Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí nukleových kyselin a proteinů. doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc. Olomouc, 23. června 2010
Elektrochemická aktivita DNA (Emil Paleček)
Nobelova cena za polarografii (Jaroslav Heyrovský)
Elektrochemické metody … polarografie kapající rtuťová elektroda -I
n e-
Xm
Xm-n
kvantifikace (jaká je koncentrace)
identifikace elektrochemicky aktivní látky (co to je)
-E
Elektrochemické metody … voltametrie •visicí rtuťová kapková elektroda
•pevné elektrody
-I
n e-
Xm
Xm-n
n e-
Xm
Xm-n -E
elektrochemie proteinů
Elektrochemie proteinů
od dvacátých let XX. století (J. Heyrovský, R. Brdička)
UHLÍKOVÉ ELEKTRODY
RTUŤOVÉ ELEKTRODY katalytické vylučování vodíku prenatriová vlna pík H
-I
elektrochemická oxidace tryptofanu a tyrozinu
redukce vazby S-Hg redukce vazby S-S (cystin)
Brdičkova reakce (v přítomnosti Co)
+1
-1
Y W
signály peptidů a proteinů obsahujících cystein (cystin)
-2 E/V
Katalytické vylučování vodíku (CHE)
V této oblasti potenciálu je elektrochemicky generována katalyticky aktivní částice (R)
Brdičkova reakce
Brdička, 1933: polarografické vlny v přítomnosti sérových proteinů a solí kobaltu
Brdičkova reakce a diagnostika rakoviny
-kdysi poměrně rozšířený diagnostický test -dnes renesance tohoto přístupu -R. Kizek a spol (MENDELU) -rakovina a metalothioneiny
pík H: (pořád ještě) nový nástroj studia proteinů
Tomschik et al., 1998
• katalytický proces na rtuťové elektrodě, ne zcela objasněný mechanismus (dusíkaté skupiny; cystein není nezbytně nutný, ale výrazně přispívá)
• vysoká citlivost detekce peptidů a bílkovin • citlivost k agregaci bílkovin denaturaci bílkovin změnám redox stavu peptidů a bílkovin (-SH vs. –S-S-)
agregace a-synucleinu a-synuclein:
hlavní součást spojených s Parkinsonovou chorobou
tzv.
Lewyho
tělísek
podléhá agregaci vedoucí k tvorbě fibrilárních struktur pochopení mechanismu agregace a nalezení možností jejího ovlivnění je důležité pro vývoj léčebných postupů
zdá se, že hlavní toxický efekt mají nízkomolekulární agregáty v počáteční fázi agregace
Co „vidí“ různé metody: 1
AFM
0.8
CD
20
0h 3 weeks
10
A 1950
0.6 Peak height
Normalized fluorescence
0
0.4
pík H
-10 0h 48 h
-20
24 h 72 h
-30 195
1450
215
235
255
Wavelength (nm)
950 450 -50 -1.76
-1.74
-1.72
-1.7
-1.68
Potential (V)
0.2
0
pík H: unikátní citlivost k počátečním změnám vedoucím k agregaci -0.2 0
50
100
150 Time (h)
200
250
(Masařík a kol., 2004)
DLS pík H
Elektorchemie DNA
Struktura DNA…
1953: James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin, Maurice Wilkins: dvoušroubovice DNA 1962: Nobelova cena (JW, FC, MW) vysvětlení základních principů uchování, předávání a exprese dědičné informace
pyrimidinové báze O
O
NH2 CH3
HN
purinové báze
N
N
O
R
N
N N
N R
R
thymin (T)
O
NH2 N
dvoušroubovice
cytosin (C) adenin (A)
N
HN H2N
N
N R
guanin (G)
2-deoxyribóza
nukleotid
CH2
O
base
O -O P O O
fosfát
párování bazí v řetězcích DNA
1958 – 1960 Emil Paleček: polarografie DNA
(převážně) uhlíkové elektrody
+ tvorba 7,8 –dihydroguaninu
oxidace N
HN H2N
G H2N
N
NH2
N N
N
N N
N
+1.0 potential/V vs. SCE
N
N
NH2 N
R
NH2
N
N
R
N
-1.0
N
CA redukce cytosinu + adeninu R
Gox Aox N
HN
R
O
oxidace guaninu a adeninu O
O
-2.0
current
rtuťové nebo amalgamové elektrody
R
-
tensametrické signály DNA na rtuti doublestranded
3
ds, distorted
2
1
p.z.c.
singlestranded
-1.5
E/V
-1.0
-0.5
vysoká citlivost ke struktuře DNA
Detekce poškození DNA
Nejčastější „produkty“ poškození DNA přerušení cukrfosfátové páteře DNA
jednořetězcový zlom
dvouřetězcový zlom
kyslíkové radikály činnost nukleáz důsledek poškození bazí
přerušení N-glykosidické vazby
„abazická“ místa
spontánní hydrolýza (depurinace) důsledek poškození bazí
Nejčastější „produkty“ poškození DNA poškození bazí: chemické modifikace
guanin
O
O
N
HN
oxidativní poškození deaminace bazí
H N
N
H 2N
NH 3
N N
N
N
HN
R OH NH 2
OH +
N
N
O
N
N R
CH 3
N
OH
N
N
N
N
R
reakce s protinádorovými
N
HN
R
R
NH 2
N
O
O N
NH 2
adenin
aktivovanými karcinogeny
R
N
R
N
N
N
H 2N
N
N
reakce s metabolicky
H 2N
H N
N
N
poškození UV zářením (sluneční světlo)
Pt
O
+
N
R
O HN
O H 3N
CH 3
HN
N
N
H 2N
R
alkylace bazí
O N
HN
N
N
H 2N
CH 3
N
N
O
R
NH 2
CH 3 OH
HN N
OH
R
O
léky
O CH CH O 3 3
N
HN O
R
cytosin
NH
HN
N
O
O CH 3
HN
N R
O
N
N
R
R
O
O
N R
thymin
• v podstatě jakékoli poškození DNA lze v principu detekovat elektrochemicky
DNA s konci a bez konců nadšroubovicová
otevřená kružnicová
lineární
zlomy = poškození DNA – tedy možnost „měřit“ poškození DNA
Rtuťová elektroda modifikovaná kovalentně uzavřenou kružnicovou (nadšroubovicovou, sc) DNA: senzor pro látky indukující zlomy v DNA
scDNA
ocDNA
·OH
ACV ACV
1
-1.6
E/V
3
-0.8
-1.6
1
E/V
-0.8
similar responses to DNA damage like with the HMDE can be obtained • with mercury film electrodes (Kubičárová 2000)
• with amalgam electrodes (Cahová-Kuchaříková, Fadrná, Yosypchuk, Novotný 2004) 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0
Cu(phen)2
AC voltammograms of sc, linear ds and denatured DNA at m-AgSAE
changes in the peak 3 height (at mAgSAE) due to scDNA exposure to a chemical nuclease Cu(phen)2
nebojte se rtuti! nekouše!
Hybridizace DNA (RNA) je založena na principu tvorby dvoušroubovice ze dvou komplementárních řetězců hybridizační sonda
CGAATACGACCTTA
sekvence sondy je navržena (syntetizována) vzhledem k sekvenci DNA, která nás zajímá
CGAATACGACCTTA GCTTATGCTGGAAT
GCTTATGCTGGAAT
cílová DNA je pomocí sondy detekována
DNA „čipy“ („arrays“):
•aplikace mnoha sond současně •aplikace různých (různě“barevných“) fluorescenčních značek
Elektrochemický senzor pro hybridizaci DNA: elektroda se zakotvenou hybridizační sondou na povrchu •hybridizace s cílovou DNA se provede stejně jako v případě optických senzorů •odezvou na hybridizační událost je elektrochemický (proudový) signál I hybrid
samotná sonda
E
Dvoupovrchová strategie: •hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody •účinné zachycení a separace cílové DNA •poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna a elektrochemicky stanovena
detekční elektroda
povrch H
Dvoupovrchová strategie: •hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody •účinné zachycení a separace cílové DNA •poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna a elektrochemicky stanovena
detekční elektroda
Magnetické částice („kuličky“) nesoucí různé „biorekogniční elementy“: všestranné využití v biopreparacích a bioanalýze buňky
komplementární NA řetězec
specifická protilátka
biotinyl. ss ODN
antigen (protein) protilátky
biotinylovaný ds ODN
streptavidin
protein G protein A
DNA-vazebný protein oligo(dT)n
chelát kobaltu
specifická protilátka
protein s „His-tagem“ N
N
NA řetězec s úsekem (A)n
N
Co N
magnetické částice
výstup (separovaný vzorek k analýze)
další složka molekulárního „sendviče“
magnetická separace inkubace (vazba)
odstranění nespecifických složek vzorku
smíchání promývání
vstup (původní vzorek+ matrice) • proceduru lze snadno automatizovat • kompatibilita s mikrofluidikou, „laboratoř na čipu“
povrch H
detekční elektroda
detekce cílová DNA
nespecifická DNA
magnetická kulička s hybridizační sondou
uvolnění cílové DNA
hybridizace separace magnet
značení a sekven(c)ování DNA
chemická modifikace DNA oxokomplexy osmia
-selektivní značení ss konců -detekce abazických míst, nekanonických párů bazí, inzercí..
Inkorporace značených nukleotidů pomocí enzymů
napojování nukleotidů přes 5‘-OH a 3‘-OH
F. Sanger
značené dideoxy: navázání značky podle komplementární báze
2‘,3‘-dideoxynukleotidy: terminátory syntézy DNA (není kam napojit další nukleotid)
Syntéza DNA in vitro („primer extension“) templát primer Deoxynukleotid trifosfáty (dNTP) DNA polymeráza
syntetizovaný úsek
vložení značek do DNA pomocí DNA polymeráz templát primer ZNAČENÉ dNTP DNA polymeráza
-směs normálních deoxy a značených dideoxy -pro každou bázi jiná barva -různě dlouhé produkty, dělení elektroforézou F. Sanger
-značka (barva) odpovídá koncové bázi
Detekce a identifikace mutací a polymorfismů -důležité pro diagnostiku (určité mutace v určitých pozicích jsou spojeny s určitým onemocněním) -zjišťuje se, jaká (jedna) báze je v konkrétní pozici templát G primer C
T
A
G C T
A
Značení DNA elektroaktivními skupinami mercury and amalgam electrodes 3
-1.5
1
Os,L (farad)
-1.0
-0.5
G
AQ
G*
0
0.5
ox Gox A
Tox
Cox
1.0 1.5 potential/V vs. SCE
Fc conjugates [Os (bpy)3]3+/2+
CA Os,L (cat)
nitrophenol
carbon electrodes
Proč, když je DNA sama elektroaktivní? -odlišení řetězců (hybridizace DNA: značení sond) -zvýraznění inkorporovaných bazí (monitorování syntézy, SNP typing)
Inkorporace do DNA pomocí DNA polymeráz, magnetická separace a jednoduchá elektrochemická analýza 10
primer 5‘ 3‘
biotin
DBstv
CATGGGCGGCATGGGAUFcAUFcAUFcAUFcAUFcA
dUFcTP+dATP
primer
DNA polymerase dNFcTP (+dNTP)
I [A]
template
8
synthesized stretch
6
dUTP+dATP
4
dUFcTP+dATP, no polymerase
UFc
2
Gox
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
E [V]
washing
Fc label heat or NaOH measurement
guanine
„cizí“ elektrochemicky aktivní skupina: nový signál
Identifikace jednonukleotidových polymorfismů pomocí elektrochemie Os2+/3+ PhNH2 4
I/A 2
…ACCC PhNO2 …ACCC …GCCC
…GCCC
0
…TCCC
-2
…TCCC
-4
dNTP mix: APhNO2 +CPhNH2 +UOs +G
-6 -8 -0.8
-0.4
0.0
E/V
0.4
0.8
1.2
pomocí jednoduchých levných elektrod (ne drahých sekvenátorů) příslib pro levnou decentralizovanou diagnostiku
Enzymové značky: biokatalytická amplifikace signálu
obvykle se využívají biotinylované sondy a konjugáty (strept)avidinu s vhodným enzymem tvorba elektroaktivního indikátoru „biokatalytická“ amplifikace: jedna molekula enzymu přemění mnoho molekul substrátu
substrát substrát substrát
substrát
substrát substrát
substrát
substrát substrát
substrát
produkt produkt produkt
produkt
produkt
produkt produkt produkt produkt produkt produkt produkt
Vícenásobná amplifikace signálu - příklad hybridizace
PEX inkorporace B
A electrode BSA BSA
BSA
BSA
BSA BSA
BSA
BSA
BSA
BSA
BSA
BSA
jednorázové tištěné elektrody
P O
ALP STV
BSA
OH
BSA
ALP STV BSA
AL P ST V
BSA
etDNA
N
biotinylated probe PEX-biotinylated DNA biotinylated DNA
• pomocí PEX se inkorporuje více biotinylovaných nukleotidů • na ně se naváže více molekul enzymu • vyšší citlivost
Monitorování genové exprese A total DNA
genomic DNA
transcription &splicing
mRNA translation
genomic DNA PCR
PCR
DNA isolation
RT
RNA isolation
PEX
PCR
RT-PCR cDNA
total RNA protein
B
C genomic DNA PCR
callus
plant
callus
1
2
3
4
callus culture
no
nc
be pr o no
on
om
ca
pl c
llu s
tr o l
e -g en
e en
pl an
t-g
io n ss re
-e xp llu s ca
t-e
xp
re s
si on
0
pl an
1 2
3
4
frrbcL
no probe
plant
I, A
(expression) gen : 1.6 rbcL 1.4 exprimován 1.2 green plant 1.2 pouze 1 v zelených 0.8 0.6 0.6 rostlinných 0.4 pletivech 0.2
controls non-specific amplicon
RT-PCR
1.8 1.8
nanoparticle-based detection systems
nanoparticle-based detection systems
dissolving label in suitable solvent
x x xx xx x
stripping
• amplification: each particle contains many molecules (atoms) of the tracer
Detection in „solid state“: magnetic attraction of the MB-DNA-nanoparticle assembly to the electrode
electrode
DNA (protilátky) značené uhlíkovými nanotrubičkami modifikovanými alkalickou fosfatázou
Modifikace povrchů elektrod • • • • • •
vodivé filmy (+funkční skupiny) nanočástice (Au) uhlíkové nanotrubky (bývaly populárnější) grafenové listy (hit sezóny) zvětšení aktivního povrchu, imobilizace sond zlepšení přenosu elektronů, elektrokatalytické vlastnosti • mnoho autorů, mnoho publikací, některé dobré
Zdrsněné elektrody z grafitu nebo skelného uhlíku: -amplifikace signálů volných purinových bazí -i další purinové metabolity, které reakci s ionty mědi tak ochotně nedávají
výrazné (alespoň dva řády) zvýšení citlivosti pro některé analyty (kyselina močová, dopamin, ale nikoli např. kyselina askorbová) není to jen efekt velikosti povrchu!!! selektivně ex situ!
vysoká citlivost bez přídavku mědi
XO
xantin
kyselina močová
XO hypoxantin
oxypurinol
XO
alopurinol
monitorování enzymových přeměn in vitro
analýza moči pacientů
Děkuji za pozornost
