teixeira a kol., 2000). Rody Blastocrithidia, Crithidia, Leptomonas a Wallaceina nalezneme u některých zástupců z těchto čeledí – Alydidae (vroubenkovití), Coreidae (vroubenkovití), Gerridae (bruslařkovití), Largidae, Lygaeidae (ploštičkovití), Miridae (klopuškovití), Nabidae (lovčicovití), Nepidae (splešťulovití), Pentatomidae (kněžicovití), Pyrrhocoridae (ruměnicovití), Reduviidae (zákeřnicovití), Rhopalidae (vroubenkovití), Saldidae (pobřežnicovití) a Veliidae (hladinkovití) (Wallace, 1966; Podlipaev a kol., 1990; Kostygov a kol., 2004; Westenberger a kol., 2004; Yurchenko, 2006a). Náhodně byl popsán výskyt některých druhů Herpetomonas, ale v těchto případech šlo zřejmě o nákazu z potravy (Carvalho a Deane, 1974; Podlipaev, 1990). Nesmí se zapomenout ani na dvouhostitelské

17

rody Phytomonas a Trypanosoma, které využívají některé zástupce hemipter jako své přenašeče. K

poměrně

dobře

prostudovaným

regionům

s výskytem

jednohostitelských

trypanosomatid u ploštic patří oblasti v Jižní a Střední Americe (studie od Westenberga, Yurchenka, Lukeše, Maslova ad.) a dále je to území na severu Ruska (studie od Podlipaeva, Frolova, Kolesnikova ad.). Na subarktický region se poprvé zaměřil Kostygov a kol. (2004). I v takto vysokých zeměpisných šířkách byla objevena vysoká diverzita parazitů. K identifikaci jednotlivých kultur trypanosomatid byla použita metoda UP-PCR a v souladu s dříve získánými daty (sekvenční data SSU rRNA) (Merzlyak a kol., 2001) byla potvrzena jedinečnost fauny trypanosomatid ze severního a severozápadního Ruska. Na fylogenetických stromech většina z nich tvoří samostatnou větev s nerozlišenou příbuzností mezi jednotlivými druhy (Kostygov a kol., 2004). Tato skupina organismů je reprezentována trypanosomatidy nalezených v širokém hostitelském spektru (Hemiptera: Gerridae, Nabidae, Miridae), z čehož lze vyvodit nízká hostitelská specifita (Podlipaev a kol., 2004). V Brazílii proběhla studie, která měla odhalit diverzitu trypanosomatid u fytofágních ploštic (Batistoti a kol., 2001). V tomto průzkumu byly zahrnuty ploštice z čeledí Pyrrhocoridae, Coreidae, Lygaeidae a Pentatomidae. Výsledkem bylo získání 49 nových izolátů parazitů, jejichž klasifikace proběhla na základě morfologie, růstu, biochemických a molekulárních technik. Na základě těchto charakteristik byly jednotlivé izoláty přirazeny k rodům Crithidia, Leptomonas a Phytomonas. Kostarika je známá jako země s velkou diverzitou organismů včetně hmyzu. Průzkumem tohoto bohatého ekosystému by mohlo být objeveno mnoho nových druhů trypanosomatid. Zde proběhla studie, do níž byly zahrnuty ploštice z 6 čeledí (Alydidae, Coreidae, Largidae, Miridae, Pentatomidae, Pyrrhocoridae) a z 62 nakažených jedinců bylo získáno 29 nových izolátů trypanosomatid (Westenberger a kol., 2004). Protože je těžké některé parazity převést do kultury, využívalo se k identifikaci sekvenace genu pro SL RNA amplifikované přímo ze vzorků. Na základě této analýzy bylo popsáno 18 unikátních typových jednotek, které by mohly reprezentovat nové druhy a v některých případech i nové rody. Ve výzkumu tohoto biotopu pokračoval Maslov a kol. (2007), ale v jejich studii je navíc zahrnuta oblast Ekvádoru. Přibližně 170 druhů ploštic náležících do šestnácti čeledí bylo vyšetřováno na přítomnost parazitů. Infekce byla zjištěna u 62 druhů z 9 čeledí (Alydidae, Coreidae,

Largidae,

Lygaeidae,

Miridae,

Pentatomidae,

Pyrrhocoridae,

Reduviidae

a Rhopalidae). Po provedení sekvenační analýzy SL RNA bylo determinováno 30 nových

18

typových jednotek. Tyto průzkumy ukázaly, že diverzita jednohostitelských trypanosomatid je obrovská a její značná část nebyla dosud objevena. Z těchto studií vzešlo několik popisů nových druhů. Z ploštic čeledi Miridae se získalo řada izolátů, které reprezentují tři přesné typové jednotky neboli potenciální nové druhy (označené TU3, TU4 a TU40) (Westenberger a kol., 2004; Maslov a kol., 2007). Tyto druhy trypanosomatid byly na základě morfologie přiřazeny k rodu Leptomonas a pojmenovány L. bifurcata, L. tarcoles a L. acus. Ovšem fylogenetické analýzy (SSU rRNA a GAPDH) prokázaly blízkou příbuznoust s rodem Crithidia (Yurchenko a kol., 2008). Další nové druhy (L. jaderae, L. neopamerae, C. insperata, C. abscondita a C. permixta) byly získány ze smíšených infekcí (přítomnost více druhů parazitů v jednom hostiteli) (Yurchenko a kol., in press). Ve střevě ploštice byla původně pozorována přítomnost epimastigotů, ovšem v kulturách se množila stádia promastigotů a choanomastigotů. Forma epimastigota je charakteristická pro rod Blastocrithidia, ale tyto parazity je někdy obtížné převést do axenické kultury tak, aby rostli mimo tělo hostitele. V případě směsných infekcí pak ostatní trypanosomatida přerůstají v kultuře tyto blastocrithidie. Řešením této situace je využití sekvenčních dat z genu pro SL RNA (např. metodou barcoding) (Maslov a kol., 2007). Porovnáním sekvencí získaných přímo ze střeva hostitele a poté z kultury bylo s úspěchem použito právě v případě těchto nových druhů (Yurchenko a kol., in press).

6.1 Přenos jednohostitelských trypanosomatid mezi plošticemi Prostředí v hostiteli, ve kterém paraziti žijí, se zásadně odlišuje od podmínek panujících mimo něj. Jelikož hostitel je konečný – někdy zemře, musí populace parazitů zajistit svoje rozšíření a infekci jiných jedinců. V rámci čeledi Trypanosomatidae se uplatňuje několik způsobů přenosu. Nejdůležitější z nich jsou kontaminace potravy, koprofágie, kanibalismus a pasivní přenos pomocí pseudocyst. U některých druhů byl popsán i transovariální přenos.

6.1.1 Pseudocysty Pseudocysty trypanosomatid se nacházejí ve výkalech hostitelského hmyzu, což naznačuje, že tyto organismy představují latentní formy parazitů, které jsou vybaveny schopností sloužit jako prostředek šíření parazitů. Navíc přítomnost pevné subpelikulární vrstvy dává pseudocystám schopnost vysoké rezistence vůči fyzikálním činitelům (zahřátí na 60 oC, vysušení, ultrazvuk nebo zmražení). Hostitel se nakazí při náhodném požití buď koprofágií nebo nepřímou kontaminací, jež zaručuje rozšíření nákazy v populaci ploštic (Porter, 1909; McGhee a Hanson, 1962; Schaub a kol., 1989). 19

Druhy trypanosomatid, v jejichž životním cyklu se vyskytují pseudocysty, náleží do rodů Leptomonas a Blastocrithidia (Wallace, 1966). První popisy a různé klasifikace u různých druhů se objevily již na začátku minulého století (např. Porter, 1909). Podle analogie s ostatními jednobuněčnými organismy se cysty (zde pseudocysty) považují za rezistentní formy bičíkovců, a to i přesto, že dosud není mnoho známo o jejich rezistenci k fyzikálním a chemickým faktorům nebo o jejich přesné roli v šíření parazitů. Zpravidla vznikají jako flagelární pseudocysty (tzv. straphangery). Informace o ultrastruktuře a buněčné diferenciaci během procesu encystace byly publikovány pro druh Blastocritihidia triatomae (Peng a Wallace, 1982) a pro několik druhů Leptomonas spp. izolovaných z ploštic (Takata a kol., 1996; Romeiro a kol., 2000; Malysheva a kol., 2006), z blech (Molyneux a Croft, 1980 cit. dle Romeiro a kol., 2000) a z motýlů (Abe, 1980). Pseudocysty nalezneme např. u druhu Leptomonas capsularis parazitující ve střevě ploštice Cletus ochraceus (Gibbs, 1951). Na střevní stěně jsou přichycení promastigoti, jež se diferencují v amastigotní formy, které se oddělují do lumen střeva. U Leptomonas oncopelti izolované z ploštice Oncopeltus fasciatus popsali McGhee a Hanson (1962) vznik straphangerových pseudocyst, což jsou amastigotní formy přiléhající k bičíku promastigota této leptomonády. U nymfálních stádií se paraziti vyskytují v jícnu, voleti, žaludku a pyloru. U dospělců je nalezneme jak ve stejných částech trávicí soustavy, tak i v rektální ampuli a to ve vysokých koncentracích. Promastigoti jsou převažující formou. Vznik pseudocyst začíná ve středním střevě a vykazuje stejný model vývoje jak pro nymfy, tak i pro dospělce hostitelského hmyzu. Při procesu encystace nejdříve migruje jádro ke kinetoplastu, pak následuje nerovnoměrné dělení buňky. Tento proces dá vzniknout čtyřem bezbičíkatým formám, které zůstávají přichyceny svými anteriorními konci poblíž flagelární kapsy mateřské buňky. Později se odpojí a dají vzniknout pseudocystám, které si zachovávají schopnost dále se dělit. Malysheva a kol. (2006) ve své studii o vývoji flagelárních pseudocyst L. oncopelti popsali tento děj podrobněji. Nerovnoměrným dělením aktivního promastigota se na předním konci mateřské buňky oddělí malá buňka označovaná jako C1, která zůstává připojena k rodičovskému individuu. Dělením C1 buňky vzniknou dvě ekvivalentní buňky C2 a následně se rozdělí na čtyři morfologicky podobné buňky C3. Při procesu maturace pseudocyst se C3 buňky stávají vejčitými a oddělují se od mateřského promastigota. U Leptomonas wallacei probíhá encystace podobně (Romeiro a kol., 2000), avšak na rozdíl od předešlého popisu nebylo pozorováno dělení pseudocyst a počet adherovaných pseudocyst k rodičovskému organismu se pohyboval od jedné do čtyř. Proto byl navržen nový 20

model encystace. Vznik pseudocyst probíhá podle všeho standartním dělením mateřské buňky. Obě vzniklá individua zůstávají spojená pomocí bičíku. Jedna z nich se začne diferencovat při procesu odlupování membrány jako filopodium, zároveň probíhá kondenzace cytoplasmy a vstřebávání bičíku. V druhé buňce začíná nový cyklus dělení, při kterém se vytvoří nová pre-cystická forma. K bičíku mateřské buňky jsou připojeny až čtyři pseudocysty. U Blastocrithidie triatomae jsou též pseudocysty připevněné k mateřskému bičíku, ale nepodařilo se prokázat, že by vznikaly nerovnoměrným dělením mateřské buňky, tak jak je tomu např. u L. oncopelti. Peng a Wallace (1982) se domnívají, že pokud pseudocysty nevznikly z organismu, kterým jsou neseny, musely vzniknout z jiných buněk, a teprve pak se připojit. Tato hypotéza však není příliš pravděpodobná, protože se zvyšujícím se stářím kultury B. triatomae nevzrůstá počet bičíkovců nesoucích pseudocysty a průměrný počet pseudocyst na jednotlivého bičíkovce se též nezvyšuje. Avšak volných pseudocyst v kultuře přibývá (Peng a Wallace, 1982). Na rozdíl od cyst ostatních jednobuněčných organismů jako je např. giardie nebo entamoeba není u pseudocyst trypanosomatid přítomna cystová stěna (Peng a Wallace, 1982; Reduth a Schaub, 1988; Takata a kol., 1996; Romeiro a kol., 2000; Malysheva a kol., 2006). Na druhé straně však byla pozorována homogenní subpelikulární oblast pod buněčnou membránou u B. triatomae (Peng a Wallace, 1982; Reduth a Schaub, 1988), B. familiaris (Tieszen a kol., 1985 cit. dle Tieszen a kol., 1986), L. oncopelti (Takata a kol., 1996) a u L. wallacei (Romeiro a kol., 2000). Přítomnost subpelikulárních mikrotubulů byla prokázána u pseudocyst rodu Leptomonas (Takata a kol., 1996; Romeiro a kol., 2000), avšak nebyly nalezeny u druhu B. triatomae (Reduth a Schaub, 1988). Cytoplasma zralých pseudocyst je velmi kondenzovaná (Schaub a Pretsch, 1981), proto je vysoce elektrondensní a je obtížné v ní pozorovat vnitřní struktury. Při použití metody mrazového leptání a mrazového lámání (Reduth a Schaub, 1988) se ukázalo, že vnitřek pseudocysty vyplňuje jádro s kinetoplastem, zatímco mitochondrie a endomembránový systém jsou vyvinuty jen částečně. Typické orgány kinetoplastid – flagelární aparát a bazální tělísko nebyly pozorovány. O procesu excystace zatím není mnoho informací. U B. triatomae je indikován růstem buňky i bičíku a přeměnou na epimastigota v tenkém střevě již 24 hodin po infekci hostitele. Excystace může být závislá na příjmu potravy hostitele (Triatoma), protože v žaludku se potrava pouze uchovává, ale k trávení dochází až v tenkém střevě (Schaub a Pretsch, 1981). Také u pseudocyst rodu Leptomonas je excystace zahájena růstem bičíku a buňky (Takata a kol., 1996). 21

U druhu Wallaceina incostans byly pozorovány jisté změny struktury endomastigota, pokud byl ponechán 24 na vzduchu. Tyto změny, podobné procesu encystace u Leptomonas a Blastocrithidia, zahrnovaly změnu struktury povrchu, bičíku a flagelární kapsy, cytoplasmy, endomembránového systému, mitochondrie, kinetoplastu a jádra. To by mohlo naznačovat, že forma endomastigota může být speciálním stádiem uplatňujícím se při přenosu (Frolov a Malysheva, 1992).

6.1.2 Nákaza z prostředí kontaminovaného infekčními stádii Obvyklý přenos je představován náhodnou kontaminací trypanosomatidy z trusu nakaženého hmyzu (McGhee a Cosgrove, 1980). Míra infekce ploštice Oncopeltus fasciatus bičíkovcem Leptomonas oncopelti je poměrně nízká. Tato leptomonáda vytváří během svého života dvě morfologická stádia. Jednak jsou to promastigoti a flagelární pseudocysty, které vznikají jejich dělením. Obě tyto formy se nacházejí v trusu napadených dospělých jedinců. U nymf je situace odlišná – v trusu totiž nebylo nalezeno žádné z těchto stádií (McGhee a Hanson, 1962). To může být zapříčiněno nedokončeným vývojem zadní části trávicí trubice nymfálních stádií. V okamžiku posledního svlékání se zažívací trakt stane průchodným a parazité tak mohou sestoupit do rekta, odkud se s trusem dostanou do venkovního prostředí a mohou tak šířit nákazu. V laboratorních podmínkách je to nejčastěji kontaminací společného vodního a potravního zdroje (McGhee a Hanson, 1962). U bruslařek z čeledi Gerridae byl popsán výskyt několika druhů jednohostitelských trypanosomatid (B. gerridis, B. gerricola, C. flexonema, L. collosoma a L. costocoris) (Podlipaev, 1990). U těchto ploštic vykazují dospělci větší míru nákazy trypanosomatidy než nymfy a navíc se prevalence mění v průběhu roku. Největší je v průběhu pozdního jara nebo časného léta (Tieszen a Molyneux, 1989b; Gurski a Ebbert, 2003). To může být způsobeno změnami chování ovlivňující možnosti kontaktu infikovaných a neinfikovaných bruslařek. Tyto změny by zahrnovaly rozmnožování, ochranu teritoria, sdílení kořisti a agregaci ploštic. Jako zdroj nákazy by zpočátku mohli sloužit nakažení jedinci, kteří přežili zimu a vykazují silnou míru infekce (Tieszen a Molyneux, 1989b). Alternativní hostitel např. kořist by mohla být také příčinou nákazy. Ale tato možnost zatím nebyla potvrzena, a proto by zasluhovala další pozornost (Gurski a Ebbert, 2003). Aktivita dospělců je v období jara soustředěna na rozmnožování, a protože při něm dochází k těsnému kontaktu jedinců, může tak vzrůst pravděpodobnost přenosu parazitů (Tieszen a Molyneux, 1989b). Páření bruslařek trvá někdy až 12 hodin, ačkoli většina se páří krátce po dobu 15-60 sekund a samečci jsou schopni za hodinu vyhledat v průměru 12 samiček (Blanckenhorn a kol., 1998). Signifikantní rozdíl míry 22

nákazy mezi pohlavími však nebyl pozorován (Tieszen a Molyneux, 1989b). Pokles v prevalenci trypanosomatid ke konci sezóny by mohl být vysvětlen na základě zvýšené mortality nakažených ploštic, na něž má infekce negativní vliv a dokáže snížit jejich fitness (Arnqvist a Mäki, 1990; Klingenberg a kol., 1997). K iniciaci infekce B. triatomae v přírodě může pravděpodobně dojít při společném sání infikovaných a neinfikovaných ploštic na stejném zdroji potravy kontaminovaném infekčním trusem, jak bylo pozorováno při laboratorním pokusu (Schaub a kol., 1989). Ploštice včetně predátorských druhů využívají šťávy z rostlin jako zdroj tekutin a je tedy pravděpodobné, že to může být podmínkou nespecifického přenosu bičíkovců z hmyzu na rostliny a mezi rostlinami. Na cukry bohaté rostlinné pletivo by mohlo sloužit jako médium pro množení a růstu trypanosomatid hmyzu (Conchon a kol., 1989). Druh Leptomonas serpens dokáže infikovat plody rajčete stejně dobře jako ploštici Nezara sp. (Gibbs, 1957 cit.dle McGhee a Cosgrove, 1980). Přenáší se prostřednictvím slin v době, kdy hostitel saje na rostlině. Catarino a kol. (2001) izolovali parazity z různých plodů a semen (rajče, jablko, granátové jablko, švestka, pomeranč, grapefruit, ananas, kukuřice, ad.), které vykazovaly jasné známky po bodnutí fytofágním hmyzem. V této studii bylo klasifikováno 21 nových izolátů trypanosomatid, které byly přirazeny nejen k rodu Phytomonas, ale i k rodům Leptomonas, Crithidia a Herpetomonas. V plodech rajčete byl nedávno objeven nový druh Herpetomonas spp., u kterého byla prokázána příbuznost s Herpetomonas samuelpessoai (Marín a kol., 2007).

6.1.3 Kanibalismus Kanibalismus nebo-li vnitrodruhová predace je chování, které se vyskytuje u širokého spektra živočichů včetně hmyzu. Výskyt tohoto chování je závislý na hustotě populace a rozmanitosti potravních zdrojů (Fox, 1975). Avšak byl pozorován i v případě, že potravy bylo dostatek. Pokud dojde ke kanibalismu mezi plošticemi z podčeledi Triatominae je pozřena jenom část napadnutého jedince. Konkrétně se jedná o obsah žaludku a/nebo hemolymfu. (Añez, 1982). Takto se mohou nakazit druhy B. triatomae i T. cruzi (Schaub, 1988; Schaub a kol., 1989). Ovšem závisí to i na zdroji nasáté krve. Na rozdíl od T. cruzi dochází k nákaze B. triatomae vždy nezávisle na druhu krve, který ploštice nasála. U kuřecí krve totiž bylo pozorováno, že dochází k lýzi metacyklických epimastigotů, naopak u krve myší nebyl tento jev zjištěn (Schaub, nepubl. data cit.dle Schaub, 1989). To že se daná ploštice nakazí B. triatomae je způsobeno přítomností odolných pseudocyst tvořících přibližně 4 % populace parazita v zažívacím traktu ploštice. Tato vývojová stádia excystují po nasátí až v tenkém 23

střevu ploštice (Schaub a Pretsch, 1981), kde jsou již stráveny faktory komplementu pocházejících z krve hostitele. Bylo pozorováno, že dospělé ploštice druhů Dipetalogaster maxima a Triatoma infestans dávají přednost napadení a sání na procházející plně nasáté nymfě, ač jsou v blízkosti hostitele a tedy i zdroje teplé krve. Toto chování bylo méně časté u druhů Triatoma sordida a Panstrongylus megistus, naopak velmi zřídka se objevovalo u druhů Rhodnius prolixus a R. robustus (Schaub a kol., 1989). Proto přenos trypanosomatid kanibalismem může být důležitý u agresivních druhů triatom, ale nebude pravděpodobně tak běžný jako přenos koprofágií. Kanibalismus je široce rozšířen mezi dravými vodními plošticemi. Praví predátoři jsou polyfágní a složení jejich stravy se mění s jejich velikostí (Fox, 1975). Silnější jedinci ploštic mohou napadat slabší dospělce nebo nymfy a požírat jejich vnitřnosti, jako je tomu u druhu Nepa cinerea (Porter, 1909). Mrtví nebo umírající jedinci bruslařek (Gerridae), kteří přezimovali, mohou sloužit jako potrava pro ostatní, a také jako zdroj parazitární nákazy (Tieszen a Molyneux, 1989b). I u herbivorního hmyzu může docházet ke kanibalizaci, a to i v případě, že nabídka jejich rostlinné potravy je hojná (Fox, 1975). Takové chování bylo popsáno např. u druhu Pyrrhocoris apterus (Teodoro, 1927 cit.dle Wallace, 1966). Některé ploštice kladou vajíčka do shluků (např. Booth, 1990). Navíc jsou spojována lepkavým materiálem, který si zachovává svůj lepivý charakter až do doby, než se začnou líhnout nymfy. Líhnutí zpravidla neprobíhá současně a nejčasněji narození jedinci požírají ostatní nevylíhnutá vajíčka. Potom nemusí až dva dny vyhledávat potravu a zdroj vody. Trypanosomatidae řady ploštic by mohli zřejmě přežívat v této lepkavé hmotě, která udržuje vajíčka pohromadě, jak bylo pozorováno u Leptomonas oncopelti u ploštice Oncopeltus fasciatus. Zda jsou vajíčka kontaminována výkaly, však není známo. V případě ploštice druhu Lygaeus kalmii, infikované jiným parazitem, dochází při kladení k pokrývání masy vajíček detritem slepovaným k sobě pomocí trusu. Zatím nebylo zjištěno, zda se tento typ přenosu vyskytuje i u jiných druhů ploštic, avšak druhy Leptoglossus phylopus, Arilus cristatus, Acanthocephala femorata kladou vajíčka ve shlucích a též jsou parazitovány trypanosomatidy (McGhee a Cosgrove, 1980).

6.1.4 Koprofágie Opětovné využívání výkalů přináší hmyzu několik výhod - jsou zdrojem mutualistické fauny ze zadní části střeva, mikrobiálních proteinů a doplňkové potravy (enzymů, metabolitů a nestrávených partikulí) (Weiss, 2006).

24

Vývoj ploštic z podčeledi Triatominae, jako striktně krevsajícího hmyzu, je závislý na mutualistických bakteriích, které mají obsaženy v trávicím traktu (Eichler a Schaub, 2002). Infikované triatomy produkují výkaly, v nichž jsou přítomny pseudocysty B. triatomae odolné proti vyschnutí, a které jsou schopny přežít období minimálně tří let (Schaub a Pretsch, 1981). Suché výkaly nejsou pravděpodobně přijímány plošticemi ve větším množství, navíc samotná pravděpodobnost nákazy významně záleží na jejich stáří – mladší vykazují větší míru infekce (Schaub a kol., 1989). Zdá se, že koprofágie je vázaná na období po příjmu potravy a zřídka se vyskytuje mezi hladovějícími plošticemi. To je zřejmě zapříčiněno agregačními feromony u některých triatom (Schofield a Patterson, 1977), jež přitahují ostatní hladové jedince ke zdroji krve, ale také ke zdroji symbiontů. K získání symbiontů musí dojít alespoň jednou v životě tohoto hmyzu, proto přenos trypanosomatid koprofágií bude běžnější než nákaza prostředníctvím kanibalismu. Porter (1909) pozorovala způsob infekce splešťule (Nepa cinerea) druhem Leptomonas jaculum a povšimla si, že dospělci kladou vajíčka mezi vodní rostliny, na jejichž listy zároveň defekují. V těchto výkalech byli nalezeni bičíkovci společně s pseudocystami. Mladí jedinci se pohybují okolo těchto listů a nasávají trus společně s vodou. Pitva těchto jedinců prokázala přítomnost pseudocyst ve voleti. Takto přijaté pseudocysty zřejmě způsobují primární infekci nymf. Koprofágie by též mohla být zodpovědná za vzrůst prevalence trypanosomatid mezi plošticemi z čeledi Gerridae v jarním období (Tieszen a Molyneux, 1989b). 6.1.5 Transovariální přenos Transovariální přenos se teoreticky jeví jako nejúčinější způsob nákazy, ale byl pozorován jen u několika málo druhů a nepovažuje se tedy za hlavní model šíření infekce. Přítomnost parazitů v ovariích byla popsána u druhu L. jaculum (Porter, 1909) a L. pyrrhocoris (Lipa, 1958 cit.dle Wallace, 1966). Vniknutí parazita do těchto orgánů má za následek změnu morfologie parazita. Penetrací střevní stěny se dostává L. jaculum do vaječníků, kde vzápětí ztrácí svůj bičík a stává se z ní značně široká a veliká buňka. Ve snaze potvrdit transovariální přenos u jiných jednohostitelských druhů trypanosomatid proběhlo několik studií. Schaub a kol. (1989) vyvrátili tuto možnost u přenosu B. triatomae u ploštic z čeledi Triatominae na základě pitvy vajíček.

6.1.6 Infekce z kořisti Je známo, že některá trypanosomatida hmyzu mají nízkou hostitelskou specifitu (Podlipaev, 2003). Možnost nespecifické nebo náhodné nákazy bude značně vysoká zejména u dravých druhů, které se živí infikovanou potravou. Zelus leucogrammus (Reduviidae) je dravá 25

ploštice, u níž je často pozorována nákaza zároveň několika druhy trypanosomatid (Blastocrithidia, Crithidia, Herpetomonas a Leptomonas) (Podlipaev, 1990). Pakliže jsou jedinci krmeni sterilní potravou, objevila se u nich nákaza jenom blastocrithidiemi. Ostatní bičíkovci v jejich zažívacím traktu proto pravděpodobně pochází z hmyzu, který loví v přírodě (Carvalho a Deane, 1974). Ploštice Salda littoralis a Saldula pallipes osidlují unikátní biotop v supralitorálu Bílého moře. Žijí pod silnou vrstvou mořských řas na hranici přílivové zóny. Z těchto druhů byly současně získány dva izoláty leptomonád (označené PL a Sld). U nich se později prokázalo, že by se mohlo jednat o jeden a ten samý druh parazita (Kostygov a kol., 2004). Jedním z možných vysvětlení je, že se jedinec druhu Salda littoralis nakazí během požírání kořisti – ploštic druhu Saldula pallipes. V čeledi Saldidae není obvyklé formování kolonií nebo větších skupin jedinců, proto agregace nebude mít velký význam na přenos infekce. Nový druh Leptomonas costaricensis izolovaný ze zástupce čeledi Reduviidae je fylogeneticky příbuzný s trypanosomatidem G755 neznámoho původu (Noyes a kol., 1997). Oba organismy tvoří sesterskou skupinu rodu Leishmania (Yurchenko a kol., 2006b) – dvouhostitelské organismy, které využívají flebotomy jako přenašeče. Nákaza ploštice tímto druhem leptomonády by proto mohla být výsledkem pozření nakažené kořisti, která je v tomto případě flebotomus.

6.2 Přenos jednohostitelských trypanosomatid u ostatního hmyzu Způsoby přenosu zmíněné u ploštic se uplatňují i u ostatního hmyzu. Jak již bylo řečeno výše, koprofágie se vyskytuje u hmyzu poměrně často. Toho k svému přenosu využívají i trypanosomatida blech. U druhu Pulex simulantis se nachází parazit Leptomonas pulexsimulantis, v jehož životním cyklu se objevují amastigotní stádia (pseudocysty), která jsou schopná přežít vyschnutí v trusu. Mladé larvy blech se nakazí při konzumování výkalů dospělců (Beard a kol., 1989). To platí i pro blechu druhu Ctenocephalus canis a jejího parazita Leptomonas ctenocephali. Zvyk pojídat trus rodičovských organismů se vyskytuje i u vši Pediculus humanus, ve které se může vyskytovat druh Leptomonas pedicula (Wenyon, 1926 cit. dle McGhee a Cosgrove, 1980). Pseudocysty byly popsány u několika druhů trypanosomatid nejen ploštic, ale i blech a motýlů. Pomocí pseudocyst se šíří druh Leptomonas bombycis z bource Bombyx mori. Velice zajímavý je jejich vznik, který nebyl pozorován u jiného druhu. Při procesu encystace se dlouzí promastigoti shlukují do rozet, tato stádia mění svojí morfologii a tvoří oválné formy pokryté acidofilní látkou, které se mění přímo v pseudocysty (Abe, 1980). U těchto oválných

26

promastigotů byla pozorována dvě jádra, což naznačuje možnost fúze dvou protáhlých promastigotů během tvorby rozet, a tedy i přítomnost sexuálního rozmnožování. Schopnost využít vodní prostředí k přenosu dokáže druh Crithidia fasciculata, který ve vodě přežívá až 24 hodin. Clark a kol. (1964) potvrdili nákazu komářích larev druhu Culiseta incidens z vody, přičemž tento bičíkovec je schopen přečkat stádium kukly a vydržet až do dospělosti komára. Crithidia fasciculata se zpětně do vody dostane pravděpodobně s trusem dospělců nebo z těl samic uhynuvších při kladení. Přečkat stádium larvy a kukly až do dospělosti dokáže i Herpetomonas muscarum, jak bylo pozorováno u mušky Hippelates pussio (Chloropidae) (Bailey a Brooks, 1972). Přenos tohoto bičíkovce probíhá mezi larvami i dospělci nejčastěji z kontaminovaného vodního zdroje a potravy. Blíže nespecifikovaný druh crithidie izolovaný z mušky Drosophila robusta je schopen přežívat v rozmačkaném banánu, jenž byl podáván tomuto hmyzu jako potrava (McGhee a Cosgrove, 1980). V pokusu, kdy byly mušky krmeny touto směsí, byla po třech dnech pozorována přítomnost choanomastigotů. Přítomnost jednohostitelských trypanosomatid (B. hyalommae a B. haemaphysalidis) byla pozorována ve vaječnících klíšťat, což naznačuje transovariální přenos na následující generaci (Wallace, 1966). Ovšem způsob nákazy (primární) je v tomto případě značně problematický. U sociálního hmyzu (čmeláci aj.) se druh Crithidia bombi šíří pomocí kontaminovaného zdroje nektaru a pylu (Durrer a Schmid-Hempel, 1994). Infekční částice se po defekaci takto nakaženého hmyzu přilepí na jeho tělo a díky blízkému kontaktu mezi jedinci v kolonii se nákaza může šírit dále. Tento systém kontaktů tedy odráží rychlost nákazy C. bombi (Otterstatter a Thomson, 2007). Studie životních cyklů zahrnují pouze několik málo druhů z početné čeledi Trypanosomatidae. Jisté je, že tito paraziti vynalezli mnohé metody svého přenosu. K nejjednodušším životním cyklům patří cykly těch parazitů, jejichž hostitelé se vyskytují ve vodním prostředí (např. Crithidia fasciculata a Culiseta incidens) (Clark a kol., 1964). U hmyzu, jehož různá vývojová stádia se vyskytují na jednom místě, probíhá nákaza nejčastěji skrz kontaminovanou potravu, koprofágii a vodní zdroj, protože bičíkovci jsou určitou dobu schopní přežít ve venkovním prostředí. Pakliže hostitel prochází stádiem kukly, jsou jednohostitelská trypanosomatida schopna tuto transformaci přežít. Pseudocysty jsou další možností, jak překonat nepříznivé podmínky vnějšího prostředí.

27

7 Závěr Čeled Trypanosomatidae zahrnuje celosvětově rozšířené parazity, kteří se vyskytují ve velké škále hostitelů. Studie týkající se těchto prvoků však byly zaměřeny ve prospěch dvouhostitelských rodů, které jsou původci závažných chorob člověka a ekonomicky důležitých živočichů a rostlin. Monoxenní rody jako paraziti hmyzu jsou tedy z tohoto pohledu méně důležité a způsob jejich přenosu, hostitelská specifita a fylogenetické postavení je proto stále nedostatečně vysvětleno. Je však velmi pravděpodobné, že největší druhová a možná i rodová diverzita spadá právě do této skupiny. Proto by tyto organismy mohly posloužit jako vhodné modely pro výzkum biodiverzity, koevoluce a ekologické valence. Jednohostitelská trypanosomatida nalezneme nejčastěji u dvou řádů hmyzu - Diptera a Hemiptera. Ploštice jsou hojným hmyzem i na území našeho státu, ovšem doposud na nich nebyla provedena žádná studie zaměřená na přítomnost těchto parazitů. Právě to je i cílem mé další práce. Ploštice budou sbírány na lokalitě ve východních Čechách, následně bude provedeno vyšetření na přítomnost jednohostitelských trypanosomatid. Získané izoláty budou charakterizovány pomocí morfologických i molekulárních metod.

28

8 Použitá literatura Abe, Y. (1980). On the encystment of Leptomonas sp. (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), a parasite of the silkworm, Bombyx mori Linnaeus. Journal of Protozoology, 27: 372374 Abreu Filho, B. A., Dias Filho, B. P., Vermelho, A. B., Jankevicius, S. I., Jankevicius, J. V. & dos Santos, R. L. (2001). Surface component characterization as taxonomic tools for Phytomonas spp. identification. Parasitology Research, 87: 138-144 Añez, N. (1982). Studies on Trypanosoma rangeli Tejera, 1920. III. Direct transmission of Trypanosoma rangeli between triatomine bugs. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 76: 641-647 Arnqvist, G. & Mäki, M. (1990). Infection rates and pathogenicity of trypanosomatid gut parasites in the water strider Gerris odontogaster (Zett.) (Heteroptera: Gerridae). Oecologia, 84: 194-198 Bailey, C. H. & Brooks, W. M. (1972). Effects of Herpetomonas muscarum on development and longevity of eye gnat Hippelates pusio (Diptera: Chloropidae). Journal of Invertebrate Pathology, 20: 60-66 Batistoti, M., Cavazzana Jr., M., Serrano, M. G., Ogatta, S. F., Baccan, G. C., Jankevicius, J. V., Teixeira, M. M. G. & Jankevicius, S. I. (2001). Genetic variability of trypanosomatids isolated from phytophagous hemiptera defined by morphological, biochemical, and molecular taxonomic markers. Journal of Parasitology, 87: 1335-1341 Beard, C. B., Butler, J. F. & Greiner, E. C. (1989). In vitro growth characterization and host-parasite relationship of Leptomonas pulexsimulantis n. sp., a trypanosomatid flagellate of the flea, Pulex simulans. Journal of Parasitology, 75: 658-668 Blanckenhorn, W. U., Grant, J. W. A. & Fairbairn, D. J. (1998). Monopolization in a resource queue: water striders competing for food and mates. Behavioral Ecology and Sociobiology, 42: 63-70 Blom, D., de Haan, A., van den Berg, M., Sloof, P., Jirků, M., Lukeš, J. & Benne, R. (1998). RNA editing in the free-living bodonid Bodo saltans. Nucleic Acids Research, 26: 1205-1213 Booth, C. L. (1990). Biology of Largus californicus (Hemiptera: Largidae). The Southwestern Naturalist, 35: 15-22 Carvalho, A. L. M. & Deane, M. P. (1974). Trypanosomatidae isolated from Zelus leucogrammus (Perty, 1834) (Hemiptera: Reduviidae), with a discussion on flagellates of insectivorous bugs. Journal of Protozoology, 21: 5-8

29

Catarino, L. M., Serrano, M. G., Cavazzana Jr., M., Almeida, M. L., Kaneshina, E. K., Campaner, M., Jankevicius, J. V., Teixeira, M. M. G. & Itow-Jankevicius, S. (2001). Classification of trypanosomatids from fruits and seeds using morphological, biochemical and molecular markers revealed several genera among fruit isolates. FEMS Microbiology Letters, 201: 65-72 Cavalier-Smith, T. (1981). Eukaryote kingdoms: seven or nine? Biosystems, 14: 461-481 Clark, T. B., Kellen, W. R., Lindegren, J. E. & Smith, T. A. (1964). The transmission of Crithidia fasciculata Leger 1902 in Culiseta incidens (Thomson). Journal of Protozoology, 11: 400-402 Conchon, I., Campaner, M., Sbravate, C. & Camargo, E. P. (1989). Trypanosomatids other than Phytomonas spp. isolated and cultured from fruit. Journal of Protozoology, 36: 412-414 Croft, S. L., Chance, M. L. & Gardener, P. J. (1980). Ultratructural and biochemical characterisation of stocks of Endotrypanum. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 74: 585-589 d´Ávila-Levy, C. M., Araújo, F. M., Vermelho, A. B., Branquinha, M. H., Alviano, C. S., Soares, R. M. A. & dos Santos, A. L. S. (2004). Differential lectin recognition of glycoproteins in choanomastigote-shaped trypanosomatids: taxonomic implications. FEMS Microbiological Letters, 231: 171-176 de Souza, W. & Motta, M. C. M. (1999). Endosymbiosis in protozoa of the Trypanoomatidae family. FEMS Microbiology Letters, 173: 1-8 Docampo, R., de Souza, W., Miranda, K., Rohloff, P. & Moreno, S. N. J. (2005). Acidocalcisomes – conserved from bacteria to man. Nature Reviews, 3: 251-261 Du, Y., McLaughlin, G. & Chang, K.-P. (1994a). 16S ribosomal DNA sequence identities of β-proteobacterial endosymbionts in three Crithidia species. Journal of Bacteriology, 176: 3081-3084 Du, Y., Maslov, D. A. & Chang, K.-P. (1994b). Monophyletic origin of β-division proteobacterial endosymbionts and their coevolution with insect trypanosomatid protozoa Blastocrithidia culicis and Crithidia spp. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 91: 8437-8441 Durrer, S. & Schmid-Hempel, P. (1994). Shared use of flowers leads to horizontal pathogen transmission. Proceedings of the Royal Society of London, Series B-Biological Sciences, 258: 299-302 Eichler, S. & Schaub, G. A. (2002). Development of symbionts in triatomine bugs and the effects of infections with trypanosomatids. Experimental Parasitology, 100: 17-27

30

Fampa, P., Corrêa-da-Silva, M. S., Lima, D. C., Oliveira, S. M. P., Motta, M. C. M. & Saraiva, E. M. B. (2003). Interaction of insect trypanosomatids with mosquitoes, sand fly and the respective insect cell lines. International Journal for Parasitology, 33: 1019-1026 Faria-e-Silva, P. M., Soares, M. J. & de Souza, W. (1996). Proliferative opisthomastigote forms in Herpetomonas roitmani (Kinetoplastida: Trypanosomatidae). Parasitology Research, 82: 125-129 Fox, L. R. (1975). Cannibalism in natural populations. Annual Review of Ecology and Systematics, 6: 87-106 Freymüller, E. & Camargo, E. P. (1981). Ultrastructural differences between species of trypanosomatids with and without endosymbionts. Journal of Protozoology, 28: 175182 Frolov, A. O. & Malysheva, M. N. (1992). The endomastigotes, a special type of the transmission stages of trypanosomatides of the genus Proteomonas. Parazitologiia, 26: 351-355 (rusky s anglickým shrnutím) Gadelha, C., Wickstead, B., de Souza, W., Gull, K. & Cunha-e-Silva, N. (2005). Cryptic paraflagellar rod in endosymbiont-containing kinetoplastid protozoa. Eukaryotic Cell, 4: 516-525 Gibbs, A. J. (1951). Leptomonas capsularis n. sp. and other flagellates parasitic in Cletus ochraceus (Hemiptera). Parasitology, 41: 128-133 Gurski, K. C. & Ebbert, M. A. (2003). Host age, but not host location within a stream, is correlated with the prevalence of gut parasites in water striders. Journal of Parasitology, 89: 529-534 Hoare, C. A. & Wallace, F. G. (1966). Developmental stages of trypanosomatid flagellates: a new terminology. Nature, 212: 1385-1386 Hollar, L., Lukeš, J. & Maslov, D. A. (1998). Monophyly of endosymbiont containing trypanosomatids: phylogeny versus taxonomy. Journal of Eukaryotic Microbiology, 45: 293-297 Honigberg, B. M. (1963). A contribution to systematics of the non-pigmented flagellates. In: Progress in Protozoology, ed: Ludvik, J., Lom., J. & Vavra, J. (New York), p. 68 Jensen, C., Schaub, G. A. & Molyneux, D. H. (1990). The effect of Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae) on the midgut of the reduviid bug Triatoma infestans. Parasitology, 100: 1-9

31

Klingenberg, C. P., Leigh, R. H. B., Keddie, B. A. & Spence, J. R. (1997). Influence of gut parasites on growth performance in the water strider Gerris buenoi (Hemiptera: Gerridae). Ecography, 20: 29-36 Kostygov, A. Y., Slisarenko, E. P., Merkulov, P. A. & Podlipaev, S. A. (2004). Genetic diversity of insect trypanosomatids from subarctic and North-West Russia revialed by UP-PCR typing. Protistology, 3: 257-264 Lukeš, J. & Votýpka, J. (2000). Trypanosoma avium: novel features of the kinetoplast structure. Experimental Parasitology, 96: 178-181 Lukeš, J., Guilbride, D. L., Votýpka, J., Zíková, A., Benne, R. & Englund, P. T. (2002). Kinetoplast DNA network: Evolution of an improbable structure. Eukaryotic Cell, 1: 495-502 Lukeš, J., Hashimi, H. & Zíková, A. (2005). Unexplained complexity of the mitochondrial genome and transcriptome in kinetoplastid flagellates. Current Genetics, 48: 277-299 Malysheva, M. N., Frolov, A. O. & Skarlato, S. O. (2006). Development of cyst-like cells of the flagellate Leptomonas oncopelti in the midgut of the hemipteran Oncopeltus fasciatus. Cytologiia, 48: 723-733 (rusky s anglickým shrnutím) Marín, C., Fabre, S., Sánchez-Moreno, M. & Dollet, M. (2007). Herpetomonas spp. isolated from tomato fruits (Lycopersicon esculentum) in southern Spain. Experimental Parasitology, 116: 88-90 Maslov, D. A., Westenberger, S. J., Xu, X., Campbell, D. A. & Sturm, N. R. (2007). Discovery and barcoding by analysis of spliced leader RNA gene sequences of new isolates of Trypanosomatidae from Heteroptera in Costa Rica and Ecuador. Journal of Eukaryotic Microbiology, 54: 57-65 McGhee, R. B. & Cosgrove, W. B. (1980). Biology and physiology of the lower Trypanosomatidae. Microbiological Reviews, 44: 140-173 McGhee, R. B. & Hanson, W. L. (1962). Growth and reproduction of Leptomonas oncopelti in the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Journal of Protozoology, 9: 488-493 Merzlyak, E., Yurchenko, V., Kolesnikov, A. A., Alexandrov, K., Podlipaev, S. A. & Maslov, D. A. (2001). Diversity and phylogeny of insect Trypanosomatids based on small subunit rRNA genes: polyphyly of Leptomonas and Blastocrithidia. Journal of Eukaryotic Microbiology, 48: 161-169 Miranda, K., Docampo, R., Grillo, O. & de Souza, W. (2004). Acidocalcisomes of trypanosomatids have species-specific elemental composition. Protist, 155: 395-405

32

Molyneux, D. H., Croft, S. L. & Lavin, D. R. (1981). Studies on the host-parasite relationships of Leptomonas species (Protozoa: Kinetoplastida) of Siphonaptera. Journal of Natural History, 15: 395-406 Moreira, D., López-García, P. & Vickerman, K. (2004). An updated view of kinetoplastid phylogeny using environmental sequences and a closer outgroup: proposal for a new classification of the class Kinetoplastea. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 1861-1875 Motta, M. C. M., Soares, M. J., Attias, M., Morgado, J., Passos-Lemos, A., Saad-Nehme, J., Meyer-Fernandes, J. R. & de Souza, W. (1997). Ultrastructural and biochemical analyses of the relationship of Crithidia deanei with its endosymbiont. European Journal of Cell Biology, 72: 370-377 Noyes, H. A., Arana, B. A., Chance, M. L. & Maingon, R. (1997). The Leishmania hertigi (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) complex and the lizard Leishmania: their classification and evidence for a neotropical origin of the Leishmania-Endotrypanum clade. Journal of Eukaryotic Microbiology, 44: 511-517 Otterstatter, M. C. & Thomson, J. D. (2007). Contact networks and transmission of an intestinal pathogen in bumble bee (Bombus impatiens) colonies. Oecologia, 154: 411-421 Peng, P. L. M. & Wallace, F. G. (1982). The cysts of Blastocrithidia triatomae Cerisola et al., 1971. Journal of Protozoology, 29: 464-467 Podlipaev, S. A. (1990). Catalogue of world fauna of Trypanosomatidae (Protozoa). Proceedings of the Zoological Institute Leningrad, 144: 1-174 Podlipaev, S. A. (2000). Insect trypanosomatids: the need to know more. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 95: 517-522 Podlipaev, S. A. (2001). The more insect trypanosomatids under study-the more diverse Trypanosomatidae appears. International Journal for Parasitology, 31: 648-652 Podlipaev, S. A. (2003). Host specificity of homoxenous trypanosomatids. Parazitologiia, 37: 3-17 (rusky s anglickým shrnutím) Podlipaev, S. A., Frolov, A. O. & Kolesnikov, A. A. (1990). Proteomonas incostans n. gen., n. sp. (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) – a parasite of the bug Calocoris sexguttatus (Hemiptera: Miridae). Parazitologiia, 24: 339-345 (rusky s anglickým shrnutím) Podlipaev, S. A., Sturm, N. R., Fiala, I., Fernandes, O., Westenberger, S. J., Dollet, M., Campbell, D. A. & Lukeš, J. (2004). Diversity of insect trypanosomatids assessed from the spliced leader RNA and 5S rRNA genes and intergenic regions. Journal of Eukaryotic Microbiology, 51: 283-290 33

Porter, A. (1909). The life-cycle of Herpetomonas jaculum (Léger), parasitic in the alimentary tract of Nepa cinerea. Parasitology, 2: 367-391 Reduth, D. & Schaub, G. A. (1988). The ultrastructure of the cysts of Blastocrithidia triatomae Cerisola et al. 1971 (Trypanosomatidae): A freeze-fracture study. Parasitology Research, 74: 301-306 Rogers, W. E. & Wallace, F. G. (1971). Two new subspecies of Herpetomonas muscarum (Leidy 1856) Kent 1880. Journal of Protozoology, 18: 645-649 Roitman, I. & Camargo, E. P. (1985). Endosymbionts of trypanosomatidae. Parasitology Today, 1: 143-144 Romeiro, A., Solé-Cava, A., Sousa, M. A., de Souza, W. & Attias, M. (2000). Ultrastructural and biochemical characterization of promastigote and cystic forms of Leptomonas wallacei n. sp. isolated from the intestine of its natural host Oncopeltus fasciatus (Hemiptera: Lygaeidae). Journal of Eukaryotic Microbiology, 47: 208-220 Santos, A. L. S., Abreu, C. M., Alviano, C. S. & Soares, R. M. A. (2005). Use of proteolytic enzymes as an additional tool for trypanosomatid identification. Parasitology, 130: 79-88 Shapiro, T. A. & Englund, P. T. (1995). The structure and replication of kinetoplast DNA. Annual Review of Microbiology, 49: 117-143 Schaub, G. A. & Pretsch, M. (1981). Ultrastructural studies on the excystment of Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae). Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 75: 168-171 Schaub, G. A. (1988). Direct transmission of Trypanosoma cruzi between vectors of Chagas´disease. Acta Tropica, 45: 11-19 Schaub, G. A. (1994). Pathogenicity of trypanosomatids on insects. Parasitology Today, 10: 463-468 Schaub, G. A., Böker, C. A., Jensen, C. & Reduth, D. (1989). Cannibalism and coprophagy are modes of transmission of Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae) between Triatomines. Journal of Protozoology, 36: 171-175 Schaub, G. A., Neukirchen, K. & Golecki, J. (1992). Attachment of Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae) by flagellum and cell body in the midgut of the reduviid bug Triatoma infestans. European Journal of Protistology, 28: 322-328 Schofield, C. J. & Patterson, J. W. (1977). Assembly pheromone of Triatoma infestans and Rhodnius

prolixus

nymphs

(Hemiptera:

Reduviidae).

Journal

of Medical

Entomology, 13: 727-734

34

Simpson, A. G. B., Gill, E. E., Callahan, H. A., Litaker, R. W. & Roger, A. J. (2004). Early evolution within Kinetoplastids (Euglenozoa), and the late emergence of Trypanosomatids. Protist, 155: 407-422 Simpson, A. G. B., Stevens, J. R. & Lukeš, J. (2006). The evolution and diversity of kinetoplastid flagellates. Trends in Parasitology, 22: 168-174 Svobodová, M., Zídková, L., Čepička, I., Oborník, M., Lukeš, J. & Votýpka, J. (2007). Sergeia podlipaevi gen. nov., sp. nov. (Trypanosomatidae, Kinetoplastida), a parasite of biting midges (Ceratopogonidae, Diptera). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57: 423-432 Takata, C. S. A., Camargo, E. P. & Milder, R. V. (1996). Encystment and excystment of a trypanosomatid of the genus Leptomonas. European Journal of Protistology, 32: 9095 Teixeira, M. M. G., Serrano, M. G. & Camargo, E. P. (2000). New data from old trypanosomatid preparations. Parasitology Today, 16: 261-263 Tieszen, K. L. & Molyneux, D. H. (1989a). Morphology and host-parasite relationships of Crithidia flexonema (Trypanosomatidae) in the hindgut and malpighian tubules of Gerris odontogaster (Hemiptera: Gerridae). Journal of Parasitology, 75: 441-448 Tieszen, K. L. & Molyneux, D. H. (1989b). Transmission and ecology of trypanosomatid flagellates of water striders (Hemiptera: Gerridae). Journal of Protozoology, 36: 519523 Tieszen, K. L., Molyneux, D. H. & Abdel-Hafez, S. K. (1986). Host-parasite relationships of Blastocrithidia familiaris in Lygaeus pandurus Scop. (Hemiptera: Lygaeidae). Parasitology, 92: 1-12 Vercesi, A. E., Moreno, S. N. J. & Docampo, R. (1994). Ca2+/H+ exchange in acidic vacuoles of Trypanosoma brucei. Biochemical Journal, 304: 227-233 Vickerman, K. & Preston, T. M. (1976). Comparative biology of kinetoplastid flagellates. In: Biology of the Kinetoplastida, ed: Lumsden, W. H. R. & Evans, D. A. Academic Press. p. 35-130 Vickerman, K. (1990). Phylum Zoomastigina, class Kinetoplastida. In: Handbook of Protoctista, ed: Margulis, L., Corliss, J. O., Melkonian, M. & Chapman, D. J. (Boston: Jones & Barlett). p. 215-238 Vickerman, K. (2000). Order Kinetoplastea Honigberg, 1963. In: An illustrated Guide to the Protozoa, ed: Lee, J. J., Leedale, G. F. & Bradbury, P. (Allen Press). p. 1159-1185

35

Volf, P., Hajmová, M., Sádlová, J. & Votýpka, J. (2004). Blocked stomodeal valve of the insect vector: similar mechanism of transmission in two trypanosomatid models. International Journal for Parasitology, 34: 1221-1227 Wallace, F. G. (1966). The Trypanosomatid parasites of insects and arachnids. Experimental Parasitology, 18: 124-193 Wallace, F. G., Camargo, E. P., McGhee, R. B. & Roitman, I. (1983). Guidelines for the description of new species of lower trypanosomatids. Journal of Protozoology, 30: 308-313 Weiss, M. R. (2006). Defecation behavior and ecology of insects. Annual Reviews of Entomology, 51: 635-661 Westenberger, S. J., Sturm, N. R., Yanega, D., Podlipaev, S. A., Zeledón, R., Campbell, D. A. & Maslov, D. A. (2004). Trypanosomatid biodiversity in Costa Rica: genotyping of parasites from Heteroptera using the spliced leader RNA gene. Parasitology, 129: 537-547 Yoshida, N. & Camargo, E. P. (1978). Ureotelism and ammonotelism in trypanosomatids. Journal of Bacteriology, 136: 1184-1186 Yurchenko, V. Y., Lukeš, J., Xu, X. & Maslov, D. A. (2006a). An integrated morphological and molecular approach to a new species description in the Trypanosomatidae: the case of Leptomonas podlipaevi n. sp., a parasite of Boisea rubrolineata (Hemiptera: Rhopalidae). Journal of Eukaryotic Microbiology, 53: 103-111 Yurchenko, V. Y, Lukeš, J., Jirků, M., Zeledón, R. & Maslov, D. A. (2006b). Leptomonas costaricensis sp. n. (Kinetoplastea: Trypanosomatidae), a member of the novel phylogenetic group of insect trypanosomatids closely related to the genus Leishmania. Parasitology, 133: 537-546 Yurchenko, V. Y., Lukeš, J., Tesařová, M., Jirků, M. & Maslov, D. A. (2008). Morphological discordance of the new trypanosomatid species phylogenetically associated with the genus Crithidia. Protist, 159: 99-114 Yurchenko, V. Y., Lukeš, J., Jirků, M. & Maslov, D. A. Selective recovery of the cultivation-prone components from mixed trypanosomatids infections: a case of several new species isolated from Neotropical Heteroptera. (in press)

36

Sekundární citace Aratake, Y., Kayamura T. (1977). A new record of flagellate parasite (Trypanosomatidae; Protomonadina) pathogenic to Bombyx mori L. Journal of Sericultural Science of Japan, 46: 87-88 (japonsky) Gibbs, A. J. (1957). Leptomonas serpens n. sp. parasitic in the digestive tract and salivary glands of Nezara viridula (Pentatomidae) and in the sap of Solanum lycopersicum (tomato) and other plants. Parasitology, 47: 297-303 Lipa, J. J. (1958). Pierwotniaki zyjace w roslinach. Wszechswiat, 1: 13-15 Molyneux, D. H. & Croft, S. L. (1980). Studies on the ultrastructure of candidate „cysts“ in Leptomonas species of Siphonaptera. Zeitschrift für Parasitenkunde, 63: 233-239 Page, A. M., Canning, E. U., Barker, R. J. & Nicholas, J. P. (1986). A new species of Rhynchoidomonas Patton 1910 (Kinetoplastida, Trypanosomatina) from Operophtera brumata (Lepidoptera, Geometridae). Systematic parasitology, 8: 101-105 Teodoro, G. (1927). Osservazioni sul Pyrrhocoris apterw L., noc particolare riguardo alia flagellosi. Redia IS: 45-50 Tetley, L. & Vickerman, K. (1985). Differentiation in Trypanosoma brucei: host-parasite cell junction and their persistence during acquisition of the variable antigen coat. Journal of Cell Science, 74: 1-19 Tieszen, K. L., Heywood, P. & Molyneux, D. H. (1983). Ultrastructure and host-parasite association of Blastocrithidia gerridis in the ventriculus of Gerris odontogaster (Gerridae: Hemiptera). Canadian Journal of Zoology, 61: 1900-1909 Tieszen, K. L., Molyneux, D. H. & Abdel-Hafez, S. K. (1985). Ultrastructure of cyst formation in Blastocrithidia familiaris in Lygaeus pandurus (Hemiptera: Lygaeidae). Zeitschrift für Parasitenkunde, 71: 179-188 Wenyon, C. M. (1926). Protozoology, a manual for medical men, veterinarians and zoologist. Bailliere, Tindall & Cox, London

37

Příloha Jednohostitelská trypanosomatida můžeme nalézt v hmyzu po celém světě a jejich prevalence u jednotlivých hostitelů je značně vysoká. Dříve se při determinaci nových rodů vycházelo z předpokladu, že tyto organismy mají úzkou hostitelskou specifitu. Ovšem domněnka „co hostitel, to nový druh“ byla postupně nahrazována představou, že alespoň některá monoxenní trypanosomatida mají širokou hostitelskou specifitu (Podlipaev, 2003). Druh Leptomonas pyrrhocoris byl popsán z ploštice Pyrrhocoris apterus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) z několika evropských oblastí (Francie, Itálie, Švýcarsko, Polsko a Rumunsko) (Wallace, 1966). Příbuzné ploštice jsou taktéž často infikovány jednohostitelskými trypanosomatidy (Maslov, osobní sdělení). Otázkou ovšem zůstává, zda jde o stejný organismus, nebo zda se jedná o různé druhy. Naším cílem bylo tento problém objasnit. K dispozici jsem měla izoláty z Francie, Číny, Tuniska a Kostariky (viz tabulka 1). Ze dvou českých populací P. apterus jsem izolovala další trypanosomatida. Celková DNA byla izolována z axenických kultur trypanosomatid pomocí komerčního kitu (firma Roche). Pro PCR odpovídajícího genu pro GAPDH byly použity primery YR a YF (Yurchenko a kol., 2006a). Alignment získaných sekvencí, spolu s ostatními sekvencemi volně dostupných z databáze GenBank, byl vytvořen pomocí programu ClustalX a ručně doupraven s pomocí programu BioEdit. Fylogenetický strom byl spočítán pomocí statistických metod maximum likelihood (PhyML), maximum parsimony (PAUP) a Bayesiánské analýzy (MrBayes). Na fylogenetickém stromě (obr. 1) je patrné vytvoření samostatné a statisticky silně podpořené monofyletické skupiny. Na základě sekvenční analýzy lze všechny testované izoláty považovat za příslušníky stejného druhu. Z našich výsledků vyplývá, že druh Leptomonas pyrrhocoris se vyskytuje kosmopolitně (Evropa, Asie, Amerika) v příbuzných druzích ploštic (P. apterus a Dysdercus spp.) z čeledi Pyrrhocoridae. Současně je však zřejmé, že tyto ploštice mohou hostit i další druhy jednohostitelských trypanosomatid (pro P. apterus je to izolát z Tunisu a u ploštice D. suturellus byl popsán druh L. seymouri). Tabulka 1. označení H10 H18 F19 F165 CH278 CH282 10VL 14BT 25EC 57VL L. pyrrhocoris PYRTU

země původu Česká republika Česká republika Francie Francie Čína Čína Kostarika Kostarika Kostarika Kostarika Rusko Tunisko

lokalita Praha Předboř Anduze Montpellier Sanchahe Sanchahe Rio Tarcolitos Dos Brazos El Ceibo Rio Tarcolitos Krasnodar Sidi Bouzid

hostitel P. apterus P. apterus P. apterus P. apterus D. poecilius D. poecilius Dysdercus sp. Dysdercus sp. Dysdercus sp. Dysdercus sp. P. apterus P. apterus

izolace vlastní vlastní Votýpka Votýpka Votýpka, Lukeš Votýpka, Lukeš Maslov Maslov Maslov Maslov Votýpka

sekvenace vlastní vlastní vlastní vlastní vlastní vlastní Maslov Maslov Maslov Maslov AY029072 (GB) vlastní

38

Bodo caudatus Bodo saltans C. deanei Cr1 H. roitmani C. oncopelti Herpetomonas sp. TCC080 Sergeia podlipaevi C. abscondita H10 H18 F19 F165 72/64/1 CH278 CH282 100/100/1 10VL 14BT 25EC 96/93/1 57VL

(P. apterus)

} (D. poecilius) (Dysdercus sp.)

L. pyrrhocoris (P. apterus) PYRTU (P. apterus) L. seymouri (D. suturellus) L. neopamerae

56/48/0,8

L. jaderae L. podlipaevi C. insperata C. deanei

89/86/0,9

L. bifurcata C. fasciculata

59/-/0,8 98/97/1

C. luciliae Leptomonas sp. P L. tarcoles L. acus B. gerridis Leptomonas sp. Nfm W. incostans Leptomonas sp. F2 W. brevicola L. peterhoffi

100/99/0,6

88/87/-

C. permixta Leptomonas sp. CFM B. miridarum 100/100/1

L. costaricensis Leishmania tarantolae Leishmania mexicana

B. culicis C. oncopelti L. collosoma 94/83/1

H. megaseliae H. muscarum

100/100/1

H. samuelpessoai L. lactosovorans P. serpens Phytomonas sp. Phytomonas sp. EM1

0.1

Obr. 1. Fylogenetický strom (maximum likelihood) dle sekvencí genu pro GAPDH. Složené hodnoty u jednotlivých větví odpovídají bootstrapům maximum likelihood/maximum parsimony/Bayesiánská analýza. Vysvětlivky: - < 50; 0,5. V závorkách jsou uvedeny jména hostitelských organismů.

39