Imunoreakce se značenými protilátkami
Kvantitativní stanovení antigenu/protilátky: precipitace - 30 g/ml
aglutinace - 1 g/ml
Neprecipitační imunochemické metody: RIA, FIA, EIA - 1 pg/ml
Rozdělení metod podle použitého značení • • • •
Radioaktivní Enzymatické Fluorescenční Luminiscenční
Typy imunoreakcí
Kompetitivní: neznačený analyt v testovaném vzorku soutěží o vazebná místa protilátek s přidaným značeným analytem Neznačený antigen blokuje vazbu značeného antigenu – čím méně signálu je naměřeno, tím vyšší koncentrace analytu (nepřímá úměra). Protilátka není v nadbytku, je přidáváno omezené množství, tak aby mohlo docházet ke kompetici
Typy imunoreakcí
Nekompetitivní (sendvičová analýza)
Obecně nejvyšší úroveň sensitivity a specifity Sendvič: analyt je vázán mezi dvěma specifickými protilátkami Protilátka je v nadbytku, takže všechen analyt je vyvázán Množství navázané značené protilátky je úměrné množství analytu ve vzorku
Homogenní vs heterogenní metody a) heterogenní - vyžadují separaci volné a vázané frakce analytu b) homogenní - nevyžadují separaci volné a vázané frakce analytu
Pokud navázání protilátky na antigen ovlivní intenzitu signálu značky (např. prostorovým blokováním, aktivního místa enzymu protilátkou), není důvod k separaci frakcí Homogenní metody jsou obecně používány při měření malých analytů (léky, drogy). Není vyžadováno oddělení komplexů Ab-Ag od volného Ag* rychlejší a jednodušší v provedení S enzymem se ale podařilo sestavit homogenní imunoanalýzu pouze pro několik dvojic hapten-enzym
Heterogenní imunoanalýza Metodu heterogenní imunoanalýzy lze sestrojit pro každou dvojici protilátkaantigen Stěžejní problém je separace volné a vázané frakce: chromatograficky, srážením imunokomplexů, nebo zakotvením neznačeného imunoreaktantu na pevnou fázi
Výsledky imunoanalýzy
kvalitativní Jediný kalibrační bod („cutoff“ bod) Výsledky jsou buď ‘pozitivní’ nebo ‘negativní’; (tj. nad nebo pod hodnotou cutoff) Možné falešně pozitivní výsledky; použití monoklonálních protilátek toto nebezpečí omezuje
kvantitativní Vztah mezi naměřenou hodnotou a koncentrací zkoumané látky určen z kalibrační křivky (obvykle 5 – 6 bodů) Problémy může způsobovat crossreaktivitita (protilátka se váže i na jiné podobné antigeny).
Radioimunoanalýza (RIA)
v roce 1960 (Berson a Yalow) - metoda pro stanovení koncentrace inzulinu v plazmě
První případ, kdy bylo možné stanovit hormonální hladinu z krve pomocí in vitro metody.
Využíváno v klinické praxi v mnoha oblastech: Endokrinologie (hladiny hormonů) v krvi digitoxin nebo digoxin u pacientů, kteří berou tyto léky Toxikologie: průkaz přítomnosti drog Krevní transfuze: přítomnost povrchového antigenu hepatitidy B HBsAg) v darované krvi Imunologie: anti-DNA protilátky u systémového lupus erythematosus (SLE).
RIA velmi citlivá metoda kompetitivní heterogenní metoda postup: Ab + Ag + Ag* v jedné směsi separace imunokomplexů měření aktivity, nepřímo úměrná množství Ag Různé techniky separace imunokomplexů • solid phase radioimmunoassay • sekundární precipitační protilátky • elektroforéza • ionexová chromatografie • precipitace přidáním solí • varianta se značenou protilátkou - IRMA
RIA
Značení - 125I a 131I pro proteinové antigeny, tritium nebo 14C pro nízkomolekulární látky. Radioaktivita se měří např. scintilací. Pro kvantifikaci nutná standardizace.
RIA Dva způsoby provedení 1. Smísí se Ag* (známá konc.) a Ag (neznámá konc.) a směs se inkubuje se specifickou protilátkou (volně v roztoku). Následuje přídavek sekundární protilátky, komplex AbAg/Ag* je takto precipitován, separován, v precipitátu se měří radioaktivita. Primární protilátka může být imobilizována, např. na stěně zkumavky, pak se zkumavka po přídavku směsi a inkubaci pouze vymyje. 2. Protilátka reaguje nejdříve pouze se značeným antigenem a přídavky neznačeného antigenu o různé koncentraci různě vytěsňují Ag* z vazby. Ab-Ag* se tak doplňuje Ab-Ag.
Provedení RIA – 1. způsob
Separace Ab-Ag komplexu pomocí sekundární protilátky – sraženina se separuje centrifugací
Imunoradiometrické stanovení (IRMA)
Nekompetitivní metoda
Použití dvou protilátek – jedna značená (125I), druhá neznačená
Neznačená protilátka imobilizována na stěně zkumavky
Veškerý stanovovaný antigen se vyváže na stěnu zkumavky
Promytí zkumavek
Volná značená protilátka/antigen zůstává v roztoku a je odmyta
Měření radioaktivity ve zkumavce př. stanovení parathormonu, C-peptidu
Nevýhody RIA •
Náročnost a riziko spojené s prací s radioaktivním materiálem
•
125I
•
Lidské tělo má tendenci koncentrovat atomy jódu (radioaktivní i neradioaktivní) ve štítné žláze
or 131I emitují gamma záření, které vyžaduje speciální zařízení
Gamma Counter
Enzymová Immunoassay (EIA)
Značení antigenu/protilátky enzymem detekce: podle povahy substrátu (spektrofotometrie)
Klasifikace: Heterogenní nebo homogenní Kompetitivní nebo nekompetitivní
výhoda: Srovnatelná citlivost s RIA výhoda: Odpadá práce s radioaktivitou nevýhoda: nebezpečí inhibice enzymu některými látkami v biologickém materiálu (např. salicyláty)
Enzymatická detekce Používané substráty pro křenovou peroxidázu (horseradish peroxidase HRP) v Ab-konjugátech:
Oxidace substrátu za přítomnosti peroxidu vodíku Chromogenní substráty ( barevný produkt - kolorimetrická detekce) 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidin (TMB) 2,2´-azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát) - ABTS o-fenylendiamin o-dianisidin o-toluidin Používané substráty pro alkalickou fosfatasu (AP) v Ab konjugátech: 4-nitrofenylfosfát
LIA (Luminiscence Immunoassay)
Chemiluminiscenční substráty (záblesky světla - detekce světla) SuperSignal ECL
Heterogenní enzymová assay – ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Nejběžnější imunoanalýza v biochemických a klinických laboratořích
Komplex Ab-Ag je imobilizován na pevný povrch – plastové mikrotitrační destičky
Stanovení koncentrace antigenů nebo protilátek
přímá úměra mezi koncentrací analytu a aktivitou enzymu
Varianty: přímá ELISA nepřímá ELISA Kompetitivní ELISA Sendvičová ELISA
Nepřímá (nekompetitivní) ELISA
Immobilizovaný antigen. Nejdříve se Ag inkubuje s primární protilátkou a její nadbytek se vymyje. Sekundární protilátka konjugát se váže na primární Ab, nadbytek se opět vymyje. Pozitivní reakce - ve vzorku musí být přítomna primární Ab. Podmínkou spolehlivosti je, že sekundární Ab neváže imobilizovaný Ag ani nepřilne na stěny mikrotitrační destičky.
Enzyme-linked immunosorbent assay Principle of ELISA/RIA (ELISA) 1
3
2
4
1. Potažení jamek antigenem 2. Přidání vzorku séra 3. Přídání enzymem značené protilátky (anti-human IgG) 4. Přidání substrátu 5. Odečtení barevné reakce
Sendvičová ELISA („capture“, „sandwich“ ELISA) Varianta se záchytem antigenu.
Protilátka vážící Ag je immobilizována (může to být i test jejího titru). Přídavek Ag, promytí. Přidá se značená protilátka, která váže zachycený Ag. Přísné podmínky – značená Ab nesmí reagovat s immobilizovanou Ab. Značená Ab by měla být z jiného obratlovce (králík - koza) a reaguje s jiným epitopem Nesmí být nespecifická vazba s pevnou fází.
Sendvičová ELISA („capture“, „sandwich“ ELISA) Varianta se záchytem protilátky. Immobilizovaná protilátka váže protilátky ze vzorku (např. lidské IgG, IgA nebo IgM ze zkoumaného séra pacientů).
Po vymytí se přidá specifický antigen a nakonec anti-Ag konjugát poskytující signál.
Značená Ab nesmí reagovat s Ab ve vzorku bez přítomnosti Ag.
Nesmí ani vytvářet nespecifickou vazbu s pevnou fází
ELISA - detekce
Při sendvičové ELISE může být použito i sekundární protilátky
Kompetitivní ELISA U kompetitivní ELISy se zkoumané sérum inkubuje společně se značeným anti-Ag konjugátem. Antigen je vázán na nosič. Kompetice o vazbu protilátky Nutná standardizace.
Kompetitivní ELISA – varianta s immobilizovanou protilátkou
Detekce antigenu v séru
Nespecifické vazby protilátek mohou být odstraněny blokováním stěn ELISA destiček 0.1% roztokem BSA.
EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) homogenní EIA antigen je navázán na enzym lyzozym malátdehydrogenáza, glukóza-6-fosfátdehydrogenáza protilátky kompetují o antigeny po vzniku imunokomplexu dochází k měřitelné změně aktivity enzymu • snížení – obvyklé, blokáda vazebného místa, konf. změna • zvýšení – jen tyroxin, konformační změna použití – stanovení koncentrace nízkomolekulárních látek (haptenů - léků a drog v tělních tekutinách) • léky – antibiotika, cytostatika, digoxin Kompetitivní • hormony – T3, T4, kortizol Homogenní Čím více antigenu tím více signálu
Avidin-biotin systém Zesilovací efekt: Avidin je glykoprotein (MW 68 Kd), který má vysokou afinitu k malé molekule (MW 24Kd) vitaminu biotinu, rozpustnému ve vodě. Biotin může být konjugován k celé řadě biomolekul, včetně protilátek, a to tak, že k jedné molekule protilátky může být připojeno mnoho molekul biotinu. Biotinylovaná protilátka potom může vázat několik molekul avidinu. Podobné vlastnosti jako avidin má také streptavidin (MW 60 Kd), izolovaný z bakterie Streptomyces avidinii .
Využití ELISA metod
výzkum humánní a veterinární diagnostika
Příklady : Screening dárců krve na virové infekce HIV-1 and HIV-2 (přítomnost anti-HIV protilátek) hepatitis C (přítomnost protilátek) hepatitis B (testování protilátek, antigenů)
Využití ELISA metod
Hormonální hladiny HCG (test těhotenství) LH (určení ovluace) TSH, T3 and T4 (funkce štítné žlázy) hormony (e.g., anabolika, HGH) u sportovců Detekce infekcí Sexuálně přenosné (HIV, syphilis, and chlamydia) hepatitis B and C Toxoplasma gondii
Využití ELISA metod
Detekce alergenů v jídle a prachu Stanovení revmatoidního faktoru, autoprotilátek u autoimunitních onemocnění (lupus erythematosus) Měření toxinů v kontaminovaném jídle Detekce drog kokain opiáty Δ-9-tetrahydrocannabinol
FIA (Fluoro Immuno Assay)
metody využívají toho, že některé látky po ozáření absorbují energii a se zpožděním jí část vyzáří Stokesův posun = rozdíl mezi vlnovou délkou pohlceného a vyzářeného záření heterogenní i homogenní uspořádání kompetitivní i nekompetitivní techniky (obdoba EIA) měření fluorescence je silně ovlivňováno prostředím (interference některých látek v séru, fluorescence trvá řádově nanosekundy) citlivější než měření radioaktivity stanovení nízko- i vysokomolekulárních látek značka: konjugovaný nebo kovalentně vázaný fluorochrom fluorescein-isothiokyanát (FITC) umbeliferon cheláty vzácných zemin (Eu, Tb, Sm) detekce: fluorometricky
Princip fluorimetru
Základní konstrukce fluorimetrů sestává ze zdroje zářivé energie, dvou optických separačních prvků a detektoru. Zdrojem záření jsou nejčastěji halogenové žárovky a xenonové výbojky. Světlo ze zdroje prochází buď interferenčním filtrem nebo mřížkovým monochromátorem. Dále prochází kyvetou s roztokem měřeného vzorku a emitovaná fluorescence se měří pod úhlem 90 °, kdy po průchodu filtrem nebo po difrakci reflexní mřížkou dopadá emitované světlo vybrané vlnové délky na fotonásobič. Fluorimetr obsahuje také pomocné optické prvky jako clonku, čočky a zrcadla; špičkový přístroj má navíc dělič paprsku přivádějící část světla k referenčnímu fotonásobiči.
Heterogenní FIA SepFIA = Separační FIA • značený antigen IFMA = ImmunoFluoroMetric Assay • značené protilátky MEIA = Microparticle Enzyme IA • mikročástice s protilátkou, na které se váže Ag • druhá protilátka s alkalickou fosfatázou • po separaci se přidá substrát a fosfatáza štěpí substrát (4-metylumbelliferylfosfát) na produkt s vyšší fluorescencí
Homogenní FIA jednoduché uspořádání je málo citlivé a použitelné jen na hapteny modifikace zvyšují přesnost i citlivost DELFIA FPIA
Fluorescent Polarized Immunoassay (FPIA)
homogenní, kompetitivní, značený Ag rovinně polarizované excitační záření malé molekuly v roztoku rychle rotují depolarizace záření po vazbě Ag* na protilátku se rotace zpomalí emitované fluorescenční záření zůstává polarizováno (polarizační filtry) stanovení malých molekul (např. nádorové markery, hormony, léky, vitamíny)
nepřímá úměra mezi koncentrací analytu a naměřenou fluorescencí
LIA (CLIA) ChemiLumminiscence ImmunoAssay
Chemiluminiscence se liší od ostatních luminiscenčních jevů tím, že excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po nástřiku syntetizovaného činidla, nebo se k aktivaci činidel využívá oxidace na anodě (elektrochemiluminiscence).
luminiscenční značka – chemiluminofor luminol, izoluminol (aktivace přidáním H2O2) luciferáza - luciferin citlivost je vyšší než u RIA modifikace: luminiscence zesílená enzymem (enzym AP) elektroluminiscence (ECLIA)
