VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
IZOLACE DNA Z ROSTLINNÝCH TKÁNÍ PRO POUŽITÍ V POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCI DNA EXTRACTION FROM PLANT TISSUES FOR POLYMERASE CHAIN REACTION ANALYSIS
DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS
AUTOR PRÁCE
Bc. ZDENĚK TROJÁNEK
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR
BRNO 2013
doc. Ing. BOHUSLAV RITTICH, CSc.
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12
Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:
FCH-DIP0756/2012 Akademický rok: 2012/2013 Ústav chemie potravin a biotechnologií Bc. Zdeněk Trojánek Chemie a technologie potravin (N2901) Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. RNDr. Aleš Kovařík, CSc.
Název diplomové práce: Izolace DNA z rostlinných tkání pro použití v polymerázové řetězové reakci
Zadání diplomové práce: 1. Vypracujte literární přehled k dané problematice 2. Popište použité experimentální metody 3. Zpracujte získané experimentální výsledky 4. Vyhodnoťte získané výsledky formou diskuse
Termín odevzdání diplomové práce: 3.5.2013 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.
----------------------Bc. Zdeněk Trojánek Student(ka)
V Brně, dne 31.1.2013
----------------------doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. Vedoucí práce
----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty
ABSTRAKT Extrakce nukleových kyselin je důležitým krokem pro všechny molekulárně-biologické studie. Proces izolace rostlinné DNA je komplikovaný vzhledem k přítomnosti polyfenolů, polysacharidů a jiných metabolitů, které mohou být izolovány současně s DNA a působit jako inhibitory PCR. Cílem této práce bylo porovnat mezi sebou klasickou metodu izolace rostlinné DNA – metoda CTAB, komerční kit DNeasy Plant Mini Kit, přímou homogenizaci, polymerní neporezní magnetické nosiče funkcionalizované karboxylovými skupinami a kombinaci výše uvedených metod pro izolaci DNA z různých rostlin a potravin rostlinného původu. DNA izolovaná jednotlivými metodami byla hodnocena z hlediska množství, čistoty a použití v PCR. Všechny metody poskytly DNA v kvalitě vhodné pro PCR. Nicméně jednotlivé metody vykazovaly rozdíly v množství a čistotě izolované DNA, pracnosti izolace DNA a ceně. Kombinací přímé homogenizace a magnetických nosičů pokrytých karboxylovými skupinami byla izolována DNA z různých rostlin a potravin rostlinného původu v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, PCR v reálném čase a restrikční analýzu. Tato metoda je časově nenáročná, jednoduchá a nevyžaduje práci se škodlivými látkami.
ABSTRACT Extraction of nucleic acids is an important step for all molecular biological studies. The process of isolation of plant DNA is complicated due to the presence of polyphenols, polysaccharides and other metabolites. They can be co-isolated with DNA and act as PCR inhibitors. The aim of this study was to compare CTAB extraction procedure, Qiagen DNA easy kit, direct homogenization, carboxyl-functionalised magnetic non-porous HEMA based microspheres and combination of the above mentioned methods for DNA isolation from different plants. The DNA was evaluated regarding concentration, purity and amplification in PCR. All methods provided DNA that could be used in downstream PCR applications. However, there were differences regarding yield, purity, labour intensiveness and cost. Combination of direct homogenization and magnetic microspheres coated by carboxyl groups was isolated DNA from various plants and plant foods in a quality suitable for convectional PCR, real time PCR and restriction analysis. This method is fast, simple and does not require work with harmful substances.
KLÍČOVÁ SLOVA Izolace rostlinné DNA, magnetické nosiče, polymerázová řetězová reakce (PCR), inhibitory PCR
KEYWORDS Isolation of plant DNA, magnetic microspheres , polymerase chain reaction (PCR), inhibitors of PCR 3
TROJÁNEK, Z. Izolace DNA z rostlinných tkání pro použití v polymerázové řetězové reakci. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2013. 84 s. Vedoucí diplomové práce doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc..
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem citoval správně a úplně. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana FCH VUT.
…………………………… podpis studenta
Poděkování: Rád bych touto formou poděkoval panu doc. Ing. Bohuslavu Rittichovi, CSc., paní doc. RNDr. Aleně Španové, CSc., panu RNDr. Aleši Kovaříkovi, CSc. a panu Ing. Daliborovi Hůskovi, PhD. za ochotu, laskavost, odborné a cenné rady při zpracování této diplomové práce. Vřelý dík patří také mé rodině a přítelkyni za podporu a trpělivost během mého studia. 4
OBSAH 1. ÚVOD .................................................................................................................................... 8 2. TEORETICKÁ ČÁST ......................................................................................................... 9 2.1. Izolace DNA z rostlinných tkání ............................................................................................... 9 2.1.1. Proces extrakce DNA .......................................................................................................................... 9 2.1.2. Úchova vzorků................................................................................................................................... 10
2.2. Magnetické nosiče .................................................................................................................... 10 2.2.1. Vlastnosti magnetických nosičů ........................................................................................................ 11 2.2.1.1. Magnetické jádro ....................................................................................................................... 12 2.2.1.2. Povrchová úprava magnetických nosičů.................................................................................... 12 2.2.1.3. Tvar a velikost magnetických nosičů......................................................................................... 13 2.2.2. Imobilizace biologicky aktivních látek.............................................................................................. 13 2.2.3. Příprava hydrofilních neporézních magnetických nosčů ................................................................... 14 2.2.4. Využití magnetických nosičů při izolaci nukleových kyselin............................................................ 15
2.3. Metody používané při analýze DNA....................................................................................... 16 2.3.1. Agarosová gelová elektroforéza ........................................................................................................ 16 2.3.2. Polymerázová řetězová reakce .......................................................................................................... 16 2.3.2.1. Princip PCR ............................................................................................................................... 17 2.3.2.2. Komponenty pro PCR................................................................................................................ 17 2.3.2.3. Termostabilní DNA polymerasa ................................................................................................ 18 2.3.2.4. Primery ...................................................................................................................................... 19 2.3.2.5. Termocyklery............................................................................................................................. 19 2.3.3. Polymerázová řetězová reakce v reálném čase .................................................................................. 20 2.3.4. Inhibitory PCR................................................................................................................................... 22
2.4. Vliv technologického zpracování potravin na degradaci rostlinné DNA............................ 23 2.4.1. Citlivost DNA k degradaci během zpracování potravin .................................................................... 23
3. CÍL PRÁCE ........................................................................................................................ 25 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................. 26 4.1. Materiál..................................................................................................................................... 26 4.1.1. Použitý rostlinný materiál.................................................................................................................. 26 4.1.1.1. Zdroj rostlinného materiálu a způsob skladování ...................................................................... 26 4.1.2. Chemikálie......................................................................................................................................... 27 4.1.3. Roztoky pro izolaci DNA a purifikaci DNA ..................................................................................... 28 4.1.4. Roztoky pro agarosovou gelovou elektroforézu ................................................................................ 29 4.1.5. Komponenty pro PCR ....................................................................................................................... 30 4.1.6. Komponenty pro qPCR ..................................................................................................................... 30 4.1.7. Komponenty pro restrikční analýzu................................................................................................... 30 4.1.8. Magnetické nosiče ............................................................................................................................. 30 4.1.8.1. Vlastnosti magnetických nosičů................................................................................................. 30 4.1.9. Přístroje a pomůcky ........................................................................................................................... 31
4.2. Metody ...................................................................................................................................... 31 4.2.1. DNeasy Plant Mini Kit protokol........................................................................................................ 31 4.2.2. Úprava zařízení pro magnetickou separaci DNA izolované pomocí magnetických nosičů .............. 32 4.2.3. Izolace rostlinné DNA metodou CTAB (modifikovaná metoda dle Saghai-Maroof a spol., 1984) .. 33 4.2.3.1. Místa odebrání alikvotů během izolace DNA metodou CTAB ................................................. 34 4.2.4. Izolace rostlinné DNA homogenizací v kapalném dusíku (L-N2) ..................................................... 35 4.2.5. Izolace rostlinné DNA přímou homogenizací (PH)........................................................................... 35 4.2.6. Izolace DNA magnetickými nosiči.................................................................................................... 36 4.2.7. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA .............................................................. 37 4.2.7.1. Postup měření na NanoPhotometru............................................................................................ 37
5
4.2.8. Ověření kvality izolované DNA metodou PCR................................................................................. 38 4.2.8.1. Primery 18S_for a 5,8S_rev....................................................................................................... 38 4.2.8.2. Primery 26S_for a 26S_rev........................................................................................................ 39 4.2.9. Ověření kvality izolované DNA metodou PCR v reálném čase (qPCR) ........................................... 39 4.2.10. Restrikční analýza produktů PCR.................................................................................................... 40 4.2.11. Bioinformační analýza..................................................................................................................... 41 4.2.12. Agarosová gelová elektroforéza ...................................................................................................... 41
5. VÝSLEDKY A DISKUSE ................................................................................................. 43 5.1. Izolace rostlinné DNA pomocí protokolu DNeasy plant Mini Kit ....................................... 43 5.2. Úprava zařízení pro magnetickou separaci DNA izolované pomocí magnetických nosičů43 5.2.1. Separace magnetických nosičů v mikrozkumavkách o objemu 200 µl.............................................. 43 5.2.2. Separace magnetických nosičů v mikrozkumavkách o objemu 500 µl.............................................. 46 5.2.3. Diskuse .............................................................................................................................................. 47
5.3. Testování účinnosti purifikace DNA pomocí magnetických nosičů v jednotlivých krocích metody CTAB.................................................................................................................................. 47 5.3.1. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA izolované metodou CTAB ................... 48 5.3.2. Ověření amplifikovatelnosti DNA izolované magnetickými nosiči z alikvotů odebraných v pruběhu izolace DNA metodou CTAB...................................................................................................................... 49 5.3.3. Diskuse .............................................................................................................................................. 50
5.4. Izolace rostlinné DNA homogenizací v kapalném dusíku (L-N2) ........................................ 50 5.5. Izolace rostlinné DNA metodou přímé homogenizace (PH)................................................. 50 5.6. Izolace DNA magnetickými nosiči s karboxylovými skupinami z hrubých lyzátů buněk různých rostlinných tkání připravených metodami homogenizací v kapalném dusíku a přímé homogenizace ....................................................................................................................... 51 5.6.1. Izolace DNA homogenizací v kapalném dusíku s následným přečištěním pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) .................................................................................................... 51 5.6.2. Izolace DNA metodou přímé homogenizace s následným přečištěním pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) ............................................................................................................... 51 5.6.3. Diskuse ke kapitolám 5.4., 5.5., 5.6.1. a 5.6.2. .................................................................................. 52 5.6.4. Testování amplifikovatelnosti DNA z různých rostlinných materiálů .............................................. 52 5.6.4.1. PCR s DNA Nicotiana tabacum 1095-55 .................................................................................. 53 5.6.4.2. PCR s DNA Brassica oleracea................................................................................................... 53 5.6.4.3. PCR s DNA Musa acuminata .................................................................................................... 54 5.6.4.4. PCR s DNA Brassica oleracea var. capitata, Cucumis sativus a Allium cepa ........................... 55 5.6.4.5. Srovnání magnetických nosičů nosičů F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) a F-kol B 100 ox P(GMA) .................................................................................................................................................. 56 5.6.4.6. Diskuse ...................................................................................................................................... 57 5.6.5. Testování amplifikovatelnosti DNA z různých potravin rostlinného původu ................................... 57 5.6.5.1. PCR s primery 18S_ for a 5,8S_rev s DNA izolovanou magnetickými nosiči F-kol 135 ox z různých potravin rostlinného původu ..................................................................................................... 57 5.6.5.2. PCR s primery 26_ for a 26_rev s DNA izolovanou magnetickými nosiči F-kol 135 ox z různých potravin rostlinného původu ..................................................................................................... 59 5.6.5.3. PCR s primery 18S_ for a 5,8S_rev s DNA izolovanou magnetickými nosiči F-kol B 100 ox z různých potravin rostlinného původu ..................................................................................................... 61 5.6.5.4. Diskuse ...................................................................................................................................... 62 5.6.6. Optimalizace izolace DNA metodou přímé homogenizace s následným přečištěním pomocí magnetickými nosiči F-kol 135 ox z rostlinných materiálů......................................................................... 63 5.6.6.1. Doba eluce DNA z nosičů do TE pufru ..................................................................................... 63 5.6.6.2. Doba pusobení CTAB na hrubé lyzáty buněk během inkubace při 60 °C ................................. 64 5.6.6.3. Diskuse ...................................................................................................................................... 65 5.6.7. Polymerázová řetězová reakce v reálném čase pro různé typy vzorků.............................................. 65 5.6.7.1. Diskuse ...................................................................................................................................... 68 5.6.8. Bioinformační analýza....................................................................................................................... 68 5.6.8.1. Ověření přítomnosti specifické DNA v amplikonu ................................................................... 68
6
5.6.8.2. Restrikční analýza produktů PCR Brassica oleracea HDEM, Brassica oleracea RC, Brassica oleracea C10, Brassica oleracea (vzorek A) a Brassica oleracea var. capitata (vzorek B)...................... 69 5.6.8.3. Diskuse ...................................................................................................................................... 73
6. ZÁVĚR................................................................................................................................ 74 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .............................................................................. 75 8. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ ..................................................... 84
7
1. ÚVOD Izolace nukleových kyselin je důležitým krokem pro pro všechny molekulárně-biologické studie [1]. V praxi se používá celá řada postupů pro izolaci nukleových kyselin. K hlavním kritériím, který protokol izolace DNA zvolit patří rychlost, jednoduchost a cenová dostupnost postupu [2]. Klasická metoda izolace DNA zahrnuje fenol-chloroformovou extrakci a srážení DNA ethanolem. Tato metoda je časově náročná, pracná a vyžaduje práci se škodlivými látkami. Mezi rychlejší a sofistikovanější postupy izolace DNA patří metody využívající selektivní nebo neselektivní adsorpce DNA na povrch pevných magnetických nosičů [3]. Magnetické nosiče mají většinou charakter kompozitních materiálů. Jsou složeny z vlastní fero- nebo ferimagnetické složky, která tvoří jádro nosiče a složky diamagnetické (nemagnetické), která zajišťuje požadovanou interakci s biologickými systémy. Jádro magnetického nosiče by mělo vykazovat superparamagnetické vlastnosti. Superparamagnetické materiály vykazují magnetické vlastnosti pouze v přítomnosti vnějšího magnetického pole [4,5]. Obecnou výhodou magnetických materiálů je možnost cílené manipulace působením vnějšího magnetického pole. Spojením magnetických nosičů (jak v podobě magnetických nanočástic s rozměrem pod 100 nm, tak i magnetických mikročástic) s biologicky aktivní látkou lze dosáhnout unikátních vlastností, díky kterým je možné látky separovat i ze složitých biologických systémů (např. buněčných suspenzí, homogenátů, fermentačních médií apod.) [4].
8
2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Izolace DNA z rostlinných tkání Izolace čisté, neporušené a vysoce kvalitní DNA je zásadní pro všechny molekulárněbiologické studie [1]. V praxi se používá celá řada protokolů pro izolaci rostlinné DNA. K hlavním kritériím, který protokol zvolit, patří rychlost, jednoduchost a cenová dostupnost [2]. Biochemické složení rostlinné tkáně u různých rostlinných druhů se výrazně liší. Chemická různorodost mezi jednotlivými druhy rostlin může mít za následek nedostatečné výtěžky DNA při použití jednoho izolačního postupu [6]. Dokonce i u blízce příbuzných druhů může stejný protokol vést k neúspěšné izolaci [2]. Na rozdíl od izolace DNA z živočišné tkáně nebo mikroorganismů musí být izolační postupy speciálně upraveny pro každý rostlinný druh a dokonce i pro každou rostlinou tkáň [7,8]. Zejména z důvodů přítomnosti látek, které mohou interferovat např. při amplifikaci DNA, je její izolace v požadované kvalitě často velice náročná [9]. Řada rostlinných druhů využívaných v potravinářském, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu obsahuje vysoké množství polysacharidů, polyfenolů, pigmentů, taninů, alkaloidů, terpenů, flavonoidů a chinonů [6,9]. Vzhledem k přítomnosti endonukleas může docházet k degradaci DNA [6,7]. Největší podíl na složitosti izolace DNA z rostlin mají polysacharidy, polyfenoly a proteiny [10]. Po rozrušení buněk může dojít k adsorpci těchto látek na DNA [11]. Odstranění těchto látek hraje klíčovou roli při izolaci vysoce kvalitní DNA z rostlinných tkání. Přítomnost polysacharidů ve vzorku nese sebou několik problémů. Polysacharidy inhibují enzymovou aktivitu Taq DNA polymerasy při amplifikaci v PCR a také snižují aktivitu ligas a restrikčních endonukleas [12]. Přítomnost polysacharidů ve vzorku DNA je charakteristická vznikem velmi viskózních roztoků, které se špatně pipetují [13,14]. Přítomnost polyfenolů během izolace může vést ke snížení výtěžku a kvality izolované DNA [6]. Polyfenoly uvolněné z vakuol během rozrušení buněk jsou oxidovány celulárními oxidasami a ireversibilně se váží na nukleové kyseliny [15]. Oxidované formy polyfenolů, kovalentně vázané na nukleové kyseliny, způsobují hnědé zbarvení a snižují kvalitu izolované DNA [7,16]. Pro snížení negativního vlivu uvedených látek na kvalitu a kvantitu izolované DNA se používá řada látek. Ke snížení množství izolovaných polysacharidů byly použity m.j. manitol, glukosa, sacharosa a přídavek vyšší koncentrace NaCl k extrakčnímu pufru. K odstranění polyfenolů lze použít polyvinylpyrrolidon (PVP) a β -mercaptoethanol [17]. Ke snížení vlivu polyfenolů lze také rostlinou tkáň zmrazit před nebo během samotné homogenizace [16]. K degradaci proteinů vyskytujících se v roztoku DNA byly použity organické sloučeniny a proteinasa K [18]. 2.1.1. Proces extrakce DNA Proces extrakce DNA z rostlinné buňky zahrnuje odstranění polysacharidů a polyfenolických sloučenin s následnou deproteinizací DNA, její srážení a purifikaci DNA. Častý problém extrakce DNA spočívá ve vytváření komplexů výše uvedených látek s nukleovými kyselinami [19]. Počáteční fáze extrakce genomové DNA spočívá v mechanickém rozrušení rostlinné tkáně v prostředí tekutého dusíku, kdy dochází k dehydrataci tkáně. Zmražená tkáň je rozmělněna 9
na prášek v třecí misce. Je důležité, aby rostlinná tkáň byla zmražena po celou dobu dezitengrace z důvodu zamezení případné degradace DNA. Po rozrušení buněčných stěn následuje narušení buněčných membrán pomocí detergentů tak, aby se DNA uvolnila do extrakčního pufru. V závislosti na použitém postupu se používají dva druhy detergentů: SDS (sodium dodecyl sulfát) a CTAB (cetyl trimethylamonium bromid). Během procesu extrakce je DNA chráněna před působením endogenních nukleas přítomností disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) v extrakčním pufru. EDTA chelatuje hořečnaté ionty, které jsou nezbytným kofaktorem většiny endonukleas. V závislosti na použité metodě se k deproteinizaci používají organické sloučeniny jako fenol, chloroform a isopropanol K dosažení účinné extrakce DNA je důležité zachovat pH 8 nebo vyšší, protože při nižších pH je DNA obsažena v organické fázi [19]. Hrubé extrakty DNA obsahují velké množství RNA, proteinů, polysacharidů a pigmentů. Nicméně velká část RNA je degradována pomocí ribonukleas během rozrušení buněk. Samotná přítomnost RNA v extraktu DNA v některých případech nehraje velkou roli, když neinterferuje v PCR a při restrikční analýze. Nicméně v některých případech je důležité izolovat čistou DNA bez přítomnosti RNA z důvodu přesné kvantifikace DNA [19]. 2.1.2. Úchova vzorků K izolaci DNA je nejvhodnější čerstvý rostlinný materiál, který lze krátkodobě uchovávat při 4 °C bez poškození DNA. V některých případech je nutné vzorky odebírat ve vzdálených místech. V těchto případech je práce s čerstvým materiálem vyloučena. Proto je nutné vzorky uchovávat v suchém nebo polosuchém stavu [19]. Výhodou sušených vzorků je možnost jejich skladování při pokojové teplotě. Důležité je dodržení správných podmínek sušení, aby se zachovala celistvost tkání a nedošlo k degradaci DNA. Alternativním postupem je zmrazení vzorku na -20 °C pro krátkodobou úschovu nebo na -70 °C (nebo na nižší teplotu v kapalném dusíku) pro dlouhodobou úchovu. V případě uchovávání mraženého materiálu je nutné dbát na to, aby nedošlo ani ke krátkodobému rozmrazení. Zmrazením vzorku dochází k rozrušením rostlinné tkáně, přičemž se zachovává nukleasová aktivita. Proto i krátké rozmražení může vést k degradaci DNA [19]. Z výše uvedeného vyplývá, že je nutný vývoj protokolů pro izolaci DNA z různých rostlinných orgánů, včetně suchých tkání [6,7].
2.2. Magnetické nosiče Poprvé bylo použití magnetické separace v biotechnologii popsáno v roce 1973 P. J.Robinsonem, který použil oxid železitý pokrytý oxidem křemičitým nebo celulosou k imobilizaci enzymů α-chymotrypsinu a β-galaktosidasy pro využití v bioreaktorech [20]. Od té doby magnetické separační techniky nacházejí stále širší uplatnění v různých odvětvích průmyslu. Magnetické separační techniky jsou využívány zejména v biochemii, molekulární a buněčné biologii, (nano)biotechnologiích, a (nano)medicíně předevsím pro rychlost, cenu a vysokou účinnost separačního procesu [21-23]. Magnetické nosiče mají většinou charakter kompozitních materiálů (Obrázek 1). Jsou složeny z vlastní fero- nebo ferimagnetické složky, 10
která tvoří jádro nosiče a je zodpovědná za interakci s vnějším magnetickým polem (tedy za magnetické vlastnosti nosiče) a složky diamagnetické (nemagnetické), která zajišťuje požadovanou interakci s biologickými systémy. Nejpoužívanějšími materiály pro přípravu magnetických jader jsou biokompatibilní magnetické oxidy železa a různé typy feritů ve formě prášků nebo magnetických kapalin [4]. Jádro magnetického nosiče by mělo vykazovat superparamagnetické vlastnosti. Superparamagnetické materiály vykazují magnetické vlastnosti pouze v přítomnosti vnějšího magnetického pole. K zvýšení stability a k zabránění shlukování nebo sedimentaci nosičů jsou často potaženy (enkapsulovány) tenkou ochrannou vrstvou. Ochrannou vrstvu může tvořit přírodní nebo syntetický polymer či anorganický materiál [5]. Obecnou výhodou magnetických materiálů je možnost cílené manipulace působením vnějšího magnetického pole. Spojením magnetických nosičů (jak v podobě magnetických nanočástic s rozměrem pod 100 nm, tak i magnetických mikročástic) s biologicky aktivní látkou lze dosáhnout unikátních vlastností díky kterým je možné tyto látky separovat i ze složitých biologických systémů (např. buněčných suspenzí, homogenátů, fermentačních médií apod.) [4]. Obrázek 1: Klasická stavba magnetické nosiče pro biotechnologické využití. Upraveno dle [23].
2.2.1. Vlastnosti magnetických nosičů Použití magnetických nosičů v praxi je dáno především jejich vlastnostmi [3,25]. Mezi základní vlastnosti patří velikost, tvar a polydisperzita částic [26]. Nosiče musí být stabilní v roztocích a biokompatibilní, obsahovat vhodné funkční skupiny, minimálně adsorbovat nespecifické látky, nepodléhat nežádoucím chemickým přeměnám a současně mít vysoký obsah magnetického plniva, aby separace v magnetickém poli byla dostatečně rychlá a účinná [27,28]. 11
2.2.1.1. Magnetické jádro Magnetické jádro musí splňovat několik zákládních požadavků: (i) mít dobrou citlivost na vnější magnetické pole, (ii) vykazovat velmi nízký zbytkový magnetismus po odstranění vnějšího magnetického pole, aby nedocházelo k jejich nežádoucí agregaci, (iii) mít malou velikost (nm), (iv) mít dobrou chemickou stabilitu při různém pH a redoxních podmínkách, (v) vykazovat biokompatibilitu (vi), být cenově dostupné a (vii) snadno a rychle vyrobitelné [26]. Výše uvedené požadavky pro přípravu jader magnetických nosičů splňují oxidy železa a ferrity. Název oxidy železa se používá pro širokou skupinu sloučenin s obecným vzorcem FexOyHz (ve většině případech je z=0). Chemický vzorec ferritů je MO·Fe2O3 (M= Fe, Mn, Co, Zn, Cu a Ni). Největší pozornost je věnována aplikacím magnetitu Fe3O4 (FeO·Fe2O3) a maghemitu γ-Fe2O3, které vykazují o dva řády vyšší magnetizaci než ostatní oxidy [26]. Magnetit Fe3O4 je černý feromagnetický oxid obsahující ve své mřížce ionty Fe2+ a Fe3+, které se projevují velmi silnou magnetizací [26]. Nicméně magnetit není příliš stabilní a je citlivý k oxidaci. Proto se často používá jako prekurzor pro přípravu maghemitu [29]. Maghemit je načervenalý hnědo-černý feromagnetický oxid s podobnými vlastnostmi jako magnetit obsahující ve své mřížce pouze ionty Fe3+ [26]. Maghemit se obvykle připravuje oxidací magnetitu. Jako oxidační činidlo lze použti peroxid vodíku, dusičnan železitý nebo kyslík [29]. Maghemit vzhledem ke své vyšší stabilitě je vhodnější pro biologické aplikace [30]. Sloučeniny kobaltu, niklu a chromu vykazující rovněž dobré magnetické vlastnosti. Vzhledem k jejich toxicitě a náchylnosti k oxidaci je jejich použití v praxi omezené [24,31]. Nejčastěji používanou metodou k přípravě částic magnetitu či maghemitu je koprecipirace (Rovnice 1) [29]. Metoda je založena na reakci železnatých a železitých iontů v zásaditých roztocích. Velikost a tvar vzniklých oxidů železa závisí na typu použité soli, reakční teplotě, pH, iontové síle aj. Touto metodou vznikají většinou polydisperzní částice. Monodisperzitu částic lze dosáhnout přídavkem chelatujících organických aniontů (např. kyseliny citronové nebo olejové) nebo polymerů jako je dextran, škrob či polyvinylalkohol [4,26,31]. Rovnice 1: Příprava magnetických jader. Upraveno dle [29]. 2 Fe 3+ (aq ) + Fe 2+ (aq ) + 8OH − → Fe3O4 ( s ) + 4 H 2 O (l )
2.2.1.2. Povrchová úprava magnetických nosičů Povrchová úprava magnetických nosičů se provádí z několika důvodů: (i) stabilizuje koloidní disperzi, (ii) zajišťuje biokompatibilitu, (iii) zabraňuje nežádoucím interkacím (nespecifické interakce např.: s fosfáty a proteiny), (iv) zabraňuje agregaci nosičů, která by mohla vést ke ztrátě superparamagnetických vlastností a (v) usnadňuje povrchovou funkcionalizaci nosičů [26,31]. Povrch magnetických nosičů lze modifikovat anorganickými materiály jako jsou kovy (např.: zlato) a různými oxidy (oxid křemičitý nebo oxid hlinitý), přírodními nebo syntetickými polymery [30]. Mezi přírodní polymery používané k povrchové úpravě nosičů patří dextran [32], chitosan [33] a škrob [34]. Vzhledem k biokompatibilitě se využívají přírodní polymery předeveším v biomedicínckých aplikacích. Některé z těchto polymerů mají
12
však nedostatečnou mechanickou odolnost [24]. Mezi syntetické polymery používané k povrchové úpravě nosičů patří polyethylenglykol (PEG), poly(vinyl)alkohol (PVA) [26] a poly(mléčná) kyselina (PLA) [35]. Pro studium morfologie a velikosti nosičů lze využít transmisní a skenovací elektronovou mikroskopii (TEM, SEM), která poskytuje kvalitativní informaci o povrchu a velikosti částic [4]. Množství magnetického plniva v nosičích může být zjištěno pomocí atomové absorpční spektrometrie. Obsah karboxylových skupin lze stanovit alkalimetrickou titrací [3].
2.2.1.3. Tvar a velikost magnetických nosičů Z mnoha možných tvarů magnetických nosičů (kulička, tyčinka, vlákno, membrána, destička, nepravidelný tvar) je pro praktické aplikace nejvýhodnější tvar kuličky, který vykazuje nejlepší hydrodynamické vlastnosti. Nosiče nepravidelného tvaru jsou mnohem náchylnější k mechanickému poškození. Mezi další důležité vlastnosti nosičů patři monodisperzita (jednotná velikost). Monodisperzní nosiče vykazují jednotné fyzikální, chemické a biologické vlastnosti. Velké částice mají malý specifický povrch sloužící k navázání funkčních skupin nebo k imobilizaci biomolekul. Proto jsou v praxi využívány nano- a mikronosiče s malým průměrem a velkým specifickým povrchem. Nicméně příliš malá velikost nosiče může mít za následek snížení magnetické citlivosti, a proto se hledá kompromis mezi specifickým povrchem nosiče a jeho magnetickými vlastnostmi [26].
2.2.2. Imobilizace biologicky aktivních látek Na magnetických nosičích byla imobilizována řada biologicky aktivních látek, jak vysokomolekulárních, tak nízkomolekulárních. Vhodně funkcionalizované magnetické mikročástice či nanočástice slouží jako nosiče protilátek, hormonů, léčiv, buněk, diagnostických látek, enzymů, biologicky významných proteinů a peptidů, oligonukleotidů a nukleových kyselin. Jejich imobilizaci je možné provést řadou postupů. Mezi základní způsoby patří fyzikální adsorpce a kovalentní imobilizace. Fyzikální adsoprce je jednoduchá a velmi rychlá. Fyzikální adsorpce je však málo stabilní ve srovnání s imobilizací kovalentními vazbami. Kovalentní imobilizace vyžaduje, aby nosič obsahoval funkční skupiny, např. NH2, COOH, OH, SH, nebo CONH2), které slouží k navázání cílových molekul. Působením různých činidel se funkční skupiny na povrchu nosiče aktivují pro navázání biomolekul. Pro vytvoření kovalentní vazby musí mít vhodné funkční skupiny i imobilizovaná molekula (NH2, COOH, SH nebo OH) [4]. Magnetické nosiče umožňují separaci látek z reakční směsi bez použití filtrace nebo centrifugace, což velice usnadňuje a urychluje samotnou separaci látek [26]. Magnetické nosiče, kompatibilní s cílovou sloučeninou, se smíchají se vzorkem. V průběhu inkubace dochází k navázání cílové sloučeniny na magnetické nosiče. Poté se magnetický nosič s navázanou cílovou sloučeninou vloží do magnetického separátoru a díky superparamagnetickým vlastnostem jádra dochází k oddělení nosiče s navázanou cílovou sloučeninou od reakční směsi. Po vymytí kontaminantů, může být cilová sloučenina eluována a použita pro další práci (Obrázek 2) [31,36,37].
13
Obrázek 2: Schematické znázornění purifikace nukleových kyselin. Upraveno dle [37].
2.2.3. Příprava hydrofilních neporézních magnetických nosčů Magnetické nosiče P(HEMA-co-GMA) poly(hydroxyethylmethakrylát-coglycidylmethakrylát) (Obrázek 3) použité v diplomové práci byly připraveny disperzní kopolymerizací polymerů HEMA a GMA ve směsi toluen-2-methylpropan-1-ol stabilizované acetát-butyrát celulosy (CAB). Reakce byla iniciována dibenzoylperoxidem (BPO) v přítomnosti magnetitu (Fe3O4) a kyselina olejové [38]. Hydroxylové skupiny magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA) byly oxidovány pomocí 2% vodného roztoku manganistanu draselného v kyselém prostředí (2 M H2SO4) a v přítomnosti malého množství alkylbenzensulfonové kyseliny jako smáčedla po 3 hodiny při laboratorní teplotě za vzniku karboxylových skupin (Rovnice 2) [39]. Obrázek 3:Magnetické nonosiče P(HEMA-co-GMA), elektronový mikrosnímek převzat z práce [40].
14
Rovnice 2: Zavedení karboxylových funkčních skupin na povrch nosičů P(HEMA-co-GMA).
2.2.4. Využití magnetických nosičů při izolaci nukleových kyselin Klasické metody izolace DNA zahrnují fenol-chloroformovou extrakci a srážení DNA ethanolem. Tato metoda je časově náročná, pracná a vyžaduje práci se škodlivými látkami. Mezi rychlejší a sofistikovanější postupy izolace spadají metody využívající selektivní nebo neselektivní adsorpce DNA na povrch pevných magnetických částic [3]. Vhodně funkcionalizované magnetické částice jsou smíchány se vzorkem obsahujícím DNA. Po určité době, když jsou cílové molekuly navázány na magnetické nosiče, se tento magnetický komplex oddělí od zbytku vzorku pomocí vhodného magnetického separátoru. Po promytí od nečistot jsou molekuly DNA eluovány a použity pro další práci [37]. Pro izolaci DNA lze použít silikagelové částice (magnetické i nemagnetické). Silikagel má při pH 7 negativní náboj v důsledku deprotonizace silanolových skupin. K adsorpci DNA na povrch silikagelových částic dochází v přítomnosti chaotropních látek jako jsou NaI, NaClO4, guanidin hydrochlodrid (GuHCl) a guanidin isothiokyanatát (GuSCN). Mechanismus interakcí je popsán v práci Melzak a spol. [41]. DNA může být rovněž izolována pomocí elektrostatických sil s využitím magnetických nosičů s navázanými aminoskupinami. Aminoskupiny -NH2 mohou být protonovány na -NH3+, a takto kladně nabitá aminoskupina je schopna elektrostatické interakce s negativně nabitou molekulou DNA [42]. K izolaci DNA byla s úspěchem použita neselektivní adsorpce DNA na magnetické nosiče funkcionalizované karboxylovými skupinami. Tyto nosiče reverzibilně váží DNA v přítomnosti polyethylenglykolu a chloridu sodného. Množství adsorbované DNA na nosič se mění v závislosti na koncentraci obou těchto látek. Rostoucí koncentrace PEG a NaCl vede ke snížení aktivity vody a tím dochází ke kondenzaci dvoušroubovice DNA. Vyvolání kondenzace DNA působením vnější síly může být dosaženo pomocí osmotického tlaku, který je vyvolán neutrálním polymerem a monovaletní solí [43]. Pro navození tohoto stavu lze použít polyethylenglykol (PEG) a chlorid sodný [44,45]. Mechanismus této adsorpce je komplexní povahy a dosud nebyl plně objasněn. Při adsorpci DNA na povrch nosiče nedochází k interakci mezi karboxylovými a fosfátovými skupinami, ale k interakci dusíkatých bazí DNA s povrchovými karboxylovými skupinami magnetických nosičů. DNA lze tímto způsobem izolovat z komplexních vzorků obsahující inhibitory PCR v kvalitě vhodné pro PCR a restrikční analýzu [36].
15
2.3. Metody používané při analýze DNA K analýze DNA se nejčastěji využívají agarosová gelová elektroforéza, UV spektrofotometrie, konvenční PCR a qPCR. V některých případech se ke kvantifikaci DNA využívá nested PCR a kvantitavní kompetitivní PCR [46].
2.3.1. Agarosová gelová elektroforéza Gelová elektroforéza patří mezi nepraktičtější a nejvýkonnější metody používané pro dělení makromolekul. Použití porézních gelů (např. agarosy anebo polyakrylamidového gelu) umožňuje separaci molekul (fragmentů DNA) na principu síťového efektu a zároveň na základě elektroforetické pohyblivosti dělených látek [47]. Nukleové kyseliny obsahující fosfátové skupiny nesou záporný náboj a ve stejnosměrném elektrickém poli se pohybují k anodě [48]. Elektroforetické gely vytvářejí složitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry, jejichž velikost lze ovlivnit složením roztoku a koncentraci polymeru. Agarosové gely jsou vhodné pro separaci molekul nukleových kyselin o velikosti 100 bp až po zhruba 50 kbp [49]. Jednotlivé formy DNA o stejné molekulové hmotnosti mají různou pohyblivost. Nadšroubovicová forma je nejkompaktnější a za standardních podmínek migruje nejrychleji. Pohyblivost DNA je závislá na podmínkách elektroforézy, zejména iontové síle pufru, napětí, koncentraci ethidiumbromidu a množství nadšroubovicových závitů u superhelikální formy [50]. Molekuly DNA lze na gelu detegovat ethidiumbromidem, který se vmezeřuje (interkaluje) mezi sousední páry bazí v DNA a vytváří komplex, který po osvětlení ultrafialovým světlem červeně fluoreskuje. Molekuly DNA jsou pak na gelu patrné jako proužky, jejichž intenzita je úměrná koncentraci DNA. Místo ethidiumbromidu může být k detekci nukleových kyselin použita také skupina fluorescenčních kyaninových barviv s komerčním označením SYBR [49]. Ke stanovení velikosti (počtu párů bazí – bp) fragmentů se používají markery molekulových hmotností, což jsou směsi fragmentů DNA o definovaných velikostech. Porovnání polohy získaného fragmentu s odpovídajícím fragmentem markeru slouží k odhadu jeho velikosti [51].
2.3.2. Polymerázová řetězová reakce Koncept amplifikace DNA poprvé navrhnul H. Gobind Khoranav 1971. V roce 1983 objevil Kary B. Mullis princip polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction PCR) a o dva roky později byla tato metoda úspěšně zavedena do praxe. Za tento významný objev v oblasti molekulární biologie obdržel v roce 1993 Kary B. Mullis Nobelovu cenu. Tato elegantní metoda měla revoluční vliv na všechny odvětví molekulární biologie [52].
16
2.3.2.1. Princip PCR PCR je založena na exponenciální amplifikaci cílové sekvence DNA [54]. Templátová DNA může být jedno nebo dvouvláknová [53]. Princip PCR (Obrázek 3) spočívá ve třech opakujících se krocích: (1) denaturace dvouřetězcové DNA (dsDNA) na jednořetězcovou DNA (ssDNA), (2) připojení primerů (annealing) a (3) syntetická fáze (elongace) [54]. Prvním krokem je denaturace templátové DNA. Teplota a doba denaturace zavisí především na délce templátové DNA. V prvním cyklu bývá denaturace zpravidla prodloužena, aby proběhla kompletní denaturace templátu, protože temlátová DNA je většinou mnohem delší než cílový amplikon. Také některé “hot-start” polymerasy vyžadují zvýšenou teplotní aktivaci [55]. Vazba primerů, které jsou komplementární k hraničním úsekům cílové sekvence DNA, je podmíněna ochlazením směsi na 50–60 °C. Teplota vhodná k připojení primerů závisí především na délce primerů a na zastoupení A-T a G-C párů. Většinou se teplota pohybuje několik stupňů pod teplotou tání obou primerů [53]. Posledním krokem je syntéza nových řetězců. Jedná se o extensi připojených primerů DNA polymerasou. V této fázi jsou připojovány jednotlivé deoxynukleotidy ve směru 5‘→ 3‘. Teplota je v této fázi dána teplotním optimem použité DNA polymerasy. V případě použití Taq polymerasy je teplota nastavena na 72 °C, což je teplotní optimum tohoto enzymu [53]. Počet cyklů je závislý na výchozí koncentraci templátové DNA a zpravidla se pohybuje v rozmezí od 20–40 cyklů [56]. Obrázek 3: Princip polymerázové řetězové reakce. Upraveno dle [53].
2.3.2.2. Komponenty pro PCR Reakční směs (obvykle v rozmezí 25 – 100 µl) se skládá z následujících složek: 17
Matrice DNA (DNA templát) – makromolekula DNA, podle které se komplementárně syntetizují nové řetězce DNA. Obsahuje cílová místa pro primery.
Oligonukleotidové primery – bývají synteticky připravené a jsou komplementární k templátové DNA, která má být amplifikována. Primery jsou sekvenčně specifické.
DNA polymerasa – katalyzuje syntézu nové DNA ve směru 5‘→ 3’podle sekvence nukleotidů v komplementárním řetězci DNA od 5´ konce primeru. Ke katalýze se používají termostabilní polymerasy.
3´-deoxynukleotid-5-trifosfáty (dNTP) – (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) – stavební kameny pro syntézu nové DNA. Optimální koncentrace je 200 µM, toleranční rozpětí je 20 - 400 µM. Vysoká koncentrace dNTP (od 4 mM a výše) působí inhibičně, protože vyvazuje hořečnaté ionty.
Mg2+ ionty – jsou nezbytné pro aktivitu DNA polymerasy. Koncentrace Mg2+ musí být optimalizována pro každou kombinaci primerů a DNA templátu. Obvykle se používá koncentrace 1,5 mM Mg2+. Toleranční rozpětí je 0,5-0,8 mM. Vyšší koncentrace iontů snižuje specifitu PCR.
Pufr pro PCR – vytváří optimální prostředí pro DNA polymerasu. Standardní reakční pufr obsahuje 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 - 8,8), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2. případně může ještě obsahovat acetamid, albumin, želatinu nebo Tween 20.
Voda pro PCR – používá se k doplnění směsi pro PCR na požadovaný objem. Nejvhodnější je voda o odporu 18 mΩ nebo voda pro injekce ČSL 4 [48].
2.3.2.3. Termostabilní DNA polymerasa Jak již bylo uvedeno, v PCR se využívá termostabilní DNA polymerasa pro opakovanou syntézu obou vláken. První enzym, který byl použit, byl izolován z bakterie Escheria coli, jako DNA polymerasa I (Klenowův fragment), která měla teplotní optimum při 37,5 °C. Použití tohoto enzymu mělo řadu nevýhod. Enzym je nestabilní při vysokých teplotách, a proto vyžaduje opakované přidávání po denaturaci v každém cyklu. Kromě toho cílová DNA, která má počet parů bazí vyšší než několik set, nemůže být amplifikována. K velkému pokroku došlo s objevem Taq DNA polymerasy, která byla izolována z termofilní bakterie Thermus aquaticus. Taq DNA polymerasa má teplotní optimum při teplotě 75 °C v přítomnosti hořečnatých iontů a dNTP. Tento enzym zůstává aktivní i po opakovaném vystavení teplotě 94 °C během denaturace. Poločas inaktivace je přibližně 40 minut při teplotě 95 °C. Jedná se o enzym, který má pouze 5‘→ 3‘ polymerasovou aktivitu a postrádá 3‘→ 5‘ exonukleasovou aktivitu, což znamená, že tento enzym není schopen opravovat chyby vzniklé při replikaci [56]. Kromě Taq DNA polymerasy jsou používané také Pwo a Pfu DNA polymerasy izolované z bakterií Pyrococcus woesei a Pyrococcus furiosus. Tyto enzymy mají kromě polymerasové aktivity také 3‘→ 5‘ exonukleasovou aktivitu, umožňující opravu chybně inkorpovaných deoxynukleotidů. Produkty těchto enzymů jsou syntetizovány s desetinásobně vyšší přesností ve srovnání s Taq DNA polymerasou. Přesnost in vitro syntézy je jedním z nejdůležitějších parametrů při PCR a je vyžadována především pro klonování fragmentů, studium alelického 18
polymorfismu jednotlivých RNA transkriptů, charakterizaci jednotlivých buněčných populací v kultuře a charakterizaci málo častých mutací ve tkáni. Nevýhodou je nižší schopnost syntetizovat dlouhé úseky DNA ve srovnání s Taq DNA polymerasou [51]. Mezi další používané termostabilní DNA polymerasy patří polymerasa izolovaná z bakterie Thermus thermophilus (Tht). Tento enzym má teplotní optimum při 70 °C a v přítomnosti Mn2+ je schopen působit jako reversní transkriptasa s následnou tvorbou cDNA. Přidání hořečnatých iontů umožňuje amplifikaci templátové DNA. Tato dvojí aktivita Tht DNA polymerasy umožňuje RNA-PCR, která se provádí v jedné zkumavce a vyhýbá se potřebě oddělené amplifikace cDNA [57]. Tato metoda se zkráceně nazývá RT-PCR (zpětná PCR) [58].
2.3.2.4. Primery PCR primery jsou krátké oligodeoxyribonukleotidy, které jsou navrženy tak, aby byly komplementární s koncovou sekvencí cílového amplikonu. Primery se většinou skládají z 15 25 nukleotidů a mají vyvážený obsah G/C a A/T páru (přibližně 50 - 60%), protože každý ze dvou primerů je komplementární k různým částem cílové sekvence amplikonu [57]. Je důležité, aby teplota tání primerů a templátové dvoušrobovice byla přibližně stejná a rozdíl mezi nimi byl maximálně 2 °C [53]. Teplotou tání (Tm) se rozumí teplota, při které je polovina molekul jednořetězcových a druhá polovina molekul dvouřetězcových. Teplotu tání zvyšuje přítomnost vodíkových můstků. Primery s větším obsahem G/C párů mají vyšší teplotu tání, než primery s nižším obsahem G/C párů. Důvodem je vazba mezi guaninem a cytosinem, která je tvořena třemi vodíkovými můstky, a proto je potřeba k rozrušení této vazby vyšší teploty než u vazby mezi adeninem a thyminem, která je tvořena dvěma vodíkovými můstky [59]. Za přijatelnou Tm se považuje teplota v rozmezí 55 - 65 °C [53]. K výpočtu teploty tání se používá řada vzorců [59]. Nukleotidové sekvence primerů nesmějí být vzájemně komplementární, aby se zabránilo tvorbě dimerů a netvořily se sekundární struktury (vlásenky) [59]. Optimální koncentrace primerů v reakci je zpravidla 0,1 - 0,6 µM, vyšší koncentrace mohou vést ke vzniku nespecifických produktů [51]. Komerčně dostupné syntetizátory oligonukleotidů poskytují dostatečnou čistotu (> 98%) a primery běžných velikostí mohou být používány při PCR bez přečištění. Pro návrh primerů v analyzovaných oblastech sekvence DNA existuje řada počítačových programů, které umožňují zohlednit výše zmíněná pravidla [49].
2.3.2.5. Termocyklery Termocykler (Obrázek 4) je programovatelný termostat řízený mikroprocesorem a představují nejpohodlnější způsob provedení PCR v laboratoři. V termocykleru se teplota mění automaticky v naprogramovaných časových intervalech [56]. Hlavními požadavky jsou přesnost teploty a rychlost přechodu mezi jednotlivými teplotami [53]. Postupným opakováním tohoto procesu se exponenciálně (2n, n = počet cyklů) vytváří až miliarda kopií vybraného úseku cílové molekuly [49].
19
Obrázek 4: MJ MINI Termo cykler [60].
2.3.3. Polymerázová řetězová reakce v reálném čase Metoda kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) je založena na sledování množství vytvořeného amplifikovaného produktu pomocí fluorescenčních barviv nebo sond v každém cyklu polymerazové řetězové reakce. Intenzita fluorescenčního záření je měřena během každého cyklu PCR a je přímo úměrná množství amplikonu přítomného v reakční směsi [53]. S rostoucím množstvím produktu exponenciálně roste i intenzita fluorescenčního signálu. Poslední fáze je tzv.: “plató fáze” dochází k saturaci systému, množství amplifikovaného produktu se dále nemění a fluorescenční signál zůstává konstantní [61]. Způsoby identifikace amplikonů v PCR v reálném čase lze rozdělit do 2 základních skupin: fluorescenční barviva (SYBR GREEN I (Obrázek 5) a II, SYBR GOLD, BEBO) a značené sondy nebo primery (TaqMan, Molecular Beacons, Amplifluor, Scorpions) [53,55,58].
20
Obrázek 5: Kyanidové barvivo SYBR GREEN. Upraveno dle [53].
Mezi nejčastěji používané fluorescenční barvivo patří SYBR GREEN. Toto barvivo volně rozptýlené v roztoku nevykazuje prakticky žádnou fluorescenci. Po začlenění SYBR GREEN do dvoušroubovice DNA dochází až k tisícinásobnému zvýšení intenzity fluorescence [62]. Komplex DNA – barvivo absorbuje modré světlo (λmax = 494 nm) a emituje zelené světlo (λmax = 524 nm) [63]. Intenzita flourescence těchto bariviv se zvyšuje se zvyšujícím množstvím amplikonů. Hlavní nevýhoda SYBR GREEN spočívá v tom, že intenzita fluorescence roste v přítomnosti jakékoliv dvoušrobovice DNA, včetně nespecifických produktů (dimery primerů). Přítomnost nespecifických produktů v reakci může vést k nadhodnocení výsledné koncentrace DNA [53,55]. Z tohoto důvodu je důležité odlišit specifické produkty od nespecifických. Toho lze dosáhnout pomocí analýzy křivek tání po dokončení PCR. Po dosažení teploty tání Tm, při které dochází k rozrušení dvoušroubovice DNA a k uvolnění barviva do roztoku, flourescence náhle klesá. Vzhledem k tomu, že nespecifické produkty jsou obvykle kratší délky než cílový amplikon, dochází k jejich tání při nižší teplotě a jejich přítmnost je snadno rozpoznatelná [53]. Další nevýhodou použití SYBR GREEN je skutečnost, že se nedá využít pro multiplexní reakce, protože flourescenční signály různých produktů se nedají rozlišit [62]. Polymerazová řetězová rekace v reálném čase využívající, značené sondy a primery, je založená na specifické detekci cílového produktu PCR. Flourescecenčně značené sondy a primery detegují pouze DNA obsahující specifickou sekvenci použité sondy nebo primeru. Flourescecenčně značené sondy a primery se mohou využít pro multiplexní reakce. Z důvodu možnosti použití různě značených sond (každá sonda je označena jiným barvivem) lze detegovat několik cílových sekvencí najednou v jedné reakci [64]. Princip použití TaqMan sond je uveden na Obrázku 6. 21
Obrázku 6: Princip použití TaqMan sondy. Upraveno dle [65].
2.3.4. Inhibitory PCR Mezi inhibitory PCR patří široká škála různých chemických látek organických či anorganických. Ionty vápníku patří mezi nečastější anorganické látky s inhibičním účinkem na PCR. Nicméně většina známých inhibitorů jsou organické sloučeniny např.: žlučové soli, močovina, fenol, ethanol, polysacharidy, dodecyl sulfát sodný (SDS), třísloviny, kolagen, myoglobin, hemoglobin a proteinasy. Inhibitory PCR se vyskytují v různých biologických materálech (tkáně, tělní tekutiny), v životním prostředí (voda, půda, vzduch) a v potravinách (maso, mléko, ovoce, zelenina). Některé inhibitory mohou kontaminovat vzorek během jeho dopravy, zpracování nebo extrakce DNA [66]. Inhibitory PCR mohou interferovat s různými kroky PCR. Inhibice PCR může být způsobena jedním z následujích mechanismů: (i) vazba inhibitoru na polymerasu, (ii) navázání inhibitoru na templátovou DNA, (iii) interakce inhibitoru s polymerasou nebo temlátovou DNA během připojování primerů a (iv) interakce inhibitorů se sondami v qPCR [68,69]. Přítomnost nukleas během zpracování vzorku a extrakce DNA může mít za následek degradaci DNA. Připojení primerů během reakce PCR může být také ovlivněno některými inhibitory. Jedná se o kompetetitivní vazbu inhibitoru na templátovou DNA místo primeru. K zamezení tohoto negativního vlivu jsou navrhovány primery s větším obsahem G-C párů, které mají vyšší teplotou tání a jsou silněji vázány k templátové DNA [67,68]. Existuje řada inhibitorů interferujících přímo nebo nepřímo s DNA polymerasou. Některé látky způsobují degradaci tohoto enzymu, např.: proteinasy, detergenty, močovina nebo fenol [69-71]. Vápník, kolagen a třísloviny snižují aktivitu polymerasy. Vysoké koncentrace vápenatých iontů vedou ke kompetitivní vazbě na DNA polymerasu místo hořečnatých iontů. 22
Třísloviny na sebe váží hořečnaté ionty. V obou případech hořečnaté ionty nemohou působit, jako kofaktor DNA polymerasy, což má za následek snížení její aktivity [66]. Polysacharidy mají podobnou strukturu jako nukleové kyseliny, a proto mohou snižovat účinnost DNA polymerasy [72]. V potravinách byla zjištěna přítomnost celé řady různých inhibitorů PCR. Glykogen, polysacharidy, minerální látky, stejně jako enzymy přítomné v potravinách mohou působit ihibičně na PCR [73]. V mléce působí inhibičně převážně vysoký obsah vápenatých iontů. Zatímco obsah tuků má minimální vliv na průběh PCR [74]. Rostliny obsahují mnoho sekundárních metabolitů, jako jsou polysacharidy, polyfenoly, pektiny a xylany, které mohou být izolovány současně s DNA a poté inhibovat PCR [75]. Zejména polysacharidy a polyfenoly mají inhibiční účinek na amplifikaci DNA [72]. Některé inhibitory PCR jsou používány během přípravy vzorku nebo během extrakce DNA. Mezi používané látky patří různé soli (chlorid sodný a chlorid draselný), detergenty a organické sloučeniny (cetyl trimethlyamonium bromid (CTAB), ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), dodecylsulfát sodný (SDS), ethanol, isopropanol nebo chloroform) a při nevhodně provedeném postupu mohou působit inhibičně na Taq DNA polymerasu (např. fenol) [76].
2.4. Vliv technologického zpracování potravin na degradaci rostlinné DNA Ve studiích zkoumajících stabilitu DNA bylo zjištěno, že mechanické namáhání, vysoká teplota, pH, použití chemických činidel, enzymatická aktivita a fermentace mohou ovlivňovat primární strukturu DNA a způsobovat např.: hydrolýzu, oxidaci a deaminaci DNA. Tyto podmínky se běžně vyskytují při výrobě potravin a mohou vést ke fragmentaci DNA, což má za následek snížení citlivosti analýzy a rovněž vliv na její kvantitativní stanovení [46,77]. Rostlinná a potravinová matrice obsahuje širokou škálu různých sloučenin např.: rostlinné polysacharidy a polyfenoly, proteiny, aditiva nebo různá chemická činidla, které mohou být izolovány současně s DNA a inhibovat PCR [78] – viz 2.3.4. Volba postupu izolace DNA je obvykle založena na předešlých zkušenostech s podobnými potravinami [78].
2.4.1. Citlivost DNA k degradaci během zpracování potravin Použití vysokých teplot během zpracování potraviny vede k denaturaci DNA. Zahřívání roztoku DNA patří k nejjednoduším způsobům, jak zkoumat vliv vaření na fragmentaci DNA při různých teplotách a časech. Hupfer a spol. (2000) zjistili, že při teplotě 95 °C po 60 minutách byla průměrná délka fragmentů DNA v roztoku DNA snížena na méně než 600 bp [79]. V práci Debode a spol. (2007) pozorovali, že při zahřívání roztoku DNA (99 °C/7 hod) se průměrná velikost fragmentů DNA pohybovala okolo 400 bp [80]. Nicméně k degradaci rostlinné DNA může docházet i při teplotách nižších než je bod varu. Během vaření bramborových hlíz po dobu 1 hodiny při teplotě 80 °C byla DNA degradována na fragmenty menší než 792 bp [77]. Na druhou stranu vaření máčených fazolí při teplotě 100 °C po dobu 10 - 20 minut nemá výrazný efekt na DNA [81]. Tyto výsledky ukazují, že teplota 100 °C nemusí výrazně degradovat DNA. Důležitou roli hraje doba zahřívání, čím déle bude zahřívání probíhat, tím větší nastane fragmentace DNA. Teploty používané pro konzervování nebo autoklávování 121 °C/15 min však nepoškozují veškerou DNA využitelnou pro PCR. 23
V dalších procesech jako je pečení, sušení a pražení dochází k degradaci DNA. DNA se štěpí na menší fragmenty a dochází ke snížení citlivosti PCR [46]. K degradaci DNA během sušení dochází již při teplotě 70 °C po dobu 2 hodin. Při vyšších teplotách dochází k degradaci DNA mnohem rychleji. Při výrobě kukuřičných lupínků se používá teplota kolem 100 °C, což má za následek výraznou degradaci a intaktnost DNA [82]. Pečení výrazně snižuje velikost extrahované DNA. U chleba hraje důležitou roli, ze které části chleba je vzorek odebrán. Vrchní vrstva chleba je přímo vystavena vysokým teplotám přes 200 °C, a proto zde degradace DNA probíhá nejvýrazněji. Vyšší obsah vlhkosti ve středu chleba přispívá k vyšší degradaci DNA než u vzorku odebráném pod kůrkou [83]. Mnoho potravin, zejména ovoce nebo zelenina, je vystaveno kyselým podmínkám. Kyselé pH způsobuje depurinaci DNA a vede k následnému štěpení DNA [84]. Účinek pH je limitován přítomností buněčných membrán, které chrání DNA před štěpením. Po delší inkubaci při nízkém pH dochází k lýzi buněk. Nicméně enzymy zodpovědné za degradaci DNA (endogenní nuklasy) jsou denaturovány dříve než samotná DNA [85]. Navíc DNA vystavená působení nízkého pH je jednovláknová a dá se použít jako matrice pro PCR. Ve slabém alkalickém prostředí při pH 8,5 - 9,5 dochází pouze k rozvolnění dvoušroubovice DNA [84]. Silná degradace DNA během fermentačního procesu je pravděpodobně způsobena DNasami, které jsou produkovány mikroorganismy ve fermentačním médiu. Fermentace miso omáček probíhá 5 až 6 měsíců. Po této době byla DNA degradována na fragmenty menší jak 200 bp [86]. Podobné problémy byly zaznamenány při výrobě tofu, kdy k amplifikaci silně degradované DNA bylo zapotřebí použí nested PCR. Dále byla pozorována silná degradace DNA během výroby natto (kvašené sójové boby) a sójové omáčky [46].
24
3. CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo porovnat mezi sebou klasickou metodu izolace rostlinné DNA – metoda CTAB, komerční kit DNeasy Plant Mini Kit, přímou homogenizaci, polymerní neporezní magnetické nosiče funkcionalizované karboxylovými skupinami a kombinaci výše uvedených metod pro izolaci DNA z různých rostlin a potravin rostlinného původu. DNA izolovaná jednotlivými metodami byla hodnocena z hlediska množství a čistoty, relativní neporušenosti a použití v PCR. Všechny metody poskytli DNA v kvalitě vhodné pro PCR.
25
4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1. Materiál 4.1.1. Použitý rostlinný materiál
Název rostliny latinsky
Tabulka 1: Použitý rostlinný materiál Název rostliny Část rostliny/ česky potraviny
Způsob skladování
tabák virginský
listy
odebrány z živé rostliny
hlávkové zelí
listy
chladnička *
špenát
listy
Spartina anglica
-
suché listy
Spartina maritima
-
suché listy
Musa acuminata Cucumis sativus Olea europaea
banánovník okurka setá olivovník evropský
mraznička ** v papírových sáčcích při laboratorní teplotě v papírových sáčcích při laboratorní teplotě chladnička chladnička chladnička
Brassica olerecea
brukve zelná
Allium cepa Beta vulgaris
cibule kuchyňská řepa červená
Glycine soja
sója
Zea mays
kukuřice
Theobroma cacao
kakaovník pravý
Tritium aestivum, Secale cereale
pšenice, žito
Nicotiana tabacum Brassica oleracea var. capitata Spinacia
plod plod plod dužnatý stonek chladnička s růžicemi cibule chladnička kořen chladnička odtučněná sójová v plastovém sáčku mouka při laboratorní teplotě zrno/kukuřičný v plastovém sáčku lupínek při laboratorní teplotě v alobalu při semeno/čokoláda laboratorní teplotě v plastovém sáčku chléb/střídka při laboratorní teplotě
*……. při teplotě 4 °C **…... při teplotě -20 °C
4.1.1.1. Zdroj rostlinného materiálu a způsob skladování
Suché listy rostliny Spartina anglica a Spartina maritima, zelené listy Nicotiana tabacum a purifikovaná DNA Brassica oleracea HDEM, RC a C10 byly dodány 26
RNDr. A. Kováříkem, CSc. z Biofyzikálního ústavu AV ČR v.v.i, v Brně a byly skladovány v papírových sáčcích při laboratorní teplotě nebo v mrazničce při -20 °C.
Ostatní vzorky: Brassica oleracea var. capitata, Spinacia, Musa acuminata, Cucumis sativus, Olea europaea, Brassica olerecea, Allium cepa, Beta vulgaris, Glycine soja (sušené sójové boby), Zea mays (kukuřičné lupínky), Theobroma cacao (čokoláda) a Tritium aestivum, Secale cereale (chléb) byly zakoupeny v běžné obchodní síti a skladovány v chladničce, mrazničce nebo při laboratorní teplotě.
4.1.2. Chemikálie
Acetát amonný (PENTA, Praha, ČR)
Acetát sodný (PENTA, Praha, ČR)
Agarosa pro elektroforézu DNA (Serva, Heidelberg, SRN)
Cetyl triethylamonium bromid (CTAB) (Sigma-Aldrich, St. Louis ,USA)
DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Gaithersburg, USA)
EB pufr (QIAGEN, Gaithersburg, USA)
Ethanol (Merck, Darmstadt, SRN)
Ethidiumbromid (EtBr) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
Ethylendiaminotetraoctová kyselina (EDTA) (Serva, Heidelberg, SRN)
Fenol (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
Hydrogenuhličitan sodný (PENTA, Praha, ČR)
Chloroform (PENTA, Praha, ČR)
Kyselina chlorovodíková (PENTA, Praha, ČR)
Kyselina octová (PENTA, Praha, ČR)
Isoamylalkohol (PENTA, Praha, ČR)
Isopropanol (PENTA, Praha, ČR)
Lysozym (Reanal, Budapešť, Maďarsko)
β-merkaptoethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
Oktanol (PENTA, Praha, ČR)
Polyethylenglykol 6000 (PEG 6000 ) (Sigma-Aldrich, St. Louis ,USA)
Proteinasa K (Serva, Heidelberg, Německo)
RNAsa A (Serva, Heidelberg, Německo)
Tekutý dusík (Linde, Praha, ČR)
Tris-hydroxymethyl-aminomethan (Tris-báze) (Amresco, Solon, USA)
Tris-hydroxymethyl-aminomethan hydrochlorid (Tris-HCl) (Amresco, Solon, USA)
27
4.1.3. Roztoky pro izolaci DNA a purifikaci DNA
Lyzační pufr CTAB
Navážka 1 g cetyl triethylamonium bromidu byla rozpuštěna v 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 16 ml 5 M NaCl, 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) a 42 ml destilované vody.
Směs chloroform-oktanol
Chloroform a oktanol byl smíchán v poměru 24:1.
1 M Tris-HCl (pH 7,8)
Navážka 121,1 g Tris-báze byla rozpuštěna v 800 ml destilované vody. Bylo upraveno pH roztoku na hodnotu 8,0 pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Roztok byl doplněn destilovanou vodou na 1 litr a poté byl sterilizován 20 min. při 121 °C.
0,5 M EDTA (pH 8,0)
Navážka 186,1 g EDTA byla rozpuštěna v 800 ml destilované vody. pH bylo upraveno na hodnotu 8,0 přidáním asi 20 g hydroxidu sodného v nádobě s magnetickým míchadlem. Roztok byl doplněn destilovanou vodou do 1 litru a poté byl sterilizován 20 min. při 121 °C.
TE pufr
1 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0) byl smíchán s 0,2 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) a doplněn sterilní destilovanou vodou do objemu 100 ml.
Fenol (pH 7,8)
Destilovaný fenol byl nasycen v TE pufru a hodnota pH byla upravena pomocí hydrogenuhličitanu sodného na 7,8.
Směs fenol-chloroform-isoamylalkohol
Fenol, chloroform a isoamylalkohol byly smíchány v poměru 25:24:1.
Směs chloroform-isoamylalkohol
Chloroform a isoamylalkohol byl smíchán v poměru 24:1.
Roztok acetátu amonného v 70% ethanolu (10 mM)
200 µl 5M NH4Ac bylo smícháno s 70 ml 96% ethanolu a 26 ml destilované vody.
70% ethanol
70 ml 96% ethanolu bylo smícháno s 26 ml destilované vody. 28
Roztok acetátu sodného (3 M)
Navážka 264 g bezvodého acetátu sodného byla rozpuštěna ve 400 ml destilované vody.
Roztok chloridu sodného (5 M)
Navážka 87,66 g NaCl byla rozpuštěna v 300 ml destilované vody.
Roztok 40% polyethylenglykolu 6000
Navážka 40 g PEG 6000 byla rozpuštěna v 60 ml destilované vody. Objem byl doplněn do 100 ml destilovanou vodou.
4.1.4. Roztoky pro agarosovou gelovou elektroforézu
TAE pufr (1x koncentrovaný)
Navážka 121 g Tris-báze byla rozpuštěna v 28,55 ml koncentrované kyseliny octové, 50 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) a 1000 ml destilované vody. pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 7,8 pomocí koncentrované kyseliny octové. Takto připravený roztok byl zředěn 50x.
Agarosový gel
Agarosový gel (1,8%): 0,9 g agarosy bylo rozpuštěno ve 50 ml 1x koncentrovaného TAE pufru. Agarosový gel (0,8%): 0,4 g agarosy bylo rozpuštěno ve 50 ml 1x koncentrovaného TAE pufru.
DNA standard 100 bp žebříček (BioLabs, Ipswich, USA)
Obsahuje fragmenty 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200 a 1500 bp.
DNA standard 1kbp žebříček (BioLabs, Ipswich, USA)
Obsahuje fragmenty 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8 a 10 kbp.
DNA standard 100 bp + 1kbp žebříček (BioLabs, Ipswich, USA)
Obsahuje fragmenty 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8 a 10 kbp.
Nanášecí pufr 6x koncentrovaný (BioLabs, Ipswich, USA)
Ethidiumbromid 1mg/ml
Navážka 20 mg ethidiumbromidu byla rozpuštěna v 20 ml destilované vody.
29
4.1.5. Komponenty pro PCR
Oligonukleotidové primery 18S_for a 5,8S_rev; 26S_for a 26S_rev (GENERI BIOTECH, Hradec Králové ČR)
dNTP směs (25 mM) (Serva, Heidelberg, SRN)
Reakční pufr kompletní pro DyNazyme DNA polymerasu (10x koncentrovaný) (Thermo Scientific, Anglie)
Voda pro PCR
DyNazyme DNA polymerasa (2 U/µl) (Thermo Scientific, Anglie)
4.1.6. Komponenty pro qPCR
Oligonukleotidové primery 26S_for a 26S_rev (GENERI BIOTECH, Hradec Králové ČR)
FastStart Universal SYBR Green Master (Roche Applied Science, Indianapolis, USA)
Voda pro PCR
4.1.7. Komponenty pro restrikční analýzu
Voda
Restrikční pufr pro restrikční enzym BstNI (BioLabs, Ipswich, USA)
Restrikční pufr pro pro restrikční enzym EcoRV (Takara Bio, Kyoto, Jap)
Restrikční enzym BstNI (10U/ µl ) (BioLabs, Ipswich, USA)
Restrikční enzym EcoRV (15U/ µl ) (Takara Bio, Kyoto, Jap)
4.1.8. Magnetické nosiče V práci byly použity magnetické nosiče P(HEMA-co-GMA) - poly(hydroxyethyl methakrylát-co-glycidyl methakrylát) a P(GMA) - poly(glycidyl methakrylát), které byly připraveny Ing. D. Horákem CSc. na Ústavu makromolekulární chemie Akademie věd ČR, v.v.i. v Praze.
4.1.8.1. Vlastnosti magnetických nosičů Charakteristika testovaných nosičů, typ polymeru tvořícího vrchní ochranou vrstvu magnetického jádra, obsah Fe v magnetickém jádru nosiče (hmotnostní %), stupeň pokrytí povrchu nosiče karboxylovými funkčními skupinami, průměr jádra nosiče (µm) bez polymerní ochrannévrstvy a index polydispersity (PDI) je uvedena v Tabulce 2.
30
Tabulka 2: Charakteristické vlastnosti magnetických nosičů Fe
-COOH
Průměr
(% hm)
(mM/g)
(µm)
P(HEMA-coGMA)
6,6
2,61
1,0
1,05
P(GMA)
5,4
0,67
1,2
1,10
Označení
Nosič
F-kol 135 ox F-kol B 100 ox
PDI
4.1.9. Přístroje a pomůcky
Centrifuga 5414D (Eppendorf, Hamburg, SRN)
Centrifuga 5804R (Eppendorf, Hamburg, SRN)
Centrifuga MINI (Labnet, New Jersey, USA)
Cykler MJ mini (Bio-Rad, Hercules, USA)
Mikropipety Gilson o objemu 2, 10, 20, 200 a 1000 µl (Gilson, Middleton, USA)
Laboratorní váhy MXX-612 (Denver instruments, Göttingen, SRN)
Nanodrop spectrofotometr ND-1000 (Thermo Fisher Scientific,Wilmington, USA)
PCR box Bio II A (TELSTAR, Madrid, ESP)
Real-Time PCR system 7300 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan den IJssel, NL)
Thermostat IP 100-U (Scientific LTE, Greenfield, UK)
Thermostat plus (Eppendorf, Hamburg, SRN)
Transiluminátor TVR 3121 (Spectroline, Paramount, USA)
Třepačka MS2 Minishaker ( IKA, SRN)
Zdroj elektrického napětí pro elektroforézu BS- 525 (Tesla, ČR)
Běžné laboratorní sklo, materiál a pomůcky
4.2. Metody 4.2.1. DNeasy Plant Mini Kit protokol
Bylo odváženo cca 100 mg rostlinného materiálu.
Zvážený vzorek byl přemístěn do třecí misky.
V třecí misce (třecí miska byla předem vychlazena tekutým dusíkem) byl rostlinný materiál rozmělněn v tekutém dusíku (0,5 l).
Homogenizovaná tkáň byla převedena do 1,5 ml mikrozkumavky a bylo k ní přidáno 400 µl pufru AP1 a 4 µl RNasy A (100 mg/ml). 31
Suspenze byla promíchána a inkubována při 65 °C po dobu 10 min. Během inkubace byla směs 2-3x promíchána.
K suspenzi bylo přidáno 130 µl pufru AP2 a směs byla inkubována 5 min. na ledu.
Po inkubaci na ledu byla suspenze centrifugována 20 000 · g po dobu 5 min.
Suspenze byla přepipetována do QIAshreder Mini spin column umístěné ve 2 ml sběrné mikrozkumavce a byla provedena centrifugace 20 000 · g po dobu 2 min.
Proteklá frakce byla přenesena do čisté mikrozkumavky, bylo k ní přidáno 1,5 objemu pufru AW1 a suspenze byla řádně promíchána.
Suspenze (včetně možných sraženin) byla přenesena do DNeasy Mini spin column umístěné ve 2 ml mikrozkumavce a byla centrifugována 6 000 · g po dobu 1 min.
Se zbylým vzorkem byl opakován předchozí krok.
DNeasy Mini spin column byl přenesen do čisté 2 ml mikrozkumavky, bylo přidáno 500 µl promývacího pufru AW2 a centrifugováno 6 000 · g po dobu 1 min.
K DNeasy Mini spin column bylo opět přidáno 500 µl promývacího pufru AW2 a byl centrifugován 20 000 · g po dobu 2 min.
DNeasy Mini spin column byl přenesen do nové 2 ml mikrozkumavky. Na membránu DNeasy Mini spin column bylo napipetováno 100 µl pufru AE.
Suspenze byla inkubována při 15-25 °C po dobu 5 min a poté byla centrifugována 6 000 · g po dobu 1 min.
Eluát DNA byl zamražen na -20 °C pro další zpracování.
4.2.2. Úprava zařízení pro magnetickou separaci DNA izolované pomocí magnetických nosičů
Stojan určený k separaci je konstruován na 1,5 ml mikrozkumavky (Obrázek 7- A).
Pomocí lepící pásky a gumiček byl magnetický pás upraven tak, aby mohly být použity mikrozkumavky o objemech 200 a 500 µl (Obrázek 7- B)
32
Obrázek 7: Stojan k magnetické separaci DNA (A), upravený stojan k magnetické separaci DNA (B).
4.2.3. Izolace rostlinné DNA metodou CTAB (modifikovaná metoda dle Saghai-Maroof a spol., 1984)
Bylo odváženo 0,1 - 0,5 g rostlinného materiálu.
Zvážený vzorek byl přemístěn do třecí misky.
V třecí misce (třecí miska byla předem vychlazena tekutým dusíkem) byl rostlinný materiál rozmělněn v tekutém dusíku (0,5 l).
Homogenizovaná tkáň byla převedena do 15 ml zkumavky s víčkem
K homogenizované tkáni bylo přidáno 5 ml lyzačního pufru CTAB a 5 µl β merkaptoethanolu.
Vzorek byl inkubován při 60 °C po dobu 30 min. a byl 2-3x promíchán♦1.
K suspenzi bylo přidáno ekvivalentní množství směsi chloroform-oktanol (24:1), byla promíchána a centrifugována při 10 000 · g po dobu 10 min.
Horní fáze byla přenesena do čisté Erlenmeyerovy baňky ♦2 a DNA vysrážena 0,6 objemem ispropanolu po dobu 1 min. při laboratorní teplotě.
Suspenze byla centrifugována 10 000 · g po dobu 5 min.
Sraženina v sedimentu byla promyta 10 mM acetátem amonným, pH 7,4 v 70% ethanolu (2 x 30 min.), centrifugována a vysušena při laboratorní teplotě.
33
Sraženina byla rozpuštěna v 500 µl TE pufru♦3.
K suspenzi byly přidány 4 µl RNAsy A (10 mg/ml) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 15 min.
Poté byly přidány 4 µl proteinasy K (20 mg/ml) a suspenze byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hod♦4.
K roztoku DNA bylo přidáno 400 µl směsi fenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1). Směs byla promíchána a centrifugována po dobu 2 min.
Horní fáze byla přenesena do čisté mikrozkumavky♦5 a byl přidán ekvivalentní objem směsi chloroform:isoamylalkohol (24:1). Směs byla promíchána a centrifugována 2 min.
Horní fáze byla přenesena do čisté mikrozkumavky, okyselena 10 µl 3 M acetátu sodného a srážena 2,5 objemem studeného ethanolu (-20 °C).
Směs byla dobře promíchána a centrifugována při 10 000 g po dobu 2 min.
Sraženina DNA byla promyta 70% ethanolem, vysušena při laboratorní teplotě a rozpuštěna ve 40 µl TE pufru♦6.
4.2.3.1. Místa odebrání alikvotů během izolace DNA metodou CTAB ♦1-5
….. V těchto krocích (Tabulka 3) bylo odebráno 100 µl suspenze hrubých lyzátů buněk či částečně purifikovaná DNA a zamraženo na -20 °C pro další zpracování magnetickými nosiči, případně pro použití v PCR.
♦6
...... V tomto kroku (Tabulka 3) bylo odebráno 10 µl purifikované DNA a naředěno 90 µl TE pufru a zamraženo na -20 °C pro další zpracování magnetickými nosiči, případně pro použití v PCR.
Alikvot
♦1 ♦2 ♦3 ♦4 ♦5 ♦6
Tabulka 3: Místa odebrání alikvotů Krok izolace Stav vzorku Po homogenizaci rozbití buněk, tkáně a aplikaci uvolnění DNA CTAB Po přidání deproteinace chloroform -oktanol Po rozpuštění v TE odstranění CTAB pufru Po použití RNAsy A degradace RNA, a proteinasy K další deproteinace Po přidání odstranění zbytků chloroformfenolu, isoamylalkohol přečištění Purifikovaná DNA
po 10x naředění
34
4.2.4. Izolace rostlinné DNA homogenizací v kapalném dusíku (L-N2)
Bylo odváženo cca 80 mg rostlinného materiálu.
Zvážený vzorek byl přemístěn do třecí misky.
V třecí misce (třecí miska byla předem vychlazena tekutým dusíkem) byl rostlinný materiál rozmělněn v tekutém dusíku (0,5 l) (Obrázek 8).
Homogenizovaná tkáň byla převedena do 1,5 ml mikrozkumavky.
K homogenizované tkáni byl přidán 1 ml lyzačního pufru CTAB a 5 µl merkaptoethanolu.
Vzorek byl inkubován při 60 °C po dobu 30 min. a občas byl promíchán.
Po inkubaci byl vzorek zamražen na -20 °C pro další zpracování magnetickými nosiči případně pro použití v PCR.
Obrázek 8: Homogenizace rostlinného materiálu pomocí tekutého dusíku v třecí misce s tloučkem.
4.2.5. Izolace rostlinné DNA přímou homogenizací (PH)
Bylo odváženo cca 80 mg rostlinného materiálu.
Zvážený vzorek byl přemístěn do 1,5 ml mikrozkumavky a bylo přidáno 500 µl lyzačního roztoku CTAB a 5 µl merkaptoethanolu.
Pomocí kopistu a skleněné tyčinky s hrotem byla provedena homogenizace (Obrázek 9).
Po homogenizaci bylo přidáno dalších 500 µl lyzačního roztoku CTAB. 35
Vzorek byl inkubován při 60 °C po dobu 30 min. a občas byl promíchán.
Po inkubaci byl vzorek zamražen na -20 °C pro další zpracování magnetickými nosiči případně pro použití v PCR.
Obrázek 9: Přímá homogenizace rostlinného materiálu v mikrozkumavce pomocí kopistu.
4.2.6. Izolace DNA magnetickými nosiči K izolaci DNA byly použity magnetické nosiče F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) a F-kol B 100 ox P(GMA) pokryté karboxylovými skupinami. Složení separační směsi pro izolaci DNA a pořadí přidávání složek je uvedeno v Tabulce 4. Tabulka 4: Složení separační směsi Komponenta
Objem (µl)
5 M NaCl
100
200
Hrubý lyzát buněk (DNA)
25
50
40 % PEG 6000
100
200
36
Magnetický nosič (2 mg/ml)
25
50
Celkem
250
500
Po smíchání komponent byla směs inkubována při laboratorní teplotě po dobu 15 min.
Po uplynutí doby inkubace byly zkumavky umístěny na 5 min. do magnetického separátoru a magnetické nosiče byly odseparovány. V přítomnosti magnetického pásu byl supernatant opatrně odpipetován ze zkumavky.
Magnetické nosiče s navázanou DNA bez přítomnosti magnetického pásu byly promyty 500 µl 70% ethanolu. Směs magnetických částic a ethanolu byla promíchána a magnetických nosiče byly odseparovány za použití magnetického separátoru po dobu 1 min.
Supernatant byl opatrně odpipetován ze zkumavky v přítomnosti magnetického pásu.
Magnetické nosiče s navázanou DNA bez přítomnosti magnetického pásu byly promyty 200 µl 70% ethanolu. Magnetické nosiče byly odseparovány za použití magnetického separátoru po dobu 1 min.
Supernatant byl opatrně odpipetován ze zkumavky v přítomnosti magnetického pásu a zbylý ethanol se nechal odpařit.
DNA adsorbovaná na magnetických částicích byla eluována do 50 µl TE pufru při laboratorní teplotě.
Po 60 min. byly nosiče odseparovány pomocí magnetického separátoru a eluát obsahující DNA byl odebrán do čísté mikrozkumavky.
4.2.7. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA Měření koncentrace a čistoty izolované DNA bylo provedeno na přístroji NanoPhotometer. Vzorky byly před měřením řádně promíchány. Jako slepý vzorek byl použit TE pufr. Na spektrofotometru byla měřena absorbance v rozmezí vlnových délek 230 až 320 nm. Ze záznamu o měření byla odečtena koncentrace (ng/µl), poměry absorbancí při vlnových délkách A260nm/A280nm a A260nm/A230nm.
4.2.7.1. Postup měření na NanoPhotometru
Byl zapnut PC a spuštěn program ND-1000 v. 3.7.1.
Čočka na přístroji NanoPhotometr byla očištěna vodou.
V programu bylo nastaveno měření pro nukleové kyseliny.
Na čočku byly naneseny 2 µl vody jako nulová hodnota. Čočka byla omyta vodou a poté byl na ni nanesen slepý vzorek. 37
Čočka byla opět očištěna vodou.
Byl nanesen vzorek DNA a proměřen.
4.2.8. Ověření kvality izolované DNA metodou PCR
Všechny komponenty PCR byly před použitím promíchány a centrifugovány.
Komponenty byly smíchány v pořadí a objemovém množství uvedeném v Tabulce 5. Jako negativní kontrola místo DNA matrice byl použit TE pufr a jako pozitivní kontrola byla použita DNA izolovaná metodou CTAB zředěná na 5 ng/µl. Tabulka 5: Složení směsi pro PCR Komponenta
Objem (µl)
Voda pro PCR
16,75
10x Reakční pufr kompletní
2,50
Primer forward (100 pmol/µl)
0,50
Primer reverse (100 pmol/µl)
0,50
Směs dNTP (25 mM)
0,25
DyNazyme DNA polymerasa (2 U/µl)
0,50
Matrice DNA
4,00
CELKEM
25,00
4.2.8.1. Primery 18S_for a 5,8S_rev Byl použit pár primerů [87]:
18S_for
5´- GCG CTA CAC TGA TGT ATT CAA CGA G-3´
5,8S_rev
5´- CGC AAC TTG CGT TCA AAG ACT CGA-3´
Byl amplifikován produkt PCR o délce 700bp.
Provedení PCR s primery 18S_for a 5,8S_rev
Všechny složky směsi pro PCR byly promíchány a poté vloženy do termocykleru.
Na termocykleru byl nastaven program pro průběh PCR při detekci specifické oblasti ITS1. Podmínky amplifikace jsou uvedeny v Tabulce 6.
Kroky 2 až 4 byly opakovány 34x.
38
Tabulka 6: Podmínky amplifikace DNA v PCR s primery 18S_for a 5,8S_rev Krok
Teplota (°C)
Čas
1. Počáteční denaturace
94
3 min
2. Denaturace
94
20 s
3. Hybridizace primerů
50
20 s
4. Syntéza DNA
72
40 s
5. Poslední cyklus
72
10 min
4.2.8.2. Primery 26S_for a 26S_rev Byl použi pár primerů [88]:
26S_for
5´- GAA TTC ACC CAA GTG TTG GGA T-3´
26S_rev
5´- AGA GGC GTT CAG TCA TAA TC-3´
Byl amplifikován i produkt PCR o délce 220 bp.
Provedení PCR s primery 26S_for a 26S_rev
Všechny složky PCR směsi byly promíchány a poté vloženy do termocykleru.
Na termocykleru byl nastaven program pro průběh PCR. Podmínky amplifikace jsou uvedeny v Tabulce 7.
Kroky 2 až 4 byly opakovány 39x. Tabulka 7: Podmínky amplifikace DNA v PCR s primery 26S_for a 26S_rev Krok
Teplota (°C)
Čas
1. Počáteční denaturace
94
3 min
2. Denaturace
94
20 s
3. Hybridizace primerů
50
20 s
4. Syntéza DNA
72
20 s
5. Poslední cyklus
72
10 min
4.2.9. Ověření kvality izolované DNA metodou PCR v reálném čase (qPCR) Amplifikace DNA izolovaná magnetickými nosiči F-kol 135 ox a F-kol B 100 ox z ů zných typů vzorků byla ověřena pomocí PCR v reálném čase za využití primerů 26S_for a r 39
26S_rev (velikost produktů PCR 220 bp). Komponenty qPCR směsi byly smíchány v pořadí a objemovém množství uvedeném v Tabulce 8. Všechny vzorky byly pipetovány v tripletu. Jako negativní kontrola byla použita voda pro PCR a směs pro qPCR bez DNA. V programu Applied Biosystems byly nastaveny podmínky amplifikace, které jsou uvedeny v Tabulce 9. Kroky 2 až 4 byly opakovány 40x. Byl zvolen detektor ACT_MF pro oblast emise SYBR GREEN. Pro kvantifikaci byla použita metoda absolutní kvantifikace. Pomocí softwaru Applied Biosystems Real-Time PCR System byla vytvořena kalibrační křivka, ze které bylo přímo odečítáno množství DNA ve směsi pro PCR. Statistické vyhodnocení výsledků a analýza křivek tání pro zjištění přítomnosti nespecifických produktů PCR bylo provedeno pomocí softwaru Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System. Tabulka 8: Složení PCR směsi pro qPCR Objem (µl)
Komponenta Voda pro PCR
3,350
qPCR SYBR Green master mix
7,500
Primer forward (100 µM)
0,075
Primer reverse (100 µM)
0,075
DNA matrice
4,000
Celkem
15,000
Tabulka 9: Podmínky amplifikace DNA v qPCR s primery 26S_for a 26S_rev Krok
Teplota (°C)
Čas
1. Počáteční denaturace
95
3 min
2. Denaturace
95
15 s
3. Hybridizace primerů
57
30 s
4. Syntéza DNA
72
30 s
95
15 s
60
1 min
95
15 s
60
15 s
5. Disociace
4.2.10. Restrikční analýza produktů PCR Produkt PCR byl podroben restrikčnímu štěpení pomocí enzymů BstNI (10 U/µl) a EcoRV (15 U/µl). Komponenty pro restrikční štěpení byly smíchány v pořadí a objemovém množství uvedeném v Tabulce 10.
40
Tabulka 10: Složení směsi pro restrikční analýzu Komponenta
Objem (µl)
Produkt PCR
5,0
Restrikční pufr
2,0
Voda do PCR
12,5
Restrikční enzym
0,5
Celkem
20,0
Reakce s výše uvedenými enzymy probíhala při 37 °C/2 hod. Produkty restrikčního štěpení (20 µl) byly smíchány s nanášecím pufrem (4 µl) a byly detegovány pomocí gelové elektroforézy na 1,8 % agarosovém gelu v 1x TAE pufru (60V/1,5 hod).
4.2.11. Bioinformační analýza
Sekvence amplikonu ITS1 byla stažena z intenetové databáze GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) ve formátu FASTA do PC.
Sekvence byly přenesena do počítačového programu BioEdit, kde byly označeny sekvence primerů, zjištěna délka sekvence a porovnána se experimentálně zjištěnou velikostí v PCR.
Poté byla provedena RFLP (restriction fragment length polymorphism). Tato operace probíhala online v programu Nebcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/)
Do okna byla zkopírována sekvence a pomocí příkazu search resriction size byly nalezeny vhodné restrikční endonukleasy, které štěpí fragment DNA v oblasti ITS1, která je variabilní a díky tomu můžeme na základě štěpných produktů identifikovat o jakou DNA se jedná.
V programu Nebcutter byl teoreticky předpovězen obraz po štěpení příslušnými endonukleasami a ten byl porovnán s experimentálním výsledkem.
4.2.12. Agarosová gelová elektroforéza Agarosová gelová elektroforéza byla použita k detekci rostlinné DNA a produktů PCR.
Byl připraven agarosový gel. Pro detekci rostlinné DNA byl použit gel o koncentraci 0,8% (bylo naváženo 0,4g agarosy do 50 ml 1x TAE pufru). Pro detekci produktů PCR byl použit gel o koncentraci 1,8% (bylo naváženo 0,9g agarosy do 50 ml 1x TAE pufru).
Suspenze byla pečlivě rozvařena v Papinově hrnci. K rozvařenému gelu vytemperovaného na 60 °C bylo přidáno 15 µl ethidium bromidu (1mg/ml) a byl opatrně nalit do předem připravené elektroforetické vaničky s hřebínkem a nechán 1 hodinu zatuhnout. Před nanášením vzorků byl hřebínek opatrně vyjmut tak, aby nedošlo k poškození vytvořených komůrek. 41
Gel byl přenesen do elektroforetické vaničky a převrstven 1x TAE pufrem do výšky 2-3 mm nad gel.
Vzorky byly nanášeny do komůrek společně s nanášecím pufrem. Na parafilm byly naneseny 2 µl nanášecího pufru (6x koncentrovaný) a 10 µl produktu PCR. Směs byla promíchána a nanesena do komůrky.
Jako standard u rostlinné DNA byl použit žebříček 1 kbp u produktů PCR byl použit žebříček 100 bp.
Po nanesení vzorků byl zapnut zdroj napětí.
Elektroforéza probíhala 1 hodinu při 60 V.
Separace byla ukončena, jakmile nanášecí pufr doputoval do 2/3 délky agarosového gelu.
42
5. VÝSLEDKY A DISKUSE 5.1. Izolace rostlinné DNA pomocí protokolu DNeasy plant Mini Kit DNA byla izolována z rostliny Spartina maritima dle postupu uvedeném v kapitole 4.2.1. Pro zjištění množství izolované DNA bylo provedeno spektrofotometrické stanovení koncentrace izolované DNA (Tabulka 11) a pro kontrolu kvality izolované DNA byla provedena PCR (Obrázek 10). Tabulka 11: Hodnoty koncentrace izolované metodou DNeasy plant Mini Kit protokol Vzorek cspekt. (ng/µl) S. maritima 15 A 10,0 S. maritima 15 C 34,5 S. maritima 23 A 19,7 S. maritima 23 C 20,6 Obrázek 10: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev. Běh 1 2 3 4
DNA S. maritima 15A S. maritima 15C S. maritima 23A S. maritima 23C
Produkt PCR ++ ++ +++ +++
Amlifikovány byly 4 µl DNA izolované z S. maritima. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR.
DNA izolovaná pomocí protokolu DNeasy plant Mini Kit byla izolována v kvalitě vhodné pro PCR.
5.2. Úprava zařízení pro magnetickou separaci DNA izolované pomocí magnetických nosičů 5.2.1. Separace magnetických nosičů v mikrozkumavkách o objemu 200 µl Z počátku byla separace prováděna v mikrozkumavkách o objemu 200 µl dle postupu uvedeného v kapitole 4.2.6. Objem separační směsi byl 250 µl. Pro testování byla použita 43
DNA izolované metodou CTAB z Nicotiana tabacum (bez použití a s použitím magnetických nosičů). Na agarosový gel byly naneseny vzorky DNA (20 µl) o různých koncentracích a DNA izolovaná magnetickými nosiči ze separačních směsí, které obsahovaly různé množství DNA (Obrázek 11). Kvalita izolované DNA byla ověřena pomocí PCR. Výsledky jsou uvedeny na Obrázku 12. Obrázek 11: Agarosová gelová elektroforéza různého množství DNA Nicotiana tabacum izolované metodou CTAB (bez použití a s použitím magnetických nosičů).
Objem separační směsi byl 250. Na gel bylo naneseno 20 µl DNA N. tabacum.
Běh
Purifikovaná DNA(ng/µl)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
standard 100 40 40 30 30 20 20 10 10 5 5 2,5 2,5
Množství DNA v separační směsi (ng)
1000 750 500 250 125 62,5
Po izolaci MN*
Detekce DNA
-
1 kbp žebříček +++
+ + + + + +
+++ +/+++ +/+++ +/+++ ++ ++ -
DNA detegována: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě;+/- velmi slabě; – nebyl detegována * MN- izolace DNA magnetickými nosiči.
44
DNA izolovaná metodou CTAB a zředěná na různé koncentrace byla detegována v bězích č. 2, 4, 6, 8, 9, 10 a 12. DNA izolovaná metodou CTAB zředěná na různé koncentrace a přečištěná pomocí magnetických nosičů byla velmi slabě detegována v bězích č. 5, 7 a 9.
Obrázek 12: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev.
Amlifikovány byly 4 µl DNA izolované z N. tabacum. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR.
Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Purifikovaná DNA (ng/µl) standard 10 10 5 5 2,5 2,5 1,25 1,25 0,625 0,625 0,3125 0,3125 PK NK
Po izolaci MN* + + + + + +
Produkt PCR 100 bp žebříček +++ ++ +++ ++ +++ + +++ + ++ + +++ -
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě;+/- velmi slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA) * MN- izolace DNA magnetickými nosiči. 45
Produkty PCR byly detegovány po amplifikaci ve všech vzorcích kromě běhů č. 11 a 13. Produkty PCR měli různou intenzitou v závislosti na výchozí koncentraci DNA. Nejnižší množství DNA reizolované pomocí magnetických nosičů a amplifikované v PCR za vzniku produktu PCR detegovatelného na gelu bylo 1,25 ng/µl.
5.2.2. Separace magnetických nosičů v mikrozkumavkách o objemu 500 µl Separace s objemem separační směsi 500 µl byla prováděna v mikrozkumavkách o stejném objemu dle postupu uvedeného v kapitole 4.2.6. Pro testování byla použita DNA izolované metodou CTAB z Nicotiana tabacum (bez použití a s použitím magnetických nosičů) a DNA izolována metodou přímé homogenizace s použitím magnetických nosičů. Na agarosový gel byly naneseny vzorky DNA (20 µl) o různých koncentracích bez použití magnetického nosiče a DNA izolovaná pomocí magnetických nosičů ze separačních směsí, které obsahovaly různé množství DNA. Dále byly na agarosový gel naneseny vzorky Nicotina tabacum, Brassica oleracea a Musa acuminata získané přímou homogenizací s použitím magnetických nosičů. Výsledky jsou uvedeny na Obrázku 13. Obrázek 13: Agarosová gelová elektroforéza různého množství DNA Nicotiana tabacum a DNA Nicotina tabacum, Brassica oleracea a Musa acuminata.
DNA N. tabacum byla izolována metodou CTAB bez použití a s použitím magnetických nosičů (objem separační směsi 500 µl) a DNA N. tabacum, B. oleracea a M. acuminata získaná přímou homogenizací s použitím magnetických nosičů. Na gel bylo naneseno 20 µl rostlinné DNA.
Běh 1 2 3 4 5 6 7 8
Purifikovaná DNA (ng/µl) standard 200 40 40 30 30 20 20
Množství DNA v separační směsi (ng)
2000 1500 1000
Po izolaci MN* + + +
Detekce DNA 1 kbp žebříček ??? +++ + +++ + +++ + 46
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
10 10 5 5 2,5 2,5 N. tabacum B. oleracea M. acuminata
500 250 125
+ + +
+++ +/++ ++ -
+ + +
++ ++ -
DNA detegována: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě;+/- velmi slabě; – nebyl detegována * MN- izolace DNA magnetickými nosiči.
DNA izolovaná metodou CTAB vyředěna na různé koncentrace byla detegována v bězích č. 2, 3, 5, 7, 9, 11 a 13. DNA izolovaná metodou CTAB, vyředěna na různé koncentrace a reizolována pomocí magnetických nosičů byla detegována v bězích č. 4, 6 a 8. DNA izolována metodou přímé homogenizace s následným přečištěním pomocí magnetických nosičů z N. tabacum a B. oleracea byla detegována v bězích č. 16 a 17.
5.2.3. Diskuse Pro testování podmínek separace DNA pomocí magnetických nosičů byla použita purifikovaná DNA získaná metodou CTAB. Cílem experimentů bylo navrhnout experimentální uspořádání magnetického separátoru pro menší objemy vzorku. Proto byl magnetický pás upraven tak, aby mohly být používány mikrozkumavky o objemu 200 a 500 µl. Během přečištění DNA dochází ke ztrátám magnetických nosičů. Výhoda použití menších objemů mikrozkumavek spočívá v tom, že magnetické nosiče jsou koncentrovány na menším prostoru a tím nedochází k jejich ztrátám. Izolace prováděné v objemu 250 µl byly uspěšné (Obrázek 12), ale vzhledem k malému objemu mikrozkumavek byla manipulace s nimi nepohodlná a množství izolované DNA bylo malé (Obrázek 11). Z těchto důvodů byly použity mikrozkumavky o objemu 500 µl, kde výše uvedené problémy byly odstraněny.
5.3. Testování účinnosti purifikace DNA pomocí magnetických nosičů v jednotlivých krocích metody CTAB DNA byla izolována dle postupu uvedeném v kapitole 4.2.3. Během izolace bylo v předem určených krocích odebráno 6 alikvotů dle postupu uvedeném v kapitole 4.2.3.1. Pro přípravu hrubých lyzátů buněk byly použity listy rostliny Spartina anglica.
47
5.3.1. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA izolované metodou CTAB Koncentrace izolované DNA a 10x zředěné DNA izolované metodou CTAB byla změřena proti TE pufru pomocí přístroje NanoPhotometr (Tabulka 12, Obrázek 14). Tabulka 12: Hodnoty koncentrace, celkové hmotnosti, absorbance a čistoty DNA izolované metodou CTAB Absorbance (nm) Poměry absorbancí cspekt. TE pufr mcelkem 260 nm/ 260 nm/ 230 260 280 (ng/µl) (µl) (ng) 280 nm 230 nm purifikovaná 249,1 50 12710 1,92 4,99 2,64 1,89 2,60 DNA purifikovaná DNA- 10x 25,97 90 2337,3 0,02 0,52 0,27 1,92 28,99 zředěná Obrázek 14: Absorpční spektrum 10x zředěné DNA izolované metedou CTAB.
Koncentrace purifikované 10x zředěné DNA byla 25,97 ng/µl. Poměr absorbancí 260 nm/ 280 nm byl 1,92. Lze konstatovat, že byla izolována DNA v kvalitě vhodné pro PCR.
48
5.3.2. Ověření amplifikovatelnosti DNA izolované magnetickými nosiči z alikvotů odebraných v pruběhu izolace DNA metodou CTAB Byla provedena izolace DNA z listů Spartina anglica dle postupu uvedeného v kapitole 4.2.3. Během izolace bylo v předem určených krocích odebráno 6 alikvotů dle postupu uvedeném v kapitole 4.2.3.1. a ty byly použity pro přečištění DNA pomocí magnetických nosičů. Pro srovnání byl vzorek DNA ze stejného alikvotu zředěn v EB pufru. DNA byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1. Do PCR směsi byly přidány 4 µl DNA. Amplifikoval se produkt délky 700 bp (Obrázek 15). Obrázek 15: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev.
Amplifikovány byly 4 µl DNA odebráné v průběhu izolace DNA metodou CTAB po zředění v EB pufru nebo po přečištění magnetickými nosiči. Běh
Alikvot
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
standard ♦1 ♦1 ♦2 ♦2 ♦3 ♦3 ♦4 ♦4 ♦5 ♦5 ♦6 ♦6 NK PK standard
Ředění DNA 100x 10x 10x 10x 10x 10x*** -
Přečištění DNA pomocí MN* + + + + + +
Produkt PCR 100 bp žebříček ++ ++ +++ +++ -** +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 100 bp žebříček 49
♦3
17
-
+
+++
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA) * MN- izolace magnetickými nosiči. ** při opakování PCR byl produkt PCR detegován zřetelně (běh č.17). *** alikvot byl zředěn v TE pufru.
DNA byla amplifikována ve všech alikvotech s různou intenzitou kromě alikvotu č.1 100x zředěného v EB pufru (bez přečištění magnetickými nosiči).
5.3.3. Diskuse DNA izolovaná metodou CTAB vykazovalo po spektrofotometrickém měření velice dobrou čistotu. Poměr absorbancí 260 nm/280 nm byl 1,92. Z obrázku 1 je zřejmé, že po 100 násobném vyředění alikvotu 1 nebyl produkt PCR detegován. Při použití magnetických nosičů lze DNA izolovat již po homogenizaci vzorku v kapalném dusíku a aplikaci CTAB.
5.4. Izolace rostlinné DNA homogenizací v kapalném dusíku (L-N2) Pro přípravu hrubých lyzátů buněk byly použity listy Nicotiana tabacum. Hrubé lyzáty byly připraveny dle postupu uvedeném v kapitole 4.2.4. Hrubý lyzát buněk z Nicotiana tabacum byl 100x zředěn v EB pufru a pro zjištění kvality izolované DNA byla provedena PCR. Výsledek je uveden na Obrázku 16- běh č.2.
DNA po zředění (100x) nebyla izolována v kvalitě vhodné pro PCR.
5.5. Izolace rostlinné DNA metodou přímé homogenizace (PH) Pro přípravu hrubých lyzátů buněk byly použity listy Nicotina tabacum. Hrubé lyzáty byly připraveny dle postupu uvedeném v kapitole 4.2.5. Hrubý lyzát buněk z Nicotiana tabacum byl 100x zředěn v EB pufru a pro zjištění kvality izolované DNA byla provedena PCR. Výsledek je uveden na Obrázku 16- běh č.4.
DNA po zředění (100x) byla izolována v kvalitě vhodné pro PCR.
50
5.6. Izolace DNA magnetickými nosiči s karboxylovými skupinami z hrubých lyzátů buněk různých rostlinných tkání připravených metodami homogenizací v kapalném dusíku a přímé homogenizace 5.6.1. Izolace DNA homogenizací v kapalném dusíku s následným přečištěním pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk Nicotiana tabacum pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox dle postupu uvedeného v kapitole 4.2.6. Pro zjištění kvality izolované DNA byla provedena PCR reakce. Výsledek je uveden na Obrázku 16- běh č.1.
DNA byla po použití magnetických nosičů izolovaná v kvalitě vhodné pro PCR.
5.6.2. Izolace DNA metodou přímé homogenizace s následným přečištěním pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk Nicotiana tabacum pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox dle postupu uvedeného v kapitole 4.2.6. Pro zjištění kvality izolované DNA byla provedena PCR reakce. Výsledek je uveden na Obrázek 16- běh č.3.
DNA byla po použití magnetických nosičů izolovaná v kvalitě vhodné pro PCR.
Obrázek 16: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev.
Amplifikovány byly 4 µl DNA z N. tabacum. Amplifikovaná DNA byla izolována homogenizací v kapalném dusíku nebo přímou homogenizací s následným přečistěním pomocí magnetických nosičů nebo 100x zředěním v EB pufru.
51
Běh
DNA
Ředění DNA
1 2 3 4 5 6 7
L-N2 L-N2 PH PH NK PK
100x 100x
Přečištění DNA pomocí MN* + + -
Produkt PCR ++ +++ ++ +++
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA) * MN- izolace magnetickými nosiči.
Produkty PCR s různou intenzitou byly detegovány po amplifikaci DNA z N. tabacum v bězích č. 1, 3 a 4.
5.6.3. Diskuse ke kapitolám 5.4., 5.5., 5.6.1. a 5.6.2. Vlastnosti použitého rostlinného materálu výrazně ovlivňují výběr izolačního postupu. Při použtí rostlinného materiálu, který je obsahuje pevná a tvrdá pletiva (např.: Spartina anglica) je použití tekutého dusíku k homogenizace tkáně nezbytné. Testovali jsme použití tekutého dusíku nebo metodu příme homogenizace k homogenizaci měkkých rostliných tkání (listy Nicotiana tabacum). Pokud má rostlinný materiál měkčí pletiva je lepší použít metodu přímé homogenizace. Odpadá použití kapalného dusíku, který nemusí být k dispozici v každé laboartoři. Dále bylo testováno použití magnetických nosičů na hrubé lyzáty buněk získané homogenizací v kapalném dusíku nebo pomocí přímé homogenizace. Pro kontrolu byly hrubé lyzáty buněk 100x zředěny v EB pufru. DNA izolována z hrubých lyzátů buněk získaných homogenizací v kapalném dusíku a 100x zředění v EB pufru nebyla v kvalitě vhodné pro PCR. DNA izolována z hrubých lyzátů buněk získaných homogenizací v kapalném dusíku s následným přečištěním pomocí magnetikých nosičů byla v kvalitě vhodné pro PCR. Po použití magnetických nosičů na hrubé lyzáty buněk získané pomocí přímé homogenizace byly detegován intenzivnější produkt PCR než po 100x zředění v EB pufru.
5.6.4. Testování amplifikovatelnosti DNA z různých rostlinných materiálů Pro amplifikaci byla použita DNA izolovaná metodou přímé homogenizace s nasledným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) a F-kol B 100 ox P(GMA) s karboxylovými skupinami dle postupu uvedeného v kapitole 4.2.6. Izolace byla opakována
52
2-5x. Byla provedena PCR pro specifickou oblast ITS1 s purifikovanou DNA izolovanou z různých rostlinných materiálů.
5.6.4.1. PCR s DNA Nicotiana tabacum 1095-55 DNA izolovaná z listů Nicotiana tabacum v 5 opakováních pomocí přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1 (Obrázek 17). Obrázek 17: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev. Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DNA standard N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum PK NK
Číslo izolace 1 2 3 4 5
Produkt PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ +++ +++ +++ -
Amlifikovány byly 4 µl DNA N. tabacum. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA)
DNA N. tabacum izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů se amplifikovala. Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA N. tabacum ze všech izolacích.
5.6.4.2. PCR s DNA Brassica oleracea DNA izolovaná z dužnatých stonků s růžicememi Brassica oleracea pomocí přímé homogenizace s následným použití magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1 (Obrázek 18).
53
Obrázek 18: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev. Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DNA standard B. oleracea B. oleracea B. oleracea B. oleracea B. oleracea PK NK
Číslo izolace 1 2 3 4 5
Produkt PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ +++ +++ +++ -
Amlifikovány byly 4 µl DNA B. oleracea. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA)
DNA B. oleracea izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů se amplifikovala. Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA B. oleracea ze všech izolacích.
5.6.4.3. PCR s DNA Musa acuminata DNA izolovaná z plodů Musa acuminata pomocí přímé homogenizace s následným použití magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1 (Obrázek 19). Obrázek 19: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev. Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DNA standard M. acuminata M. acuminata M. acuminata M. acuminata M. acuminata PK NK NK2
Číslo izolace 1 2 3 4 5
Produkt PCR 100 bp žebříček ++ ++ +++ ++ ++ +++ 54
Amlifikovány byly 4 µl DNA M. acuminata. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA) NK2 … negativní kontrola ( izolace pomocí magnetických nosičů bez DNA)
DNA M. acuminata izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů se amplifikovala. Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA M. acuminata z izolací č. 1,2,4 a 5. Produkt PCR s intenzitou vyšší byl detekován po amplifikaci DNA M. acuminata z izolace č.3.
5.6.4.4. PCR s DNA Brassica oleracea var. capitata, Cucumis sativus a Allium cepa DNA izolovaná z listů Brassica oleracea var. capitata, plodů Cucumis sativus a cibule Allium cepa pomocí přímé homogenizace s následným použití magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1 (Obrázek 20). Obrázek 20: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev. Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DNA standard B. oleracea v. capitata B. oleracea v. capitata C. sativus C. sativus A. cepa A. cepa PK NK
Číslo izolace 1
Produkt PCR 100 bp žebříček +++
2
+++
1 2 1 2
++ ++ +++ +++ +++ -
Amlifikovány byly 4 µl DNA B. oleracea var. capitata, C. sativus a A. cepa. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA) 55
DNA B. oleracea var. capitata, C. sativus a A. cepa izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů se amplifikovala. Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA z B. oleracea var. capitata a A. cepa ze všech izolací. Po amplifikaci DNA z C. sativus byly detegovány produkty PCR o menší intenzitě.
5.6.4.5. Srovnání magnetických nosičů nosičů F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) a F-kol B 100 ox P(GMA) PCR s DNA Nicotiana tabacum 1095-55 DNA izolovaná z listů Nicotiana tabacum v 2 opakováních pomocí přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox a F-kol B 100 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1 (Obrázek 21). Obrázek 21: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev.
Amlifikovány byly 4 µl DNA N. tabacum. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Běh 1 2 3 4 5
DNA standard N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum
Číslo izolace
Nosiče
1 2 1 2
F-kol 135 ox F-kol 135 ox F-kol B 100 ox F-kol B 100 ox
Produkt PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ +++
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA) 56
DNA N. tabacum izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox a F-kol B 100 ox se amplifikovala. Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA z N. tabacum ze všech izolací.
5.6.4.6. Diskuse Izolace DNA metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox byla úspěšně provedena u všech testotovaných vzorků (Obrázky: 17 - 20). Můžeme pozorovat rozdíly v intenzitách produktů PCR mezi jednotlivýcmi vzorky v zavislosti na použité části rostliny. U vzorků, kde byl použit plod jako zdrojový materiál k izolaci DNA (Musa acuminata a Cucumis sativus), byla zjištěna slabší intenzita produků PCR než u vzorků, kde byly použity listy jako zdrojový materiál k izolaci DNA (Nicotiana tabacum, Brassica oleracea, Brassica oleracea var. capitata). Dále byla testována účinnost izolace DNA pomocí magnetických nosičů F-kol B 100 ox. Na obrázku 21 můžeme vidět, že intezita produktů PCR po izolaci DNA magnetickými nosiči F-kol 135 ox a magnetickými nosiči F-kol B 100 ox byla přibližně stejná.
5.6.5. Testování amplifikovatelnosti DNA z různých potravin rostlinného původu Pro amplifikaci byla použita DNA izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox P(HEMA-co-GMA) a F-kol B 100 ox P(GMA) dle postupu uvedeného v kapitole 4.2.6. Izolace byla opakována 2-3x. Byla provedena PCR s primery 18S_for a 5,8S_rev a dále s primery 26S_for a 26S_ rev. Byla použita purifikovaná DNA izolovaná z různých potravin rostlinného původu.
5.6.5.1. PCR s primery 18S_ for a 5,8S_rev s DNA izolovanou magnetickými nosiči F-kol 135 ox z různých potravin rostlinného původu DNA izolovaná z různých potravin rostlinného původu (Tabulka 13) pomocí přímé homogenizace s následným použití magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1 (Obrázek 22). Tabulka 13: Použitý rostlinný materiál a jeho technologická úprava Část rostliny/ Technologická Potravina Rostlina potraviny úprava čerstvá řepa Beta vulgaris kořen čerstvá sterilovaná řepa Beta vulgaris kořen sterilizace, naložená mražený špenát Spinacia list mražený sušené sojové boby Glycina soja odtučněná sójová mletí, vysokotlaká extruze mouka Zea mays zrno/kukuřičný vaření, sušení, lisování, kukuřičné lupínky lupínek pečení 57
85% čokoláda sterilované olivy pšenično-žitnéhý chléb
Theobroma cacao Olea europaea Tritium, Secale
semeno/čokoláda plod střídka
sušení, pražení,drcení, mletí, lisovaní, konšování sterilizace mletí, pečení
Obrázek 22: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev.
Amlifikovány byly 4 µl DNA z různých potravin rostlinného původu (Tabulka 13). Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 15 16 17 18 19 20 21 22
DNA Standard B. vulgaris B. vulgaris B. vulgaris sterilovaná B. vulgarit sterilovaná Spinacia Spinacia G. soja G. soja Z. mays Z. mays T. cacao T. cacao PK NK Standard O. europaea O. europaea O. europaea pšenično-žitnéhý chléb pšenično-žitnéhý chléb
Číslo izolace 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
Produkt PCR 100 bp žebříček +++ +++ ++ ++ + + -
1 2 3 1 2
+++ 100 bp žebříček 58
23 24 25 26
pšenično-žitnéhý chléb PK NK
3
+++ -
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA)
DNA B. vulgaris, Spinacia a Z. mays izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox se amplifikovala. Produkty PCR různé intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA z B.vulgaris, Spinacia a Z.mays ze všech izolací.
5.6.5.2. PCR s primery 26_ for a 26_rev s DNA izolovanou magnetickými nosiči F-kol 135 ox z různých potravin rostlinného původu DNA izolovaná z různých potravin rostlinného původu (Tabulka 14) pomocí přímé homogenizace s následným použití magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována s primery 26S_for a 26S_rev (Obrázku 23). Tabulka 14: Použitý rostlinný materiál a jeho technologická úprava Část rostliny/ Technologická Potravina Rostlina potraviny úprava čerstvá řepa Beta vulgaris kořen čerstvá sterilovaná řepa Beta vulgaris kořen sterilizace, naložená mražený špenát Spinacia list mražený sušené sojové Glycina soja odtučněná sójová mletí, vysokotlaká extruze boby mouka kukuřičné lupínky Zea mays zrno/kukuřičný vaření, sušení, lisování, lupínek pečení 85% čokoláda Theobroma semeno/čokoláda sušení, pražení,drcení, cacao mletí, lisovaní, konšování
59
Obrázku 23: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 26S_for a 26S_rev.
Amlifikovány byly 4 µl DNA z různých potravin rostlinného původu (Tabulka 14). Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
DNA standard B. vulgaris B. vulgaris B. vulgaris sterilovaná B. vulgaris sterilovaná Spinacia Spinacia G. soja G. soja Z. mays Z. mays T. cacao T. cacao
Číslo izolace 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
produkt PCR 100 bp žebříček +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ + +
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA)
DNA B. vulgaris, B. vulgaris (sterilovaná), Spinacia, G. soja, Z. mays a T. cacao izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox se amplifikovala. Produkty PCR různé intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA ze všech izolací.
60
5.6.5.3. PCR s primery 18S_ for a 5,8S_rev s DNA izolovanou magnetickými nosiči F-kol B 100 ox z různých potravin rostlinného původu DNA izolovaná z různých rostlin a potravin rostlinného původu (Tabulka 15) pomocí přímé homogenizace s následným použití magnetických nosičů F-kol B 100 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1 (Obrázek 24). Tabulka 15: Použitý rostlinný materiál a jeho technologická úprava Část rostliny/ Technologická Potravina Rostlina potraviny úprava brokolice Brassica oleracea dužnatý stonek s čerstvá růžicemi banán Musa acuminata plod čerstvá mražený špenát Spinacia list mražený kukuřičné lupínky Zea mays zrno/kukuřičný vaření, sušení, lisování, lupínek pečení
Obrázek 24: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev.
Amlifikovány byly 4 µl DNA z různých potravin rostlinného původu (Tabulka 15). Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DNA standard B. oleracea B. oleracea M. acuminata M. acuminata Spinacia Spinacia Z. mays Z. mays
Číslo izolace 1 2 1 2 1 2 1 2
Produkt PCR 100 bp žebříček +++ +++ ++ ++ ++ 61
10 11 12
PK NK
+++ -
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; +/- velmi slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA)
DNA B. oleracea, Spinacia a Z. mays izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol B 100 ox se amplifikovala. Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA z B. oleracea ze všech izolací. Produkty PCR nebyly detegovány po amplifikaci DNA z M. acuminata. Produkt PCR byl detegován po amplifikaci DNA ze Spinacia z izolace č.2. Produkty PCR různé intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA ze Z. mays ze všech izolací.
5.6.5.4. Diskuse Z různých potravin rostlinného původu byla provedena izolace DNA metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox. Pro výrobu testovaných potravin byly použity různé technologické procesy (sterilizace: Beta vulgaris a Olea europaea; mražení: Spinacia; mletí, vysokotlaká extruze: Glycina soja, vaření, sušení, lisování, pečení: Zea mays; sušení, pražení, drcení, mletí, lisovaní, konšování: Theobroma cacao; mletí, pečení: Tritium, Secale). Podmínky technologických procesů výroby potravin mohou vést k fragmentaci DNA. Na Obrázku 6 lze spatřit, že amplifikace DNA s primery 18S_for 5,8S_rev s produktem PCR o velikosti 700 bp proběhla jen u čerstvé červené řepy, mraženého špenátu a kukuřičných lupínků. Intenzita produktu se u jednotlivých vzorků lišila. U zbylých vzorků proběhla pravděpodobně fragmentace DNA během výroby potraviny. Proto byl pokus opakován s primery 26S_for a 26S_rev s produktem PCR o velikosti 220 bp (Obrázek 23). Při použití primerů 26S_for a 26S_rev se amplifikoval produkt PCR různé intenzity o velikosti 220 bp u všech vzorků. Kratší úseky DNA byly tedy amplifikovány. Dále byly testovány magnetické nosiče F-kol B 100 ox k izolaci DNA z různých rostlin a potravin rostlinného původu. Na Obrázku 24 lze pozorovat, že amplifikace s primery 18S_for a 5,8S_rev s produktem PCR o velikosti 700 bp proběhla u vzorků Brassica oleracea, Spinacia a Zea mays (izolace č.2). Byly detegovány produkty PCR různé intenzity. Produkty PCR po amplifikaci DNA Musa acuminata nebyly detegovány. Při izolaci DNA z Musa acuminata pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox byl produkt PCR detegován. Tento rozdíl mezi nosiči při izolaci DNA zřejmě závisí na funkcionalizaci nosičů. V případě nosičů F-kol 135 ox bylo izolováno více DNA než pomocí nosičů F-kol B 100 ox, neboť nosiče Fkol 135 ox mají více karboxylových skupin.
62
5.6.6. Optimalizace izolace DNA metodou přímé homogenizace s následným přečištěním pomocí magnetickými nosiči F-kol 135 ox z rostlinných materiálů 5.6.6.1. Doba eluce DNA z nosičů do TE pufru DNA izolovaná z listů Nicotiana tabacum pomocí přímé homogenizace a následným přečištěním pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1. Byla testována doba eluce DNA z nosičů do TE pufru v rozmezí 15 – 60 min. Výsledky jsou uvedeny na Obrázku 25. Obrázku 25: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev.
Amlifikovány byly 4 µl DNA N. tabacum, u kterých se lišila doba eluce DNA z nosičů do TE pufru. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR. Běh
DNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
standard N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum PK NK
Číslo izolace 1 2 1 2 1 2 1 2
Eluce DNA (min) 15 15 30 30 45 45 60 60
Produkt PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ -
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA) 63
Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA z N. tabacum ve všech vzorcích. Doba eluce neměla výraznější vliv na množství izolované DNA. Rozdíl mezi elucí do TE pufru 15 min a elucí 60 min byl nevýznamný.
5.6.6.2. Doba pusobení CTAB na hrubé lyzáty buněk během inkubace při 60 °C DNA izolovaná z listů Nicotiana tabacum pomocí přímé homogenizace a následným přečištěním pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1. Byla ověřována doba působení CTAB na hrubé lyzáty buněk během inkubace při 60 °C v rozmezí 5 – 30 min. Výsledky jsou uvedeny na Obrázku 26. Obrázku 26: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev.
Amlifikovány byly 4 µl DNA N. tabacum, u kterých se lišila doba působení CTAB na hrubé lyzáty buněk během inkubace při 60 °C. Na gel bylo naneseno 10 µl produktu PCR.
Běh
DNA
1 2 3 4 5 6 7
standard N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum N. tabacum
Působení CTAB (min) 5 10 15 20 25 30
Produkt PCR 100 bp žebříček +++ +++ +++ +++ +++ +++ 64
8 9 10
PK NK
+++ -
Produkt PCR detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován PK … pozitivní kontrola NK … negativní kontrola (bez DNA)
Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA z N. tabacum ve všech vzorcích. Doba působení CTAB na hrubé lyzáty buněk během inkubace při 60 °C neměla výraznější vliv na množství izolované DNA. Rozdíl mezi působením CTAB 5 min a 30 min byl nevýznamný.
5.6.6.3. Diskuse Izolace DNA metodou přímé homogenizace s následným přečištěním pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox byla úspěšně použita na různé rostlinné materiály. Naší snahou bylo tuto metodu urychlit. Byla testováná doba eluce DNA do TE pufru (Obrázek 25) a doba působení CTAB na hrubý lyzát buněk (Obrázek 26). Z obrázků je zřejmé, že doba eluce DNA do TE pufru může být zkrácena z 60 min. na 15 min a doba působení CTAB na hrubé lyzáty buněk může být zkrácena z 30 min. na 5 min.
5.6.7. Polymerázová řetězová reakce v reálném čase pro různé typy vzorků Kvantifikace DNA izolované pomocí magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA) a P(GMA) z různých typů vzorků byla provedena pomocí PCR v reálném čase za využití primerů 26S_for a 26S_rev dle postupu uvedeného v kapitole 4.2.9. Amplifikační křivky DNA standardtů jsou uvedeny na Obrázku 27- A. Kvantifikace byla provedena metodu absolutní kvantifikace na základě kalibrační křivky (rozsah 100 ng/µl – 0,01 ng/µl) (Tabulka 16) sestrojené pomocí programu Applied Biosystems za použití DNA Nicotiana tabacum (Obrázek 27- B). Výsledky kvantifikace v PCR v reálném čase jsou uvedeny v Tabulkách 17 a 18. Srovnání magnetických nosičů v množství izolované DNA je uvedeno v Tabulce 19. Tabulka 16: Koncentrace DNA standartů použitých pro sestrojení kalibrační křivky DNA standart
cDNA (ng/µl)
1
100,00
2
10,00
3
1,00
4
0,10
5
0,01 65
Obrázek 27: Amplifikační křivky DNA standartů (A), Kalibrační křivka (B).
log c0…. logaritmus množství templátové DNA Tabulka 17: Výsledky kvantifikace DNA izolované z různých vzorků s použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox Vzorek tabák tabák tabák
Ct 15,6 15,3 15,8
brokolice brokolice brokolice
15,8 15,8 15,6
cibule cibule cibule
17,1 16,4 16,6
zelí zelí zelí
16,9 16,9 17,2
špenát mražený špenát mražený špenát mražený
20,5 19,2 20,6
S.d. 0,3
DNA (ng) 2,0780 2,4530 1,7300
0,1
1,7666 1,8020 2,0359
0,3
0,7515 1,1437 1,0143
0,2
0,8311 0,8153 0,6907
0,7
0,0734 0,1730 0,0710
Průměr (ng) 2,0871
1,8682
0,9698
0,7790
0,1058
S.d.
Tm
0,3620
79,4 79,4 79,1
0,1460
0,2000
0,0769
0,0582
79,9 79,9 80,2 79,4 79,1 79,1 80,2 80,2 80,2 79,6 79,6 79,6 66
kukuričné lupínky kukuričné lupínky kukuričné lupínky
22,2
0,0237 0,1
22,1
0,0254
80,5 0,0235
0,0021
80,5
22,3
0,0213
80,5
22,7 22,6 23,0
0,2
0,0167 0,0184 0,0135
79,6 79,6 79,9
0,4
0,0124 0,0128 0,0210
0,3
0,0032 0,0034 0,0045
0,3
0,0007 0,0008 0,0005
0,3
0,0003 0,0003 0,0002
0,2
0,0001 0,0001 0,0001
řepa čerstvá řepa čerstvá řepa čerstvá okurka okurka okurka banán banán banán
23,1 23,1 22,4
soja soja soja
27,4 27,2 27,8
olivy olivy olivy
28,9 28,7 29,3
chléb chléb chléb
30,3 29,9 30,0
řepa steril. repa steril. repa steril. čokoláda čokoláda čokoláda
Undetermined Undetermined Undetermined
80,2 80,2 69,4
Undetermined Undetermined Undetermined
69,4 69,4 69,4
25,2 25,1 24,6
0,0162
0,0154
0,0037
0,0007
0,0002
0,0001
0,0025
0,0048
0,0007
0,0001
0,0001
0,0000
79,9 79,6 79,6 79,4 79,4 79,4 79,6 79,4 79,4 79,9 79,6 79,6 79,4 79,6 79,6
Tabulka 18: Výsledky kvantifikace DNA izolované z různých vzorků s použitím magnetických nosičů F-kol B 100 ox Vzorek brokolice brokolice brokolice špenát mražený špenát mražený špenát mražený
Ct 20,7 20,7 24,7 18,4 19,2 19,4
S.d. 2,3
0,5
DNA (ng) 0,4908 0,4639 0,0184 0,3211 0,2391 0,1456
Průměr (ng)
S.d.
0,3244
0,2650
0,2353
0,0878
Tm 80,5 80,5 79,4 79,6 79,9 79,6 67
kukuričné lupínky kukuričné lupínky kukuričné lupínky banán
23,1
0,0655
80,5
27,6
0,0017
79,6
banán
27,4
banán
27,4
23,3 23,2
0,0569 0,1
0,1
0,0622
0,0021
80,8 0,0615
0,0019
0,0043
0,0002
0,0020
80,5
79,6 79,1
Tabulka 19: Srovnání magnetických nosičů v množství izolované DNA DNA(ng) Vzorek Použité magnetické nosiče 1,8682 brokolice F-kol 135 ox 0,3244 brokolice F-kol B 100 ox 0,1058 špenát mražený F-kol 135 ox 0,2353 špenát mražený F-kol B 100 ox 0,0235 kukuřičné lupínky F-kol 135 ox 0,0615 kukuřičné lupínky F-kol B 100 ox 0,0037 banán F-kol 135 ox 0,0019 banán F-kol B 100 ox
5.6.7.1. Diskuse Izolovaná DNA pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox a F-kol B 100 ox byla v kvalitě a množství vhodném pro PCR v reálném čase s výjímkou DNA izolované ze sterilované červené řepy a z čokolády. Porovnáním výsledku PCR v reálném čase a konvenční PCR můžeme říct, že dosažené výsledky se shodují. Gelová elektroforéza produktů konvenční PCR odpovída množství DNA stanovené pomocí PCR v reálném čase. Množství DNA získáné z čerstvého rostlinného materiálu je výrazně větší než u rostliného materiálu, který byl technologicky zpracován. Množství DNA izolované pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox a F-kol B 100 ox se lišilo (Tabulka 19).
5.6.8. Bioinformační analýza 5.6.8.1. Ověření přítomnosti specifické DNA v amplikonu Purifikovaná DNA z Brassica oleracea HDEM, Brassica oleracea RC, Brassica oleracea C10 a DNA izolovaná z dužnatých stonků s růžicememi Brassica oleracea a Brassica oleracea var. capitata pomocí přímé homogenizace s následným přečištěním pomocí magnetických nosičů F-kol 135 ox byla amplifikována se specifickými primery 18S_for a 5,8S_rev pro oblast ITS1 (Obrázek 28).
68
Obrázek 28: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) s primery 18S_for a 5,8S_rev. Běh 1 2 3 4 5 6 7
DNA B. oleracea HDEM B. oleracea RC B. oleracea C10 B. oleracea B.oleracea v. capitata NK
Produkt PCR +++ +++ +++ +++ +++ -
Amlifikovány byly 4 µl DNA B. oleracea HDEM, B. oleracea RC, B. oleracea C10, B. oleracea a B. oleracea var. capitata . Na gel byly naneseny 4 µl produktu PCR. PCR produkt detegován: +++ silně; ++ zřetelně; + slabě; – nebyl detegován NK … negativní kontrola (bez DNA)
Produkty PCR přibližně stejné intenzity byly detegovány po amplifikaci DNA B. oleracea.
5.6.8.2. Restrikční analýza produktů PCR Brassica oleracea HDEM, Brassica oleracea RC, Brassica oleracea C10, Brassica oleracea (vzorek A) a Brassica oleracea var. capitata (vzorek B) S produkty PCR byla provedena restrikční analýza amplikonu 18S-ITS1-5.8S Brassica oleracea (Obrázek 29) s enzymy BstNI a EcoRV dle postupu uvedeného v kapitole 4.6.10. Výsledek restrikční analýzy je uveden na Obrázku 30. Na Obrázcích 31 a 32 jsou uvedeny teoretické výsledky restrikční analýzy.
69
Obrázek 29: Sekvence amplikonu 18S-ITS1-5.8S Brassica oleracea
70
Obrázek 30: Agarosová gelová elektroforéza produktů PCR (700 bp) po restrikčním štěpení enzymy BstNI a EcoRV.
Štěpeno bylo 5 µl produktů PCR B. oleracea HDEM, B. oleracea RC, B. oleracea C10, B. oleracea (vzorek A) a B. oleracea var. capitata (vzorek B). Na gel bylo naneseno 20 µl restrikční směsi.
Běh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
DNA neštěpená DNA Vzorek A Vzorek A Vzorek B Vzorek B B.oler.C10 B.oler.C10 B.oler.RC B.oler.RC B.oler.HDEM B.oler.HDEM standard
Produkt (kbp)
Enzym EcoRV
BstNI
-
-
-
+ + + + + -
+ + + + +
++ ++ ++ ++ ++ -
0,1
0,35 -
0,5
0,7
-
+
+ ++ + ++ + ++ + ++ + ++ 100 bp žebříček
-
Po štěpení produktu PCR (0,7 kb) ze všech DNA enzymem EcoRV vznikl 1 fragment o přibližné velikosti 0,5 kb a 2 fragmenty o přibližné velikosti 0,1 kb. Po štěpení produktu PCR (0,7 kb) ze všech DNA enzymem BstNI vznikli celkem 2 fragmenty o přibližné velikosti 0,35 kb. 71
Obrázek 31: Teoretický výsledek restrikční analýzy amplikonu 18S-ITS1-5.8S Brassica oleracea po restrikčním štěpení produktů PCR (700 bp) enzymem BstNI.
Obrázek 32: Teoretický výsledek restrikční analýza amplikonu 18S-ITS1-5.8S Brassica oleracea po restrikčním štěpení produktů PCR (700 bp) enzymem EcoRV.
72
5.6.8.3. Diskuse DNA izolovaná metodou přímé homogenizace s následným použitím magnetických nosičů F-kol 135 ox je v kvalitě vhodné pro restrikční analýzu. Produkty PCR nemuseli být před použitím restrikčních enzymů přečištěny. Získané experimentální výsledky (Obrázek 30) se shodují s teoretickými výsledky restrikční analýzy (Obrázky 31 a 32). Dále bylo restrikční analýzou potvrzeno, že izolovaná DNA náleží druhu Brassica oleracea.
73
6. ZÁVĚR Srovnání použitých metod dle různých hledisek je uvedeno v Tabulce 20. Komerční kit Quiagen DNA easy kit poskytuje relativně rychlou izolaci DNA s výslednou koncentrací DNA 10 – 35 ng/µl. Nevýhodou této metody je cenová náročnost okolo 120 Kč za vzorek a opakující se centrifugace. Klasická metoda CTAB je časově náročná, proces extrakce zahrnuje několik centrifugací a inkubací, vyžaduje práci se škodlivými látkami a je potřeba k izolaci větší množství vzorku. Na druhou stranu množství izolované DNA je z použitých metod nejvyšší. Kombinace přímé homogenizace s magnetickými nosiči poskytuje rychlou a snadnou izolaci DNA v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, PCR v reálném čase a restrikční analýzu. Výhodou této metody je její rychlost, cenová dostupnost a nenáročnost na vybavení laboratoře. V práci byl vypracován postup izolace DNA z různých rostlinných tkání a potravin rostlinného původu. Postup lze shrnout následovně: Požadované množství rostlinného materiálu bylo odváženo a přeneseno do 1,5 ml mikrozkumavky. Do mikrozkumavky s rostlinným materiálem bylo přidáno 300 µl lyzačního roztoku CTAB a 5 µl β – merkaptoethanolu. Pomocí kopistu byla provedena homogenizace tkáně a poté bylo k suspenzi přidáno 700 µl lyzačního roztoku CTAB. Suspenze byla řádně promíchána a inkubována při 60 °C po dobu 5 min. Z takto připraveného hrubého lyzátu buněk byla provedena izolace DNA magnetickými nosiči. Doba eluce DNA do TE pufru byla 15 min. Vzorky byly uchovávány při -20 °C, aby se předešlo možné degradaci. Tabulka 20: Srovnání použitých metod Cena Časová Metoda
Pracnost *
vzorku
náročnost
Quiagen DNA easy kit CTAB Přímá homogenizace Magnetické nosiče
Množství výchozího
cspekt.
vzorku
(ng/µl)
(Kč)
(mg)
Amplifikovatelnost Restrikční konvenční PCR
qPCR
analýza
< 1 hod.
2
120 Kč
100
10-35
+
+
+
> 3 hod.
4
10-15 Kč
100 - 500
250
+
+
+
15 min.
1
< 10 Kč
80
-
+
+
+
40 min.
1
< 10 Kč
-
-
+
+
+
< 1 hod.
1
< 10 Kč
80
-
+
Přímá homogenizace +
+
+
magnetické nosiče
* 1 – nejméně náročný postup, 5 – nejvíce náročný postup
74
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. LUTZ, K. A., W. WANG, A. ZDEPSKI a T. P. MICHAEL. Isolation and analysis of high quality nuclear DNA with reduced organellar DNA for plant genome sequencing and resequencing. BMC Biotechnology. 2011, roč. 11, č. 1, s. 54-. ISSN 1472-6750. DOI: 10.1186/1472-6750-11-54. Dostupné z: http://www.biomedcentral.com/1472-6750/11/54 2. SYED, A. M., G. M. MASOOD, Q. H. PERVAIZ, V. VIJESHVER, B. F. SEEMI a Q. N. GHULUM. RAPID DNA ISOLATION PROTOCOL FOR ANGIOSPERMIC PLANTS. BULG. J. PLANT PHYSIOL. 2004, roč. 30, č. 2, s. 25-33. 3. HORÁK, D., B. RITTICH a A. ŠPANOVÁ. Carboxyl-functionalized magnetic microparticle carrier for isolation and identification of DNA in dairy products. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2007, roč. 311, č. 1, s. 249-254. ISSN 03048853. DOI: 10.1016/j.jmmm.2006.10.1157. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0304885306025418 4. PEČOVÁ, M., L. ZAJONCOVÁ, K. POLÁKOVÁ, J. ČUDA, M. ŠAFAŘÍKOVÁ, M. ŠEBELA a I. ŠAFAŘÍK. Biologicky aktivní látky imobilizované na magnetických nosičích a jejich v biochemii a biotechnologii. Chemické Listy. 2011, roč. 105, č. 7, s. 524-530. 5. HORÁK, D. a N. BENEDYK. Magnetic poly(glycidyl methacrylate) microspheres prepared by dispersion polymerization in the presence of electrostatically stabilized ferrofluids. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 2004-11-15, roč. 42, č. 22, s. 5827-5837. ISSN 0887-624x. DOI: 10.1002/pola.20406. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/pola.20406 6. KHANUJA, S. P. S., A. K. SHASANY, M. P. DAROKAR a S. KUMAR. Rapid isolation of DNA from dry and fresh samples of plants producing large amounts of secondary metabolites and essential oils. Plant Molecular Biology Reporter. 1999, roč. 17, č. 1, s. 74-74. ISSN 07359640. DOI: 10.1023/A:1007528101452. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1023/A:1007528101452 7. SAHU, S. K., M. THANGARAJ a K. KATHIRESAN. DNA Extraction Protocol for Plants with High Levels of Secondary Metabolites and Polysaccharides without Using Liquid Nitrogen and Phenol. ISRN Molecular Biology. 2012, roč. 2012, s. 1-6. ISSN 2090-7907. DOI: 10.5402/2012/205049. Dostupné z: http://www.hindawi.com/isrn/mb/2012/205049/ 8. WARUDE, D., P. CHAVAN, K. JOSHI a B. PATWARDHAN. DNA isolation from fresh, dry plant samples with highly acidic tissue extracts. Plant Molecular Biology Reporter. 2003, roč. 21, č. 4, s. 467-467. ISSN 0735-9640. DOI: 10.1007/BF02772600. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/BF02772600 9. DEHESTANI, A. a S. K. KAZEMI TABAR. A rapid efficient Metod for DNA islotaion from plants with high levels of secondary metabolites. Asian Journal of Plant Sciences. 2007, roč. 6, s. 977-981. ISSN 1682-3974
75
10. ZHANG, L., B. WANG, L. PAN a J. PENG. Recycling isolation of plant DNA, a novel method. Journal of Genetics and Genomics. 2013, roč. 40, č. 1, s. 45-54. ISSN 16738527. DOI: 10.1016/j.jgg.2012.10.001. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1673852712001920 11. GUILLEMAUT, P. a L. MARÉCHAL-DROUARD. Isolation of plant DNA: A fast, inexpensive, and reliable method. Plant molecular biology reporter. 1992, roč. 10, č. 1, s. 60-65. ISSN 1572-9818. DOI: 10.1007/BF02669265. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/BF02669265 12. POREBSKI, S., L. G. BAILEY a B. R. BAUM. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter. 1997, roč. 15, č. 1, s. 8-15. ISSN 0735-9640. DOI: 10.1007/BF02772108. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/BF02772108 13. ADAMS, R. P. a N. DO. A simple technique for removing plant polysaccharide contaminants from DNA. BioTechniques. 1991, roč. 10, č. 2. 14. KUMAR MISHRA, M., N. S. RANI, A. S. RAM, H.L. SREENATH a JAYARAMA. A simple method of DNA extraction from coffee seeds suitable for PCR analysis. African journal of biotechnology. 2008, roč. 7, č. 4, s. 409-413. ISSN 1684-5315 15. MOYO, M., S. O. AMOO, M. W. BAIRU, J. F. FINNIE a J. VAN STADEN. Optimising DNA isolation for medicinal plants. South African Journal of Botany. 2008, roč. 74, č. 4, s. 771-775. ISSN 02546299. DOI: 10.1016/j.sajb.2008.07.001. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0254629908002640 16. PETERSON, D. G., K. S. BOEHM a S. M. STACK. Isolation of milligram quantities of nuclear DNA from tomato (Lycopersicon esculentum), A plant containing high levels of polyphenolic compounds. Plant Molecular Biology Reporter. 1997, roč. 15, č. 2, s. 148153. ISSN 0735-9640. DOI: 10.1007/BF02812265. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/BF02812265 17. RIBEIRO, R. A. a M. B. LOVATO. Comparative analysis of different DNA extraction protocols in fresh and herbarium specimens of the genus Dalbergia. Genet. Mol. Res. 2007, roč. 6, č. 1, s. 173-187. 18. GOLDENBERGER, D., I. PERSCHIL a M. RITZLER. A simple “universal” DNA extraction procedure using SDS and proteinase K is compatible with directly PCR amplification. Genome Res. 1995, roč. 4, s. 368-370. 19. VINOD, K. K. Total genomic dna extraction quality check and quantitation. Presented in the training programme on “Classical and modern plant breeding techniques – A hands on training”. Centre for Advanced Studies on Genetics and Plant Breeding, Tamil Nadu Agricultural University, Coimbatore. Nov 1-21, 2004. 20. BRUCE, I. J., J. TAYLOR, M. TODD, M. J. DAVIES, E. BORIONI, Claudio SANGREGORIO a Tapas SEN. Synthesis, characterisation and application of silicamagnetite nanocomposites. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2004, roč. 76
284, s. 145-160. ISSN 03048853. DOI: 10.1016/j.jmmm.2004.06.032. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0304885304006973 21. SAIYED, Z. M., C. BOCHIWAL, H. GORASIA, S. D. TELANG a C. N. RAMCHAND. Application of magnetic particles (Fe3O4) for isolation of genomic DNA from mammalian cells. Analytical Biochemistry. 2006, roč. 356, č. 2, s. 306-308. ISSN 00032697. DOI: 10.1016/j.ab.2006.06.027. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0003269706004519 22. AGUILAR-ARTEAGA, K., J. A. RODRIGUEZ a E. BARRADO. Magnetic solids in analytical chemistry: A review. Analytica Chimica Acta. 2010, roč. 674, č. 2, s. 157-165. ISSN 00032670. DOI: 10.1016/j.aca.2010.06.043. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0003267010008366 23. BERGEMANN, C., D. MÜLLER-SCHULTE, J. OSTER, L. BRASSARD a A. S LÜBBE. Magnetic ion-exchange nano- and microparticles for medical, biochemical and molecular biological applications. DOI: 10.1016/S0304-8853(98)00554-X.Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S030488539800554X 24. MCBAIN, S. C., H. H. P. YIU a J. DOBSON. Magnetic nanoparticles for gene and drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 2008, č. 3, s. 169-180 25. ŠPANOVÁ, A., B. RITTICH, M. J. BENEŠ a D. HORÁK. Ferrite supports for isolation of DNA from complex samples and polymerase chain reaction amplification. Journal of Chromatography A. 2005, roč. 1080, č. 1, s. 93-98. ISSN 00219673. DOI: 10.1016/j.chroma.2005.05.006. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967305009489 26. HORÁK, D., M. BABIČ, H. MACKOVÁ a M. J. BENEŠ. Preparation and properties of magnetic nano- and microsized particles for biological and environmental separations. Journal of Separation Science. 2007, roč. 30, č. 11, s. 1751-1772. ISSN 16159306. DOI: 10.1002/jssc.200700088. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jssc.200700088 27. ŠÁLEK, P.. Příprava a charakterizace magnetických nosičů z hypersíťovaných polystyrenových mikročástic a jejich použití v biosenzoru. Praha, 2012. 39 s. Zkrácená verze dizertační práce na Fakultě chemické VUT Brno na Ústavu materálů. Vedoucí práce Ing. Daniel Horák, CSc. 28. TARTAJ, P., M. P. MORALES, T. GONZÁLEZ-CARREÑO, S. VEINTEMILLASVERDAGUER a C. J. SERNA. Advances in magnetic nanoparticles for biotechnology applications. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2005, 290-291, s. 28-34. ISSN 03048853. DOI: 10.1016/j.jmmm.2004.11.155. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0304885304013952 29. LAURENT, S., D. FORGE, M. PORT, A. ROCH, C. ROBIC, L. VANDER ELST a R. N. MULLER. Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Vectorization, Physicochemical Characterizations, and Biological Applications. Chemical Reviews. 2008, roč. 108, č. 6, s. 2064-2110. ISSN 0009-2665. DOI: 10.1021/cr068445e. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr068445e 77
30. GUPTA, A. K. a M. GUPTA. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 2005, roč. 26, č. 18, s. 39954021. ISSN 01429612. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2004.10.012. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0142961204009317 31. MA, Z. a H. LIU. Synthesis and surface modification of magnetic particles for application in biotechnology and biomedicine. China Particuology. 2007, roč. 5, 1-2, s. 1-10. ISSN 16722515. DOI: 10.1016/j.cpart.2006.11.001. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1672251507000024 32. PAUL, K. G., T. B. FRIGO, J. Y. GROMAN a E. V. GROMAN. Synthesis of Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxides Using Reduced Polysaccharides. Bioconjugate Chemistry. 2004, roč. 15, č. 2, s. 394-401. ISSN 1043-1802. DOI: 10.1021/bc034194u. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bc034194u 33. HASSAN, E. E., R. C. PARISH a J. M. GALLO. Optimized Formulation of Magnetic Chitosan Microspheres Containing the Anticancer Agent, Oxantrazole. Pharmaceutical Research. 1992, roč. 09, č. 3, s. 390-397. ISSN 07248741. DOI: 10.1023/A:1015803321609. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1023/A:1015803321609 34. VEIGA, V., D. H. RYAN, E. SOURTY, F. LLANES a R. H. MARCHESSAULT. Formation and characterization of superparamagnetic cross-linked high amylose starch. Carbohydrate Polymers. 2000, roč. 42, č. 4, s. 353-357. ISSN 01448617. DOI: 10.1016/S0144-8617(99)00166-6. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0144861799001666 35. GÓMEZ-LOPERA, S. A., R. C. PLAZA a A. V. DELGADO. Synthesis and Characterization of Spherical Magnetite/Biodegradable Polymer Composite Particles. Journal of Colloid and Interface Science. 2001, roč. 240, č. 1, s. 40-47. ISSN 00219797. DOI: 10.1006/jcis.2001.7579. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021979701975794 36. RITTICH, B., A. ŠPANOVÁ, D. HORÁK, M. J. BENEŠ, L. KLESNILOVÁ, K. PETROVÁ a A. RYBNIKÁŘ. Isolation of microbial DNA by newly designed magnetic particles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2006, roč. 52, č. 2, s. 143-148. ISSN 09277765. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2006.04.012. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0927776506001457 37. ERENSMEIER, S.. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 2006-11-13, roč. 73, č. 3, s. 495-504. ISSN 0175-7598. DOI: 10.1007/s00253-006-0675-0. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s00253-006-0675-0 38. ŠPANOVÁ, A., D. HORÁK, E. SOUDKOVÁ a B. RITTICH. Magnetic hydrophilic methacrylate-based polymer microspheres designed for polymerase chain reactions applications. Journal of Chromatography B. 2004, roč. 800, 1-2, s. 27-32. ISSN 15700232. DOI: 10.1016/j.jchromb.2003.09.010. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S157002320300727X 78
39. KŘÍŽOVÁ, J., A. ŠPANOVÁ, B. RITTICH a D. HORÁK. Magnetic hydrophilic methacrylate-based polymer microspheres for genomic DNA isolation. Journal of Chromatography A. 2005, roč. 1064, č. 2, s. 247-253. ISSN 00219673. DOI: 10.1016/j.chroma.2004.12.014. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967304022551 40. HORÁK, D., N. SEMENYUK a F. LEDNICKÝ. Effect of the reaction parameters on the particle size in the dispersion polymerization of 2-hydroxyethyl and glycidyl methacrylate in the presence of a ferrofluid. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 2003-06-15, roč. 41, č. 12, s. 1848-1863. ISSN 0887-624x. DOI: 10.1002/pola.10728. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/pola.10728 41. MELZAK, K. A., C. S. SHERWOOD, R. F. B. TURNER a Ch. A. HAYNES. Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions. Journal of Colloid and Interface Science. 1996, roč. 181, č. 2, s. 635-644. ISSN 00219797. DOI: 10.1006/jcis.1996.0421. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S002197979690421X 42. RAHMAN, M. M. a A. ELAISSARI. Temperature and magnetic dual responsive microparticles for DNA separation. Separation and Purification Technology. 2011, roč. 81, č. 3, s. 286-294. ISSN 13835866. DOI: 10.1016/j.seppur.2011.07.030. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1383586611004369 43. TEIF, V. B. a K. BOHINC. Condensed DNA: Condensing the concepts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 2011, roč. 105, č. 3, s. 208-222. ISSN 00796107. DOI: 10.1016/j.pbiomolbio.2010.07.002. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0079610710000659 44. VASILEVSKAYA, V. V., A. R. KHOKHLOV, Y. MATSUZAWA a K. YOSHIKAWA. Collapse of single DNA molecule in poly(ethylene glycol) solutions. The Journal of Chemical Physics. 1995, roč. 102, č. 16, s. 6595-. ISSN 00219606. DOI: 10.1063/1.469375. Dostupné z: http://link.aip.org/link/JCPSA6/v102/i16/p6595/s1 45. BLOOMFIELD, V. A. DNA condensation by multivalent cations. Biopolymers. 1997, roč. 44, č. 3, s. 269-282. DOI: 10.1002/(SICI)1097-0282(1997)44:3<269::AID-BIP6>3. 46. GRYSON, N.. Effect of food processing on plant DNA degradation and PCR-based GMO analysis: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2010, roč. 396, č. 6, s. 20032022. ISSN 1618-2642. DOI: 10.1007/s00216-009-3343-2. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s00216-009-3343-2 47. KÁŠ, J., M. KODÍČEK a O. VALENTOVÁ. Laboratorní techniky biochemie. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 2005, 258 s. ISBN 80-708-0586-2. 48. ŠPANOVÁ, A. a B. RITTICH. Analýza vybraných druhů bakterií mléčného kvašení pomocí metod molekulární biologie. 1. vyd. Brno: Vysoké učení technické, Fakulta chemická, 2010, 86 s. ISBN 978-80-214-4004-3.
79
49. ŠMARDA, J.. Metody molekulární biologie. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2010, 188 s. ISBN 978-80-210-3841-7. 50. RUML, T.. Genové inženýrství. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 2002, 270 s. ISBN 80-7080-4998. 51. KRÁLOVÁ, B., L. FUKAL, P. RAUCH a T. RUML. Bioanalytické metody. 3. vyd. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická, 2001, 254 s. ISBN 80-708-0449-1. 52. LISBY, G.. Application of Nucleic Acid Amplification in Clinical Microbiology. Molecular Biotechnology. 1999, roč. 12, č. 1, s. 75-99. DOI: 10.1385/MB:12:1:75. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1385/MB:12:1:75 53. KUBISTA, M., J. M. ANDRADE, M. BENGTSSON, A. FOROOTAN, J. JONÁK, K. LIND, R. SINDELKA, R. SJÖBACK, B. SJÖGREEN, L. STRÖMBOM, A. STÅHLBERG a N. ZORIC. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 2006, roč. 27, č. 2-3, s. 95-125. ISSN 00982997. DOI: 10.1016/j.mam.2005.12.007. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0098299705000907 54. WHITE, E. a A. Bruce. PCR protocols current methods and applications. Heidelberg [etc.]: Springer, 1993. ISBN 978-159-2595-020. 55. MA, H., S., K. J., ChEN, G., X. T. QIAO a M. Y. CHUANG. Application of Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). J. Am. Sci. 2006, roč. 2, č. 3. 56. BERMINGHAM, N. a K. LUETTICH. Polymerase chain reaction and its applications. Current Diagnostic Pathology. 2003, roč. 9, s. 159-164. DOI: 10.1016/S09686053(02)00102-3. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0968605302001023 57. WALKER, J. M.. Molecular Biology and Biotechnology. Vyd. 3. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2000, 563 s. ISBN 08-540-4606-2. 58. WARD, Pierre a Denis ROY. Review of molecular methods for identification, characterization and detection of bifidobacteria. Le Lait. 2005, roč. 85, č. 2, s. 23-32. ISSN 0023-7302. DOI: 10.1051/lait:2004024. Dostupné z: http://www.edpsciences.org/10.1051/lait:2004024
89.
59. CHEN, B. Y. a B. W. JANES. PCR cloning protocols. 3. vyd. Totowa, N. J: Humana Press, 2002, 439 s. ISBN 15-925-9177-9. 60. MJ Mini Thermal Cycler. Bio-rad [online]. [cit. 2013-04-10]. Dostupné z: http://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSE/PDP/16cd26ac-8bc7-4a25-adde54c3c155976f/MJ-Mini-Thermal-Cycler 61. LOGAN, J., K. EDWARDS a S. SAUNDERS. Real-time PCR: current technology and applications. Norfolk: Caister Academic Press, 2009, 284 s. ISBN 978-1-904455-39-4.
80
62. Bio-rad: PCR Primer and Probe Chemistries. [online]. [cit. 2013-04-06]. Dostupné z: http://www.biorad.com/evportal/en/CZ/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=SolutionsLandi ngPage&catID=LUSOJW3Q3 63. ZIPPER, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Research. 2004-07-07, roč. 32, č. 12, e103-e103. ISSN 1362-4962. DOI: 10.1093/nar/gnh101. Dostupné z: http://www.nar.oupjournals.org/cgi/doi/10.1093/nar/gnh101 64. Gene-quantification: Dyes & Fluorescence detection chemistry in qPCR. [online]. [cit. 2013-04-06]. Dostupné z: http://dyes.gene-quantification.info/ 65. EliGene kits and Real-Time PCR instruments. Eligene [online]. [cit. 2013-04-10]. Dostupné z: http://www.eligene.com/eligene-kits-and-real-time-pcr-instruments1.html 66. SCHRADER, C., A. SCHIELKE, L. ELLERBROEK a R. JOHNE. PCR inhibitors occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 2012, roč. 113, č. 5, s. 1014-1026. ISSN 13645072. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x 67. OPEL, K. L., D. CHUNG a B. R. MCCORD. A Study of PCR Inhibition Mechanisms Using Real Time PCR. Journal of Forensic Sciences. 2010, roč. 55, č. 1, s. 25-33. ISSN 00221198. DOI: 10.1111/j.1556-4029.2009.01245.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1556-4029.2009.01245.x 68. HUGGETT, J. F., T. NOVAK, J. A. GARSON, C. GREEN, S. D. MORRIS-JONES, R. F. MILLER a A. ZUMLA. Differential susceptibility of PCR reactions to inhibitors: an important and unrecognised phenomenon. BMC Research Notes. 2008, roč. 1, č. 1, s. 70-. ISSN 1756-0500. DOI: 10.1186/1756-0500-1-70. Dostupné z: http://www.biomedcentral.com/1756-0500/1/70 69. POWELL, H. A., C. M. GOODING, S. D. GARRETT, B. M. LUND a R. A. MCKEE. Proteinase inhibition of the detection of Listeria monocytogenes in milk using the polymerase chain reaction. Letters in Applied Microbiology. 1994, roč. 18, č. 1, s. 59-61. ISSN 0266-8254. DOI: 10.1111/j.1472-765X.1994.tb00802.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1472-765X.1994.tb00802.x 70. WILSON, I. G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY. 1997, roč. 63, č. 10, s. 3741-3751. 71. KATCHER, H. L. a I. SCHWARTZ. A distinctive property of Tth DNA polymerase: enzymatic amplification in the presence of phenol. BioTechniques. 1994, roč. 16, č. 1, s. 84-92. 72. PEIST, R., HONSEL, D., TWEILING, G. a D. LOFFERT. PCR inhibitors in plant DNA preparations. QIAGEN News 3. 2001, s 7-9.
81
73. RICHARDS, G. P. Limitations of molecular biological techniques for assessing the virological safety of foods. Journal of Food Protection. 1999, roč. 62, s. 691-697. 74. BICKLEY, J., J. K. SHORT, D. G. MCDOWELL a H. C. PARKES. Polymerase chain reaction (PCR) detection of Listeria monocytogenes in diluted milk and reversal of PCR inhibition caused by calcium ions. Letters in Applied Microbiology. 1996, roč. 22, č. 2, s. 153-158. ISSN 0266-8254. DOI: 10.1111/j.1472-765X.1996.tb01131.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1472-765X.1996.tb01131.x 75. WEI, T., G. LU a G.CLOVER. Novel approaches to mitigate primer interaction and eliminate inhibitors in multiplex PCR, demonstrated using an assay for detection of three strawberry viruses. Journal of Virological Methods. 2008, roč. 151, č. 1. DOI: 10.1016/j.jviromet.2008.03.003. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0166093408000955 76. ANKLAM, E., F. GADANI, P. HEINZE, H. PIJNENBURG a G. VAN DEN EEDE. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products. European Food Research and Technology. 2002-1-1, roč. 214, č. 1, s. 3-26. ISSN 1438-2377. DOI: 10.1007/s002170100415. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s002170100415 77. KHARAZMI, M., T. BAUER, W. P. HAMMES a C. HERTEL. Effect of Food Processing on the Fate of DNA with Regard to Degradation and Transformation Capability in Bacillus subtilis. Systematic and Applied Microbiology. 2003, roč. 26, č. 4, s. 495-501. ISSN 07232020. DOI: 10.1078/072320203770865774. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0723202004702131 78. CANKAR, K., D. ŠTEBIH, T. DREO, J. ŽEL a K. GRUDEN. Critical points of DNA quantification by real-time PCR –effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnology. 2006, roč. 6, č. 1, s. 37-52. ISSN 14726750. DOI: 10.1186/1472-6750-6-37. Dostupné z: http://www.biomedcentral.com/1472-6750/6/37 79. HUPFER, C., H. HOTZEL, K. SACHSE, F. MOREANO a K. H. ENGEL. PCR-based quantification of genetically modified Bt maize: single-competitive versus dualcompetitive approach. European Food Research and Technology. 2000, roč. 212, č. 1, s. 95-99. ISSN 1438-2377. DOI: 10.1007/s002170000208. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s002170000208 80. DEBODE, F., E. JANSSEN a G. BERBEN. Physical degradation of genomic DNA of soybean flours does not impair relative quantification of its transgenic content. European Food Research and Technology. 2007, roč. 226, 1-2, s. 273-280. ISSN 1438-2377. DOI: 10.1007/s00217-006-0536-1. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s00217-0060536-1 81. CHEN, Y., Y. WANG, Y. GE a B. XU. Degradation of Endogenous and Exogenous Genes of Roundup-Ready Soybean during Food Processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005, roč. 53, č. 26, s. 10239-10243. ISSN 0021-8561. DOI: 82
10.1021/jf0519820. Dostupné z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf0519820 82. CHITER, A., J. M. FORBES a G. E. BLAIR. DNA stability in plant tissues: implications for the possible transfer of genes from genetically modified food. FEBS Letters. 2000, roč. 481, č. 2, s. 164-168. ISSN 00145793. DOI: 10.1016/S0014-5793(00)01986-4. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0014579300019864 83. GRYSON, N., K. MESSENS a K. DEWETTINCK. PCR detection of soy ingredients in bread. European Food Research and Technology. 2008, roč. 227, č. 2, s. 345-351. ISSN 1438-2377. DOI: 10.1007/s00217-007-0727-4. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s00217-007-0727-4 84. HUPFER, C., H. HOTZEL, K. SACHSE a K. H. ENGEL. Detection of the genetic modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A. 1998-3-23, roč. 206, č. 3, s. 203-207. ISSN 1431-4649. DOI: 10.1007/s002170050243. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s002170050243 85. HERMAN, L. Detection of viable and dead Listeria monocytogenes by PCR. Food Microbiology. 1997, roč. 14, č. 2, s. 103-110. ISSN 07400020. DOI: 10.1006/fmic.1996.0077. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0740002096900775 86. PAN, T. M. a T. W. SHIH. Detection of Genetically Modified Soybeans in Miso by Polymerase Chain Reaction and Nested Polymerase Chain Reaction. Journal of Food and Drug Analysis, 2003, roč.11, č.2, s. 154-158. 87. KOVARIK, A. a spol. Rapid Concerted Evolution of Nuclear Ribosomal DNA in Two Tragopogon Allopolyploids of Recent and Recurrent Origin. Genetics. 2005, roč. 169, s. 931-944. DOI: 10.1534/genetics.104.032839. Dostupné z: http://www.genetics.org/cgi/doi/10.1534/genetics.104.032839 88. YOONG LIM, K., A. KOVARIK, R. MATYÁŠEK, M. BEZDĚK, C. P. LICHTENSTEIN a A. R. LEITCH. Gene conversion of ribosomal DNA in Nicotiana tabacum is associated with undermethylated, decondensed and probably active gene units. Chromosoma. 2000, roč. 109, č. 3, s. 161-172. ISSN 1432-0886. DOI: 10.1007/s004120050424. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s004120050424
83
7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOLŮ bp BPO CAB cDNA CTAB DNA dsDNA dNTP dATP dCTP dGTP dTTP EDTA GMA GuHCl GuSCN HEMA PCR PDI PEG P(GMA) P(HEMA-co-GMA) PLA PVA qPCR RFLP RNA RT-PCR SDS SEM ssDNA TEM Tm
páry bazí dibenzoylperoxid acetát-butyrát celulosa komplementární DNA cetyl trimethylamonium bromid deoxyribonukleová kyselina dvouřetězcová DNA 2´- deoxyribonukleotid- 5´-trifosfát 2´- deoxyadenin- 5´-trifosfát 2´- deoxycytosin- 5´-trifosfát 2´- deoxyguanin- 5´-trifosfát 2´- deoxythymin- 5´-trifosfát ethylendiamintetraoctová kyselina glycidylmethakrylát guanidin hydrochlorid guanidin isothiokyanatát hydroxyethylmethakrylát polymerázová řetězová reakce index polydisperzity polyethylenglykol poly(glycidylmethakrylát) poly(hydroxyethylmethakrylát-co-glycidylmethakrylát) poly(mléčná) kyselina poly(vinyl)alkohol polymerázová řetězová reakce v reálném čase polymorfismus délky restrikčních fragmentů ribonukleová kyselina zpětná polymerázová řetězová reakce dodecylsulfát sodný skenovací elektronová mikroskopie jednořetězcová DNA transmisní elektronová mikroskopie teplota tání
84
