ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT PADA TANAMAN Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. LUKMAN AMIR

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT PADA TANAMAN Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd.

LUKMAN AMIR

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA  Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit pada Tanaman Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Desember 2015

Lukman Amir NIM A154130061



Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.

RINGKASAN

LUKMAN AMIR. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit pada Tanaman Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. Dibimbimg oleh DWI ANDREAS SANTOSA dan GIYANTO. Acacia decurrens merupakan tanaman dengan kemampuan tumbuh cepat dan termasuk kedalam famili Leguminosae. Jenis tanaman ini dapat dijumpai di kawasan taman nasional gunung Merapi (Selo dan Cangkringan) dan kawasan taman nasional gunung Merbabu, Indonesia. Tanaman ini terkenal di Indonesia selain karena kemampuan tumbuh cepatnya, juga karena kemampuan daya adaptasi tinggi yang terkadang mampu menginvasi suatu kawasan. Kemampuan tersebut diduga dipengaruhi kuat oleh keberadaan mikroorganisme khusunya bakteri endofit pada jaringan tanaman tersebut. Tujuan dari penelitian ini yaitu: (1) untuk mendapatkan bakteri endofit dengan cara mengisolasi, mengkarakterisasi, menyeleksi dan mengidentifikasi bakteri endofit dari tanaman A. decurrens, (2) mempelajari peran bakteri endofit dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman padi. Lokasi pengambilan sampel terletak pada kawasan taman nasional gunung Merapi dan Merbabu. Proses isolasi, seleksi, karakterisasi dan identifikasi bakteri endofit dari sampel yang berupa bagian akar, batang dan daun tanaman A. decurrens dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB) Bogor. Sebanyak 48 isolat bakteri endofit telah diisolasi dari jaringan pada akar, batang dan daun A. decurrens. Keseluruhan isolat kemudian diseleksi melalui uji patogenitas (reaksi hemolisis pada media agar darah dan hypersensitif respon menggunakan tanaman tembakau) dan dalam meningkatkan daya kecambah dan daya tumbuh benih padi. Berdasarkan hasil seleksi, diperoleh sepuluh isolat yang akan diuji lebih lanjut. Selanjutnya, kesepuluh isolat terpilih diuji dalam menambat N2, memproduksi IAA, melarutkan fosfat, melarutkan kalium, menghambat pertumbuhan bakteri (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) dan cendawan (Rhizoctonia solani) penyebab penyakit pada tanaman. Dari hasil uji lanjut yang telah dilakukan, keseluruhan isolat terbukti mampu menambat N2 dan memproduksi IAA, enam diataranya sebagai pelarut fosfat, satu isolat dengan kemamampuan menghambat pertumbuhan X. oryzae dan satu isolat terhadap R. solani. Isolat-isolat tersebut kemudian diuji dalam meningkatkan pertumbuhan vegetatif tanaman padi. Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap yang terdiri dari 12 perlakuan dan 5 ulangan. Perlakuan tersebut yaitu (perlakuan 1-10) bakteri endofit ditambah ½ dosis rekomendasi N, P, K dan (perlakuan 11 dan 12) sebagai kontrol yaitu ½ dan 1 dosis rekomendasi pupuk N, P dan K. Diantara 10 isolat yang diujikan, isolat Bb4, Ca9 dan Bd3 merupkan isolat-isolat dengan hasil terbaik yang mampu menutupi separuh dari penggunaan pupuk N, P dan K dengan dosis rekomendasi. Ketiga isolat tersebut dilanjutkan pada tahap identifikasi. Berdasarkan gene 16S rRNA, isolat Bb4 memiliki kemiripan 96.4% dengan spesies padanan Enterobacter sp., Ca9 memeliki kemiripan 96.2% dengan

Pseudomonas sp. dan Bd3 memiliki kemiripan 96.1% dengan Enterobacter cloacae. Keseluruh isolat tersebut telah terdaftar dan memiliki nomor aksesi dari European Molecular Biology Laboratory (EMBL) Nucleotide Sequence Database. Berdasarkan pada hasil sequensing gene 16S rRNA dan karakter morfologi dan biokimia, ketiga isolat tersebut kemungkinan besar merupakan genus baru dari kelas -proteobacteria. Kata kunci: Acacia decurrens, Merapi, Merbabu, bakteri endofit, bakteri pemacu pertumbuhan tanaman, gen 16S rRNA.

SUMMARY

LUKMAN AMIR. Isolation and Characterization of Endophytic Bacteria from Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. Dibimbimg oleh DWI ANDREAS SANTOSA dan GIYANTO. Acacia decurrens is a fast growing tree from acacia species and belonging to the family Leguminosae. A. decurrens can be found in Merapi (Selo and Cangkringan) and Merbabu mountain national park, Indonesia. This plant is famous in Indonesia because of its ability to grow rapidly, adapt and even invade a territory. Microorganisms thought to play an important role in the growth of this plant, especially endophytic bacteria. The aims of this study are: (1) To obtain the endophytic bacteria by isolating, selecting, characterizing, and identifying endophytic bacteria from A. decurrens, (2) Investigated the role of endophytic bacteria in promoting the growth of the rice plant. Sampling sites located in the national park area of Merapi and Merbabu mountain. The process of isolation, selection, characterization and identification of endophytic bacteria form roots, stems and leaves of A. decurrens conducted at the Laboratory of Environmental Biotechnology Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB) Bogor. A total of 48 endophytic bacteria isolated from roots, stems and leaves of A. decurrens that grow in the national park of Merapi and Merbabu mountain. These isolates were selected by the pathogenicity test (hemolytic reaction on blood agar media and hypersensitive response of tobacco plants) and the ability to promote the germination and growth of rice seed. Following the selection test, 10 endophytic bacteria were selected for further investigation. Further, experiments were performed with 10 isolates to determine their N2 fixation, auxin producing activities, phosphate and potassium solubilizing, antagonistic activities against plant phytopathogenic bacteria (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) and fungi (Rhizoctonia solani), and plant growth promotion in rice. Our result revealed that ten bacterial isolates belonging to diazotrophic bacteria and producing IAA, while six as phosphate solubilizing, one isolate showed antagonistic activities against X. oryzae and one against R. solani. These isolates were tested in promoting vegetative growth of rice plant. The experiment was a completely randomized design consisted of 12 treatments, with 5 replications. The treatments were: (treatment 1-10) endophytic bacteria with half recommended dose of N, P, K inorganic fertilizers and (treatment 11 and 12) as a control half and full recommended dose of N, P, K fertilizers. Among 10 isolates tested, the Bb4, Ca9 and Bd3 were superior isolate, which were capable to replace half recommended dose of chemical fertilizer for the vegetative growth of rice. These isolates were chosen for futher identification. Based on the 16S rRNA sequences, the isolate of Bb4 (LN907847), Ca9 (LN907849) and Bd3 (LN907848) has 96.4%, 96.2% and 96.1% similarity to Enterobacter sp., Pseudomonas sp. and Enterobacter cloacae respectively. These isolates have registered and have accession numbers from the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) Nucleotide Sequence Database. Sequencing results of the

16S rRNA gene and further morphology and biochemical tests showed that those isolates were most probably a new genus of the γ-class of Proteobacteria. Keywords: Mt. Merapi, Mt. Merbabu, endophytic bacteria, Acacia decurrens, plant growth-promoting bacteria (PGPB), 16S rRNA gene.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ENDOFIT PADA TANAMAN AKASIA (Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd.)

LUKMAN AMIR

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi Tanah dan Lingkungan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Dra Rahayu Widyastuti, MScAgr

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan sejak Agustus 2014 sampai Oktober 2015 dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit pada Tanaman Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. Penulis menyampaikan penghargaan dan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Dwi Andreas Santosa MS dan Dr. Ir Giyanto M.Si selaku komisi pembimbing atas segala bimbingan, kritik, saran dan motivasi yang telah diberikan dengan tulus dan penuh kesabaran untuk penulis selama penelitian hingga penyelesaian tesis ini. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi untuk pemberian beasiswa sehingga penulis dapat menempu pendidikan di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada bapak, ibu dan rekan-rekan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB) atas fasilitas serta bantuannya selama masa penelitian dan penulisan tesis ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Anggreny Pramitha Wulandari dan rekan-rekan yang telah membantu, memberi dorongan dan motivasi selama masa studi di IPB. Terima kasih tak terhingga penulis sampaikan kepada ayahanda, ibunda, kakak, adik dan beserta keluarga besar yang telah memberikan limpahan kasih sayang, doa dan dukungannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Desember 2015 Lukman Amir

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN

Halaman xi xi xii 1

Latar Belakang Peruumusan Masalah

1 2

Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian

2 2

METODOLOGI PENELITIAN

3

Tempat dan waktu penelitian

3

Bahan dan Alat Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Acacia decurrens

3 3

Seleksi Bakteri Endofit Karakterisasi Bakteri Endofit

4 5

Uji Efektifitas 10 Isolat Bakteri Endofit dalam Memacu Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi

6

Identifikasi Bakteri Endofit

7

HASIL DAN PEMBAHASAN Lokasi Pengambilan sampel

9 9

Hasil Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Acacia decurrens Seleksi Bakteri Endofit Karakterisasi Bakteri Endofit

10 11 15

Pengaruh Bakteri Endofit terhadap Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi

18

Identifikasi Bakteri Endofit PEMBAHASAN UMUM SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA

20 25 27 28

LAMPIRAN

33

RIWAYAT HIDUP

38

DAFTAR TABEL

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Halaman Jumlah dan keragaman bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman 10 Acacia decurrens Uji hemolisis dan hipersensitif isolat bakteri endofit 11 Rata-rata panjang akar, panjang pucuk, bobot basah, bobot kering 14 pertumbuhan padi stelah 7 hari masa inkubasi Kemampuan menambat N2, melarutkan fosfat, kalium dan 15 menghambat pertumbuhan mikrob pathogen Tinggi tanaman, jumlah daun dan jumlah anakan setelah 4MST (37 19 hari) Bobot segar dan kering akar, daun dan batang 20 Penelusuran sekuen 16S rRNA tiga isolat bakteri endofit dengan 21 spesies padanan Karakter morfologi dan biokimia 3 bakteri endofit dengan bakteri 23 pembanding

DAFTAR GAMBAR

1. Lokasi pengambilan sampel 2. Lokasi pengambilan sampel di 3 lokasi, (a) kawasan TNG Merapi daerah Selo, (b) kawasan TNG Merbabu, (c) kawasan TNG Merapi daerah cangkringan 3. Hasil uji hemolisis dengan media agar darah setelah 17 jam masa inkubasi, a) reaksi positif ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni, b) reaksi negatif 4. Hasil uji respon hipersensitif terhadap isolat bakteri endofit pada daun tembakau. Contoh reaksi positif yang ditunjukkan oleh isolat Aa8 setelah masa inkubasi 48 jam 5. Kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kualitatif terlihat dengan terbentuknya pelikel putih di bawah permukaan media NFB pada 10 isolat uji 6. Uji bakteri endofit dalam melarutkan fosfat setelah 4 hari masa inkubasi, a) reaksi positif terlihat dari zona bening disekitar koloni, b) reaksi negatif

Halaman 9 9

11

13

16

17

7. Kemampuan 10 isolat bakteri endofit dalam menghasilkan hormon IAA 8. Koloni bakteri endofit a (Bb4), b (Ca9) dan c (Bd3) 9. Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA isolat Bd3, Bb4,Ca9 dengan penanda 1kb 10. Hasil analisis filogeni 3 isolat bakteri endofit

18 20 21 22

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Kurva standar dan pertumbuhan 10 isolat bakteri endofit

30

2. Karakteristik morfologi koloni 48 bakteri endofit

32

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang Akasia (Acacia spp.) merupakan jenis tanaman yang termasuk kedalam famili Leguminosae (Glushenkova 2012). Genus akasia merupakan tanaman tropis-subtropis yang tersebar luas dari Amerika tengah melintasi Afrika hingga pada Asia tenggara dan Australia (Burley et al. 2004). Jenis tanaman ini banyak dibudidayakan di Indonesia sebagai tanaman kehutanan atau sebagai tanaman reklamasi. Salah satu jenis akasia yang ada di Indonesia yaitu Acacia decurrens (J.C.Wendl.) Willd. Akasia jenis ini dapat dijumpai di kawasan Taman Nasional Gunung Merapi dan kawasan Taman Nasional Gunung Merbabu. Tanaman ini memiliki kemampuan tumbuh yang cepat dan daya adaptasi tinggi sehingga kerap mendominasi dalam suatu kawasan. Genus Acacia spp. termasuk kedalam famili Leguminosae dengan salah satu ciri yaitu bintil akar yang terbentuk dari hasil simbiosis antara bakteri dan akar tanaman tersebut. Berdasarkan beberapa hasil penelitian ditemukan beberapa jenis bakteri yang diisolasi dari bintil akar Acacia spp. diantaranya, yaitu Bradyrhizobium (Nuswantara et al. 1997), Rhizobium dan Sinorhizobium (Toledo et al. 2003). Namun demikian, keberadaan bakteri endofit pada jaringan tanaman akasia khususnya Acacia decurrens belum pernah dilaporkan dan diduga banyak memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan tanaman tersebut. Bakteri endofit merupakan bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman yang bersifat netral atau bermanfaat bagi tanaman inangnya. Peran bakteri endofit dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman diduga didukung oleh kemampuan bakteri tersebut dalam menghasilkan hormon tumbuh seperti indole-3- acetic acid (IAA), abscisic acid (ABA), gibberallic acid (GA) dan cytokinin (CTK) (Feng et al. 2006). Selain itu, bakteri endofit juga dilaporkan dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman melalui penambatan N2 (diazotrophic bacteria) (Doty 2011), memobilisasi fosfat (Gusmaini 2014), juga karena kemampuannya dalam meningkatkan ketahananan tanaman terhadap hama dan penyakit (Brooks et al. 1994; Duan et al. 2013). Eksplorasi bakteri endofit dari berbagai jenis tanaman dengan berbagai kepentingan telah banyak dilakukan. Hal tersebut demi memperoleh bakteri endofit yang unggul, khususnya di bidang pertanian. Bakteri dengan kemampuan meningkatkan pertumbuhan tanaman dapat dikembangkan menjadi agen pupuk hayati yang bermutu yang dapat meningkatkan hasil produksi tanaman pangan misalnya padi (Oryza sativa). Sebagai contoh, Hidayati (2014) melaporkan bahwa aplikasi pemberian inokulum bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman karet berpotensi sebagai bakteri pemacu pertumbuhan karena terbukti mampu meningkatkan pertumbuhan batang bawah Hevea brasiliensis. Padi dengan pertumbuhan yang cepat dengan hasil panen tinggi sangat dibutuhkan. Berbagai upaya telah dilakuakan salah satunya dengan pemupukan. Pertanian Indonesia sampai saat ini masih tergantung pada supalai pupuk sintetik demi memperoleh hasil panen yang lebih banyak. Akan tetapi, penggunaan pupuk sintetik secara terus menerus akan berdampak negatif bagi lingkungan dan tidak dapat menunjang sistem pertanian berkelanjutan. Oleh karena itu, upaya

2

pengurangan penggunaan pupuk sintetik terus dilakukan salah satunya melalui pendekatan biologis, dengan memanfaatkan bakteri endofit yang memiliki kemampuan memacu pertumbuhan tanaman. Minimnya informasi mengenai keberadaan bakteri endofit pada tanaman A. decurrens dan juga potensi yang dimilikinya baik untuk tanaman akasia itu sendiri maupun tanaman pangan (padi), mendorong upaya untuk mengeksplorasi bakteri endofit pada tanaman tersebut.

Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang diatas, dirumuskan masalah penelitian sebagai berikut: 1. laporan mengenai informasi keberadaan bakteri endofit pada tanaman A. decurrens masih belum ada, khususnya di Indonesia. 2. belum terdapat informasi terkait dengan potensi bakteri endofit pada tanaman A. decurrens khususnya dalam memacu pertumbuhan tanaman padi.

Tujuan Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan tujuan sebagai berikut: 1. memperoleh bakteri endofit dari tanaman A. decurrens dengan cara mengisolasi, mengkarakterisasi, menyeleksi dan mengidentifikasi bakteri tersebut. 2. mempelajari peran bakteri endofit dari tanaman A. decurrens dalam hal memacu pertumbuhan tanaman padi.

Manfaat Penelitian Dari penelitian ini diharapkan diperoleh informasi mengenai keberadaan bakteri endofit pada jaringan tanaman A. decurrens serta peranan dan manfaatnya, khususnya dalam hal pemacu pertumbuhan tanaman padi melalui proses isolasi, seleksi, karakterisasi dan identifikasi.

3

METODE PENELITIAN

Tempat dan Waktu Penelitian Lokasi pengambilan sampel jaringan tanaman A. decurrens yaitu di kawasan Taman Nasional Gunung Merapi (Kabupaten Boyolali, Provinsi Jawa Tengah dan Kabupaten Sleman Daerah Istimewa Yogyakarta) dan di kawasan Taman Nasional Gunung Merbabu (Kabupaten Boyolali, Provinsi Jawa Tengah). Proses isolasi, seleksi, karakterisasi dan identifikasi molekuler bakteri endofit dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB) Bogor. Penelitian ini dilaksanakan dari Agustus 2014 - Oktober 2015.

Bahan dan Alat Obyek penelitian berupa bagian akar, batang dan daun A. decurrens . Bahan yang digunakan untuk isolasi, seleksi, karakterisasi dan identifikasi molekuler adalah Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB), alkohol 70%, NaOCl, larutan fisiologis (NaCl 0,85%), aquadest, media Blood agar (yang mengandung 5% darah domba (Zimbro et al. 2009), tembakau (Nicotiana tabacum), media Pikovskaya, media Alexandrov, media NFB (nitrogen free broth) dan benih padi. Alat yang digunakan pada umumnya untuk isolasi, seleksi, karakterisasi dan identifikasi molekuler yaitu, mortar, tabung ulir, cawan petri, erlenmeyer, tabung reaksi, vortex, shaker, pipet mikro, magnetic stirrer, mikroskop, laminar air flow (LAF), autoclaf, inkubator, Gas Chromatography (GC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC), sentrifus, elektroforesis, mesin Polymerase Chain Reaction (PCR).

Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Acacia decurrens Pengambilan Sampel Sumber bakteri endofit diisolasi dari jaringan pada akar, batang dan daun tanaman A. decurrens. Sampel jaringan tanaman yang telah diperoleh dimasukkan ke dalam plastik sampel kemudian disimpan dengan suhu sekitar 4 0C hingga tahapan isolasi dilakukan (Strobel dan Daisy 2003). Isolasi dan Purifikasi Bakteri Endofit Isolasi bakteri endofit dari jaringan tanaman diawali dengan proses sterilisasi permukaan. Metode sterilisasi permukaan mengikuti sebagaimana yang dikemukakan Hallmann et al. (2006) yang telah dimodifikasi. Sampel jaringan tanaman A. decurrens pertama-tama dicuci dengan air mengalir sampai bersih, kemudian dikering anginkan dan ditimbang sebanyak 1 gram. Contoh kemudian disterilisasi dengan cara dibilas dengan air steril sebanyak 2 kali. Selanjutnya sampel direndam selama 6 menit dalam alkohol 70% dan dilanjutkan dengan perendaman kedalam natrium hipoklorit (NaOCl) 3%

4

selama 3 menit untuk daun dan 4 menit untuk akar dan batang. Setelah itu sampel dibilas kembali dengan air steril sebanyak 3 kali. Untuk mengetahui keberhasilan dari proses sterilisasi permukaan, sampel disapukan ke permukaan media Nutrient Agar (NA) 10%. Indikator keberhasilan yang diamati yaitu dengan tidak adanya mikrob yang tumbuh pada media yang telah disapukan sampel tersebut. Setelah proses sterilisasi permukaan, 1 gram sampel kemudian digerus hingga halus dan dilarutkan kedalam 9 ml larutan NaCl fisiologis, kemudian dilakukan seri pengenceran hingga 10 -4. Masing-masing dari seri pengenceran ditumbuhkan pada media NA 10% kemudian isolat bakteri dimurnikan pada media NA 100%.

Seleksi Isolat Bakteri Endofit Uji Hemolisis Pengujian ini bertujuan untuk membedakan bakteri endofit yang diisolasi dari jaringan tanaman A. decurrens berdasarkan kemampuan melisiskan sel darah merah. Isolat bakteri endofit ditumbuhkan pada media agar darah dan diinkubasi pada suhu 35 ± 20C selama 18-24 jam. Adanya zona bening disekitar koloni mengindikasikan bahwa isolat tersebut berpotensi patogen terhadap manusia dan hewan (Zimbro et al. 2009). Uji Respon Hipersensitif Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui sifat patogenitas isolat bakteri endofit terhadap tanaman. Isolat bakteri endofit yang telah ditumbuhkan pada media NB kemudian diinfiltrasikan pada sisi absial daun tanaman tembakau yang berumur sekitar 2 bulan. Pengamatan yang dilakukan berupa respon dari daun tembakau yang telah disuntikkan isolat bakteri endofit setelah 48 jam. Respon yang diperlihatkan dari daun tembakau berupa reaksi nekrosis pada sekitar daun yang berarti isolat tersebut berpotensi patogen terhadap tanaman (Schaad et al. 2001). Uji Daya Kecambah dan Daya Tumbuh Pengujian isolat bakteri endofit terhadap daya kecambah dan daya tumbuh bertujuan untuk melihat pengaruh bakteri endofit dalam mendukung daya kecambah dan daya tumbuh benih padi. Varietas benih padi yang digunakan yaitu varietas Ciherang. Benih padi steril direndam selama kurang lebih 24 jam kedalam suspensi isolat bakteri endofit yang telah ditumbuhkan pada media cair selama 24 jam. Sebagai kontrol benih direndam dengan air steril tanpa inokulan. Benih padi yang telah direndam kemudian diletakkan pada cawan petri yang telah dilapisi dengan kertas saring, jumlah benih pada setiap cawan petri yaitu 20 dan diulang sebanyak 3 kali. Pengamatan daya kecambah dilakukan pada hari ke 2 dan pertumbuhan setelah 7 hari inkubasi. Parameter yang diamati yaitu panjang akar, panjang pucuk, berat segar dan berat kering bibit padi. Seleksi dilakukan dengan menggunakan metode skoring seperti yang telah dilakukan Hidayati (2014). Skor diperoleh dari nilai parameter pengamatan yang telah dibandingkan dengan kontrol dikali dengan persen bobot nilai tiap parameter. Bobot nilai panjang akar dan panjang pucuk 15%, bobot nilai berat

5

segar 20% dan bobot kering 30%. Masing-masing nilai dari parameter dikalikan dengan bobot masing-masing. Selanjutnya hasil perkalian dari 4 parameter tersebut dijumlahkan. 10 isolat terbaik dipilih untuk diuji lebih lanjut.

Karakterisasi Bakteri Endofit Uji Kemampuan Menambat N2 Uji kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kualitatif dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat bakteri endofit pada media Nitrogen Free Broth (NFB). Sebanyak 100 µl suspensi isolat dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi media NFB dan di inkubasi selama 5-7 hari. Indicator yang diamati yaitu pelikel putih yang terbentuk dibawah permukaan media. Uji kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kulaitatif diamati secara tidak langsung melalui reduksi astilen menjadi etilen menggunakan Gas Chromatoghraphy (GC) (Gothwal et al. 2007). Isolat ditumbuhkan pada media cair Nitrogen free broth dan diinkubasi pada mesin pengocok selama 24 jam dengan kecepatan rotasi 180 rpm pada suhu ruang. Kemudian 20 ml suspensi isolat dimasukkan ke dalam tabung inkubasi berkapasitas 30 ml. sebanyak 10% udara dari volume tabung inkubasi dikeluarkan menggunakan alat suntik steril kemudian disubtitusi dengan gas asetilen sebanyak volume yang diambil dan diinkubasi selama 2 jam. Jumlah dari gas etilen hasil reduksi dari asetilen oleh bakteri digunakan untuk mengukur kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2. Uji Kemampuan Melarutkan Fosfat Isolat bakteri endofit yang berumur 24 jam diinokulasikan pada permukaan media pikovskaya padat (Subba-Rao 1982) dan diinkubasi selama 3-6 hari pada suhu 350C. Indikator yang diamati yaitu terbentuknya zona bening disekitar koloni yang berarti isolat tersebut mampu melarutkan fosfat (Saraswati et al. 2007). Uji Kemampuan Melarutkan Kalium Isolat bakteri endofit yang berumur 24 jam diinokulasikan pada permukaan media Alexandrof (Hu et al. 2006) padat dan diinkubasi selama 3-6 hari pada suhu 350C. Indikator yang diamati yaitu terbentuknya zona bening disekitar koloni yang berarti isolat tersebut mampu melarutkan kalium. Uji Kemampuan Menghasilkan Hormon Tumbuh Indol-3-Acetat Acid (IAA) Pengujian 10 isolat bakteri endofit dilakukan dengan menggunakan metode high-performance liquid chromatography (HPLC; Frankenberger dan Poth 1987) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 20 ml kultur cair isolat bakteri endofit yang berumur 24 jam pada media NB ditambahkan dengan methanol 20 ml dan diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 24 jam. Supernatant dievaporasi pada suhu 350C. Ekstrak ditambah dengan HCL 2 M hingga pH 2,5 dan diekstraksi sebanyak 3 kali dengan etil asetat pada volume yang sama. Ekstrak kemudian disaring dan diinjek ke HPLC detector UV/Vis dengan panjang gelombang 265 nm.

6

Uji Antagonis Bakteri Endofit terhadap Mikrob Pathogen Tanaman Uji antagonis isolat bakteri endofit diuji pada mikrob patogen yaitu Xantomonas oryzae pv. oryzae dan Rhizoctonia solani. X. oryzae merupakan salah satu jenis bakteri Gram-negatif yang menyebabkan penyakit hawar daun pada padi (Furutani 2009) dan Rhizoctonia solani merupakan cendawan penyebab hawar pelepah pada padi (Neeraja et al. 2002). Kultur cair X. oryzae disapukan secara merata kepermukaan media NA dan diikuti dengan meletakkan kertas cakram yang telah dicelupkan kedalam kultur cair bakteri endofit ke permukaan media yang telah disapukan X. oryzae sebelumnya. Uji antagonisme bakteri endofit terhadap cendawan pathogen berupa R. solani dilakukan pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Isolat bakteri endofit ditumbuhkan selama 48 jam lebih awal dari cendawan patogen. Pengujian tersebut menggunakan metode dual culture seperti yang telah dilakukan sebelumnya oleh Kim et al. (2008). Indikator bahwa bakteri endofit positif menghambat pertumbuhan isolat patogen yaitu dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni setelah masa inkubasi selama 24-48 jam untuk bakteri dan 120 jam untuk cendawan.

Uji Efektifitas 10 Isolat Bakteri Endofit dalam Memacu Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi Percobaan ini menggunakan 10 isolat bakteri endofit hasil seleksi dari uji daya kecambah. Percobaan ini terdiri dari 12 perlakuan yang terdiri dari 10 isolat bakteri endofit (ditambah 1/2 dosis anjuran pupuk NPK) dan 2 kontrol (1/2 dan 1 dosis anjuran pupuk NPK). Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap. Model linear yang digunakan adalah Y ij = μ + τi + εij. Yij Pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, μ adalah rataan umum, τi adalah pengaruh perlakuan ke-i dan εij adalah pengaruh acak pada perlakuan ke-i, ulangan ke-j. percobaan ini dilakukan hingga tanaman berumur 37 hari (4 minggu setelah tanam = MST). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali sehingga diperoleh 60 satuan percobaan. Parameter pertumbuhan yang diamati yaitu jumlah daun (seluruh daun yang muncul dihitung), tinggi tanaman (diukur dari tanah hingga daun terpanjang), jumlah anakan, bobot basah dan bobot kering tanaman. Pengaruh perlakuan terhadap peubah-peubah yang diamati dilakukan dengan menggunakan analisis sidik ragam, dan apabila ada beda nyata diuji lanjut dengan Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) pada taraf kepercayaan 5%. Percobaan ini menggunakan benih padi varietas Ciherang, benih padi direndam dengan menggunakan aquades selama 24 jam. Setelah perendaman, benih kemudian disemai pada media pembibitan hingga berumur 10 hari dan bibit siap tanam. Bibit padi ditanam pada 1 kg tanah di dalam pot plastik. Inokulasi 10 isolat bakteri endofit ketanaman padi dengan cara disemprotkan dengan kepadatan populasi 108 spk ml-1 sebanyak 5 ml/tanaman dan diaplikasikan 1 minggu sekali hingga tanaman berumur 1 bulan. Penentuan jumlah populasi berdasarkan kurva standard dan grafik pertumbuhan (Lampiran 1) masing-masing

7

isolat. Waktu aplikasi pemberian pupuk N, P dan K berdasarkan anjuran pemupukan tanaman padi. Identifikasi Bakteri Endofit Identifikasi Molekuler Identifikasi molekuler bakteri endofit dilakukan berdasarkan sekuen parsial 16S rRNA. Metode isolasi DNA mengacu pada publikasi Atashpaz et al. (2010) yang telah dimodifikasi. Kultur bakteri yang telah ditumbuhkan pada media cair selama 12 jam dimasukkan sebanyak 1,5 ml kedalam mikro tube 3 ml kemudian disentrigusai pada 5600 xg dengan suhu 40C selama 5 menit. Hasil berupa supernatant di buang dan dimasukkan kembali sebanyak 1,5 ml kedalam tabung yang sama dan disentrifugasi hingga terbentuk pelet seberat 50-100 mg. Pelet yang diperoleh diresuspensi dengan larutan buffer lisis yang telah dihangatkan pada suhu 65 0 C sebanyak 800 µl. Sampel kemudian di inkubasi pada suhu 650C selama 30 menit (untuk Gram negatif) atau 2 jam (untuk Gram positif) dengan sambil dibolak-balik setiap 10 menit. Setelah di inkubasi, sampel disentrifugasi pada suhu 4 0C selama 5 menit. Supernatant hasil sentrifugasi kemudian dipindahkan kedalam mikro tube yang baru dan ditambahkan kloroform-isoamilalkohol (24:1 v/v) dengan volume yang sama. Sampel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8064 xg pada suhu 40C selama 10 menit. Hasil sentrifugasi berupa 2 lapisan pada sampel dan lapisan diatas dipindahkan ke tabung mikro dan ditambhkan isopropanol secara perlahan demi mencegah terjadinya fragmentasi DNA. Sampel kemudian di inkubasi pada suhu -200C selama 30 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10976 xg pada suhu 40C selama 10 menit. Supernatant hasil sentrifugasi dibuang dan pelet ditambahkan etanol 96% kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8064 xg selama 5 menit. Setelah 5 menit, supernatant dibuang dan ditambahkan etanol 70% kedalam pelet dan disentrifugasi pada kecepatan, suhu dan waktu yang sama. Penambahan etanol 96% dan 70% disebut dengan tahap pencucian yang hasilnya berupa pelet. Pelet kemudian dikering anginkan dan ditambahkan air bebas nuclease sebanyak 50 µl. Hasil preparasi sampel DNA kemudian diamplifikasi. Amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR, dice mini TAKARA). Primer forward dan reverse yang digunakan yaitu 16F27 (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) dan R1492 (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT-3’) (Santosa 2001). PCR master mix disiapkan dalam volume akhir 25 µl yang mengandung 1,25 µl primer F konsentrasi 10 µM, 1,25 µl primer R konsentrasi 10 µM , 1 µl ekstrak DNA, 12,5 µl reagen 2x Kappa G dan air bebas nuclease sampai volume akhir tercapai. Program PCR mencakup 30 siklus yang terdiri denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, annealing pada suhu 48oC selama 30 detik dan extension pada suhu 72oC selama 2 menit. Siklus tersebut didahului oleh pra-denaturasi pada suhu 95oC selama 3 menit dan diakhiri dengan final extension pada suhu 72oC selama 15 menit. Polimerisasi dilakukan pada suhu 700C selama 2 menit, lalu pada siklus terakhir waktu polimerisasi diperpanjang menjadi 15 menit. Hasil PCR divisualisasi menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% dalam 1x buffer TAE. Hasil dari PCR kemudian di sekuensing menggunakan AB1 PRISM 3730xl DNA Analyzer. Hasil sekuensing dicocokkan dengan data pada

8

database EMBL (European Molecular Biology Laboratory) pada situs http://www.ebi.ac.uk.. Hasil sekuensing didepositkan di EMBL Nucleotide Sequence Database. Analisis filogeni bakteri endofit menggunakan perangkat lunak The Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versi 6.0 (Tamura et al. 2013). Karakterisasi Morfologi dan Biokimia Karakterisasi morfologi dan biokimia bakteri meliputi pengamatan morfologi koloni dan morfologi sel bakteri, pewarnaan Gram dan uji biokimia bakteri endofit. Parameter pengamatan morfologi koloni mencakup warna, bentuk koloni, elevasi (kenampakan dari samping), bentuk pinggiran dan tekstur permukaan. Morfologi Sel bakteri meliputi bentuk sel, ukuran sel serta pewarnaan Gram. Uji biokimia bakteri endofit meliputi uji motilitas, uji KOH, uji katalase, uji oksidase, uji fermentasi karbohidrat (glukosa, innositol, xylose, sorbitol, mannitol, cellubios), dan uji urease berdasarkan Mac Faddin (1979).

9

HASIL DAN PEMBAHASAN

Lokasi Pengambilan Sampel Lokasi pengambilan sampel terletak di kawasan taman nasional gunung Merapi dan Merbabu. Lokasi pertama yaitu di kawasan Taman Nasional Gunung Merapi daerah Selo, titik koordinat lokasi S 07 031’22.5” E 110027’05.07” dengan ketinggian 2111 mdpl. Lokasi kedua yaitu pada kawasan Taman Nasional Gunung Merbabu daerah Selo dengan titik koordinat S 07028’44.0” E 110027’35.4” dengan ketinggian 1975 mdpl. Lokasi ketiga yaitu pada Kawasan Taman Nasional Gunung Merapi daerah Cangkringan dengan titik koordinat S 07034,843” E 110026,586” dengan ketinggian 1140 mdpl (Gambar 1).

Gambar 1 lokasi pengambilan contoh

Gambar 2 Lokasi pengambilan sampel di 3 lokasi, (a) kawasan TNG merapi daerah selo, (b) kawasan TNG merbabu, dan (c) kawasan TNG merapi daerah cangkringan.

10

Kondisi lokasi pengambilan sampel seperti yang terlihat pada Gambar 2. Pertumbuhan tanaman A. decurrens tampak lebih padat di daerah Cangkringan dibandingkan dengan 2 lokasi lainnya. Selain itu, perbedaan lain dari ketiga lokasi pengambilan sampel tersebut yaitu ukuran pohon dan umur tanaman A. decurrens. A. decurrens yang tumbuh dilokasi Selo relatif lebih tua terlihat dari pohon yang lebih besar dan tampak berbunga. Sedangkan di Cangkringan tampak sebagian besar akasia yang tumbuh di lokasi tersebut masih muda.

Hasil Isolasi Bakteri Endofit pada Tanaman Acacia decurrens Sejauh ini, telah banyak penelitian yang melaporkan tentang keberadaan bakteri endofit dari berbagai jenis tanaman (Mocali et al. 2003; Gao et al. 2015). Kebanyakan bakteri endofit berasal dari rizosfer dan filosfer (Ryan et al. 2008). Pada penelitian ini, sebanyak 48 isolat bakteri endofit (24 dari akar, 10 dari batang, 11 dari daun) berhasil diisolasi dari jaringan tanaman A. decurrens yang tumbuh pada kawasan taman nasional gunung Merapi dan Merbabu. Ciri morfologi koloni isolat-isolat tersebut disajikan pada Lampiran 2. Isolat-isolat tersebut merupakan hasil seleksi berdasarkan penampakan warna dan bentuk koloni yang berbeda. Penelitian ini merupakan penelitian pertama yang melaporkan tentang keberadaan bakteri endofit pada tanaman A. decurrens khususnya yang tumbuh pada kawasan taman nasional gunung Merapi dan Merbabu. Tabel 1

Jumlah dan keragaman bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman Acacia decurrens

Lokasi pengambilan sampel Merbabu Merapi (Cangkringan) Merapi (Selo) Jaringan Jumlah Jumlah Jumlah tanaman populasi Keragaman populasi Keragaman Keragaman populasi -1 -1 -1 (CFU ml ) (CFU ml ) (CFU ml ) Akar 105 10 104 5 105 9 2 3 2 Batang 10 3 10 4 10 3 3 4 2 Daun 10 6 10 5 10 3 Total 19 14 15 Tabel 1 menunjukkan sebaran bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman A. decurrens dari tiga lokasi yang berbeda. Lokasi eksplorasi serta bagian jaringan tanaman yang diisolasi mempengaruhi jumlah isolat bakteri endofit yang ada. Jumlah isolat bakteri endofit dari jaringan akar lebih banyak dibandingkan jaringan lainnya. Diduga karena hasil adaptasi antara akar tanaman dengan bakteri tanah khususnya daerah rizosfer yang kemudian masuk dan mengkolonisasi jaringan pada akar tanaman tersebut. Selain itu, sejarah keberadaan suatu tanaman akan mempengaruhi tingkat adaptasi bakteri lokal terhadap tanaman tersebut. Bakteri endofit pada batang dan daun lebih sedikit dibanding akar. Hal tersebut diduga dipengaruhi oleh keberadaan bakteri di udara lingkungan sekitar (Sundin dan Jacobs 1999).

11

Seleksi Isolat Bakteri Endofit Uji Hemolisis Hasil uji hemolisis 48 bakteri endofit disajikan pada Tabel 2. Pada pengujian ini, reaksi hemolisis dapat diamati setelah ± 17 jam masa inkubasi yaitu melaui zona bening yang terbentuk disekitar koloni (Gambar 3). Diantara 48 isolat bakteri endofit terdapat 13 isolat yang menunjukkan reaksi hemolisis bertipe beta (β) pada media agar darah dengan zona bening yang terbentuk di sekitar koloni pada ± 17 jam masa inkubasi, dan 35 dengan hasil negatif atau tidak berpotensi pathogen terhadap hewan dan manusia (Tabel 2). Menurut Zimbro et al. (2009), terdapat 4 tipe hemolisis pada pengujian menggunakan media agar darah, alpha (α)-hemolysis yaitu media disekitar koloni berwarna kehijau-hijauan akibat reduksi hemoglobin menjadi met-hemoglobin, beta (β)-hemolysis yaitu sel darah merah lisis menghasilkan zona bening disekitar koloni, gamma (γ)-hemolysis berarti tidak ada hemolisis dikarenakan tidak adanya kerusakan sel darah merah dan perubahan pada media, dan alpha-prime (ά)-hemolysis yaitu suatu zona kecil dari hemolisis sempurna yang dikelilingi oleh sebagian area lisis.

b a

Gambar 3 Hasil uji hemolisis dengan media agar darah setelah 17 jam masa inkubasi, a) reaksi positif ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni, b) reaksi negatif Tabel 2 Uji hemolisis dan hipersensitif isolat bakteri endofit Kode isolat Aa1 Aa2 Aa3 Aa4 Aa5 Aa6 Aa7 Aa8 Aa9 Ab1

Sumber isolat Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merapi

Simbol: + (patogen), – (tidak patogen); td (tidak diuji)

Uji hemolisis + + +

Uji hipersensitif td td + td

12

Lanjutan Tabel 2 Kode isolat Ab2 Ab3 Ad1 Ad2 Ad3 Ba1 Ba2 Ba3 Ba4 Ba5 Bb1 Bb2 Bb3 Bb4 Bd1 Bd2 Bd3 Bd4 Bd5 Ca1 Ca2 Ca3 Ca4 Ca5 Ca6 Ca7 Ca8 Ca9 Ca10 Cb1 Cb2 Cb3 Cd1 Cd2 Cd3 Cd4 Cd5 Cd6

Sumber isolat Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Akar A. decurrens asal cangkringan KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Batang A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Batang A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Batang A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Batang A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Daun A. decurrens asal Cangkringan KTNG Merapi Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Akar A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Batang A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu Daun A. decurrens asal Selo KTNG Merbabu

Uji hemolisis + + + + + + + + + + -

Uji hipersensitif td td td td td td td + td td td + -

Simbol: + (patogen), – (tidak patogen); td (tidak diuji)

Uji Respon Hipersensitif Hasil uji respon hipersensitif terhadap 35 bakteri endofit yaitu 32 yang menunjukkan hasil negatif yang berarti tidak berpotensi patogen terhadap tanaman dan 3 bakteri yang menunjukkan hasil positif atau berpotensi menyebabkan

13

penyakit pada tanaman (Tabel 2). Respon hipersensitif yang ditunjukkan dengan reaksi nekrosis merupakan bentuk pertahanan yang ditunjukkan tanaman dari serangan pathogen (Hammond-Kosack dan Jones 1996). 32 bakteri endofit dengan hasil negatif setelah 48 jam pengamatan, tidak menunjukkan gejala seperti bercak kuning (Gambar 4) ataupun mengering seperti 3 isolat dengan hasil positif.

Reaksi positif

Gambar 4 Hasil uji respon hipersensitif terhadap isolat bakteri endofit pada daun tembakau. Contoh reaksi positif yang ditunjukkan oleh isolat Aa8 setelah masa inkubasi 48 jam Uji Daya Kecambah dan Daya Tumbuh Pada pengamatan daya kecambah benih padi, rata-rata daya kecambah benih padi yang diaplikasikan dengan 32 isolat berkisar 95-100%. Selain daya kecambah, parameter yang diamati yaitu daya tumbuh benih padi meliputi panjang akar, panjang pucuk, berat segar dan berat kering. Respon yang beragam ditunjukkan benih padi pada pengamatan panjang akar, panjang pucuk, bobot segar dan bobot kering (Tabel 3). Hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri endofit berpengaruh terhadap daya tumbuh benih padi dengan kemampuan dalam memacu pertumbuhan yang berbeda-beda. Berdasarkan seluruh parameter pengamatan (Tabel 3), tidak semua perlakuan pemberian isolat bakteri endofit menunjukkan reaksi positif atau lebih baik dari kontrol. Beberapa isolat bahkan ada yang bereaksi negatif atau tidak lebih baik dari kontrol. Hasil tersebut menunjukkan bahwa tidak semua bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman yang memiliki kemampuan tumbuh cepat memiliki potensi pemacu pertumbuhan tanaman. Kemampuan bakteri endofit berbeda-beda, ada yang berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan (Feng et al. 2006) agen biokontrol (Duan et al. 2013), hingga pada pemanfaatan potensi bakteri endofit dalam mendegradasi polutan organik (Afzal et al. 2014). Isolat Ca1 menunjukkan nilai persentasi peningkatan pertumbuhan benih padi terbaik dari yang lainnya. Reaksi positif tersebut berbanding terbalik dengan hasil yang ditunjukkan isolat Bd5. Respon negatif dengan nilai persentasi perbandingan lebih rendah dibanding kontrol juga bisa diartikan bahwa isolat Bd5 menghambat pertumbuhan benih padi. Pada parameter panjang akar, isolat Aa2 memilik persentasi panjang akar 55,7% di atas kontrol. Sebaliknya pada parameter panjang pucuk perlakuan pemberian isolat Aa2 hanya mampu meningkatkan 0,23% di atas kontrol.

14

Tabel 3 Rata-rata panjang akar, panjang pucuk, bobot basah dan bobot kering serta hasil skoring pertumbuhan padi setelah 7 hari masa inkubasi dibanding kontrol (%) Kode Isolat Ca1 Aa2 Ba3 Ba2 Ad1 Ca9 Bb4 Bd3 Ba1 Ad2 Aa3 Cb1 Cd4 Ad3 Bd2 Ca4 Cd5 Cd3 Bb3 Aa6 Ba4 Aa5 Cb2 Ca5 Aa1 Cd1 Ca7 Bd1 Ca10 Ca3 Aa9 Bd5

Panjang Akar 12.48 55.70 7.31 3.82 39.25 9.36 21.71 4.84 12.26 15.31 40.26 37.13 31.27 7.85 -10.46 -8.79 -16.31 -25.96 -1.57 25.57 -32.28 -2.28 -3.09 -19.86 -9.45 -29.93 -24.26 -22.16 -48.37 -47.38 -51.29 -65.35

Skor (15%) 1.87 8.36 1.10 0.57 5.89 1.40 3.26 0.73 1.84 2.30 6.04 5.57 4.69 1.18 -1.57 -1.32 -2.45 -3.89 -0.24 3.84 -4.84 -0.34 -0.46 -2.98 -1.42 -4.49 -3.64 -3.32 -7.26 -7.11 -7.69 -9.80

Panjang Pucuk 40.94 0.23 5.65 13.71 4.43 25.73 5.78 10.62 7.53 11.09 4.08 -6.18 -4.43 5.60 10.22 18.71 19.74 19.15 0.13 -9.10 6.45 -3.38 -10.27 17.84 -13.54 8.48 8.04 2.02 -3.65 -2.92 -18.95 -20.70

Skor (15%) 6.14 0.04 0.85 2.06 0.67 3.86 0.87 1.59 1.13 1.66 0.61 -0.93 -0.67 0.84 1.53 2.81 2.96 2.87 0.02 -1.37 0.97 -0.51 -1.54 2.68 -2.03 1.27 1.21 0.30 -0.55 -0.44 -2.84 -3.10

Bobot Segar 39.92 40.16 47.94 46.66 35.13 35.45 31.66 33.97 28.24 23.72 14.73 26.15 26.15 26.79 32.27 23.91 25.26 22.21 23.99 19.37 25.86 22.02 22.75 13.84 22.16 10.21 14.53 9.68 7.95 7.52 0.42 -15.22

Skor (20 %) 7.98 8.03 9.59 9.33 7.03 7.09 6.33 6.79 5.65 4.74 2.95 5.23 5.23 5.36 6.45 4.78 5.05 4.44 4.80 3.87 5.17 4.40 4.55 2.77 4.43 2.04 2.91 1.94 1.59 1.50 0.08 -3.04

Bobot Kering 5.97 0.67 6.72 5.73 4.09 5.67 2.28 1.62 6.62 5.89 4.73 -4.67 -3.51 2.01 -0.44 4.16 5.05 7.34 0.13 -4.82 3.17 -3.81 -2.32 1.67 -2.62 8.75 -0.03 2.44 8.36 6.72 5.73 1.27

Skor (30%) 1.79 0.20 2.01 1.72 1.23 1.70 0.68 0.48 1.99 1.77 1.42 -1.40 -1.05 0.60 -0.13 1.25 1.51 2.20 0.04 -1.45 0.95 -1.14 -0.70 0.50 -0.79 2.63 -0.01 0.73 2.51 2.02 1.72 0.38

Total Skor 25.77 24.65 23.13 23.01 21.83 21.15 17.47 16.39 16.25 15.21 13.96 13.70 13.43 13.34 12.74 12.30 12.13 10.07 9.42 8.77 7.42 6.81 6.40 5.74 4.63 3.49 3.37 1.58 -2.11 -2.52 -8.65 -18.62

Angka positif menunjukkan lebih tinggi dibanding kontrol, 0 sama dengan kontrol ,dan minus (-) lebih rendah dari kontrol.

Respon yang berbeda-beda ditunjukkan pada masing-masing parameter pengamatan. Respon positif benih padi yang telah diberi isolat bakteri endofit menunjukkan kemampuan bakteri endofit tersebut dalam memacu pertumbuhan benih padi. Hasil serupa dilaporkan pada penelitan sebelumnya dimana aplikasi perlakuan bakteri endofit mampu meningkatkan pertumbuhan benih cardon cactus (Pachycereus pringlei) (Puente et al. 2009). Bakteri endofit juga dilaporkan

15

mampu memacu pertumbuhan bibit batang bawah tanaman karet (Hidayati 2014) dan meningkatkan pertumbuhan sambiloto (Gusmaini 2014). Berdasarkan hasil uji daya kecambah dan daya tumbuh benih padi, dipilih 10 isolat terbaik untuk diuji lebih lanjut. Sepuluh isolat tersebut yaitu: Ca1, Aa2, Ba3, Ba2, Ad1, Ca9, Bb4,Bd3, Ba1 dan Ad2. Kesepuluh isolat tersebut merupakan isolat-isolat yang memiliki total skor tertinggi dengan hasil lebih baik dari kontrol.

Karakterisasi Isolat Bakteri Endofit Kemampuan Menambat N2, Melarutkan Fosfat, Kalium dan Menghambat Pertumbuhan Mikrob Patogen Berbagai jenis bakteri endofit penambat N2 dari bermacam-macam tanaman telah diteliti (Wang et al. 2006; Terakado-Tonooka et al. 2008) dan beberapa metode yang umum digunakan seperti menumbuhkan pada media bebas N (Baldani et al. 1992), mengukur aktifitas nitrogenase dengan menghitung produksi gas C2H4 (Mollica et al. 1985; Zayed 2012) dan mendeteksi keberadaan gen nif (Bürgmann et al. 2004; Zhang et al. 2007). Pada penelitian ini, 10 isolat bakteri endofit yang diisolasi dari akar, batang dan daun A. decurrens menunjukkan hasil positif baik secara kualitatif (menumbuhkan pada media bebas N) maupun kuantitaif (aktifitas nitrogenase) dalam menambat N2 (Tabel 4). Tabel 4 Kemampuan menambat N2, melarutkan fosfat, melarutkan kalium dan menghambat pertumbuhan mikrob patogen Kode isolat Ca1 Aa2 Ba3 Ba2 Ad1 Ca9 Bb4 Bd3 Ba1 Ad2

Menambat N2 ARA (µmol C2H4/µL/jam)

Media NFB

0.222 0.141 0.394 0.258 0.241 0.252 0.338 1.168 0.566 0.145

+ + + + + + + + + +

Pelarut fosfat

Pelarut kalium

+ + + + + +

-

Antagonis terhadap X. oryzae

R. solani

+ -

+ -

Simbol: + ( mampu), - (tidak mampu); ARA: acetylene reduction assay, NFB: nitrogen free broth

Kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kualitatif dapat dilihat pada Gambar 5. Keseluruhan isolat mampu tumbuh dan membentuk pelikel putih dibawah permukaan media NFB semi padat setelah 5 hari masa inkubasi. Karakteristik tersebut umumnya ditunjukkan oleh bakteri penambat N 2 dari kelompok Spirillum spp. (Muthukumarasamy et al. 2007). Hasil positif juga ditunjukkan pada uji kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kuantitatif. Keseluruhan isolat positif dalam mereduksi acetilen berkisar dari

16

0.141 hingga 1.168 µmol C2H4/µL/jam. Acetylene reduction assay (ARA) merupakan metode pengujian secara tidak langsung untuk mengetahui aktivitas enzim nitrogenase dalam mereduksi acetilen menjadi gas etilen yang dapat dihitung menggunakan gas chromatography (Doty et al. 2009). Semakin tinggi produksi gas etilen berbanding lurus dengan aktivitas nitrogenase dan semakin tinggi pula aktivitas penambatan N2.

Pelikel putih

Gambar 5

Kemampuan bakteri endofit dalam menambat N2 secara kualitatif terlihat dengan terbentuknya pelikel putih di bawah permukaan media NFB pada 10 isolat uji

Sepuluh isolat tersebut secara tidak langsung mewakili jaringan akar, batang dan daun tanaman A. decurrens. Hasil dengan kemampuan terbaik ditunjukkan pada isolat Bd3. Isolat tersebut merupakan salah satu isolat yang diisolasi dari daun tanaman A. decurrens. Daun yang mendapatkan paparan langsung dari udara diduga memberi kemungkinan bagi bakteri dari jaringan tersebut menambat N2 dengan optimal. Pada uji kemampuan melarutkan fosfat, 6 diantara 10 isolat uji mampu melarutkan tricalcium phosphate (Ca3(PO4)2) yang merupakan sumber P dalam media Pikovskaya (Tabel 4). Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni (Gambar 6). Kemampuan mikroorganisme dalam melarutkan fosfat tergantung dari aktifitas biokimianya terutama dalam memproduksi dan melepaskan asam-asam organik yang kemudian mengkelat kation terikat dan mengkonversi fosfat kedalam bentuk terlarut (Kpomblekou-a dan Tabatabai 1994). Hasil tersebut mengungkapkan bahwa beberapa bakteri endofit yang diisolasi dari jaringan tanaman A. decurrens mampu menambat N2, beberapa juga mampu melarutkan fosfat. Beberapa penelitian sebelumnya mengungkapkan bahwa tidak jarang suatu mikroorganisme mampu mensekresikan beberapa hasil metabolit yang bermanfaat bagi tanaman seperti IAA, fosfat dan siderofor oleh Enterobacter asburiae strain PS2 (Ahemad dan Khan 2010) dan Pseudomonas fluorescens (Parani dan Saha 2012) dan fosfat dan kalium (Diep dan Hieu 2013).

17

a Gambar 6

b

Uji bakteri endofit dalam melarutkan fosfat setelah 4 hari masa inkubasi, a) reaksi positif terlihat dari zona bening disekitar koloni, b) reaksi negatif

Aktifitas metabolism yang tidak kalah penting lainnya yaitu kemampuan bakteri dalam menghasilkan asam-asam organik. Asam oksalat merupakan salah satu jenis asam organik yang berperan penting dalam melarutkan kalium terikat (Shu-Xin et al. 2007). Berbeda halnya dengan uji penambatan N2 atau pelarutan fosfat, hal sebaliknya ditunjukkan dari hasil uji bakteri endofit dalam melarutkan kalium. Sepuluh isolat uji menunjukkan hasil negatif (Tabel 4). Hal yang berbeda dari peneltian Zhang dan Kong (2014) dan Meena et al. (2015) yang melaporkan bahwa bakteri yang diisolasi dari area risosfer tersebut mampu melarutkan kalium dari bentuk yang tidak tersedia menjadi tersedia bagi tanaman. Hal tersebut diduga karena isolat uji tidak mampu melarutkan kalium yang terikat dengan mineral-mineral feldspar yang diujikan dalam media Alexandrof. Metode dual culture pada uji antagonisme bakteri endofit dengan mikrob patogen tanaman menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit strain Bb4 mampu menghambat pertumbuhan R. solani yang merupakan cendawan penyebab penyakit pada tanaman. Sama halnya dengan isolat Ca9 yang menunjukkan aktifitas antagonisme terhadap pertumbuhan phytopathogenic bacterium X. oryzae pv. oryzae yang diamati melalui zona hambat antar keduanya (Tabel 4). Salah satu jenis bakteri endofit strain Pseudomonas fluorosence juga dilaporkan mampu berperan sebagai agen biokontrol karena kemampuannya menghambat pertumbuhan Rhizoctonia solani (Grosch et al. 2005). Kemampuan Menghasilkan Indol-3-Acetat Acid (IAA) Keseluruhan isolat uji terbukti mampu menghasilkan hormon IAA (Gambar 7). Kemampuan sepuluh isolat bakteri endofit dalam menghasilkan hormon IAA berkisar dari 79,89 hingga 99,87 ppm. Sama halnya dengan hasil uji penambatan N2, kemampuan terbaik dalam memproduksi IAA ditunjukkan oleh isolat Bd3. Isolat-isolat tersebut diuji setelah masa inkubasi selama 24 jam pada media cair dimana pada waktu tersebut merupakan fase eksponensial eksponensial bagi seluruh isolat uji. Hal tersebut sedikit berbeda dengan hasil penelitian sebelumnya yang melakukan uji auxin pada fase stationer (Ji et al. 2014).

18

Auksin atau IAA merupakan substansi kimia pengatur pertumbuhan tanaman (plant growth regulators = PGR) (Gardner et al. 1985). Kemampuan sepuluh bakteri endofit dalam menghasilkan hormon tumbuh berupa IAA dan juga menambat N2 mendukung hasil yang diperoleh dalam uji kemampuan bakteri endofit dalam meningkatkan daya kecambah dan pertumbuhan benih padi.

100.00 IAA

Kadar Hormon (ppm)

90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 CA1 Aa2 Ba3 Ba2 Ad1 Ca9 Bb4 Bd3 Ba1 Ad2 Bakteri endofit

Gambar 7 Kemampuan 10 isolat bakteri endofit dalam menghasilkan hormon IAA

Pengaruh Bakteri Endofit terhadap Pertumbuhan Vegetatif Tanaman Padi Pengaruh pemberian isolat bakteri endofit yang berasal dari tanaman A. decurrens dalam memacu pertumbuhan tanaman padi diamati mulai dari umur 14 MST. Kemampuan bakteri endofit dalam memacu pertumbuhan tanaman padi (tinggi tanaman dan jumlah daun) terlihat berbeda mulai dari umur tanaman dua minggu hingga pada umur empat minggu. Berdasarkan uji statistik pada parameter tinggi dan jumlah daun, beberapa perlakuan pemberian inokulan bakteri endofit berbeda nyata terhadap kontrol (½ dosis NPK anjuran). Perlakuan pemberian bakteri endofit + ½ dosis NPK anjuran berpengaruh terhadap tinggi tanaman padi pada umur 4 MST (Tabel 5). Beberapa isolat menunjukkan hasil yang lebih baik dari NPK 50% dan tidak berbeda nyata dengan NPK 100%. Hasil terbaik terlihat pada isolat Bb4 dengan rata-rata tinggi tanaman, jumlah daun dan jumlah anakan terbaik diantara bakteri endofit lainnya dan setara dengan kontrol (1 dosis anjuran NPK). Perbedaan jumlah daun antara perlakuan terlihat mulai umur 2-4 MST. Beda nyata pada parameter pengamatan jumlah daun maupun jumlah anakan di umur 4 MST terlihat pada Tabel 5. Respon bakteri endofit yang berbeda-beda dipengaruhi salah satunya tingkat kemampuan bakteri endofit tersebut dalam bertahan hidup dan bersaing dengan mikrob lokal.

19

Tabel 5 Tinggi tanaman, jumlah daun dan jumlah anakan setelah 4 MST (37 hari) Tinggi tanaman Perlakuana Jumlah daunc Jumlah anakand (cm)b Ca1 48.84 ab 14.8 bc 2.8 abcd Aa2 48.52 ab 12.6 ab 2.2 ab Ba3 49.96 b 13 abc 2.2 ab Ba2 44.44 a 14.4 bc 2.6 abc Ad1 49.44 b 14.2 bc 2.6 abc Ca9 49.96 b 14.8 bc 3.6 cde Bb4 50.94 b 16.4 c 4.2 e Bd3 50.56 b 15.6 bc 3.6 cde Ba1 50.04 b 14.4 bc 3 bcd Ad2 48.08 ab 13.2 abc 2.2 ab NPK 50% 44.18 a 10.8 a 1.8 a NPK 100% 50.48 b 16.4 c 3.8 de a

Semua perlakuan inokulan bakteri dipupuk dengan NPK ½ dosis rekomendasi, b, c, dangka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada satu kolom, tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (Duncan’s multiple range test)

Pada parameter pengamatan bobot segar (akar, batang dan daun) umur 4 MST (Tabel 6), beberapa perlakuan menunjukkan hasil yang lebih baik dibanding kontrol (½ dosis NPK anjuran). Hasil terbaik ditunjukkan isolat Bb4 dengan nilai rata-rata bobot segar daun dan batang 4,44 gram yang setara dengan kontrol NPK sesuai dosis anjuran. Kemampuan tanaman dalam menyerap unsur hara dari tanah tidak lepas dari fungsi dan kinerja akar tanaman tersebut. Pada pengamatan bobot segar akar, perlakuan dengan inokulan bakteri endofit berpengaruh terhadap peningkatan bobot segar akar. Terdapat beberapa perlakuan dengan hasil setara dengan kontrol pemberian pupuk NPK sesuai dosis anjuran ditinjau dari hasil uji lanjut DMRT yang tidak berbeda nyata pada taraf nyata 5%. Pengukuran bobot kering tanaman padi penting dilakukan untuk mengetahui berat biomassa hasil fotosintesis tanaman dengan bantuan bakteri endofit. Kemampuan bakteri endofit dalam meningkatkan bobot kering (akar, daun dan batang) pada Tabel 6 menunjukkan hasil yang bervariasi. Melalui perbandingan dengan kontrol separuh dosis pupuk anjuran, beberapa isolat mampu lebih baik dan berbeda nyata baik pada bobot kering akar maupun pada bobot kering daun dan batang. Hasil yang bervariasi tersebut menunjukkan bahwa pemberian isolat bakteri endofit berpengaruh terhadap pertumbuhan tanaman padi pada umur 4 MST. Berdasarkan seluruh parameter pengamatan, perlakuan dengan isolat BB4, Bd3 dan Ca9 (Gambar 8) ditambah separuh dosis anjuran secara statistic mampu setara dengan kontrol pemberian pupuk NPK sesuai dosis anjuran. Isolat-isolat tersebut merupakan isolat-isolat terbaik yang berpotensi dalam meningkatkan pertumbuhan vegetatif tanaman padi dengan mengurangi separuh dosis pupuk sintetik.

20

Tabel 6 Bobot segar dan kering akar, batang dan daun setelah 4 MST (37 hari) Perlakuana Ca1 Aa2 Ba3 Ba2 Ad1 Ca9 Bb4 Bd3 Ba1 Ad2 NPK 50% NPK 100%

Bobot segar daun Bobot segar dan batang (g)b akar (g)c 3.24 abc 3.09 ab 2.99 ab 2.66 ab 2.89 ab 3.64 bc 4.44 c 3.92 bc 3.31 abc 2.78 ab 2.10 a 4.48 c

3.85 b 2.30 a 2.86 ab 2.17 a 3.17 ab 3.64 b 3.88 b 3.87 b 3.17 ab 3.16 ab 2.52 a 3.88 b

Bobot kering daun dan batang (g)d

Bobot kering akar (g)e

0.78 ab 0.67 ab 0.67 ab 0.60 a 0.72 ab 0.88 bc 0.90 bc 0.91 bc 0.77 ab 0.69 ab 0.52 a 1.07 c

0.38 abc 0.29 ab 0.34 abc 0.25 a 0.35 abc 0.41 bcd 0.41 bcd 0.46 bcd 0.37 abc 0.36 abc 0.31 abc 0.55 d

a

Semua perlakuan inokulan bakteri dipupuk dengan NPK ½ dosis rekomendasi, b, c, d, eangka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada satu kolom, tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (Duncan’s multiple range test)

Dalam hal pemanfaatan bakteri sebagai agen pemacu tumbuh tanaman, telah banyak dilaporkan temuan-temuan mengenai peningkatan pertumbuhan tanaman dengan aplikasi bakteri pemacu pertumbuhan tanaman. Sebagai contoh, kombinasi antara bakteri Azotobacter chroococcum dengan separuh dosis pupuk mampu meningkatkan pertumbuhan vegetatif Sesamum indicum dan setara dengan perlakuan dengan satu kali dosis anjuran (Maheswari et al. 2012). Pengaruh pemberian inukulan juga dilaporkan Sharma et al. (2012) dimana peningkatan yang signifikan pada pertumbuhan vegetatif apel ditunjukkan dengan pemberian simbiosis antara Glomus dan Azotobacter. Sama halnya dengan isolat Ca9, Bb4 dan Bd3 yang berdasarkan uji lanjut Duncan’s multiple range test tidak berbeda nyata di setiap parameter pengamatan dengan perlakuan NPK 100%. Isolat- isolat tersebut berpotensi mengurangi separuh penggunaan pupuk N, P dan K pada pertumbuhan vegetatif tanaman padi. Faktor pendukung ketiga bakteri endofit tersebut mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman selain karena penambahan separuh dosis rekomendasi, juga karena kemampuan isolat-isolat tersebut dalam menambat N2 dan menghasilkan zat pemacu tumbuh tanaman berupa IAA. Beberapa faktor yang membedakan isolat Bb4, Bd3 dan Ca9 dalam hal peningkatan pertumbuhan dengan isolat-isolat lainnya yaitu potensi isolat Bb4 dan Ca9 dalam menghambat pertumbuhan mikrob potogen dan isolat Bd3 mampu menambat N2 dan memproduksi IAA lebih baik dari isolat-isolat lainnya. Peranan bakteri endofit yang diisolasi dari jaringan tanaman A. decurrens terhadap pertumbuhan tanaman dapat bersifat langsung dan tidak langsung. Secara langsung, bakteri endofit membantu pertumbuhan tanaman dengan memproduksi zat pemacu tumbuh, melarutkan fosfat menjadi bentuk tersedia bagi tanaman dan menambat N2. Secara tidak langsung, bakteri endofit mendukung pertumbuhan tanaman padi melalui agen biokontrol yaitu dengan menghambat

21

pertumbuhan salah satu bakteri penyebab penyakit hawar daun pada padi (X. oryzae) dan cendawan pathogen (R. solani).

Gambar 8 Isolat murni bakteri endofit a (Bb4), b (Ca9) dan c (Bd3)

Identifikasi Bakteri Endofit Identifikasi Molekuler Tiga isolat terbaik diidentifikasi melalui sekuen parsial gen 16S rRNA. Hasil amplifikasi fragmen DNA berukuran sekitar 1500 bp disajikan pada Gambar 9. Data yang diperoleh dari hasil sekuensing yang kemudian dianalisis menggunakan piranti FASTA dari EMBL (European Molecular Biology Laboratory) pada situs www.ebi.ac.uk di sajikan pada Tabel 7 dan analisis filogenetik pada Gambar 12. Hasil sekuensing isolat Bb4 memiliki kemiripan terdekat 96.4% dengan Enterobacter sp. strain HT-Z87-B1 dan isolat Bd3 memiliki kemiripan terdekat 96.1% dengan Enterobacter cloacae strain Bio103.

Gambar 9 Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA isolat Bd3, Bb4,Ca9 dengan penanda DNA 1kb

22

Berdasarkan sumbernya, kedua isolat tersebut merupakan hasil isolasi dari jaringan pada batang tanaman A. decurrens yang terletak dikawasan taman nasional gunung merapi daerah cangkringan. Isolat Bb4 dan Bd3 telah teregistrasi dan telah memperoleh nomor aksesi dari EMBL sequence of database yaitu LN907847 dan LN907848. Selain pada tanaman A. decurrens, keberadaan Enterobacter sebagai bakteri endofit juga dilaporkan ditemukan pada tanaman kehutanan lainnya seperti Eucalyptus (Torres et al. 2008), Poppulus (Taghavi et al. 2009) dan Ulms (Mocali et al. 2003). Tabel 7 Penelusuran sekuen 16S rRNA isolat bakteri endofit dengan spesies padanan pada EMBL sequence of database Kode Nomor aksesi Spesies padanan Strain Homology isolat Bb4 LN907847 Enterobacter sp. HT-Z87-B1 96.4% Ca9 LN907849 Pseudomonas sp. THG-T1 96.2% Bd3 LN907848 Enterobacter cloacae Bio103 96.1% Hasil penelusuran sekuen 16S ribosomal RNA, isolat Ca9 memiliki kemiripan terdekat 96.2% dengan Pseudomodas sp. strain THG-T1. Sama halnya dengan kedua isolat sebelumnya, isolat Ca9 juga telah teregistrasi dengan nomor aksesi LN907849. Isolat Ca9 merupakan salah satu isolat yang diisolasi dari jaringan pada akar tanaman A. decurrens yang tumbuh pada kawsan taman nasional gunug Merbabu. Kehadiran Pseudomonas sp. sebagai bakteri endofit yang diisolasi dari akar tanaman kehutanan lainnya seperti Populus, juga telah dilaporkan sebelumnya oleh Moore et al. (2006). Pseudomonas sp. sebagai bakteri endofit juga memberi manfaatan bagi tanaman inangnya diantaranya sebagai pemacu tumbuh juga sebagai agen biokontrol (Mercado-Blanko dan Bakker 2007). Genus ini juga terbukti positif menambat N2 melalui pertumbuhan pada media bebas N dan juga positif pada uji Acetylene reduction assay (Muthukumarsamy et al. 2007). Hasil analisis phyogenetic tree isolat Bb4, Bd3 dan Ca9 menggambarkan hubungan kekerabatan terdekat antara bakteri endofit dengan spesies padanan yang berdasarkan pada sekuen gen partial 16S rRNA. Posisi dari masing-masing isolat bakteri endofit berdasarkan pada kekerabatan terdekat dari masing-masing genus ataupun spesies (Gambar 10). Pohon filogeni dibangun dengan menggunakan metode Maximum-likelihood dengan boostrap 1000 kali replikasi (Tamura et al. 2013). Berdasarkan sekuen parsial 16S rRNA, ketiga isolat uji memiliki tingkat homologi dengan spesies padanan dibawah 97%. Hal tersebut memungkinkan bagi ketiga isolat uji tersebut sebagai genus baru dari -class Proteobacteria (Drancourt et al. 2000). Meskipun demikian, untuk menentukan sebagai sebuah genus baru membutuhkan uji molekuler dan karakterisasi phenotypic lebih lanjut, dimana hal tersebut diluar jangkauan penelitian ini.

23

Gambar 10 Hasil analisis filogeni 3 isolat bakteri endofit Karakterisasi Morfologi dan Biokimia Tingkat kemiripan karakter morfologi dan biokimia 3 isolat bakteri endofit tersaji pada Tabel 8. Pewarnaan Gram merupakan salah satu uji pendahuluan dan tahapan penting dalam mengklasifikasikan sifat Gram suatu mikrob (Chandra dan Mani 2011). 3 isolat bakteri endofit merupakan bakteri dengan Gram negatif begitupun dengan masing-masing spesies padanan. Berdasarkan uji KOH, ketiga isolat uji menunjukkan reaksi positif. Hasil uji KOH dengan hasil pewarnaan Gram berbanding terbalik. Hasil dari uji potasium hidroksida dapat mencirikan sifat Gram suatu bakteri dan sebagai pembanding dengan pewarnaan Gram pada umumnya (Chandra dan Mani 2011). Ketiga isolat uji memiliki kemampuan dalam memfermentasikan semua jenis karbohidrat yang diujikan kecuali pada karbohidrat jenis innositol. Keseluruhan isolat uji tidak mampu memfermentasikan jenis karbohidrat tersebut dicirikan dengan tidak terjadi perubahan pH media dari netral ke asam. Berdasarkan uji kemampuan 3 isolat uji dalam melarutkan urea, isolat Ca9 menginterprestasikan hasil positif dengan reaksi perubahan warna pada media menjadi merah muda. Kemampuan tersebut didukung dengan keberadaan enzim urease. Enzim urease merupakan enzim yang penting dalam perombakan bahan organik (Mac faddin 1979).

24

Tabel 8 Karakter fisiologi biokimia 3 bakteri endofit dengan bakteri pembanding Karakterisasi Pigmen kuning Karakteristik optic Bentuk Elevasi Margin Permukaan Gram stain Bentuk sel Diameter sel (µm) Flouroscent Red or orange colony Violet colony Motil Glukosa Sukrosa Galaktosa Innositol Xylose Sorbitol Manitol Cellubios KOH Katalase Oksidase Urease Kemiripan

Bb4

Enterobacter sp.

+

Iridescent

Opaque Irregular Raised Entire Halus mengkilap Negatif Bacil

Isolat uji dan bakteri pembanding Pseudomonas Ca9 sp. +

+/-

-

Translucent

Bulat Raised Entire

Negatif Bacil

Negatif Bacil

Negatif Coccus

Negatif Bacil

0.3-1.5

1x0.25

0.5-1.0

1x0.5

0.3-1.5

+

+/-

-

+/-

+ + + + + + + + + + + +

+/+

+ ++g + + + + + + + + + -

+ ++g + +

+ ++g

+ + +

92%

-

Translucent

Halus

+ ++g + + + + + + + + -

Enterobacter cloaca

Irregular Convex Undulate Halus mengkilap Negatif Bacil

Convex Entire

1x0.5

Bd3

+ +/82%

Flat Entire

+ + + +

81%

+

Keterangan : g ada gelembung gas, +/- beberapa spesies bereaksi positif atau negatif

Secara berurutan, karakteristik morfologi dan biokimia siolat Bb4, Ca9 dan Bd3 memiliki kemiripan 92%, 81% dan 82% dengan spesies pembanding Enterobacter sp., Enterobacter cloacae dan Pseudomonas sp. berdasarkan pada pada Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al. 1994) dan The Prokaryotes (Grimont dan Grimont 2006) yang tersaji pada Tabel 8. Hasil perbandingan antara isolat bakteri endofit dengan spesies pembanding tidak begitu mirip, hal tersebut mendukung dugaan pada hasil identifikasi molekuler bahwa isolat Bb4, Ca9 dan Bd3 kemungkinan besar merupakan genus baru dari kelas Proteobacteria.

25

PEMBAHASAN UMUM

Eksplorasi bakteri endofit pada tanaman A. decurrens di tiga titik lokasi pengambilan sampel yang terletak di kawasan taman nasional gunung Merapi (Selo dan Cangkringan) dan gunung Merbabu merupakan yang pertama kali dilaporkan khususnya di Indonesia. Dari hasil isolasi bakteri endofit melalui tahapan sterilisasi permukaan, diperoleh 48 isolat dari jaringan pada akar, batang dan daun A. decurrens. Reaksi hemolisis yang ditunjukkan 13 isolat pada uji patogenitas mengindikasikan bahwa isolat-isolat tersebut berpotensi menyebabkan penyakit pada hewan dan manusia. sama halnya dengan uji hipersensitif, 3 dari isolat-isolat yang telah lolos uji sebelumnya menunjukkan potensi menyebabkan penyakit pada tanaman yang didasarkan pada respon hipersensitif berupa reaksi nekrosis yang merupakan respon atau bentuk pertahanan diri dari tanaman tembakau. Tahapan seleksi selanjutnya yang berupa pengaruh bakteri endofit terhadap perkecambahan dan pertumbuhan benih padi secara relatif menunjukkan peningkatan pertumbuhan dibandingkan dengan kontrol yang tanpa pemberian inokulan. Dalam bidang pertanian, ketersediaan unsur hara N umumnya merupakan faktor pembatas dalam produksi tanaman budidaya. Ironisnya, sekitar 80% penyusun atmosfer berupa nitrogen dalam bentuk dinitrogen (N 2) yang tidak tersedia bagi tanaman. Suplai nitrogen untuk tanaman umumnya melalui penambahan pupuk kimia ataupun dengan penambatan N secara biologis. Beberapa jenis mikroorganisme mampu melakukan penambatan N2 dan mengubahnya kedalam bentuk tersedia bagi tanaman. Berbagai jenis bakteri endofit penambat N2 juga telah banyak diteliti (Doty 2011). Pada penelitian ini, sepuluh isolat terpilih dari hasil seleksi terbukti mampu menambat N2 terlihat dari pelikel putih yang terbentuk pada media bebas N pada uji kualitatif. Selain itu, kesepuluh isolat tersebut juga menunjukkan reaksi positif pada uji aktifitas nitrogenase melalui gas etilen dengan hasil terbaik ditunjukkan oleh isolat Bd3. Sama halnya dengan uji kemampuan bakteri endofit dalam menambat N 2, keseluruhan isolat terpilih juga mampu memproduksi IAA dengan hasil terbaik ditunjukkan oleh isolat Bd3. Fosfat (P) merupakan salah satu unsur hara makro esensial dan menjadi pembatas bagi pertumbuhan tanaman karena ketersediaannya bagi tanaman di dalam tanah yang rendah (Feng et al. 2004). Aktifitas metabolisme bakteri yang tidak kalah pentingnya yaitu kemampuan dalam menghasilkan asam-asam organik. Telah diketahui bersama bahwa asam-asam organik berperan penting dalam melarutkan fosfat yang sukar larut. Berdasarkan dari hasil penelitian ini, lebih dari separuh dari keseluruhan isolat uji terbukti mampu melarutkan fosfat dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni yang tumbuh pada media Pikovskaya. Hasil tersebut juga menyatakan bahwa isolat bakteri endofit yang diisolasi dari jaringan tanaman A. decurrens selain mampu menambat N2 dan memproduksi IAA, juga mampu dalam melarutkan fosfat. Peran bakteri endofit dalam mendukung pertumbuhan tanaman terdiri dari dua cara yaitu secara langsung dan tidak langsung. Secara langsung bakteri endofit membantu tanaman dalam menyediakan hara ataupun zat pemacu tumbuh yang dapat langsung

26

dimanfaatkan oleh tanaman. Kemampuan bakteri endofit dalam menghambat pertumbuhan mikrob patogen merupakan peranan yang secara tidak langsung mendukung pertumbuhan tanaman. Seperti halnya dengan kemampuan isolat Ca9 dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen X. oryzae pv. oryzae dan isolat Bb4 dalam menghambat pertumbuhan cendawan patogen berupa R. solani. Kemampuan-kemampuan yang ditunjukkan kesepuluh isolat bakteri endofit tersebut mendukung pemilihan isolat-isolat tersebut pada uji daya kecambah dan pertumbuhan benih padi. Hasil karakterisasi bakteri endofit yang berasal dari tanaman A. decurrens mengungkapkan bahwa keberadaan tanaman tersebut di Indonesia sebagai tanaman dengan kemampuan tumbuh cepat dan daya adaptasi tinggi berkaitan erat dengan peranan bakteri pemacu tumbuh tanaman. Bakteri pemacu tumbuh tanaman (PGPB) (Bashan dan Holguin 1998), telah banyak dimanfaatkan melalui aplikasi terhadap tanaman-tanaman agrikultur dengan tujuan meningkatkan pertumbuhan tanaman (Gururani et al. 2013). Sama halnya dengan isolat Bb4, Bd3 dan Ca9 yang merupakan isolat-isolat terbaik dalam meningkatkan pertumbuhan vegetatif tanaman padi dengan penambahan separuh dosis rekomendasi pupuk N, P dan K. Perlakuan Bb4, Bd3 dan Ca9 yang berdasarakan hasil uji DMRT tidak berbeda nyata dibandingkan perlakuan dengan dosis penuh pupuk N, P dan K. Dari hasil percobaan ini, ketiga isolat tersebut merupakan isolat-isolat unggul yang mampu menutupi penggunaan 50% pupuk sintetik. Isolat Bb4 merupakan penambat N2 dan penghasil zat pemacu tumbuh (ZPT) IAA sekaligus juga mampu menghambat pertumbuhan cendawan penyebab penyakit pada tanaman berupa R. solani, demikian juga isolat Ca9 selain mampu menambat N2 dan memproduksi ZPT, isolat tersebut memiliki keunggulan dalam menghambat pertumbuhan bakteri penyebab penyakit hawar daun pada padi. Isolat Bd3 merupakan bakteri endofit dengan kemampuan terbaik dalam menambat N2 dan menghasilkan IAA. Berdasarkan pada hasil sekuensing gen 16S rRNA, isolat Bb4, Bd3 dan Ca9 memiliki kemiripan dengan masing-masing spesies padanan pada situs databes EMBL dengan homolgi dibawah 97%. Menurut Drancourt et al. (2000), isolat dengan tingkat homologi dibawah 97% memungkinkan tergolong sebagai genus baru. Berdasarkan hal tersebut, ketiga isolat-isolat bakteri endofit tersebut kemungkinan besar tergolong kedalam genus baru dari kelas -Proteobacteria. Pernyataan tersebut juga didukung oleh hasil karakterisasi morfologi dan biokimia ketiga isolat tersebut dan dibandingkan dengan spesies padanannya masingmasing.

27

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa sebanyak 48 isolat bakteri endofit berhasil diisolasi dari jaringan pada akar, batang dan daun A. decurrens yang tumbuh di kawasan taman nasional gunung Merapi dan Merbabu. Setelah dilakukan seleksi melalui uji patogenitas dan uji daya kecambah dan pertumbuhan benih padi, diperoleh 10 isolat terpilih. Isolat-isolat tersebut dilanjutkan pada tahap karakterisasi melalui uji penambatan N2, memproduksi IAA, melarutkan fosfat, melarutkan kalium, dan menghambat pertumbuhan mikrob patogen. Berdasarkan karakterisasi tersebut, diperoleh hasil bahwa kesepuluh isolat uji mampu menambat N2 dan memproduksi IAA, enam isolat mampu melarutkan fosfat, satu isolat dengan kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri patogen (X. oryzae pv. oryzae) dan satu lagi dengan cendawan patogen (R. solani). Kesepuluh isolat terpilih diuji dalam meningkatkan pertumbuhan vegetatif tanaman padi. Dari hasil uji tersebut, perlakuan Bb4, Bd3 dan Ca9 ditambah dengan separuh dosis rekomendasi pupuk NPK mampu mengimbangi kontrol dengan dosis rekomendasi. Isolat Bb4, Bd3 dan Ca9 diidentifikasi berdasarkan gen parsial 16S rRNA. Setelah disekuensing, isolat Bb4 terbukti memiliki kemiripan 96,4% dengan spesies padanan Enterobacter sp. strain HT-Z87-B1, isolat Bd3 memiliki kemiripan 96,1% dengan Enterobacter cloacae strain THGT1 dan isolat Ca9 memiliki kemiripan terdekat 96.2% dengan Pseudomonas sp. strain Bio 103. Dari hasil identifikasi molekuler dan karakterisasi morfologi dan biokimia, ketiga isolat tersebut kemungkinan besar merupakan genus baru dari kelas -Proteobacteria.

Saran Perlunya penelitian lebih lanjut mengenai peranan bakteri endofit dari tanaman A. decurrens dalam hal membantu pertumbuhan tanaman padi hingga pada fase generatif.

28

DAFTAR PUSTAKA

Afzal M. Khan QM. Sessitsch A. 2014. Endophytic bacteria: prospects and applications for the phytoremediation of organic pollutants. Chemosphere.117:232-242. Ahemad M, Khan MS. 2010. Plant growth promoting activities of phosphatesolubilizing Enterobacter asburiae as influenced by fungicides. EurAsia J BioSci. 4:88-95. doi: 10.5053/ejobios.2010.4.0.11 Atashpaz S, Khani S, Barzegari A, Barar J, Vahed SZ, Azarbaijani R, Omidi Y. 2010. Arobust universal method for extraction of genomic DNA from bacterial species. Microbiology. 79(4):538-542. Baldani VLD, Baldani JI, Olivares F, Do¨bereiner J. 1992. Identification and ecology of Herbaspirillum seropedicae and the closely related Pseudomonas rubrisubalbicans. Symbiosis. 13:65-73. Bashan Y, Holguin, G. 1998. Proposal for the division of plant growth-promoting rhizobacteria into two classifications: biocontrol-PGPB (plant growthpromoting bacteria) and PGPB. Soil Biology and Biochemistry. 30(8):12251228. Brooks DS, Gonzalez CF, Appel DN, Filer TH. 1994. Evaluation of endophytic bacteria as potential biological-control agents for Oak Wilt. Biol. Control. 4(4):373-381. Bürgmann, H, Widmer F, Von Sigler W, Zeyer J. 2004. New molecular screening tools for analysis of free-living diazotrophs in soil. Appl. Environ. Microbiol. 70:240-247. Burley J, Youngquist J, Evans J. 2004. Encyclopedia of forest sciences. Elsevier. Chandra TJ, Mani PS. 2011. A study of 2 rapid tests to differentiate Gram positive and Gram negative aerobic bacteria. J Med Allied Sci. 1(2):84-85. Diep CN, Hieu TN. 2013. Phosphate and potassium solubilizing bacteria from weathered materials of denatured rock mountain, Ha Tien, Kiên Giang province, Vietnam. J Life Sci. 1(3):88-92. Doty SL. 2011. Nitrogen-fixing endophytic bacteria for improved plant growth. Maheswari DK, editor. In Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Responses. Springer Berlin Heidelberg: pp. 183-199. Doty SL, Oakley B, Xin G, Kang JW, Singleton G, Khan Z, Vajzovic A, Staley JT. 2009. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47:23–33 Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, Martelin R, Gayral JP, Raolti D. 2000. 16 Ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinic unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol. 38(10):36233630 Duan JL, Li XJ, Gao JM, Wang DS, Yan Y, Xue QH. 2013. Isolation and identification of endophytic bacteria from root tissues of Salvia miltiorrhiza Bge. and determination of their bioactivities. Annals Microbiol. 63(4): 1501-1512. Feng K, Lu HM, Sheng HJ, Wang XL, Mao J, 2004. Effect of organic ligands on biological avail- ability of inorganic phosphorus in soils. Pedosphere.14:8592.

29

Feng Y, Shen D, Song W. 2006. Rice endophyte Pantoeaagglomerans YS19 promotes host plant growth and affects allocations of host photosynthates. J Appl Microbiol. 100(5):938-945. Frankenberger WT, Poth M. 1987. Biosynthesis of indole-3-acetic acid by the pine ectomycorrhizal fungus Pisolithustinctorius. Appl. Environ. Microbiol. 53(12):2908-2913. Furutani A. 2009. Molecular biological studies of the pathogenicity of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae. J Gen Plant Pathol. 75(6):458–459. doi: 10.1007/s10327-009-0194-9 Gardner FP, Pearce RB, Mitchell L. 1985. Physiology of crop plant. Ames (US). The lowa State University. Gao Y, Liu Q, Zang P, Li X, Ji Q, He Z, Zhao Y, Yang H, Zhao X, Zhang L. (2015). An endophytic bacterium isolated from Panax ginseng C.A. Meyer enhances growth, reduces morbidity, and stimulates ginsenoside biosynthesis. Phytochem. Lett. 11:132-138. Glushenkova AI. 2012. Leguminosae. In Azimova SS, Glushenkova AI (eds). Lipids, Lipophilic Components and Essential Oils from Plant Sources. London (GB): Springer. p552. Gothwal RK, Nigam VK, Mohan M K, Sasmal D, Ghosh P. 2007. Screening of nitrogen fixers from rhizospheric bacterial isolates associated with important desert plants. Appl. Ecol. Environ. Res. 6(2):101-109. Grimont F, Grimont PA. 2006. The genus Enterobacter. In The prokaryotes. New York (US): Springer. p 197-214. Grosch R, Faltin F, Lottmann, J, Kofoet A, Berg G. 2005. Effectiveness of 3 antagonistic bacterial isolates to control Rhizoctonia solani Kühn on lettuce and potato. Canadian Journal of Microbiology. 51(4):345-353. Gururani MA, Upadhyaya CP, Baskar V, Venkatesh J, Nookaraju A, Park SW. 2013. Plant growth-promoting rhizobacteria enhance abiotic stress tolerance in Solanum tuberosum through inducing changes in the expression of ROSscavenging enzymes and improved photosynthetic performance. Journal of plant growth regulation, 32(2):245-258. Gusmaini. 2014. Pemanfataan Bakteri Endofit untuk Meningkatkan Produksi dan Kadar Andrografolid pada Tanaman Sambiloto (Andrographis paniculata). [disertasi]. Bogor (ID). Institut Pertanian Bogor Hallmann J, Berg G, Schulz B. 2006. Isolation procedures for endophytic microorganisms. Soil Biol. 9:299-319. Hammond-Kosack KE, Jones JDG. 1996. Resistance gene-dependent plant defense responses. Plant Cell. 8:1773-1791. Hidayati U. 2014. Potensi bakteri endofit asal tanaman karet sebagai pemacu pertumbuhan bibit batang bawah tanaman karet (hevea brasiliensis Müll. Arg) [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition. USA (US): Lippincott Williams & Wilkins. Hu X, Chen J, Guo J. 2006. Two phosphate-and potassium-solubilizing bacteria isolated from Tianmu Mountain, Zhejiang, China. World J. Microbiol. Biotech. 22(9):983-990.

30

Izumi H. (2011). Diversity of endophytic bacteria in forest trees. In Pirttil¨a AM, Frank AC, editor. Endophytes of Forest Trees: Biology and Applications. Springer Netherlands. p 95-105. Ji SH, Gururani MA, Chun SC. 2014. Isolation and characterization of plant growth promoting endophytic diazotrophic bacteria from Korean rice cultivars. Microbiol Res. 169(1):83-98. Kim WG, Weon HY, LeeSY. 2008. In vitro antagonistic effects of Bacilli isolates against four soilborne plant pathogenic fungi. Plant Pathology J. 24(1):5257. Kpomblekou-A K, Tabatabai MA. 1994. Effect of organic acids on release of phosphorus from phosphate rocks. Soil Science. 158(6):442–453. Mac Faddin JF. 1979. Biochemical test for identification of medical bacteria. Baltimore (US). The Wiliiam and Wilkins Company. Maheshwari DK, Dubey RC, Aeron A, Kumar B, Kumar S, Tewari S, Arora NK. 2012. Integrated approach for disease management and growth enhancement of Sesamum indicum L. utilizing Azotobacter chroococcum TRA2 and chemical fertilizer. World J. Microbiol. Biotechnol. 28(10):3015-3024. Meena VS, Maurya BR, Verma JP, Aeron A, Kumar A, Kim K, Bajpai VK. 2015. Potassium solubilizing rhizobacteria (KSR): Isolation, identification, and Krelease dynamics from waste mica. Ecol. Engineering. 81:340–347. Mercado-Blanco J, Bakker PA. 2007. Interactions between plants and beneficial Pseudomonas spp.: exploiting bacterial traits for crop protection. Antonie van Leeuwenhoek, 92(4), 367-389. Mocali S, Bertelli E, Di Cello F, Mengoni A, Sfalanga A, Viliani F, Fani R. 2003. Fluctuation of bacteria isolated from elm tissues during different seasons and from different plant organs. Res in Microbiol. 154(2):105-114. Mollica ML, Van Elsas JD, Penido EG. 1985. An improved method to detect acetylene-reducing activity in Bacillus strains. J. Microbiol. Methods. 3(3):147-157. Moore FP, Barac T, Borremans B, Oeyen L, Vangronsveld J, Van der Lelie D, Moore ER. 2006. Endophytic bacterial diversity in poplar trees growing on a BTEX-contaminated site: the characterisation of isolates with potential to enhance phytoremediation. Sys Appl Microbiol. 29(7):539-556. Muthukumarasamy R, Kang UG, Park KD, Jeon WT, Park CY, Cho YS, Kwon SW, Song J, Roh DH, Revathi G. 2007. Enumeration, isolation and identification of diazotrophs from Korean wetland rice varieties grown with long‐term application of N and compost and their short‐term inoculation effect on rice plants. J Appl Microbiol. 102(4):981-991. Neeraja CN, Vijayabhanu N, Shenoy VV, Reddy CS, Sarma NP. 2002. RAPD analysis of Indian isolates of rice sheath blight fungus Rhizoctonia solani. J Palant Biochemi & Biotechnol. 11:43-48. Nuswantara S, Fujie M, Sukiman HI, Yamashita M, Yamada T, Murooka Y. 1997. Phylogeny of bacterial symbionts of the leguminous tree Acacia mangium. J Fermentation and Bioengineering. 84(6):511-518. Parani K, Saha BK. 2012. Prospects of using phosphate solubilizing Pseudomonas as bio fertilizer. Eur J Biol Sci. 4 (2):40-44.

31

Puente ME, Li CY, Bashana Y. 2009. Endophytic bacteria in cacti seeds can improve the development of cactus seedlings. Environmental and Experimental Botany. 66(1):402–408. Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS microbiology letters. 278(1):1-9. Santosa DA. 2001. Rapid extraction and purification of environmental DNA for molecular cloning applications and molecular diversity studies. Mol Biotech. 17(1):59-64. Saraswati R, Husen E, Simanungkalit RDM. 2007. Metode Analisis Biologi Tanah. Jakarta (ID): Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian. Schaad NW, Jones JB, Chun W. 2001. Plant Pathogenic Bacteria. Ed ke-3. The Minnesota: American Phytopatological Society Sharma SD, Sharma NC, Sharma CL, Kumar P, Chandel A. 2012. Glomus– Azotobacter symbiosis in apple under reduced inorganic nutrient fertilization for sustainable and economic orcharding enterprise. Scientia Hortic. 146:175–181 Shu-Xin TU, Zhi-Fen GUO, Jin-He SUN. 2007. Effect of oxalic acid on potassium release from typical Chinese soils and minerals. Pedosphere, 17(4):457-466. Strobel G, Daisy B. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiol. Mol. Biol. Reviews 67(4):491-502. Subba-Rao NS. 1982. Advances in agricultural microbiology. In Subba-Rao NS, editor. Studies in agriculture and food science. London (GB): Butterworth Scientific: p 295-303. Sundin GW, Jacobs JL. 1999. Ultraviolet radiation (UVR) sensitivity analysis and UVR survival strategies of a bacterial community from the phyllosphere of field-grown peanut (Arachis hypogea L.). Microb. Ecol. 38:27-38. Taghavi S, Garafola C, Monchy S, Newman L, Hoffman A, Weyens N, van der Lelie D. 2009. Genome survey and characterization of endophytic bacteria exhibiting a beneficial effect on growth and development of poplar trees. Appl Environ Microbiol. 75(3):748-757. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30(12):27252729. Terakado-Tonooka J, Ohwaki Y, Yamakawa H, Tanaka F, Yoneyama T, Fujihara S. 2008. Expressed nifH genes of endophytic bacteria detected in fieldgrown sweet potatoes (Ipomoea batatas L.). Microbes and Environ. 23(1): 89-93. Toledo I, Lioret L, Martínez-Romero E. 2003. Sinorhizobium americanus sp. nov., a new Sinorhizobium species nodulating native Acacia spp. in Mexico. System Appl. Microbiol. 26(1):54-64. Torres AR, Araujo WL, Cursino L, Hungria M, Plotegher F, Mostasso FL, Azevedo JL. 2008. Diversity of endophytic enterobacteria associated with different host plants. J Microbiol. 46(4), 373-379.

32

Wang ET, Tan ZY, Guo XW, Rodríguez-Duran R, Boll G, Martínez-Romero E. 2006. Diverse endophytic bacteria isolated from a leguminous tree Conzattia multiflora grown in Mexico. Arch. Microbiol. 186(4):251-259. Zayed MS. 2012. Improvement of growth and nutritional quality of Moringa oleifera using different biofertilizers. Annals Agric. Sci. 57(1):53-62. Zhang L, Hurek T, Reinhold-Hurek B. 2007. A nifH-based oligonucleotide microarray for functional diagnostics of nitrogen-fixing microorganisms. Microbial Ecol. 53(3):456-470. Zhang C, Kong F. (2014). Isolation and identification of potassium-solubilizing bacteria from tobacco rhizospheric soil and their effect on tobacco plants. Soil Ecology. 82:18–25. Zimbro MJ, Power DA, Miller SM, Wilson GE, Jhonson JA. 2009. Difco & BBL manual: manual of microbiological culture media. Second edition. Maryland, Becton, Dickinson and Company.

33

LAMPIRAN

Lampiran 1 Kurva standar dan grafik pertumbuhan 10 bakteri endofit

y = 2.11E+08x - 6.34E+07 R² = 9.24E-01

5.00E+07 0.00E+00 0.2

0.4 0.6 Absorbansi

0.8

1

0

1.50E+08 y = 1.54E+08x - 5.20E+06 R² = 9.42E-01 1.00E+08

SPK/ml

5.00E+07

3.00E+08 2.00E+08 1.00E+08 0.00E+00

0

0.5

1

0

Absorbansi

Kurva Standar Ba1 y = 6.76E+07x + 1.31E+05 R² = 9.35E-01

6.00E+07 2.00E+07 0.00E+00 0

0.5 Absorbansi

1.00E+08 0

0.5 Absorbansi

1

Kurva Standar Ba3 4.00E+07

y = 1.73E+08x - 6.81E+06 R² = 9.96E-01

2.00E+08

2.00E+08

0.00E+00

1

Kurva Standar Ad1 3.00E+08

1

y = 3.83E+08x - 8.45E+07 R² = 9.68E-01

3.00E+08 SPK/ml

4.00E+07

0.5 Absorbansi

Kurva Standar Bd3

SPK/ml

SPK/ml

1

y = 4.93E+08x - 1.01E+08 R² = 9.62E-01

4.00E+08

0.00E+00

SPK/ml

0.5 Absorbansi

Kurva Standar Bb4

Kurva Standar Ca1 SPK/ml

2.00E+07 0.00E+00

0

8.00E+07

y = 5.69E+07x - 3.78E+05 R² = 9.24E-01

4.00E+07 SPK/ml

1.00E+08 SPK/ml

Kurva Standar Ca9

Kurva Standar Ad2

1.50E+08

1.00E+08 0.00E+00

y = 4.10E+07x - 8.44E+05 R² = 8.99E-01

3.00E+07 2.00E+07 1.00E+07 0.00E+00

0

0.5 1 Absorbansi

1.5

0

0.2Absorbansi 0.4 0.6

0.8

34

Kurva Standar Aa2

3.00E+08 y = 4.08E+08x - 6.23E+07 R² = 9.30E-01 2.00E+08 1.00E+08 0.00E+00 0

0.2

0.4

0.6

y = 4.09E+08x - 1.12E+08 R² = 9.66E-01

SPK/ml

4.00E+08

0.8

3.00E+08 2.00E+08 1.00E+08 0.00E+00

Absorbansi

0

1 Absorbansi

2

1.2 1.0

Ca1 Aa2

0.8 Absorbansi

SPK/ml

Kurva Standar Ba2

Ba2 Ba3

0.6

Ad1 Ca9

0.4

Bd3 0.2

Ba1 Ad2

0.0

Bb4 0

4

8

12

16

20

24 Jam ke-

28

32

36

40

48

52

35

Lampiran 2 Karakteristik morfologi koloni 48 bakteri endofit 1. Merapi Selo No

Isolat

Bentuk

Elevasi

Pinggiran

Warna

Permukaan

1.

Aa1

Bulat

Flat

Entire

Putih

Halus

2.

Aa2

Irregular

Flat

Undulate

3.

Aa3

Bulat

Convex

Entire

4.

Aa4

Bulat

Raised

Entire

Putih

5.

Aa5

Irregular

Flat

Undulate

Putih

Halus

6.

Aa6

Bulat

Raised

Entire

Putih bening

Halus mengkilap

7.

Aa7

Bulat

Convex

Entire

Putih

Kering

8.

Aa8

Bulat

Raised

Entire

Kuning

Halus mengkilap

9.

Aa9

Irregular

Flat

Undulate

Putih

Kasar

10.

Ab1

Bulat

Raised

Undulate

Putih

Halus

11.

Ab2

Irregular

Flat

Entire

Putih

Halus

12.

Ab3

Irregular

Raised

Undulate

Putih

Halus

13.

Ad1

Bulat

flat

Undulate

Putih

Halus mengkilap

14.

Ad2

Irregular

Raised

Filamentous

Putih kekuningan

Kasar

15.

Ad3

Irregular

Flat

Undulate

Putih

Kering

Putih kecoklatan Kuning buram

Halus Halus mengkilap Halus mengkilap

2. Merapi Cangkringan No.

Isolat

Bentuk

Elevasi

Pinggiran

Warna

Permukaan

1

Ba1

Bulat

Raised

Entire

Putih

Kering

2

Ba2

Bulat

Raised

Entire

Putih

Halus

3

Ba3

Rhizoid

Flat

Filamentous

Putih

Berkerut

4

Ba4

Bulat

Raised

Entire

Orange

5

Ba5

Bulat

Raised

Entire

Putih

6

Bb1

Irregular

Raised

Entire

Putih

Halus mengkilap Halus mengkilap Kering

36

7

Bb2

Bulat

Raised

Entire

Putih

Kering

8

Bb3

Bulat

Raised

Entire

Pink

Halus mengkilap

9

Bb4

irregular

Raised

Entire

Putih kekuningan

Mengkilap

10

Bd1

Bulat

Raised

Entire

Putih

Mengkerut

11

Bd2

Bulat

Raised

Entire

12

Bd3

Irregular

Convex

undulate

13

Bd4

bulat

raised

undulate

Bening kehijauan Putih bening Kuning bening

Halus mengkilap Halus mengkilap Halus mengkilap

14

Bd5

Irregular

Raised

Undulate

Putih

Kasar

Warna

Permukaan

3. Merbabu No

Isolat

Bentuk

Elevasi

Pinggiran

1.

Ca1

Bulat

Raised

Lobate

2.

Ca2

Bulat

Flat

Entire

3.

Ca3

Circular

Raised

Undulate

4.

Ca4

Circular

Raised

Entire

5.

Ca5

Bulat

Raised

Entire

6.

Ca6

Irregular

Flat

7.

Ca7

Bulat

8.

Ca8

9.

Putih kekuningan Putih kecoklatan

Kasar Kasar

Kuning

Mengkilap

Krem berpendar Hijau berpendar

Halus mengkilap Halus mengkilap

Lobate

Putih susu

Kasar

Raised

Entire

Putih kecoklatan

Kering

Bulat

Raised

Undulate

Putih

Ca9

Bulat

Raised

Entire

Berpendar (coklat)

10.

Ca10

Bulat

Flat

Entire

Putih

11.

Cb1

Bulat

Raised

Undulate

Krem

12.

Cb2

Bulat

Convex

Entire

Kuning pudar

Halus mengkilap Halus mengkilap Halus mengkilap Halus mengkilap Halus mengkilap

13.

Cb3

Irregular

Raised

Lobate

Putih

Kasar kering

14.

Cd1

Bulat

Flat

Undulate

Putih buram

Kering

15.

Cd2

Bulat

Raised

Entire

Krem berpenar

Halus mengkilap

37

16.

Cd3

Irregular

Raised

Lobate

17.

Cd4

Bulat

Raised

Undulate

18.

Cd5

Bulat

Raised

Undulate

19.

Cd6

Bulat

Convex

Entire

Putih susu Kuning pudar Berpendar putih Jingga

Kering Kasar Halus mengkilap Halus mengkilap

38

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jeneponto pada tanggal 20 September 1990 dari pasangan ayah Baso Amir dan ibu Siti Khalisah. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Takalar dan pada tahun yang sama lulus seleksi Universitas Negeri Makassar (UNM) pada Jurusan Biologi di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pengalaman selama menjadi mahasiswa di jurusan Biologi adalah aktif dalam organisasi internal kampus UNM diantaranya adalah pengurs Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) periode 2008-2009, Ketua Panitia Sport and Art (SPORA) tahun 2009, Anggota sekaligus pengurus Biro Fakultas MIPA di bidang kepecinta alama yaitu Wahana MIPA Pecinta Alam (WANAPANCA) periode 2010-2011, Pengurus Badan Eksekutuf Mahasiswa (BEM) FMIPA UNM periode 2010-2011, Ketua Umum WANAPANCA periode 2011-2012. Penulis menyelesaikan pendidikan S1 pada tahun 2012. Pada awal tahun 2013, penulis menekuni salah satu bahasa asing yaitu bahasa Inggris melalui kursus di beberapa lembaga di kampung Pare di Kediri, Jawa Timur. Pada tahun 2013 pula penulis mendapatkan beasiswa pendidikan dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI), Kementrian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi untuk calon dosen melalui Beasiswa Pascasarjana Pendidikan Dalam Negeri (BPPDN) tahun 2013 dan diterima di program studi pascasarjana mayor Bioteknologi Tanah dan Lingkungan, Insitut Pertanian Bogor.