Interferáló tényezők hatása a laboratóriumi eredmények értelmezésére

Interferáló tényezők hatása a laboratóriumi eredmények értelmezésére Dr. Siska Andrea vegyész Laboratóriumi Medicina Intézet Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Klinikai Központ

Zavaró tényezők  A preanalitikai fázisban felismerhetők (minta színe)  A beküldőtől származó információk alapján ismert  A vizsgálat elvégzése után derül ki

2010. január 28.

Általános ajánlások  minden mintát érkezés után vizuálisan ellenőrizni kell  dokumentáció  kérések áttekintése után: - nem érintett vizsgálatok elvégezhetők - előkezelés - interferáló tényező által nem zavart vizsgálati módszer alkalmazása

ha klinikailag releváns eltérés várható és sem előkezelés, sem metodikaváltás ezt nem tudja eliminálni, akkor a vizsgálatot nem ajánlott elvégezni, új mintát kell kérni

Eredményközlés  minden leleten legyen mintaleírás: rendben (appearance unremarkable), hemolizált, icterus-os, opaleszkáló, turbid/lipémiás

 a nem érintett vizsgálatokat külön kell jelezni  zavaró tényezők sikeres eliminálása után a leleten jelenjen meg az előkezelés ténye: pl. „Az erősen lipémiás mintát lipidmentesítő eljárás után mértük le. Az eredmény tájékoztató jellegű!”

 ha az interferáló tényező nem eliminálható és a módszer nem cserélhető: „a … zavarja a meghatározást” megjegyzés legyen a vizsgálat eredményének helyén

Haemolysis  Biokémiai, immunológiai, fizikai

és kémiai mechanizmusok okozzák  Complement-függő ~ (antitest okozza, ld. transfusio)  Fizikai ~ (hypotónia kiváltotta erythrocyta degradáció, csökkent vagy emelkedett nyomás)  Mechanikai hatás miatt kialakuló in-vivo ~ (katéter, szívbillentyű)  In-vitro kialakuló ~ (mintavétel, szállítás, centrifugálás, hőmérséklet)  Kontamináció okozta in-vitro ~ (bőrfertőtlenítőszer)

1

Detektálás:  Vizuális megfigyelés: >300mg/l Hgb (18,8 mmol/l) szabad szemmel látható  Spektrofotometriásan: bikromatikus  Analitikailag: szabad Hgb mérése In-vivo? Haptoglobin  Indirect bilirubin, retikulocita 

In-vitro?  szabad Hgb és az eritocyták egyéb komponensei  (K+, LDH, GOT) Haptoglobin nem változik!

In-vivo hemolízis feltételezhető, ha a beteg minden mintája hemolizált, az orvost azonnal értesíteni kell (egyidejűleg, ha szükséges, ellenőrizni a szintetikus hemoglobin származékok használatának lehetőségét).

Hemolízis okozta interferencia mechanizmusa:  Intracelluláris komponensek koncentrációjának emelkedése az extracelluláris térben (pl. K+, LDH, GOT)  Interferencia az alkalmazott analitikai módszerrel (direkt vagy indirekt módon)  Hemoglobin okozta optikai interferencia

Lipémia A hemolízis és az interferencia elkerülése:     

Dokumentálás (mindig)  kiértékelés Mintavételi eszközök és eljárás standardizálása Rendszeres képzés (mintavétel) Metodikaváltás Minta-előkezelés (fehérjementesítés, molekulaszűrők stb.)  Alkalmazott metodika módosítása (másodlagos hullámhossz megfelelő vakméréssel)  Ultrafiltráció (multilayer film technology)

 Szabad szemmel látható zavarosság Tg koncentráció >300 mg/dl (>3,4 mmol/l)  De: a mintában lévő lipidek típusától is függ!

Okok: -Tg koncentráció növekedése a szérumban/plazmában (étkezés, lipid infúzió, lipoprotein metabolizmus zavara) -De: a metabolikus rendellenesség okozta hipertrigliceridémia nem különböztethető meg az infúzió okozta emelkedéstől, hideg agglutinációtól, monoklonális immunglobulinoktól! -A szérum centrifugálás utáni koagulációja okozhat turbiditást (heparint kapó betegtől származó minta esetén)

A lipémia nem kikerülhető: diabetes mellitus, alkohol (etanol) fogyasztás, krónikus veseelégtelenség, hypothyreozis, pancreatitis, myeloma multiplex, primer biliáris cirrhosis, szisztémás lupus erythematosus, teljes parenterális táplálás, gyógyszerek (proteáz inhibitorok-HIV fertőzés, ösztrogén, szteroidok)

Detektálás:  Vizuális megfigyelés: szérumban, plazmában szabad szemmel látható Tg koncentráció >300 mg/dl (>3,4 mmol/l)  Abszorbancia mérés a turbiditás mértékének becslésére (>600 nm)  EDTA-s mintában csak rendkívül magas Tg szint (>1000 mg/l, azaz >11,3 mmol/l) okoz szabad szemmel is látható zavarosodást (hemoglobin koncentráció látszólag emelkedik a fényszórás miatt)

2

Lipémia okozta interferencia mechanizmusa:  spektrofotometriás vizsgálat: alacsonyabb vagy magasabb lehet az eredmény a ténylegesnél (fényszórás, abszorpció)

A lipémia és a turbiditás okozta interferencia elkerülése:  Vérvétel előtti előírások betartása (ld. éhgyomor, lipid infúzió)  Lipoproteinek kivonása szérumból/plazmából:

 térfogat-kihasználás-hatás (depletion): alacsonyabb Na+, K+ szint (lángfotometria, indirekt meghatározások)

• centrifugálás • extrakció (Frigen, polietilén-glikol) • Tg gazdag lipoproteinek precipitálása (polianion, cyclodextrin) • mágneses szemcsék • egyéb (Freon 113, dextrán-szulfát 500 S, Aerosil 300, butanol/diizopropil-éter) • optikai tisztító módszer (triton X-100)

 inhomogenitás  fizikai-kémiai mechanizmus: lipofil összetevők kivonása a reakcióból

Lipoclear használata:  Pontos recept  Korlátozás:  A LipoClear nem használható  (1) lipid vizsgálathoz való tisztításra,  (2) alvadási vizsgálatokra szánt plazma tisztítására,  (3) monoklonális gammopátiás immunglobulinok becslésére.  A LipoClearrel kezelt minta esetén kb. 0,4-0,8 g/dl fehérje vesztéssel kell számolni a lipoproteinek mintából való kivonása miatt.  A foszfor szint kb. 10%-ot emelkedhet LipoClear használata után bizonyos analitikai rendszerekben.  A hígítatlan mintából mért ionokat nem kell 1,2-vel szorozni. (A kapott eredményeket a hígulás miatt 1,2vel kell szorozni, második kezelés után a szorzás 1,44gyel történik).

Centrifugálás:  általában: 10 perc 12 000g szükséges  chylomicronok okozta turbiditás esetén 1 000 g elegendő, hatékony  Ultracentrifugálás kell LD- és HD-lipoproteinek szeparáláshoz (30 perc, 40 000g)

Kiadható paraméterek: Albumin

GOT

Magnézium

Alk. foszfatáz

GPT

Karbamid

Amiláz

Húgysav

Kálium

Kálcium

LDH

Klór

Eredménykiadás Lipoclear-es kezelés után:  A fent felsorolt egyes paraméterekhez a külső megjegyzésbe: Az erősen lipémiás mintát lipidmentesítő eljárás után mértük le. Az eredmény tájékoztató jellegű!  A többi kért paraméter nem adható ki, érték helyére: A lipémia zavarja a meghatározást.

Ajánlás:    

Dokumentáció Átlátszó mintatartó Centrifugálás, mint alternatíva (10 perc, 10 000g) Kémiai anyagokkal történő lipidmentesítés esetén ellenőrizni: zavarja-e a mérési módszert a lipidmentesítő anyag használata  Lipidmentesítő eljárás utáni eredménykiadás esetén számolni kell a hígulással is  EDTA-s minta esetén: centrifugálás után a sejtmentes felülúszót pótolni azonos térfogatú izotóniás oldattal

3

Lipémia vizsgálatának nehézségei:  Nincs egységes humán lipid standard  A magas lipidtartalmú betegminta nem fagyasztható  Szimuláció: parenterális táplálásban használt növényi eredetű zsír emulzióval (Intralipid)  Komoly különbségek a fiziológiás mintából és a mesterségesen előállított lipémiás mintából mért eredmények között, pl. karbamid és a kálium esetén

a VLDL (kicsi: 27-35 nm, közepes: 35-60 nm, nagy: 60-200 nm) és a chylomicronok (70-10000 nm) adják a tejszerűséget, turbiditást a VLDL és chylomicron részecskék triglicerid tartalma is nagymértékben változatos, ezért csak a triglicerid direkt mérése nem mutat jó korrelációt a fényszórással IntraLipid összetétel: 1 literben van 200 ml szójabab olaj, 12 ml tojássárga foszfolipid, 22 ml glicerin és víz az IntraLipid (steril, nem pirogén zsíremulzió) más, mint a VLDL és chylomicron  részecske mérete: 200-600 nm (átlagosan 345 nm körüli), azaz hiányzik belőle a nagy VLDL és a magas chylomicron

Icterus Bilirubin interferencia vizsgálata: konjugálatlan (free) bilirubin és vízoldékony ditauro-bilirubin szérumhoz való hozzáadásával Vizeletben: konjugált bilirubin jelenik meg, ha a vérben is megnőtt a szintje (proteinuriás betegeknél albuminhoz kötött bilirubin jelenhet meg a vizeletben) CSF-ben: intracelebrális vérzést követően konjugálatlan (free) formában jelenik meg (látható xanthochromia), a megnövekedett permeábilitással (blood-brain barrier) pedig albuminhoz kötött bilirubin jelenhet meg

lipémia szimulációja: IntraLipid, vagy más szintetikus emulzió hozzáadásával a mintához  de az ilyen minták viselkedése nem olyan, mint a natív mintáknak az előforduló hibák típusai: (1) interferencia a natív mintánál, de az IntraLipidesnél nem (2) interferencia a IntraLipidesnél, de a natív mintánál nem (3) mindkét típusú minta interferenciát mutat, de az interferenciák irányában, vagy mértékében eltérőek

Icterus okozta interferencia mechanizmusa: spektrális interferencia:  a bilirubin 340-500 nm közötti magas abszorbanciája és az állandó magas háttér abszorbancia limitáló tényezők ezeken a hullámhosszakon (pl. turbidimetriás elvű analizátor esetén az AT III értékét klinikailag releváns módon megváltoztatja a 25 μmol/l-t meghaladó bilirubin koncentráció)  A fehérjementesítés nélküli módosított Jaffé metodikánál a bilirubin okozta interferencia fő oka az alkalikus közegben lejátszódó bilirubin oxidáció miatti abszorbancia-csökkenés  Erősen savas közegben a konjugált bilirubin abszorbanciája az UV tartomány felé tolódik, ez pedig a foszfát meghatározásban okoz interferenciát (foszfomolibdát metodika)

4

Detektálás és dokumentáció: Kémiai interferencia:  a bilirubin interferenciával számolni kell az oxidáz/peroxidáz alapú reakciókban: a bilirubin a koncentrációjával arányosan reakcióba lép az oxidáz/peroxidáz típusú metodikákban képződő H2O2dal, ezért a H2O2 felhasználódás miatt enzimatikus eljárásoknál szisztematikusan alacsonyabb eredményeket kapunk (pl. glükóz, koleszterin, karbamid és kreatinin meghatározás)

 A vizuális megfigyelés gyakran nem elég szenzitív módszer a hiperbilirubinémia felismerésére, ez különösen akkor igaz, amikor a mintát egyidejűleg más anyag is pigmentálja (pl. hemoglobin vagy származékai)  Gyakran a mintatartó címkéje is gátolja az alapos vizuális megfigyelést  Spektorfotometriásan nagyobb pontossággal határozható meg a hiperbilirubinémia: 450 és 575 nm közötti abszorpció mérés megfelelő mintahígítással (ezt az eljárást használják újszülöttek esetén a hiperbilirubinémia direkt mérésére)  Sok karotin, karotinoid fogyasztása esetén a direkt mérés felülbecslést okoz

A bilirubin interferencia elkerülése:

A hiperbilirubinémia nagy prevalenciája miatt (intenzív osztályos betegek, gasztroenterológiai, sebészeti, gyermek osztályok) fontos a bilirubin zavaró hatására kevésbé érzékeny metodikákat alkalmazni a laboratóriumban.

 Vak mérés a spektrális bilirubin interferencia eltávolítására (pl. Jaffé szerinti kinetikus kreatinin meghatározásban a módszer része a vak mérése)  A párhuzamos vakmérés jobb eredményt ad azoknál a metodikáknál, ahol a reagensek egymást követően mérődnek be a küvettába  A kémiai interferencia nem kerülhető el vak mérésével. A Trinder reakción alapuló H2O2 képződéssel járó enzimatikus eljárások esetén K4[Fe(CN)6] hozzáadás hatásos a bilirubin okozta interferencia eliminálásában (a Trinder reakció komponenseinek optimális koncentrációja is csökkenti a bilirubin interferenciát).  Nemionos tenzidek hozzáadása szintén csökkentheti az interferenciát (pl. foszfát meghatározás foszfomolibdát módszerrel)  Előkezelés (pl. bilirubin-oxidázzal – kicsi a stabilitása )  Ultraszűrés centrifugálással kombinálva

Szérumindex mérése

A szérumindex  Szemikvantitatív eljárás:

 A spektrumból számol: – mintahígítástól függő faktorok – Spektrum átfedések korrekciójára szolgáló faktorok (függetlenek a mintahígítástól, mert csak az abszorbanciák arányán alapulnak)

Lipaemia Icterus NADH

Abszorbancia

– icterus index – haemolysis index – lipaemia index (zavarosságmérés, nem a triglicerid cc-t méri!)

Haemolysis

340

480

505

Range 1

546

570

600

Range 2

660 700 Range 3

Hullámhossz (nm)

5

Triglicerid tartalom és a L-index (adatok: Modular PPP, 2009.06.15.-07.02.) 350 300

y = 6,0553x - 9,3925

Lipémia index

250

2

R = 0,399 200 150 100 50 0 3

6

9

12

15

18

21

24

27

30

Triglice rid tartalom (>3,4 mmol/l)

a triglicerid koncentráció kevéssé korrelál a lipémia index-szel

Szérumindex alkalmazása

Köszönöm a figyelmet!

 Minden minta esetén automatikusan mérhetjük  Minimális mintaigény, nincs reagensigény (fiz.só)  A szérumindex-táblázat alkalmazásával lehetővé válik az interferáló tényezők objektív megítélése  Az eredményeket validáló diplomások egységesen döntenek arról, hogy kiadható-e az eredmény vagy sem  Az eredmények megbízhatóak a gyógyító orvos számára az interferáló tényezők esetén is

6