Identifikace mléčných bakterií izolovaných z hemokultur P. Švec1, A. Ševčíková2, M. Vancanneyt3, I. Sedláček1
1 2 3
Česká sbírka mikroorganismů, PřF MU, Brno Fakultní nemocnice Brno BCCM/LMG Bacteria Collection, University Gent, Belgie
Mléčné bakterie – charakteristika
•
heterogenní skupina
•
Gram-pozitivní, kataláza-negativní
•
koky, tyčky, vlákna
•
anaerobní, mikroaerofilní nebo aerotolerantní
•
kys. mléčná – hlavní produkt fermentace
•
taxonomicky velmi bohatá skupina
•
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Bifidobacterium, ……
Mléčné bakterie – fylogenetická pozice Leuconostoc, Lactobacillus
vysoké G+C Atopobium
nízké G+C
Lactobacillus, Pediococcus Streptococcus Lactococcus
Bifidobacterium
Enterococcus S. aureus B. subtilis
Corynebacterium Propionibacterium
10 %
E. coli
(Schleifer a Ludwig, The Genera of Lactic Acid Bacteria, 1999)
Mléčné bakterie – charakteristika
•
heterogenní skupina
•
Gram-pozitivní, kataláza-negativní
•
koky, tyčky, vlákna
•
anaerobní, mikroaerofilní nebo aerotolerantní
•
kys. mléčná – hlavní produkt fermentace
•
taxonomicky velmi bohatá skupina
•
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Bifidobacterium, ……
Mléčné bakterie – význam Pozitivní: •
přirozená mikroflóra - živé organismy - prostředí
•
součást potravin
•
probiotika
Negativní: •
znehodnocení potravin
•
klinický význam
Mléčné bakterie – výskyt v hemokulturách
•
obecně oportunně patogenní, nízká virulence
•
imunosuprese, dlouhodobá hospitalizace, chirurgické zákroky, dlouhodobé užívání ATB, sekundárně při jiných vážných infekcích
•
smíšené infekce
•
často kontaminanty
•
Lactobacillus, Weissella
Leuconostoc,
Lactococcus,
Analyzované kmeny
•
25 kmenů
•
FN Brno 1999 – 2003
•
automatický systém BacTAlert
•
pozitivní růst na MRS agaru, Gram-pozitivní, kataláza-negativní
Zdroj izolace
Kmen č. R-23737 R-23738 R-23739 R-23740 R-23744 R-23741 R-23742 R-23745 R-23752 R-23755 R-23756 R-23757 R-23761 R-23762 R-23849 R-23850 R-24487 R-24488 R-24489
Věk/pohlaví 37/F 3m/M
Základní diagnóza persistující astma
Komplikace kortikoidy
po resekci, sy krátkého střeva port, parenter.výživa
kapsle jogurt 49/F adenoca ovaria 12/M ependymom 55/M polytrauma 25/F Ne-Hodgkin. folikul. lymfom 18/M polytrauma 92/F diabetes mell II.st. 4/M bronchopneumonie 67/M maligní lymfoproliferace 2,5/M 13 % popálenin 49/M 30 % popálenin 18/M 50 % popálenin 6m/F sy krátkého střeva 4/M neuroblastom peritonea
chemoterapie, mukositida chemoterapie, neutropenie řízená ventilace chemoterapie, febrilní neutropenie x bradyfibrilace, řízená ventilace x hepatosplenomegalie x plicní ventilace hemoperitoneum parenterální výživa, ileus chemoterapie, jejunostomie
Identifikace - biotypizace
•
API 50CH
•
konvenční testy (15 a 45°C, GLG, NH3, dextran)
•
vyhodnocení programem BACTSELECT v. 8.0
Identifikace – (GTG)5-PCR
•
rep-PCR (repetitive elements)
•
primer (GTG)5 … (5´-GTGGTGGTGGTGGTG-3´)
•
DNA -> PCR -> ELFO -> shluková analýza
•
jednoduchá, specifická
rychlá,
druhově
až
kmenově
Identifikace – (GTG)5-PCR 20
40
60
80
10 0 %
.R-23737 . R-23738 . LMG 6907T Lactobacillus plantarum . LMG 13087T Lact. paracasei ssp. paracasei . LMG 6902T Lactobacillus fermentum . R-23757 . LMG 9477T Lact. salivarius ssp. salivarius . R-23762 . R-24487 . 106.4 Leuconostoc citreum . LMG 17302T Lact. sakei ssp. carnosus . R-23745 . LMG 11482T Leu. pseudomesenteroides . R-23752 . R-24488 . LMG 8894T Leuconostoc lactis . R-23849 . R-23850 . R-23761 . LMG 6893T Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides . R-23755 . LMG 9198T Lactobacillus curvatus . R-23756 . R-23741 . R-23744 . R-23740 . R-23739 . R-23742 . LMG 6400T Lactobacillus rhamnosus . LMG 9497T Weissella confusa . R-24489
Identifikace – celkové buněčné proteiny
•
analýza celkových metodou SDS-PAGE
buněčných
proteinů
•
buněčný extrakt -> SDS-PAGE -> shluková analýza
•
druhově specifická
Identifikace – celkové buněčné proteiny
Výsledky identifikace
Kmen č. 23737 23738 23739 23740 23742 23741 23744 23745 23752 23755 23756 23757 23761 23762 23849 23850
API50 + konv. testy
REP-PCR
SDS-PAGE
Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus sakei ssp. carnosus Leuconostoc lactis NI Lactobacillus curvatus Lactobacillus fermentum Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Lcb. salivarius ssp. salivarius Lcb. paracas ssp. paracasei Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
NT NT NT NT NT NT NT Lactobacillus sakei ssp. carnosus NT Leu. pseudomesenteroides Lactobacillus curvatus Lactobacillus fermentum NT Lcb. salivarius ssp. salivarius NT Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
24487
Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus sp. Leuconostoc lactis Leuconostoc sp. Lactobacillus sp. Lcb. fermentum Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Lcb. salivarius ssp. salivarius Lcb. paracas ssp. paracasei Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Leuconostoc sp.
Leuconostoc citreum
Leuconostoc citreum
24488 24489
Leuconostoc lactis Lactobacillus sp.
Leuconostoc lactis Weissella confusa
NT NT
Výsledky identifikace Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus
rhamnosus plantarum paracasei ssp. paracasei salivarius ssp. salivarius curvatus fermentum sakei ssp. carnosus
5 2 1 1 1 1 1
Leuconostoc Leuconostoc Leuconostoc Leuconostoc
lactis mesenteroides ssp. mesenteroides pseudomesenteroides citreum
2 2 1 1
Weissella confusa
1
Závěr
•
biotypizace - neidentifikováno: § Lac. sakei ssp. carnosus § Lac. curvatus § Leu. pseudomesenteroides § Leu. citreum § Weissella confusa (<- Lactobacillus sp.)
•
(GTG)5-PCR a SDS-PAGE – vhodné pro LAB
•
velká druhová skupině
variabilita
ve
studované
DĚKUJI VÁM ZA POZORNOST
Pavel Švec Česká sbírka mikroorganismů, PřF MU Tvrdého 14 602 00 Brno
[email protected]
