Imunoanalýza nízkomolekulárních látek

Imunoanalýza nízkomolekulárních látek ZS 2008 A idi Avidin

Y

Ag Biotin

Vítězslav Maier, Juraj Ševčík

http://analytika.upol.cz/elektromigrace1

Imunoanalýza nízkomolekulární látek Biochemické analytické metody založené na biospecifických interakcích mezi stanovovanou látkou (analytem) a specifickém činidle. Imunoalýza – využití imunitních chemických (imunochemických) reakcí (interakcí) pro stanovení nízkomolekulárních i vysokoMolekulráních á í látek á Doporučená literatura: M Ferenčík: M. F čík IImunochémia, hé i Afl Afla, B Bratislava ti l (1989) (1989). J. Krejsek, O. Kopecký: Klinická imunologie, Nucleus HK, Pardubice (2004) s. 869-898. B. Králová, L. Fukal, P. Rauch, T. Ruml: Bioanalytické metody, VŠCHT, Praha (2008) V. Chromý, J. Fiścher, J. Havel, M. Votava, Bioanalytika, MU Brno, Brno (2002) V. Doležalová a kol.: Laboratorní technika v klinické biochemii a toxikologii, IDVPZ, Brno (1995). C.A. Burtis, E. Ashwood, D.E. Burns (Eds.): Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, 6th Ed., S Sounders d Elsevier, El i St St. L Louis, i Mi Missouri,i USA (20008) (20008). A. Johnstone, R. Thorre, Immunochemistry in Practice, 3rd Ed., Blackwell Science, Australia (1996). E.P. Diamandis,, T.K. Christopoulos p ((Eds.): ) Immunoassay, y, Academic Press,, San Diego, g , California, USA (1996). 2

Postavení Imunochemie v biovědách IMUNOCHEMIE MOLEKULOVÁ IMUNOLOGIE

KLINICKÁ IMUNOLOGIE

CHEMIE

MIKROBIOLOGIE

IMUNOPATOLOGIE

MIKROBIÁLNÍ IMUNOLOGIE

IMUNOBIOLOGIE

BUNĚČNÁ IMUNOLOGIE TRANSPLANTAČNÍ IMUNOLOGIE

BIOLOGIE

IMUNOLOGIE NÁDORŮ

PATOLOGIE

IMUNOLOGIE

GENETIKA FARMAKOLOGIE PSYCHONEUROLOGIE HEMATOLOGIE

MEDICÍNA IMUNOFARMAKOLOGIE IMUNOGENETIKA IMUNOLOGIE STÁRNUTÍ

PSYCHONEUROIMUNOLOGIE

IMUNOTOXIKOLOGIE

IMUNOHEMATOLOGIE

EKOIMUNOLOGIE

3

Významné objevy spojené s imunochemií 1906

F. OBERMAYER

Modifikované proteínové antigeny

E. PICK 1907

S. ARRHENIUS

monografie imunochemie

1917

Karl LANDSTEINER

hapteny

1929

Michael HEIDELBERGER kvantitatívní chemická serológie

1934

J. MARRACK

reakce antigen-protilátka

1938

Elvin KABAT

protilátky jako globulíny

Arne TISELIUS 1958

Rodneyy R. PORTER

struktura imunoglobulínů g

1959

Gerald M. EDELMAN

struktura imunoglobulinů

1966-68

K. ISHIZAKA

studium IgE

H. BENNICH S.G.O. JOHANSSON 4

Význam imunitního systému pro život Pro vznik života je potřebné: 1) Získávání volné energie a její přeměna do formy, která je využitelná pro uskutečňování biochemických p ý reakcí (základní ( roli hraje j ENZYM). ) 2) Přepis a přenos genetické informace (transkrice a replikace genů). 3) Získávání informací z vnější i vnitřního prostředí a jejich zpracování a převedení na koordinaci a regulaci životně důlěžitých procesů v živém organismu. Příjem a zpracování informací je i v současné době pro každou živou soustavu, buňku ň i jednotlivce podmínkou í existence – zabezpečuje č adaptaci na změny vnitřního i vnějšího prostředí.

Chemický (humorální) Informační systémy živých soustav

El kt Elektrochemický h i ký ((nervový) ý) Imunochemický (imunitní) 5

Imunitní systém – vývojově velmi starý I nejjednodušší mnohobuněční živočichové jako jsou houby mají „schopnost rozpoznast vlasní od cizího“. Důsledkem je odvrhnutí (nespojení) tkání nebo buněk geneticky různých jednotlivců. Příčinou je existence specifických znaků tzv. tkáňových antigenů na p povrchu buněk a jsou j produkty p y genů. g Imunitní systém – jde o difúzní orgán, který u dospělého člověka váží asi 1000 g. Skládá se z 1012 lymfocytů (specifický druh bílých krvinek) Z některých přídatných buněk (makrofágy, polymorfonukleární Leukocyty) k ) z 10 020 molekul l k l protilátek ilá k (imunoglobulinů) (i l b li ů) a z d dalších lší h Milionů molekul různých výkonných a regulačních látek imunohormony, složky komplementu, mikrobicidní a cytotoxické látky.

6

Formy imunity NESPECIFICKÁ (přirozená, vrozená) realizace • několik anatomických struktůr a fyziologické systémy g y , NK-buňky y (buňkové ( • fagocytóza, mechanizmy) • komplementový systém a mnohé cytokíny (humorální) podmínky • není potřebný předchádzející kontakt s antigénem • působí ihned po styku organizmu s antigenem • nemají imunologickou paměť využití • při očisťování tkání od cizorodých látek • v antiinfekční a protinádorové obrane

SPECIFICKÁ (získaná, adaptívní) realizace • výkonné a regulační T-lymfocyty (buňkové mechanizmy) • protilátky tilátk (h (humorální) ál í) podmínky • reagují jen s antigenem, který jich aktivoval • nepúsobí ihneď po styku organizmu g s antigénem g (po (p niekolika dnech) • majú imunologickou paměť využití • v antiinfekční a protinádorové obraně 7

Formy imunity PROSPEŠNÁ vznik imunity INERTNÍ imunologická tolerance ŠKODLIVÁ imunopatologické stavy (alergia, autoimunita) SYSTÉMOVÁ působí v celém organismu LOKÁLNÍ působí jen v určitých častech těla (sliznice nosní, nosní střeva) AKTIVNÍ postinfekční, ti f kč í postvakcinační t k i č í PASÍVNÍ transplacentový a kolostrální přenos, injekovaní antitoxických sér a gama-globulínu 8

Antigeny Anti = proti Gen = tvořit Antigen – makromolekulární látky, které imunitní systém rozpoznává jako cizí (přirozené i umělé). Po setkání s vhodným iniciátorem stimulují tvorbu protilátek, lymfokyninů A výkonných T-lymfocytů – vznikne „imunitní odpověď“ Kompletní (funkční) - imunogen Antigen Nekompletní (nefunkční) - hapten Imunogen – má schopnost navodit imunitní odpověď (vznik protilátek, regulačních a výkonných lymfocytů) a zároveň je specifický – má schopnost y yyap protilátkami reagovat. g s těmito lymfocyty 9

Látka má vlastnosti antigenu pouze tehdy splňuje‐li dva základní  předpoklady: •Látka musí mít složení odlišné od chemického složení organismu. •Látka musí být komplexní makromolekula.

Antigen tedy musí mít ve své molekule určité uskupení (část struktury, funkční skupiny, uskupení atomů), jimiž se odlišuje od všech struktur nalézajících se na površích imunokompetentních buněk – tyto buňky antigen rozpoznají jako cizí. Antigenní molekula musí mít dostatečně velkou molekulovou hmotnost (velikost) a musí mít komplexní strukturu. Tuto podmínku velmi dobře splňují makromolekuly (např (např. biopolymery). biopolymery) Malé molekuly (s Mr < 5000 Da) obecně nebývají imunogenní, ale po konjugaci s větší makrokomolekulou (např. protein) získavají imunogennost.

10

Specifita je založena na skutečnosti, že antigen reaguje pouze s těmi lymfocyty a protilátkami jejichž tvorbu vyvolal. S ostatními lymfocyty a protilátkami obyčejně nereaguje. Hapten není schopen vyvolat imunitní reakci – může pouze specificky reagovat S buňkami a protilátkami , které vznikly po interakci imunogenu s imunokompetentní buňkou.

Hapten je součástí molekuly kompletního antigenu Makromolekulárního nosiče Imunogen se skládá z Nízkomolekulární determinantní skupiny p y (determinant)

11

Jaké látky y mohou být ý imunogenem? g Přesná odpověď není známá ☺ Látka může být imunogenem pouze tehdy má-li určité fyzikální, chemické a biologické vlastnosti. Imunogennost takové látky ale závisí i na genetické dispozici organismu a vyspělosti organismu kterému se imunogen aplikuje a na způsobu aplikace organismu, aplikace. fyzikální Vl t Vlastnosti ti antigenu ti

chemické h i ké biologické

1. Fyzikální vlastnosti – molekulová hmostnost. Imunogeny patří mezi makromolekulární látky a mají většinou větší Mr než 5000.

Imunogeny

Nerozpustné (mikroorganismy, buňky, subcelulární struktury) Koloidní (rozpustné)

12

Snižováním rozpustnosti koloidních imunogenů se zvyšuje jejich imunogennost Koloidní imunogeny se před imunizací srážejí bentonitem nebo síranem hlinitodraselným.

!

Syntetické polymery (např. teflon, silon, nylon, PVC atd.) nevykazují imunogennost, i když mají dostatečně velkou molekulovou hmostnost.

2. Elektrický náboj Přítomnost elektrických nábojů na molekule imunogenu není podmínkou imunogennosti. Pokud má ale imunogen kladný náboj, bude mít vzniklá protilátka záporný náboj a naopak. 3 Tvar 3. T molekuly l k l (konformační (k f č í struktura) t kt ) Konformace molekuly antigenu rozhoduje o přístupnosti determinantních skupin 13

Proteiny, y p polypeptidy yp p y Imunogeny

Polysacharidy (imunogeny bývají pouze vyjímečně) Nukleoproteiny a jiné komplexy

Imunogenní mohou být i některé RNA a jednovláknová (denaturovaná) DNA, DNA ale Hlavně jejich komlexy s proteiny (nukleoproteiny). Lipidy jsou obyčejně pouze hapteny, ale v komplexech s proteiny nebo polysacharidy jsou dobrými imunogeny imunogeny. Imunogenní schopnost mohou mít i některé syntetické a polosyntetické antigeny Nejsilnější imunogeny jsou: proteiny, polysacharidy a některé jejich komplexy. (neplatí ale obecně). N ř želatina Např. ž l ti jje velmi l i slabý l bý imunogen, i ale l sérový é ý albumin lb i je j silným il ý imunogenem

14

Co je podstatou rozdílu v imunogennosti mezi želatinou a albuminem? Albumin obsahuje na povrchu dostatečný počet determinantních skupin ve Vhodné konformaci a přístupnost pro receptory imunokompetentních buněk. V želatině je determinantních skupin málo. Jak želatinu převést na imunogen? Navázat N á t na žželatinu l ti nízkomolekulární í k l k lá í hapteny h t (dinitrofenol, (di it f l kyselina k li arsanylová…), které přeberou funkci determinantních skupin. Modifikovaná želatina pak může být dobrým imunogenem. 3. Biologické vlastnosti Podmínkou je druhová nepříbuznost. nepříbuznost Čím větší bude rozdíl mezi organismem ze kterého imunogen pochází a organismem do kterého imunogen vniká tím vyšší bude jeho imunogennost. P Pozor! ! Ne N všechny š h těl tělu cizí i í látky látk jsou j imunogenní i í Např. uhlík ve formě sazí je lidskému tělu cizí, ale nenavodí imunitní odpověď. yp přirozené imunity y ((fagocytozou). g y ) Z těla jje eliminován mechanismy 15

Je tedy potřebné aby látka měla kombinaci všech uvedených vlastností fyzikálních, chemických a biologických! Chemická podstat antigennosti Pomocí uměle připravených antigenů (konjugát haptenu s bílkovinným nosičem) bylo zjištěno, že protilátky proti uměle připravenému antigenu reagují (tvoří precipitáty) p p y) i s jjinými ý bílkovinami ((nosiči haptenu), p ) p pokud jjsou konjugovány j g y se stejným haptenem. Souhrn vlastností, které musí mít imunogen, aby došle k tvorbě protilátek

• Povrchová a strukturní stabilita molekuly. y • Struktura by měla být nahodilá a rozmanitá. • Minimální molekulová hmostnost by se měla pohybovat aspoň  kolem 5000 Da. • Schopnost být metabolizována v živém organismu (není nezbytná podmínka pro  uměle připrané imunogeny). • Přístupnost části imunogenu, který svou strukturou odpovídá za tvrobu protilátek.

16

Pokud mají dva antigeny dva shodné nebo strukturně podobné antigenní determinanty, mají protilátky p y vytvořené y proti jjednomu z nich tendenci reagovat p g také s druhým ý antigenem. g Taková reakce se označuje jako křížová. Antigen, který byl použit k vyvolání tvorby protilátek (imunogen) je nazývan jako homologní antigen a křížově reagující antigen je označován jako heterologní antigen.

Příkladem antigenní specifičnosti je schopnost protilátek specificky rozlišovat mezi glukozou a galaktozou, které se od sebe liší pouze vzájemnou polohou hydroxylové skupiny a atomu vodíku navázaných na tentýž atom. atom Jiným příkladem může být vliv izomerie diastereoizomerů vinné kyseliny konjugované s bílkovinným nosičem.

Antigen

P tilátk Protilátky Levovinná

Pravovinná

Mesovinná

Levovinná

+++

±

+

Pravovinná

0

+++

+

Mesovinná

±

0

+++

Každá protilátka reaguje velmi silně se svým homologickým antigenem (antigem nesoucí stejný hapten), ale reaktivita mezi levovinnou a pravovinnou kyselinou se zřetelně neprojeví. neprojeví Protilátka mesovinné kyseliny reaguje s levovinou i pravovinnou kyselinou.

17

Syntetické a konjugované antigeny • Velké využití v imunoanalytické chemii • Možnost přípravy cílených antigenů pro stanovené jakékoli nízkomolekulární látky • Bohužel B h ž l v mnoha h případech ří d h poměrně ě ě pracné é Syntetické antigeny jsou biopolymery se známou strukturou nosiče a determinantních skupin. Jde zejména o polypeptidy s lineárním nebo rozvětveným řetězcem. Kromě antigenů složených pouze z aminokyselin, lze syntetizovat i antigeny, které ve své molekule obsahují i sacharidy, nukloesidy a jiné látky. Konjugované antigeny představují komplexy, ve kterých ne přirozený nebo i y ý nosič jsou j navázané chemicky y definované determinantní skupiny p y Syntetický (hapteny)

18

Konjugované antigeny Haptenem může být každá nízkomolekulární látka a po navázání na vhodný nosič se může stát imunogenem g – může vyvolat y imunitní odpověď. p Konjugace hapten + nosič -in vitro - in vivo In vivo konjugace nastává např. mezi léčivem a buňkami případně s makromolekulami přímo v organismu hostitele. Důsledkem je pak vznik alergických reakcí na tyto látky. Např. konjugace penicilinu nebo sulfonamidu s makromolekulami nebo b ňk i v organismu. buňkami i In vitro konjugace – konjugované antigeny připraveny in vitro je možné využít pro různé imunologické výzkumy, výzkumy nebo se proti nim připraví protilátky, které jsou základem citlivého a specifického stanovení příslušných hapténů imunochomickými metodami 19

Příprava konjugovaných antigenů Co je k tomu potřeba? 1. Nosič – velká molekulová hmotnost (nejčastěji vhodný protein) 2 Přítomnost vhodných reaktivních skupin v molekule nosiče, 2. nosiče pomocí kterých je možné navázat hapten 3. Hapten Nejčastějši proteinové nosiče -sérové albuminy -globuliny g y -vaječný albumin -fibrinogen

Např. bovine serum albumin (BSA) obsahuje 104 reaktivních skupin ε-aminoskupiny lysinových y ý jjednotek,, α-aminoskupiny, p y, -OH skupina p v tyrosinu, y , -SH skupina p cysteinu, y , Imidazolová skupina histidinu. Hapten musí mít také vhodnou reaktivní skupinu.

Konjugované K j é vakcíny k í – některé ěkt é vakcinační k i č í imonogeny i se chovají h jí jjako k hapteny

20

Vznik vazby mezi haptenem a nosičem je možné realizovat velkým množstvím konjugačních reakcí. reakcí Reakce se smíšeným anhydridem H3 C

CH

H2C R

COOH

+

HAPTEN H3C

R

C

H2C

O

H3 C

C

CH

CH3

H2C O O

O O

R

C

O

C

+

HCl

O

CH3

O C

+

O

N I E T O R P N 2 H

O

CH

Cl

CH3

NOSIČ

R

C

H N PROTEIN

O

+

H3C

CH H2C

CH3

+ CO2

OH

KONJUGÁT Nosič – např. BSA – touto metodou se naváže na jjednu molekulu 15 až 30 haptenových ý

skupin 21

Reakce s karbodiimidem Jiná posloupnost reakcí: Nejdříve se naváže nosič (protein) na molekulu karbodiimidu a vzniklý meziprodukt reaguje s haptenem, který má volnou karboxylovou skupinu a vzniká O O-acylmočovina. acylmočovina. O-acylmočovina se může intramolekulárně přesmyknout na N-acylmočovinu. Oba deriváty močoviny reagují s aminoskupinami proteinového nosiče, přičemž vzniká konugát.

R2

R2 N

C

H

R2

N

H+ N

R2 C

N

KARBDIIMID R2 H+N

O

R2 C

N

+ R1

R2

NH

C

OC C

OH

HAPTEN

R1

O

+

H

N R2

O-ACYLMOČOVINA

22

NH

OC C

R1

k y m s e ř P

R2

R2

NH

O

OC C

N

R1

N

O

R2

R2

N-ACYLMOČOVINA R2

NH

OC

O

N

+

N 2 H

C

R1 PROTEIN

R2

R2

C

NH

PROTEIN

O

NOSIČ R2

+ R2

NH

H N

CO

KONJUGÁT

O-Acylmočovina může reagovat s karboxylovou skupinou dalšího haptenu, čímž vzniká anhydrid, který poté reaguje s aminokyselinou nosiče. 23

R2

NH

OC C

R1

O

O R

+

N

R1

COOH

HAPTEN

R2

C

C

R1 +

R2

NH

O

O

R2

H N

CO

ANHYDRID OACYLMOČOVINA R1

C

C

O

O

R1

+

N 2 H

O

R1

PROTEIN

CO HN

NOSIČ

+ R1

COOH

PROTEIN

KONJUGÁT Reakce probíhá ve vodném prostředí, pokud se použijí ve vodě rozpustné karbdiimidy, např. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimid hydrochlorid. H2C H2C H3C

N

C

N

CH2

CH2

CH3

Cl

N H3C

H

24

Uvedenými způsoby se mohou konjugovat nízkomolekulární látky jako jsou např.: -AMP -Morfin -LSD LSD -Serotonin -Barbituráty -prostaglandiny

Nízkomolekulární látky látky, na které si chceme vytvořit protilátky

Stejných j ý reakcí je j možné využít y pro vznik konjugátů j g protien-protein, namísto haptenu se analogicky v reakci použije protein

Další reaktivní skupinou přes ktereou se mohou hapteny navázat na nosič je –NH2 skupina. alifatické Hapteny nesoucí aminoskupinu aromatické 25

Hapteny s aromatickou aminoskupinou Landsteiner – klasická diazotační technika Reakce je založena na diazotaci aminoskupiny s HNO2 a následnou kopulací dizoniové soli s tyrosionovými, tyrosionovými histidinovými nebo lysinovými jednotkami v molekule proteinového nosiče. V některých případech mohou reagovat i argininové a tryptofanové jednotky. AsO3H2

AsO H

3 2 A O3H AsO 2

NaNO2

AsO3H2

OH

+

HCl

HO O C

ClCl NH2

N

N

N

N

CH2

CH

NH

N

N

PROTEIN CH2

HAPTEN

CH

NOSIČ

OC

NH

PROTEIN

KONJUGÁT (AZOPROTEIN)

26

Hapteny s alifatickou aminoskupinou E i t j několik Existuje ěk lik metod t d pro vazbu b alifatického lif ti kéh aminu i na nosič ič - reakce s karbodiimidem - reakce s glutaradehydem - reakce s heterobifunkčními imidestery Reakce s glutaraldehydem HC

O

R

R

+ NH2

HAPTEN

O

N

CH

CHO C H

H2O

+

GLUTARALDEHYD

R

R

N

CHO

+

H2N

PROTEIN

C H

NOSIČ

- H2O

H C

N C H

N PROTEIN

27

R

R H C

N C H

NaBH4 N

H2 C

HN C H2

PROTEIN

NH PROTEIN

KONJUGÁT Nevýhody glutaraldehydové reakce: j produktů, p , homokonjugátů j g a různých ý p polymerů y - Vznik nežádoucích vedlejších Nyní je glutarladehydová konjugace nahrazena konjugací s heterobifunkčním i látkami typu maleinimid-N-hydroxysukcinimiddiestery, které tvoří můstky mezi haptenem a nosičem.

28

O

O R

+

O

NH2

O C N

O

N R

O

R

NH

C

R

N

O O

HAPTEN R = -CH2-CH2-CH2O

+

O

N

OH O

O

O

R

NH

C

S PROTEIN

O

O R

+ HS

N

PROTEIN

R

NH

C

R

N

NOSIČ O

O

KONJUGÁT 29

Adjuvancita Látky, která zvyšují imunogennost antigenu (adujvantní = pomáhající). • mechanismus působení adjuvantních látek není příliš znám, ale zřejmě jde o kombinaci postupného uvolňování antigenu, stimulaci fagocytózy a nespecifické aktivity lymfocytů. j významně ý potencuje p j působení p antigenů g na imunitní systém y • adjuvans vakcinovaného jedince. Nejčastěji j j používaná p adjuvantní j směs jje Freundovo adjuvans j (FA) ( ) Jeho složkami jsou minerální olej, emulzifikační činidlo a vodný roztok antigenu. Směs je připravována tak, že se tvoří emulze vody s olejem. Tímto způsobem je antigen rozptýlen na nejjemějších tukových kapénkách, z nichž je pomalu uvolňován. Kompletní FA obsahuje ještě i suspenzi mrtvých baktérií (např. mycobacterium tubercolosis) Látky, které jsou schopné zvyšovat imunogennost: Kamenec, fosforečnan hlinitý, hydroxid lithný, síran berylnatý, saponin, emulze minerálního oleje, syntetické nukleové kyseliny s dvoušroubovicí (např. poly A), lipopolysacharidy.

30

Protilátky Největší skupinou jsou IMUNOGLOBULINY Imunoglobuliny jsou proteiny živočišného původu, které mají protilátkovou aktivitu aktivitu, ale i některé jiné proteiny s příbuznou chemickou strukturou a tím antigenovou specifitou. A. Tiselius, E. A. Kabat ((30. léta minulého století)) – separace protilátek ze séra a popis jejich chemické struktury. Za pomocí volné elektroforézy frakcionoval sérové proteiny. Frakce sérových proteinů, která se pohybuje nejpomaleji (γ-globuliny) obsahuje většinu sérových protilátek. Bylo dokázáno, že protilátky jsou sérové proteiny globulinového typu typu.

Imunoglobuliny heterogenní glykoproteinové molekuly Gama-globuliny g y

31

1950 – Porter 1960 – Edelman

Studium struktury yp protilátek IMUNOGLUBULINY = Ig

Molekuly protilátek se skládají z několika polypeptidových řetězců

Model protilátky p y Molekula protilátky obsahuje 4 peptidové řetězce kde dva a dva jsou identické řetězce, identické. Polypeptidové řetězce jsou navzájem spojené disulfidovými vazbami. Všechny protilátky mají stejnou základní strukturu. Malé rozdíly, které pak mezi nimi existují jsou příčinou rozdílných fyzikálně ý a biologických g ý vlastností. chemických 32

Dva těžké (H) řetězce jsou kovalentně spojeny disulfidickými můstky. Ke každému řetězci je cystinovým můstkem připojen jeden lehký (L) řetězec. Těžké řetězce se skládají ze 4 (u některých tříd 5) strukturně podobných domén. Každá doména je tvořena sekvencí 120 aminokyselin. Přibliž á molekulová Přibližná l k l áh hmostnost t tL L-řetězců ř tě ů je j ttedy d 25 kD kDa, ttežkých žký h řetězců ř tě ů 5050 75 kDa. Domény na N-konci těžkého i lehkého řetězce jsou vaiabilní a označují se VH a VL – detaily jejich struktury se liší individuálně mezi molekulami prodkukovanými různými klony B-lymfocytů. Variabilní V i bil í domény d é H a L řřetězců tě ů vytvářejí t ář jí společně l č ě vazebné b é místo í t pro antigen E i t j 5 základních Existuje ákl d í h iizotypů t ů lidských lid ký h iimunoglobulinů l b li ů IIgG, G IgA, I A IgM, I M IIgD, D IgE I E

33

V lidském organismu se IgD, IgG a IgE vyskytují jako monomery, IgA jako dimer a IgM g jjako p pentamer. Přehled vlastností jjednotlivých ý imunoglobulínů g jje uveden v tabulce. Imunoglobulin

Zastoupení v lidském organismu

Poznámky

~ 75 %

4 podtřídy; nedostatek se  projevuje respiračním  onemocněním

IgG

IgA

~ 15 – 20 %

IgM (makroglobulín)

IgD IgE

~ 3 – 10 %

Je tvořen 5 podjednotkami a má  tedy 10 vazebných míst pro  antigeny (M g y ( r = 900 kDa))

velmi nízká koncentrace

Zvýšená hladina u některých  chronických onemocněních

velmi nízká koncentrace l i í ká k t

Zvýšená hladina u některých  ý ý alergiích

34

Interakce mezi antigenem a protilátkou

Smícháme-li roztok antigenu s roztokem protilátky v přesném stechiometrickém poměr vzniká precipitát (sraženina). (sraženina) Studiem této interakce je možné zjistit údaje o: - Obsahu protilátky - efektivním počtu vazebních míst v molekule antigenu Stabilitu vznikých imunokomplexů určují mezimolekulové síly. Tj. Jde o stejné síly síly, které se podílejí na stabilizaci prostorové struktury proteinů a jiných makromolekul: • vodíkové vazby, • hydrofóbní interakce, • elektrostatické síly, • disperzní p síly, y, • prostorové odpudivé síly

35

Při interakci antigenu (reaguje vlastně ta část, která je hapetenem –H) a vazebného místa protilátky (Ab) vzniká rovnovážný stav: [Ab] + [H]

Ka Kd

[ AbH ] K= [Ab][. H ]

[AbH]

Ka – asociační konstanta Kd – disociační konstanta

K...rovnovážná asociační konstanta

Rovnovážná konstanta K charakterizuje efektivnost vazby a její hodnoty při reakci antigenů g se specifickými p ý protilátkami p se pohybují p y j v rozsahu 105 až 1011 mol/L.

Jakým způsobem lze určit rovnovážnou konstantu? Smíchat roztoky haptenu a protilátky a po ustálení rovnováhy stanovit koncentraci volného haptenu a haptenu vázeného v komplexu s protilátkou.

36

Naměřené hodnoty se dosadí do Scatchardovy nebo Langmuirovy rovnice Schatchardova rovnice

[AbH ] = r = Ab

nK [H ] 1 + K [H ]

r...počet molů haptenu vázané jedním molem přítomné protiláty [H] rovnovážná koncentrace volného haptenu [H]...rovnovážná n...valence (vaznost) protilátky

r = nK K − rK K H

r/[H] Směrnice = -K

Průsečík = n r

37

Uvažujeme-li systém, který se skládá z bivalentní protilátky (n = 2) a monovalentního haptenu a pokud se na přesně polovinu vazebných míst protilátky navázal hapten (r = 1) je možné rovnici přepsat:

1 = 2K − K = K0 [H ] K0 je vnitřní asociační konstanta K0 se rovná převrácené hodnotě koncentrace volného haptenu, a to yp pokud má komplex p protilátka p – hapten p molární poměr p 1:1. tehdy Jednotkou je L/mol

38

Langmuirova rovnice Úpravou rovnice

r = nK − rK H

Je možné dostat vztah

1 1 1 1 1 = . . + r n [H ] K n

Tento vztah odpovídá g izotermě. Langmuirově

1/r Směrnice 1/(nK) Průsečík 1/n 1/[H]

39

Langmuirova i Scatcharodova rovnice charakterizuje nejen sílu vazby mezi haptenem a protilátkou protilátkou, ale i vazbu jakéhokoliv ligandu na specifické vazebné místo. Afi it Afinita Charakterizuje intenzitu s jakou se uskutečňuje interakce mezi vazebným místem protilátky a determinantem antigenu (haptenem) (haptenem). Afinita je termodynamickým vyjádřením přímé vazebné energie protilátky pro jeden determinant antigenu.

− ∆G = RTlnK 0

Čím bude mít protilátka vyšší afinitu, tím zápornější bude hodnota ∆G0 Antigeny obsahují několik determinantů a proto se místo afinity zavádí pojem AVIDITA

40

Avidita Charakterizuje vazebnou energii mezi komplexním antigenem a protilátkou. Avidita zahrnuje afinitu, která je dána příspěvky všech vzniklých vazeb mezi antigenem a protilátkou a další nespecifické faktory, které ovlivňují vazbu mezi antigenem a protilátkou. Uplatňují se tedy multivalentní interakce a nejen specicická interakce mezi a vazebným místem a determinantní skupinou skupinou. Ve skutečnosti probíhá interakce podle obecného schématu: n Ab + mH

AbnHm

41

Klasická precipitační reakce

Při interakce antigenu s protilátkou dochází k podobné situaci, jako při srážecích reakcích. Budeme-li p přidávat antigen g k určitém množství p protilátky, y, bude nejdříve postupně docházet k narůstající tvorbě precipitátu (tj. Tvorbě komplexu antigen-protilátka). Přidáváním antigenu se po určité době dosáhne optima, za kterým vzniká méně precipitátu. V této fázi reakce už vznikají rozpustné komplexy antigenu a protilátky. mprecipitát

Ek i l t í bod Ekvivalentní b d

Antigen g ani p protilátka nejsou j přítomny v supernatantu

mantigenu

42

Z precipitační křivky lze vidět, že přidáváním stále většího množství antigenu se dosáhne určité optimum, za kterým vzniká už méně precipitátu. Analýzou precipitátu vytvořeného při nadbytku protilátky, kdy se vazebné místa na antigenu dostatečně nasytí, lze určit molární poměr antigenu a protilátky v komlexu a tedy i vaznost antigenu antigenu. 43

Grafické znázornění komplexů vytvořených mezi hypotetickým čtyřvalentním antigenem a divalentní protilátkou.

V této oblasti existují rozpustné komplexy mezi Ag a Ab, které mají většinou následující molární poměry: Ag4Ab3, Ag3Ab2 a Ag2Ab 44

Pokud se roztok antigenu smíchá v přesných poměrech s roztokem obsahujícím j protilátky, p y, dochází k vytvoření y precipitátu. p p Pomocí kvantitativní analýzy interakce mezi antigenem a protilátkou získáme údaje o obsahu protilátky, o počtě valencí antigenů, tj. o počtu efektivních vazebných míst. Tyto údaje mohou být velmi rozdílné v závislosti na povaze antigenu jeho velikosti a původu protilátky. Například králíčí protilátka může vázat vaječný albumi prostřednictvím 10 vazeb, ale lidský tyreoglobulin může s králíčími protilátkami vytvářet až 40 vazeb. Antigenní determinanty nebo epitopy nejsou identické.

45

Měření afinity protilátek Mírou afinity je rovnovážná konstanta tvorby komplexu mezi protilátkou a antigenem. Prakticky se postupuje tak tak, že při několika koncentracích antigenu se změří po dosáhnutí rovnovážného stavu množství antigenu volného a vázaného na protilátku. • rovnovážná dialýza • spektrofotometricky • zhášení fluorescence • gelová chromatografie Rovnovážná dialýza – polopropustná membrána umožňuje propuštět nízkomolekulární hapten a protilátku naopak nepropouští. Spektrofotometrická metoda – pokud haptén navázaný na protilátku má jiné absorpční b č í spektrum kt nežž volný l ý hapten, h t lze l využít žít měření ěř í absorbance b b při ři dvou vlnových délkách.

46

Fluorescenční metody Schopnost fluorescence může mít hapten. hapten Po navázaní na protilátku se fluorescence haptenu sníží nebo zvýší. Schopnost fluorescence může mít protilátka. protilátka Po navázání nefluoreskujícího haptenu na protilátku dojde k přenesení fluorescence z protilátky na hapten a fluorescence komplexu se sníží. Gelová chromatografie Pokud má antigen a protilátka dostatečně velký rozdíl mezi molekulovými hmotnostmi je možné tuto metodu využít ke stanovení množství volného a vázaného antigenu. V dialyziačním di l i č í sáčku áčk je j antigen ti (h t ) částečně (hapten) čá t č ě ve volné l é formě f ě a částečně navázaný na protilátky v závislosti na konstantě afinity. Přes dialyzační membránu mohou pronikat pouze molekuly antigenu (haptenu), a proto jeho koncentrace mimo dializační sáček bude stejná jako koncentrace volného haptenu uvnitř dializačního sáčku. Stanovení celkového množství haptenu uvnitř dializačního sáčku umožní vypočítat množství haptenu, které se navázalo na protilátku. protilátku Opakováním tohoto pokusu při různých koncentracích hapténu se dá určit průměrná afinitní konstanta K.

47

Příprava protilátek 1. Polyklonální protilátky Jsou produktem mnoha aktivovaných klonů B lymfocytů a proto jsou namířeny íř proti ti více í epitopům it ů určitého čitéh antigenu ti nebo b směsi ě i antigenů. ti ů Získávají se imunizací laboratorních zvířat antigenem (nebo jejich směsí). Při imunizaci organizmu g dochází ke stimulaci různých ý B lymfocytů y y a k jjejich j proliferaci a diferenciaci na plazmatické buňky. Je produkováno spektrum protilátek proti různým epitopům příslušné bílkoviny s různou schopností se na ni vázat. Specifita polyklonálních protilátek velice závisí na imunizačním protokolu, resp. na tom, v jaké fázi imunitní odpovědi zvířete jsou z něj protilátky získávány.

Časový průběh imunizace zvářete (myš (myš, králík)

48

Ke stimulaci tvorby polyklonálních protilátek se využívají tzv. imunizační schémata Zjednodušeně jde o postupnou vakcinaci zvířetei příslušným schémata. antigenem s FA . 1. den – odběr předimunního séra z ucha zvířete a injekce první dávky (0,2 až 0,5 mg v objemu 1 ml subkutánně 30. den – druhá injekce antigenu s FA (0,2 mg až 0,5 mg v objemu 0,5 ml) 40. den – odběr séra a kontrola titru odebraného séra 50. den – třetí injekce antigenu s FA (0,2 mg až 0,5 mg v objemu 0,5 ml) 65. den – čtvrtá injekce intravenózně (0,2 mg až 0,5 mg v objemu 0,5 ml) 75. den – kontrola titru séra, vykrvení a izolace antiséra. Nevýhody: • Zdlouhavá příprava • Protilátky jsou heterogenní a chovají se tak jako směs činidel a ve své kvalitě se liší. • Při každé imunizace se získá směs protilátek o jiném složení Výhoda: • Možnost přípravy protilátek proti zvolenému antigenu přímo v laboratoři bez složitých postupů 49 • Polyklonální protilátky mívají vyšší afinitu oproti monoklonálním

2. Monoklonální protilátky Jsou produktem jednoho klonu B lymfocytů, jsou specifické proti jediné antigenní determinantě. Fúzí normálních B lymfocytů pocházejících z imunizovaného živočicha a neoplastických myelomových buněk lze připravit tzv. hybridomy, což jsou klony buněk schopné produkce monoklonálních protilátek. Zatímco mateřský normální B lymfocyt (od imunizovaného dárce) je nositelem specifity produkované protilátky, myelomová buňka je nositelem vysokého až neomezeného proliferačního potenciálu, nesmrtelnosti. Hybridom tedy zdědí po myelomové buňce možnost nepřetržitého růstu a po aktivovaném B lymfocytu schopnost syntetizovat monoklonální protilátku namířenou proti jedné antigenní determinantě.

50

Schéma p přípravy p y monoklonálních protilátek p

51

Výhodou monokolonálních protilátek jsou: • stále stejné složení, tj. určitá standardnost při jejich použití • umožňují prokázat přítomnost nebo nepřítomnost jediného konrétního antigenu • umožňují provádět vysoce specifické stanovení antigenů

Využití monoklonálních protilátek: g , analytická y chemie,, genetika, g , onkologie, g , patologie, p g , Buněčná biologie, hematologie. Nevýhody: • dražší a pracnější příprava • nižší afinita oproti polyklonálním protilátkám, což snižuje citlivost stanoveníí při ři jjejich ji h využití ži í v analytické l i ké chemii h ii

52

3. Rekombinantní protilátky Využití poznatků molekulární biologie pro přípravu protilátek Zj d d š é schéma Zjednodušené hé přípravy ří rekombinantích k bi tí h protilátek: tilát k

Izolace genů kódujících protilátky z hybridomů

Výhody: - rychlejší připrava oproti monoklonálním protilátkám - vyšší afinita a specifita - možnost další modifikace vazebých vlastností protilátek - větší p počet vazebných ý míst,, což jje výhodné pro imunochromatografii a imunosenzory

Klonování izolovaných genů

Exprese

53

Purifikace protilátek Protilátky se získají ze zvířete nejčastěji odběrem krve z ušních žil. Protilátky jsou přítomné v séru. 1 K 1. Krev se nechá há srazit it a kkrevníí kkoláč láč se odstraní d t í centrifugací t if í při ři 5 000 g. Tímto postupem je získání krevní sérum. 2. Dalším krokem jje p přečištění imunoglobulinové g frakce séra a) precipitace síranem amonným b) konvenční chromatografické techniky (EIC, GPC…) c) afinitní chromatografie – jako SF slouží imobilizované komponenty z buněčné stěny (proteinový nosič) baktérie Streptococcus aureus nebo z různých streptokovoých kmenů vážící IgG v konstantních Fc regionech. regionech IgG se váže na nutrální proteinový nosič v neutrálním či slabě alkalickém prostředí a eluují se glycin-Cl pufrem při pH 2.7 následuje okamžitá neutralizace eluátu. Takto se získají polyklonální protilátky, které se pak selektují a kříží s nádorovými ád ý i buňkami b ňk i a jsou j produkovány d k á monoklonální kl ál í protilátky. tilátk 54

Imunochemické analytické metody Všechny založené na specifické interakci mezi antigenem (analyt) a protilátkou (specifické interakční činidlo). Interakce mezi antigenem a protilátkou probíhají v roztocích nebo na nosičích (gelech). L e je ro Lze rozdělit: dělit • elektroforetické metody • metody využívající difůze • imunoprecipitační metody • kompetetivní metody • mikroskopické techniky Metody M t d I. I generace – pouze kvalitativní k lit ti í analýza lý a semikvantitativní ik tit ti í analýza lý Metody II. generace – dovolují analyzovat i složité směsi antigenů a umožňují jejich kvantifikaci. Metody III III. Generace – dovolují velmi přesně a citlivě stanovit antigeny ve složitých směsích, ale i protilátky a hapteny 55

Metody I. generace – sérologické metody Metody založené na precipitační reakci a sledování (detekci) vzniklého precipitátu. Probíhají j ve vodném prostředí. Pomocí sérologických metod se určují protilátka nebo antigen, někdy i hapten. Umožňují pouze stanovit přibližnou koncentraci těchto látek. Pokud je k dispozici známý antigen je možné ho využít na důkaz protilátek v séru nebo jiném roztoku. Koncentrace protilátek, které se v séru dokáží se určuje jako TITR SÉRA. TITR SÉRA – největší zředění séra, které ještě reaguje s antigenem. Sérum se ředí fyziologickým roztokem v poměrech odpovídající geometrické řadě (1:2 1:4 (1:2, 1:4, 1:8 nebo při vysoké koncentraci protilátek v poměrech 1:20 1:20, 1:40…).

Obdobně je možné známou pritilátkou zjišťovat přítomnost neznámého antigenu

56

A. Imunoprecipitační metody

Precipitační sérologická reakce se uskutečňuje: - Na podložním sklíčku (ke kapce séra se přidá kapka roztoku antigenu nebo naopak a pozoruje se vznik precipitátu) - v skleněné zkumavce (pozoruje se vznik precipitačního prstence na rozhraní roztoku antigenu a protilátky tzv. prstencová precipitace.) Pro kvalitativní analýzu zjišťuje pouze pozitivitu nebo negativitu precipitační reakce, při kvantitativní analýze se množství precipitátu změří. Křížové reakce – mnohé precipitující protilátky nejsou přísně specifické proti určitému antigenu, ale mohou i když v menší míře precipitovat i jiné podobné antigeny. Jde tedy o reakci s příbuznými antigeny.

57

Metody I. generace – sérologické metody Metody založené na precipitační reakci a sledování (detekci) vzniklého precipitátu. Probíhají j ve vodném prostředí. Pomocí sérologických metod se určují protilátka nebo antigen, někdy i hapten. Umožňují pouze stanovit přibližnou koncentraci těchto látek. Pokud je k dispozici známý antigen je možné ho využít na důkaz protilátek v séru nebo jiném roztoku. Koncentrace protilátek, které se v séru dokáží se určuje jako TITR SÉRA. TITR SÉRA – největší zředění séra, které ještě reaguje s antigenem. Sérum se ředí fyziologickým roztokem v poměrech odpovídající geometrické řadě (1:2 1:4 (1:2, 1:4, 1:8 nebo při vysoké koncentraci protilátek v poměrech 1:20 1:20, 1:40…).

Obdobně je možné známou pritilátkou zjišťovat přítomnost neznámého antigenu

58

Stanovení koncentrace volného haptenu Použijí se dvě řady zkumavek. Do jedné se přidává protilátka a konjugát haptén-nosič a do druhé řady se kromě těchto složek přidá i volný hapten. Protilátka má hlavně z prostorových důvodů vyšší afinitu k volnému haptenu než ke konjugátu hapten – nosič. Výsledkem je obsazení vazebných míst protilátky. Přítomnost volného haptenu se projeví jako inhibice precipitace. Přesná koncentrace haptenu se u této metody určí z kalibrační křivky sestrojené z pomocí známých koncentrací haptenu. Imunoprecipitační metody v roztoku jsou založeny na uskutečnění reakce mezi protilátkou a stanovovanou látkou (antigenem) za vzniku pevného imunoprecipitátu a stanovení množství antigenu turbidimetrickými nebo nefelometrickými metodami.

59

B. Imunonefelometrie a imunoturbidimetrie

Základem je precipitační sérologická reakce. Vznikající komplex se detekuje s vyšší citlivostí nefelometricky nebo turbidimetricky (dají se určit ng množství vzniklého komplexu). Je možné využít i imunofluoronefelometrie nebo lasarové imunofelometrie – další snížení íž í detekčního d t kč íh limitu. li it

Schéma nefelometru a turbidimetru

Turbidimetrie – 0° Nefelometrie – 90 90° 60

Imunoprecipitační reakce mezi antigenem a protilátkou probíhá v několik fázích. První fáze jje velmi rychlá y ap probíhá řádově v milisekundách a druhá následující fáze již probíhá v řádu hodin. Proto se pro nefelometrické a turbidimetrické imunochemické stanovení využívají dva rozdílné způsoby měření: 1. Kinetické měření rychlosti vzniku imunoprecipitátu 2. Měření množství imunoprecipitátu v pseudorovnováze (pseudoekvilibriu). Vzhledem V hl d k tomu, t ž při že ři postupném t é vzniku ik imunoprecipitátu i i itát se mění ě í v závislosti na čase množství rozptýleného záření dIs/dt probíhá kinetické měření během prvních několika minut za podmínek, kdy je dIs/dt maximální. Měření v pseudorovnovážném stavu se provádí za podmínek, podmínek kdy je změna rozptýleného záření za časovou jednotku relativně malá, tj. nejčastěji 30 až 60 minut po zahájení imunoprecipitační reakce. Ale i po několika desítkách minut od zahájení imunoprecipitační reakce není systém v rovnovážném stavu, stavu proto je tento stav nazýván jako pseudorovnovážný.

61

Křivka závislosti signálu g na koncentraci antigenu g ap protilátky y Rychlost tvorby imunitních komplexů je zvýšena přítomností ve vodě rozpustných lineárních polymerů (např. polyethylenglykol 6000), které vedle zvýšení rychlosti interakce specifických protilátek s analytem a také suspensi imunitních komplexů v roztoku stabilizují. Při konstantní vysoké koncentraci specifických protilátek, je množství vytvořených imunitních komplexů (turbidita analyzovaného vzorku tělní t k ti ) přímo tekutiny) ří úměrné ú ě é kkoncentraci t i analytu. l t 62

Kinetické měření Měří se rychlost vzniku imunoprecipitátu čas potřebný k dosažení maximální rychlosti tvorby imunoprecipitátu jsou přímo uměrné koncentraci antigenu. Získané výsledky není potřebné korigovat na slepý l ý pokus k a neníí potřebné ř b é ččekat k 30 až ž 60 minut i oprotii měření ěř í v pseudorovnovážném stavu.

U nefelometrického a turbidimetrického měření suspenze imunoprecipitátu je nutné uvážit také rozptyl světla, který není způsobený vznikajícím imunikomplexem ale přítomnými biopolymery (zejména bílkovin a lipidů), imunikomplexem, lipidů) které jsou přirozenou součástní reálných vzrorků zejména biologických jako je krevní sérum. Lepší poměr signálu k šumu a tedy vyšší citlivost pak vykazují stanovení v moči nebo v mozkomíšním moku, moku kde je obsah bílkovin a lipidů zanedbatelný. zanedbatelný

63

Měření v pseudorovnovážném stavu Provádí se za p podmínek,, kdyy jje změna rozptýleného pý záření za časovou jjednotku relativně malá, tj. nejčastěji 30 až 60 minut po zahájení imunoprecipitační reakce. Ale i po několika desítkách minut od zahájení imunoprecipitační reakce není systém v rovnovážném stavu, proto je tento stav nazýván jako pseudorovnovážný. Nefelometrické a turbidimetrické imunoanalytické metody jsou používány předvším ve zdravotnictví, zdravotnictví pro stanovení specifických proteinů, proteinů imunoglobulinů a koagulačních faktorů. Při stanovení nízkomolekulární proteinů (např. myoglobinu s Mr 17,8 kDa) je možná zvýšit citlivost stanovení použitím latexových částic obalených protilátkou. Nefelometrické metody jsou v porovnání s turbidimetrickými metodami obecně citlivější a dovolují stanovit např. sérové proteiny v koncentracích 1 až 10 mg.l-1. Nefelometrické a turbidimetrické metody je možné využít také pro stanovení nízkomolekulárních látek (haptenů) například některá léčiva – fenobarbital, digoxin theophylin, digoxin, theophylin gentamycin apod. apod V případě stanovené haptenů se využívá inhibiční technika

64

Činidlem při inhibiční technice měření je konjugát nosiče (hovězí sérový albumin, BSA) a haptenu. Konjugát soutěží s volným haptenem o vazbu na protilátku. Protože na protilátce je více vazebných míst saturováno volným haptenem, je tvorba imunokomplexu konjugát – protilátka inhibována a výsledkem je snižený rozptyl světla. Jestliže v analyzovaném vzorku není přítomen příslušný volný h t hapten, potom t h t vázaný hapten á ý v konjugátu k j át reaguje j s vazebnými b ý i místy í t na protilátce tilát za vzniku zesíťovaných precipitátů a výsledný rozptyl světla je velmi vysoký. V inhibiční technice je tak množství vznikajícího precipitátu nepřímo úměrné koncentraci stanovované látky. látky Turbidimetrie sleduje j p pokles intenzityy záření p procházejícího j absorbující j a rozptylující vrstvou. Na částicích dochází k rozptylu záření a částečně i jeho absorpci. Prošlé záření má tedy vždy nižší intenzitu než záření dopadající (světelný zdroj). Závislost turbidance (absorbance) na koncentraci analytu je obecně nelineární (jde většinou o polynom 2. řádu). V případě vhodně zvolených podmínek je možno závislost aproximovat proložením přímkou. přímkou K turbidimetrickému měření zákalu se obvykle využívají klasické absorpční fotometry a automatické analyzátory pracující metodou absorpční fotometrie. 65

C. Aglutinační metody Aglutinační metody jsou obdobou precipitačních metod, ale jako antigen se využívají různé baktérie, případně mikroorganismy nebo buňky (zejména erytrotrocyty). Interakce mezi protilátkou a partikulárním antigenem vede ke vzniku viditelných shluků - k aglutinaci. aglutinaci Nadbytek Ab inhibuje aglutinační reakci (efekt prozóny) prozóny). Hemaglutinační reakce je rutinně prováděna při stanovení krevních skupin. Při pH jjsou erytrocyty y y y obklopeny p y negativním g iontovým ý mrakem,, takže se neutrálním p navzájem odpuzují (odpudivé síly se nazývají zeta potenciál). IgM může překonat zeta potenciál a vyvolat hemaglutinaci. IgG je mnohem méně efektivní. Hemaglutinace se používá i při stanovení Rh fenotypu.

66

Pasivní hemaglutinace je založena na navázání antigenů na červené krvinky a jejich aglutinaci antisérem proti tomuto Ag. K navazování Ag se užívá taninová kyselina nebo chlorid chromitý. Pasivní hemaglutinace je daleko citlivější než precipitační reakce a může detegovat Ab ještě v koncentraci 0,001 , g/ml. g Inhibice aglutinace je velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, g která aglutinuje. g j Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab. Tento test se používá i k průkazu užívání drog (kokain, heroin). Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).

67

68

Metody II. generace A. Imunodifúzní metody Základem je opět precipitační reakce reakce, které probíhá na nosiči (gelové médium) médium). Pro imunodifúzní testy je nejvýhodnější gel připravený z agaru nebo agarozy.

Agaroza

Agar je směs polysacharidů, které se extrahují z buněčných stěn červených mořských řas. Agarový nebo agarozový gel se připravuje tak tak, že se odvážené množství agarozy (0,5 – 2,0 % roztok) za tepla rozpustí ve vhodném pufru. Pokud se roztok ochladí pod 42°C dojde ke vzniku gelu. 69

Imunodifuzní metody se uskutečňují v gelu vylitém na různých podložkách nebo ve zkumvakách, kde se rlzným způsobem aplikuje protilátka a antigen, jejichž molekuly difundují gelem. Podle P dl způsobu ů b aplikace lik může ůž dif difundovat d t pouze jjedna d složka l žk (j (jednoduchá d d há imunodifúze) nebo obě složky (dvojitou imunodifúzi). Jednoduchá i dvojitá j imunodifůze se může uskutečnit jjednom nebo dvou rozměrech. V místech styku difundujících složek vzniká precipitační reakce reakce, která se projevuje tvorbou precipitačních linií, obloučků, prstenců, kruhů… Rychlost difúze je řízena Fickovým zákonem

2

dx d c =D 2 dt dt 70

Jednoduchá a pasivní imunodifúze jsou dvě základní provedení imunoprecipitační reakce v gelovém médiu využitelné pro kvalitativní účely účely. Jednoduchá imunodifúze probíhá tak, že antigen difunduje postupně gelem, který je napuštěný (impregnovaný) protilátkou. Koncentrační gradient zde vzniká pouze pro antigen. Dvojitá imunodifúze probíhá tak, že gelem difundují oba účastníci reakce antigen-protilátka. g p Koncentrační g gradient vzniká p pro antigen g ip pro p protilátku. Dvojitá imunodifúze je využívána často jako nástroj pro pro přímé porovnání dvou a více studovaných (testovaných) vzorků za účelem stanovení identity antigenů ve vzorcích, případně neidentity a křížových reakcí.

Schéma precipitace při dvojité imunodifúzi 71

Dvojitá imunodifúze je vhodná kvalitativní metoda k identifikaci antigenů a k určení jejich imunochemické příbuznosti pokud jsou k dispozici příslušné protilátky (imunní séra, antiséra). Dvojitou imunodifúzi můžeme využít i k důkazu přítomnosti protilátek pomocí čistých antigenů.

Radiální imunodifúze Radiální imunodifúze je metodou využívající jednoduchou imunodifúzi pro kvatnitativní účely. Radiální imunodifúze se uskutečňuje v agarasových gelech, které jjsou impregnovány p g yp protilátkami. Antigen g se p pak dávkuje j do jjamek vyříznutých v impregnovaném agarosovém gelu, který je nejčastěji nalitý na skleněnou destičku (např. Pteriho miska). Gel se inkubuje při laboratarorní teplotě 48 až 72 hodin podle charakteru antigenu. Antigen radiálně difunduje do gelu v němž je koncentrace protilátky konstantní. Antigen pokračuje v migraci gelem, až do doby, kde je dosaženo zóny ekvivalence Vzniklý imunoprecipitát se projeví jako ostrý bílý prstenec kolem ekvivalence. jamky. Plocha (případně druhá mocnina průměru) precipitačního prstence je přímo úměrná koncentraci antigenu. 72

Schéma jednoduché radiální imunodifúze (S1 až S7 - standardy, V1 až V2 vzorky) Radiální imunodifúze poskytuje omezenější možnosti stanovení na rozdíl od imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie, které se dnes využívají častěji.

73

Imunoelektroforéza Imunoelektroforéza (gammaglobulinová elektroforéza, imunoglobulinová elektroforéza) je imunochemická metoda využívaná k separaci a identifikaci rozličných proteinů například v krevním séru nebo míšní tekutině. Imunoelektroforéza spočívá nejprve v separaci antigenů (obvykle vzorek krevního séra) elektroforézou na agaru nebo agarosovém gelu. podle svých ý elektroforetických ý p pohyblivostí. y Jednotlivé složkyy se tak rozdělí p Po ukončení elektroforézy se podél elektroferogramu vyřízně kanálek, který se naplní protilátkou (antisérum monospecifické nebo polyspecifické). Protilátkyy a rozdělené antigeny g y se nechají j v druhém kroku p proti sobě difundovat. V místě, kde dojde k reakci antigenu s protilátkou a k imunoprecipitaci vznikne precipitační oblouček. Imunoelektroforéza tak kombinuje elektroforetickou separaci antigenů s pasivní difúzí. Difúzní krok opět trvá 12-48 hodin

74

Schéma imunoelektroforézy Imunoelektroforéza je využívána pro analýzu komplexních směsí proteinů s využitím odpovídajícíh imunosér a k identifikaci proteinů na základě jejich elektroforetické pohyblivosti a antigenicity.

75

Protisměrná imunoelektroforéza Protisměrné imunoelektroforéza (electrosynersis, counter-imunoelectrophoresis) je imunoelektroforetická technika využívající migrace antigenu i protilátky ve stejnosměrném elektrickém poli v agarovém gelu. • Do agarového gelu se vyříznou dvě jamky na proti sobě v určité vzdálenosti. • Do jedné se nadávkuje antigen a do druhé protilátka. • Při protisměrné ti ě é iimunoelektroforéze l kt f é se využívá elektroosmotického toku, který má za následek pohyb kapaliny v gelu od anody ke katodě katodě. • Pracuje se při hodnotě pH, kdy protilátka nemá žádný elektrický náboj a pohybuje se stejným směrem a stejně rychle jako elektroosmotický tok. Protilátka se dávkuje do jamky blízké anodě a antigen naopak do jamky blízké katodě katodě. 76

Takto to je zajištěná protisměrná migrace antigenu a protilátky. V místě kde se antigen a protilátka setkají v poměru koncentrací odpovídajích zóně ekvivalence vznikne precipitační linie. Protisměrná imunoelektroforéza probíhá velmi rychle (většinou během 10 minut) a jedná se o velmi citlivé gelovou i imunoprecipitační i it č í techniku. t h ik

Kříž á iimunoelektroforéza Křížová l kt f é (CRIE) Křížová imunoelektroforéza (dvoudimenziální imunoelektroforéza) je y Antigeny g y jjsou v p prvním kroce separovány p y v modifikací immunoelektroforézy. agarovém nebo agarosovém gelu podle své elektroforetické pohyblivosti. Ve druhém kroku je opět využito elektrofézy (dotud dvoudimenzionální imunoelektroforéza). Rozseparováné antigeny se nechají migrovat do gelu obsahující protilátku specifickou pro antigen, který chceme detekovat. CRIE je mnohem citlivější technika oproti IEP a navíc poskytuje větši rozlišení.

77

Elektroferogram CRIE

78

Raketová imunoelektroforéza Raketová imunoelektroforéza (elektroimunostanovení) je založená na migraci antigenu do gelu impregnovaného protilátkou. Využívá se opět agarosový g ýg gel impregnovaný p g ýp protilátkou a p pracuje j se v p prostředí o p pH 8,6. , Do jamek se nadávkuje roztok antigenu a nechá se migrovat do gelu obsahující protilátky. Při pH 8,6 protilátka v gelu téměř nemigruje nebo jen velmi p pomalu a bez p přítomnosti elektroosmotického toku. Naopak p antigeny g y nesoucí elektrický náboj migrují do gelu (současně zde ale působí i příčná difúze) a při kontaktu s protilátkou vzniká precipitát, který se projeví jako precipitační píky. Doba elektroforézy se podle použitého napětí pohybuje nejčastěji mezi 6 až 16 hodinami. Plocha a výška precipitačních píků je úměrná koncentraci antigenu, antigenu který byl dávkován do jednotlivých jamek. Raketová imunoelektroforéza se využívá k citlivým stanovením. Pracuje se metodou kalibrační křivky, která je ale lineární pouze ve velmi úzkém intervalu a vzorek je tedy nutné podle rozhsahu zředit nebo zakoncentrovat p linární kalibrační křivky. 79

Imunofixace IImunofixace fi zahrnuje h j elektroforetické l kt f ti ké dělení děl í proteinů t i ů s následnou á l d i imunoprecipitací i it í za použití specifických antisér. Imunofixace je imunoelektroforetická metoda, která slouží k detekci rozseparovaných proteinů elektroforézou na agarosovém gelu nebo v gelu na bázi acetátu celulózy. celulózy K detekci rozseparovaných bílkovin v následném kroku po separaci pak slouží imunoprecipitační reakce. Do gelu se vyříznou jamky a do nich se nadávkují vzorky obsahující antigeny, které chceme detekovat a stanovit a provede se elektroforetická separace antigenů. antigenů

80

• Po ukončení elekroforetické separace se na gel přiloží šablona, která má vyříznuté proužky odpovídající dráze migrace jednotlivých vzorků gelem (podobně jako závodní běžecké dráhy). • Do proužků se nanášejí specifické protilátky (např. proti imunoglobulinům), které difundují do gelu a v místech, místech kde se setkají s antigeny vytvoří precipitáty. precipitáty • Po ukončení precipitačních reakcí se gel promyje vhodným pufrem, který vymyje nereagující antigeny s aplikovanými protilátkami a nadbytek protilátek. V gelu tedy zůstanou fixovány pouze precipitáty, precipitáty jejiž zóny se zvýrazní obarvením. obarvením Při imunofixaci je velmi důležité ředění vzorku. Při nadbytku antigenu nebo protilátky se imunokomplex začne rozpadat, rozpadat hrozí tedy při špatném naředění nemožnost průkazu nízkých koncentrací antigenu a vysokých koncentrací, které nespadají do zóny ekvivalence. Tento problém se řeší pomocí Western blottingu.

81

Imunoblotting Blotiing = „pijákování“ gelu (polyakrylamidový, (p y y ý, agarozový) g ý) do Přenos molekul z mobilní fáze v g pevné fáze např. na nitrocelulózovou membránu. Přenos molekul se může uskutečnit: • difuzí • pomocí stejnosměrného proudu Význam: po přenesení molekul do pevné fáze je možné provést jejich detekci: • různé barevné reakce • reakce se specifickými protilátkami IMUNOBLOTTING K čemu blotting slouží: je využíván zejména pro přenos fragmentů DNA a RNA, proteinů, glykoproteinů po jejich předešlé separaci gelovou elektroforézou nebo izoelektrickou fokusací na gelových nosičích. 82

1975 – E.M. Southern Popsal metodu na přenos fragmentů DNA z agarozoveho gelu na nitrocelulozovou membranu prostřednictvím kapilárních sil. Fragmenty F t DNA přenesené ř é na nitrocelulózu it l ló se poté té h hybridizovali b idi li s radioaktivně di kti ě značenou RNA, což umožnilo detekci homologních úseků na molekule DNA. Homologní fragmenty DNA se staly viditelnými jako ostře ohraničení pruhy na autoradiogramu. autoradiogramu

S th Southern blotting bl tti – jižní již í blotting bl tti

83

Schéma Southern blottingu

84

Vysoká y selektivita p při analýze ý Výsledek blottingu

85

86

Nitrocelulóza je nevhodná pro blotting pro malé fragmenty NA, které se obtížně kovalentně vážou na nitrocelulózu nitrocelulózu. Nothern blotting – místo nitrocelulózy se využívá diazobenzylmethylovaného papíru (DBM) – na tento papír se mohou vázat i kratší fragmenty NA.

1981 - Burnette Detekce imobilizovaných antigenů pomocí specifické protilátky – Western blotting. Od 80. let minulého století se imunoblottingové metody staly jedny z nejpoužívanějších metod při analýzách enzymů, sérových proteinů, antigenů patogenních mikroorganismů a virů, onkogenů, alergenů a glykoproteinů. Výhody: lehká uskutečnitelnost, vysoká citlivost, specifičnost, možnost detekce jjednoho p proteinu ve velmi složitých ý směsích,, možnost získání identické kopie p elektroforetického obrazu z povrchu gelu, kde je možné uskutečnit analytické 87 procedury, které na gelu nejsou uskutečnitelné.

Postup při imunoblottingu 1. Rozdělení analyzované směsi antigenů jednorozměrnou nebo dvourozměrnou elektroforézou nebo izoelektrickou fokusací v agarozovém nebo polyakrylamidovém gelu. 2. Po elektroforéze se gel vloží do blottingové aparatury, kde se uskuteční přenos antigenu z gelu na vhodnou matrici. Proběhne imobilizace antigenů na matrici a po imobilizaci se matrice nechá zreagovat s tzv tzv. blokujícím činidlem. Blokující činidlo zablokuje nespecifické vazebné místa matrice. Tím se zabrání nežádoucím reakcím mezi detečním činidlem (sondou) a matricí. 3 Detekčními 3. D t kč í i či činidly idl mohou h být být: - protilátky - specifické vazebné proteiny - další specifické ligandy. 4 Vizualizace detekčního činidla (sondy) – autoradiograficky, 4. autoradiograficky barevnou reakcí reakcí, fluorescenčně)

88

Přenos proteinů z gelu na imobilizační matrici 1. Jednoduchá difúze (ne příliš efektivní metoda) 2. Kapilárním tlakem 3. Negativním tlakem (vákuem) 4. Elektroforeticky, elektroblotting (nejvíc efektivní, nejpoužívanější) Elektroblotting umožňuje získat i několik kopií a s každou je možné uskutečnit jjinou detekční reakci. Navíc velikost proteinů p ap podmínky y elektroblottingu g určují, j které proteiny se budou dát přednostně detekovat na jednotlivých kopiích. Nízkomolekulární proteiny se objeví na první kopii a větší proteiny a proteiny ve větších koncentracích se objeví na dalších kopiích.

89

Schéma uspořádání pro elektroblotting Používají se buď horizontální nebo vertikální aparatury, platinové nebo grafitové elektrody a jako imobilizační matrice se používá buď nitrocelulóze nebo diazobenzyloxymethylovaný papír papír. 90

Na nitrocelulózu se proteiny váží hydrofóbními silami a na DBM papír se proteiny navazují kovalentními vazbami. Při elektroblottingu proteinů na nitrocelulózu se používá většinou Tris-glycinový pufr o pH 8,3 8 3 s 20% methanolu. methanolu Při napětí 60 V a proudu 0 0,2 2 A trvá přenos asi 5 hodin. Po přenesení proteinů na nitrocelulózovou membránu je možné provést jejich detekci pomocí barviv. Další možností je využití právě specifických protilátek. V tomto p případě p je j nitrocelulózovou matrici inkubovat s blokujícím j činidlem, což může být: Hovězí sérový albumin (3 až 5%) Hemoglobín (5%) Ethanolamin (10%) Tween 20 (0,05%)

91

Detekce proteinů na nitrocelulózové matrici může být uskutečněna pomocí následujících technik: a) Přímým specifickým barvením proteinů. b) Přímým specifickým označením (prvním ligandem). ligandem) c) Nepřímým specifickým označením (druhým, příp. třetím ligandem).

Na přímé nespecifické barvení je možné použít: amidovou čerň 10B, coomassie brilliant blue R-250, tuš, stříbrné barvivo, koloidni zlato. Při přímém specifickém označení pouze vybraných proteinů se používá specifická protilátka nebo jiný ligand, ale protilátka nebo ligand musí mít sám značku ((radioaktivní ad oa izotop, o op, flourofor, ou o o , e enzym), y ), která eáu umožňuje o uje je jeho o zviditelnění d e ě v nitrocelulózové membráně. Nepřímé specifické označení patří mezi nejpoužívanější metody. Používají se při tom 2 nebo 3 ligandy. ligandy

92

První ligand – má funkci specifické sondy, která se naváže pouze na analyzovaný protein i ((obyčejně b č j ě to bývá bý á právě á ě protilátka). ilá k ) S ostatními í i proteiny i nereaguje. j Tento T první ligand ale nenese značku. Na jjeho detekci se musí p použít druhý ý ligand g – další sekundární p protilátka,, která má značku (ale ani tento druhý ligand značku mít nemusí). Druhým ligandem bez značky může být i protein A, který reaguje s Fc-doménami většiny imunoglobulinů. Pokud ani druhý ligand nenese značku značku, je nutné na jeho detekci použít třetí ligand – označená třetí protilátka.

Elektroimunoblotting se nejčstěji využívá při určování antigenů patogenních mikroorganismů a virů, dále při zjišťován autoantigenů apod.

93

Souhrn – Imunoprecipitační metody

Imunoprecipitační gelové techniky jsou variantní a principi jednotlivých technik lze velmi dobře modifikovat a kombinovat. kombinovat Místo agarosového gelu je v některých případech možné využít gelu polyakrylamidového a jako elektroforetický separační krok je možné využít izoelektrickou fokusaci. Pokud je stanovovaným antigenem enzym, pro který existuje charakteristická barevná reakce v gelu, je možné detekovat jeho aktivitu v imunoprecipitátu přímo v gelu. Tuto techniku je možné užít i pro studium enzymů. Imunoprecipitační p p reakce v g gelových ý médiích se nejčastěji j j využívají y j v laboratořích klinické bioochemie pro identifakci a stanovení sérových proteinů, nádorových márkrů a jiných patologických stavů.

94

Imunoextrakční techniky Využívají reverzibilitu tvorby imunokomplexu • imunoextrakční i t kč í metody t d • imunoafinitní chromatografie Imunoafinitní chromatografie j se jjako p preparativní p analytická y technika,, ale jje možné jji využít y i • Uskutečňuje pro analytické separace. • Využívá se pro izolaci a purifikaci protilátek specifických pro jeden konkrétní antigen. Stejně tak dobře je možné postupovat opačně, kdy se imunoafinitní chromatografie využívá pro purifikaci antigenů. Pro uskutečnění imunoafinitní interakce je nutné imobilizovat čistý (purifikovaný) antigen nebo protilátku na vhodný nosič, nosič který nebude bránit interakci imunoafinitní interakci.

95

Vhodné nosiče pro zakotvení antigenu nebo protilátky: • dextranu • agararosa • akrylamidu Principiálně jde o vytvoření kovalentní vazby mezi nosičem v podobě gelu a antigenem či protilátkou. Pro zakotvení se využívá reakce s bromkyanem (BrCN) nebo s glutaraldehydem. glutaraldehydem Pro zakotvení protilátky na nosič je nutné volit takové místo vazby, aby pak mohla probíhat imunafinitní interakce s co největší reaktivitou. reaktivitou Tedy co nejdál od paratopů, které jsou zodpovědné za imunitní intarakci s antigenem. Např. u IgG je možné využít sacharidovou část těžkých řetězců k navázání na nosič. Pro zakotvení protilátky na nosič se také využívá interakce mezi proteinem A, který produkuje Staphylococcus aureus, který je sám nejdříve kovalentně navázán na nosič a velmi silně interaguje s těžkými řetězce králíčího IgG (myší a lidské IgG nereguje). N á á í protilátky Navázáním tilátk nebo b antigenu ti na nosič ič vzniká iká IMUNOSORBENT 96

V poslední době se také začínají využívat nanočástice jako nosiče pro zakotvení protilátky nebo antigenu, což zlepšuje prostupnost mobilní fáze přes imusorbent a zvýšení účinnosti purifikace. Protilátka

Proteinový epitop

+ Nosičč Nos

Raménko a é o

Enzym vázaný na protilátku

97

Imunohistochemie Imunohistochemie pak využívá interakce mezi antigenem a protilátkou k specifickému a citlivému průkazu molekul v tkáních a buňkách in situ. Prokazuje j se tak p přítomnosti buněčných ý a tkáňových ý antigenů. g Nejčastěji se v buňkách a tkáních takto dokazují specifické proteiny, glykoproteiny g y p y a p proteoglykany gy y a jjako p protilátky y ((reakční činidlo)) se zde využívají sérové proteiny nejčastěji imunoglobuliny Ig). Primární protilátky se tedy využíjí pro identifikaci přítomnosti příslušného antigenu v tkáňovém řezu nebo přímo v buňce a následně je možné lokalizovat (zviditelnit) i místo výskytu použití protilátky, která je vázána na detekovaný antigen buď přímo pokud je předem vhodně značená, či nepřímo (primární protilátka tilátk je j neznačená) č á) pomocíí sekundární k dá í protilátky tilátk nebo b molekuly, l k l která kt á je j protilátkou pro primární protilátku. Po přídavku primární protilátky, je nutné tkáňový řez nebo buňky promýt k odstranění nespecifických interakcí.

98

Značky, která se využívají pro značení protilátek (primárních nebo sekundárních) jsou následující: • Fluorescenční • Enzymatické • Koloidní zlato • Interakce avidin-biotin Fluorescenční značky – Jako fluorescenční značky (fluorochromy), které lze jednoduše navázat na protilátku se osvědčili fluorescein a rhodamin. rhodamin Po ozáření fluoresceinu UV světlem dochází k emisi zeleného fluorescenčního záření u rhodaminu je emitováno oranžové fluorescenční záření. Při praktickém provedení fluorescenční imunohistochemického testu je nutné nejdříve provést zjištění autofluorescence, tedy detekovat fluorescenci tkáňového řezu před přídavkem značené protilátky.

Fluorescein

Rh d i Rhodamin 99

Enzymatické y značky yp poskytují y j výhodu ý oproti p fluorescenčním značkám v tom,, že jje možné převést rozpustný substrát na nerozpustný produkt, čímž je možné detekovaný antigen v tknáni či buňce lokalizovat. Jako enzymatické značky jsou využívány peroxidáza (odpovídající substráty jsou 3´,3´- diaminonezidin DAB a 3-amino-9-ethylkarbazol AEC) a alkalická fosfatáza (5-bromo-4-chloro-3indoylfosfát/tetrazoliová nitromodř).

diaminobenzidin

100

Koloidní zlato je univerzální značkou pro přímou a nepřímou lokalizaci dokazovaného antigenu, protože nevyžaduje přídavek žádného dalšího reagentu. Zlaté nanočástice mohou být světelnou mikroskopii a pokud jsou dopované stříbrem mohou být detekovány i elektronovým mikroskopem. V případě interakce avidin-biotin se biotin používá jako primární neznačená protilátka a značený avidin jako sekundární protilátka. Citlivost detekce plyne ze skutečnosti skutečnosti, že na jednu molekulu biotinu se může navázat až 150 molekul značeného avidinu. Přímá imunohistochemická metoda, metoda která využívá značenou primární protilátku je méně citlivější metoda, než nepřímá, kdy se citlivost detekce a lokalizace zvýší právě následnou interakcí mezi primární navázanou protilátkou a sekundární značenou protilátkou.

Přímá metoda

Nepřímá metoda

101

Neprecipitační imunometody • Reakce mezi antigenem a protilátkou ve velmi nízké koncentraci nevede ke tvorbě imunoprecitpitátu p p • Množství případně vzniklého imunoprecipitátu je tak nízké, že ho nelze detekovat metodami popsanými výše. • Precipitační metody neumožňují stanovit hapteny, které jsou monovalentní a tedy vůbec netvoří precipitát.

?

Jak provést stanovení imunokomplexu

?

Na jeden z reaktantů je možné navázat značku, kterou lze následně detekovat ve velmi nízké koncentraci dostupnými technikami – značka musí p poskytovat y intenzivní měřitelný ý signál. g

102

Kvantitativní imunoanalytické techniky Imunnoanalytické techniky jsou založeny na reakci mezi antigenem a protilátkou, ale nevyužívá se zde tvorby precipitátu, ale pouze tvorby imunokomplexu. Kvantitativné imunoanalytické y metody y lze dělit podle p několika kritérií. Nejjednodušší dělení spočívá podle jejich provedení na metody: • Kompetetivní imunochemické analýzy a • Nekompetetivní imunochemické analýzy. Jako značky se využívají například radioisotopy nebo enzymy. Reaktanty mohou být smíchány simultánně nebo sekvenčně. Kompetetivní metody Při simultánní kompetetivní metodě se využívá pro stanovení protilátek značeného Ag* a neznačeného antigenu Ag, kteří soutěží o omezený počet vazebných ý míst na stanovované p protilátce. Při simultánní metodyy se všechnyy reaktanty smíchají najednou.

103

Vhodné značky pro značení imunoreaktantů: 1. Radionuklidy 2. Fluorescenční a chemiluminiscenční značky 3. Enzymy Jde pouze o nejrozšířenější typy značek, mohou se ale využítat jiné značky.

104

Princip simultánní kompetetivní analýzy ý y

Za těchto podmínek musí být avidita protilátky pro značený a neznačený antigen stejná. Pravděpodobnost, že se na protilátku naváže značený antigen je tak nepřímo úměrná koncentraci neznačených antigenů. antigenů

105

Při sekvenční kompetetivní metodě se v prvním kroku neznačený antigen smíchá s přebytkem protilátky a reakce vedoucí ke vzniku imunokoplexu se nachá proběhnout do rovnovážného stavu. V následujícím kroku se přidá do reakční směsi značený antigen a opět se nechá ustavit rovnováha. Po separaci jje navázaná značka změřena ((radioaktvita,, enzymová y aktivita apod.) p ) a vypočítána koncentrace nevázaného antigenu. V tomto dvoukrokovém stanovení se více neznačených antigenů naváže na protilátku oproti simultánnímu stanovení což vede ke snížení detekčního limitu ((2x až 4x). ) Zvýšení limity detekce plyne ze zvýšení vazby Ag:Ab (a tím snížení Ag*), což je umožněno právě postupným přidáváním Ag a Ag*. Jestliže k1 ≥ k-1 (oproti simultánní kompetice kde je k1>> k-1 je disociace imunokomplexu Ag:Ab víc pravděpodobnější což vede ke zvýšené kompetici mezi Ag* a Ag.

Sekvenční kompetetivní metoda

106

U kompetetivních metod platí, že množství stanovovaného antigenu je úměrné signálu odpovídající značenému antigenu antigenu. Kalibrační křivka u kompetetivních metod zápornou hodnotu směrnice. p metody y Nekompetetivní Nekompetetivní (sendvičové) metody využívají imobilizované protilátky specifické proti antigenu, který chceme stanovit. Imobilizace protilátky může být uskutečněna buď prostou pasivní sorpcí nebo pomocí kovalentní vazby. Po přídavku analyzovanéno vzorku, reagují antigeny s imobilizovanou protilátkou. Nenavázané a nestanovované antigeny se odstrané promytím. V dalším kroku se přidá značená protilátka, která má schopnost reagovat s navázaným stanovovaným antigenem se sekundárním odlišným vazebným místem (epitopem), takže vazba mezi stanovovaným antigenem a imobilizovanou protilátkou zůstává zachována. Opět se reakční směs promyje a odstraní se přebytečná značená protilátka. Změří se navázaná značeá protilátka, která je přímo úměrná koncentraci stanovovaného t éh antigenu. ti

107

U nekompetetivní imunoanalýzy je možné využít polyklonální i monoklonální protilátky V případě monoklonální protilátky, protilátky. protilátky která reaguje specificky jenom s jedním epitopem je možné dvoukrokovou inkubaci spojit do jednoho kroku, kdy se do reakční směsi přidá stanovovaný antigen i značená protilátka, což zjednoduší pracovní postup.

108

Imunorádioizotopové metody R. S. Yalowová a S. A. Berson -Výzkum metabolismu insulinu značeného radioaktivním izotopem I (135). V séru pacientů, kteří si léčili cukrovku insulinem se nacházejí protilátky proti insulinu. Tyto protilátky vytvářejí komplexy s radioaktivně značeným insulinem a přidání neoznačeného insulinu mohlo z komplexu vytěsnit označení insulin. Na základě tohoto pozorování vypracovali metodu na stanovení insulinu. Yalowova dostala roku 1977 za objev radioimunoanalytických metod Nobelovu cenu. Imunoradioizotopové metody se vyznačují vysokou citlivostí a specifičností specifičností. Je možné stanovit každou látku, vůči které lze připravit protilátku. Koncentrační citlivost se pohybuje v 11 až 10 10-17 17 mol/l. rozmezí 10-11 mol/l

109

110

Radioimunoanalýza (RIA)

Využívá radioizotopů pro detekci antigenů nebo protilátek v biologických tekutinách Základní princip stanovení Technika RIA stanovení určité látky (antigenu, protilátky nebo obecně ligandu) využívá 3 základní složky: 1. ANTIGEN (LIGAND) – na specifickopu protilátku kterou stanovujeme 2. ZNAČENÝ ANTIGEN – stejná specifická protilátka s navázaným radioaktivním izotopem p 3. PROTILÁTKA – specifická pro antigen, který stanovujeme. Metoda RIA je založená na kompetetivní vazebné reakci, reakci kdy určité neměnné množství radioaktivně značeného antigenu a neznámé množství neznačeného antigenu ve vzorku soutěží o omezené a neměnné množství specificky vazebných míst na protilátce. Dojde tak k vazbě jak označeného, tak neznačeného antigenu na protilátku a ke vzniku imunokomplexu. V další fázi musí být odděleny volné radioaktivní antigeny od vázaných antigenů v imunokomplexech. p Procento vázané radioaktivityy klesá s rostoucí koncentrací neznačeného antigenu ve vzorku.

111

RIA - radioimunoanalýza Kompetetivní metoda používaná ke stanovení antigenů nebo haptenů. Tzn. antigen nebo hapten je značenou molekulou.

Nekompetetivní metoda používaná ke stanovení protilátek. V tomto případě je značená tzv. sekundární protilátka

RIA - radioimunoanalýza

HETEROGENNÍ METODY

IRMA – imunoradiometrická analýza

VYŽADUJÍ SEPARAČNÍ KROK!

112

Kompetetivní RIA Heterogenní metoda Signál radionuklidové značky, použitý k označení antigenu či haptenu není ovlivněn vlastní reakcí mezi antigenem g ap protilátkou.

Celkový signál radionuklidové značky v rekčním objemu před interakcí antigenu s protilátkou je shodný s celkovým signálem po této interakci. Před kvantifikací jje nutné p provést separaci p značeného antigenu g ((haptenu) p ) v imunokoplexu od nezreagovaného značeného antigenu. Jak tuto separaci provést? • gelová chromatografie na mikrokolonce • precipitací imunokomplexu pomocí sekundární protilátky • nespecifickou adsorpcí značených haptenů např. na aktivním uhlí • imobilizací i bili í protilátky tilátk nebo b antigenu ti na pevnou fá fázii • frakční precipitací polyethylejglykolem Oproti p homogenním g metodou jjsou heterogenní g metody y zdlouhavější j a vyžadují několik kroků, ale jsou více citlivé

113

V případě RIA analýzy je nutné pro dosažení vysoké citlivosti a přesnosti stanovení vnášet do reakce takové množství značeného antigenu g a tak ředěnou protilátku, aby v nepřítomnosti neznačeného antigenu bylo vázáno s protilátkou okolo 30 až 50 % vneseného značeného antigenu. Tzn. Aby bylo detekováno okolo 30 až 50 % radioaktivity. RIA je heterogenní typ imunoanalýzy, která především vyžaduje fyzikální oddělení volného značeného antigenu od imunokomplexu tj. vázaného značeného antigenu na protilátku. Po oddělení těchto dvou forem značeného antigenu měříme většinou radioaktivitu jeho vázané formy. Využívají se 3 typy separačních technik pro metody RIA 1. Stanovení na pevné fázi – nejjednodušší typ. Specifické protilátky jsou adsorbovány v určitém množství na vnitřní stěně zkumavek. zkumavek Vzorky s neznačeným antigenem a s konstantním přídavkem značeného antigenu lze potom jednoduše přidat do protilátkou potažených zkumavek. Během inkubace soutěží značené a neznačené antigeny o vazbu na omezený počet vazebných míst na imobilizovaných molekulách protilátek. Po skončení inkubace je zbylý volný antigen ostraněn slitím nebo odsátím. Radioaktivita značeného imunokomplexu antigen – protilátka vázaného na stěny zkumavek může být přitom změřena na gama – počítači.

114

2. Metoda separace na aktivovaném uhlí – využívá sorpčních vlastností dextranem povlečeného aktivního uhlí. uhlí Takto modifikovaný sorbent vychytává nízkomolekulární antigeny (volný antigen), zatímco vázaný antigen zůstává v roztoku ve formě imunokomplexu antigen – protilátka. Měří se radioaktivita volného značeného antigenu v sedimentu aktivovaného uhlí. Metoda má výhodu v nízké nespecifické vazbě. Nevýhodou je určitá závislost reprodukovatelnosti výsledků na době inkubace s aktivovaným uhlím. Metoda nemůže být použita pro detekci antigenů o vysoké molekulové hmotnosti. 3. Metoda separace srážením – založena na počáteční fázi kompetetivní reakce mezi radioaktivně značeným a neznačeným antigenem a omezeným počtem vazebných míst na protilátkách. Vzniklé komplexy antigen – protilátka jsou oddělovány od volného značeného antigenu z roztoku nasyceným amonium sulfátem (tzv. Farrova technika). Jiná srážecí separační technika používá k oddělení původně rozpustných imunokomplexů tzv. metodu srážení pomocí druhé protilátky. Pro oddělení volné a vázanou formu značeného antigenu přidáváme do systému druhou protilátku, ilá k specifickou ifi k protii primární i á í protilátce ilá a vyvoláme lá takk vznik ik velkých lký h precipitujících imunokomplexů antigen‐primární protilátka‐sekundární protilátka. Precipitáty vznikající při všech typech srážecích reakcí mohou být sedimentovány centrifugací. centrifugací 115

Kalibrační křivka v případě kompetetivní heterogenní RIA analýzy

Měře ená radio oaktivita

- Závislost mezi měřenou radioaktivitou a koncentrací stanovovaného antigenu (haptenu) má tvar blízký rovnoosé hyperboly.

K Koncentrace t antigenu ti (haptenu) (h t ) 116

Částečná linearizace – vynesením závislosti měřené radioaktivity na logaritmu koncentrace stanovovaného antigenu (haptenu)

Logit % B

Úplná linearizace – transformací souřadnic na závislost logit - log

log koncentrace antigenu log koncentrace antigenu

117

Pro vzájemné porovnávání jednotlivých kalibračních křivek se na y-osu vynaší poměr B/B0 x 100 100. B = Ai - Ni B0 = A0 - N0

Specifická vazba v nepřítomnosti stanovovaného antigenu

Ai – radioaktivita di kti it imunokomplexu i k l při ři různých ů ý h kkoncentracích t í h stanovovaného t éh antigenu ti A0 – radioaktivita imunokomplexu bez přítomnosti antigenu v reakci Ni – radioaktivita di kti it naměřená ěř á v iimunokomplexové k l é ffrakci k i při ři různých ů ý h kkoncentracích t í h Antigenu bez specifické protilátky. N0 – radioaktivita naměřená v imunokomplexové bez specifické protilátky a bez stanovovaného antigenu

118

Specifická vazba v nepřítomnosti stanovovaného antigenu při nulové koncentraci stanovovaného antigenu je základní charakteristikou RIA RIA. Hodnoty se vyjadřují v procentech.

Specifická vazba = 100 x (A0 - N0)/T = 100 x B0/T T je celková radioaktivita vnášená do systému Hodnotyspecifické vazby se obvykle pohybují v rozmezí 20 – 50 %.

Nespecifická vazba je nespecificky vázaná radioaktivita bez specifické protilátky. Specifická vazba = 100 x N/T

Její hodnoty odpovídají účinnosti separačního postupu užitého k dělení g a o nespecifickém p záchytu y volného volného a vázaného antigenu radioindikátoru ve vázané frakci. 119

Koncentrace antigenu v testovaném vzorku je nepřímo úměrná množství  radioaktivity ve vázané formě radioaktivity ve vázané formě.  y Protilátky v RIA Jsou používané jako činidla ‐ jsou navázané na pevný nosič jako jsou např. vnitřní p povrchyy p polystyrenových y y ý zkumavek nebo p polystyrenové y y kuličky. y Protilátky specificky rozpoznají antigen nebo hapten (tj. např. léčivo nebo steroidní hormon, který chceme stanovit). Protilátka může být jak polyklonální, tak monoklonální. Monoklonální protilátky v RIA – identické molekuly protilátek rozeznávající jednu  antigenní determinantu s totožnou afinitou. g Polyklonální protilátky v RIA – směs protilátek rozeznávající různé antigenní  determinanty na antigenu a/nebo stejný antigen s odlišnou afinitou.  Radioaktivně značený antigen – R di kti ě č ý ti purifikovaná molekula s kovalentně vázaným  ifik á l k l k l t ě á ý radioizotopem. Nejčastěji používaným izotopem je 125I.

120

Ředící roztok ‐ používají se pufry, které obsahují EDTA a hovězí sérový albumin (BSA), aby se omezili nespecifické vazby a jako konzervační prostředek. prostředek Standardy a kontrolní séra – obsahují deklarovanou koncentraci antigenu nebo protilátky proti antigenu, azid sodný a sérum většinou lidského původu. Existuje řada variant a modifikací RIA, které se liší experimentálním uspořádáním, p , ale i principem. p p Solid phase RIA – RIA na pevné fázi – protilátky nebo antigen jsou vázány na nosič – výrazné zvšení citlivosti. Homogenní RIA ISAC-RIA = internal sample attenuator counting SPA = scintilation proximity radioimmunoassay

121

ISAC-RIA = internal sample attenuator counting • Kompetetivní metoda s přímou modulací na pevné fázi • Do částic vhodného materiálu je zabudován adsorbent radioaktivního záření (oxidy bizmutu) a na jejich povrch jsou navázány protilátky protilátky. • Antigen je značem 125I • Jeho radioaktivita v imunokomplexu je vázaném stavu nižší než ve volné formě SPA = scintilation proximity radioimmunoassay

• Kompetetivní metoda na pevné fázi, ale s nepřímou modulací. pevné fáze jjsou navázané p protilátky y a vhodný ý fluorofor • Na částice p • Fluorofor je excitován v momentě, kdy se na protilátku naváže značený antigen 125I

122

Výhody, nevýhody a praktické aplikace RIA Výhody: použití značených antigenů. Díky velmi citlivému měření radioaktivity je možné dosahovat velmi nízkých limitů detekce. detekce Citlivost je závislá na použitém druhu radionuklidu ke značení, na afinitě protilátky proti antigenu. Nevýhody: radioizotopy použité ke značení mají krátký poločas života tj. 1 až 2 měsíce.

123

Imunoradiometrická analýza (IRMA) Principem je použití radioizotopem značené protilátky ke kvantitativnímu stanovení antigenu v biologických tekutinách. IRMA využívá nadbytek radioaktivně značené protilátky ke stanovení veškerého antigenu ve vzorku a jde tedy o nekompetetivní typ metody. K oddělení radioaktivně značené protilátky navázané na antigen od volné značené protilátky je třeba proces separace. IRMA na pevné fázi je označována jako sendvičová technika. Je používána ží á k stanoveníí vysokomolekulárních ke k l k lá í h antigenů ů s nejméně é ě dvěma d ě antigenními determinanty. Stanovení je založeno na využití imobilizované primární protilátky specifické  proti první  antigenní determinantě na antigenu a na sekundární protilátce  značené 125I, která je namířena proti druhé antigenní determinantě  na téže  molekule. V k Vzorky s antigenem jsou přidány do zkumavek potažených primární protilátkou a  i j řidá d k k ž ý h i á í ilá k potom následuje přidání sekundární značené protilátky s jodem. Během  inkubace se naváže antigen na imobilizovanou protilátku takovým způsobem, že  do há í k ýhodné orienta i anti en pro a b načené sek ndární protilátk dochází k výhodné orientaci antigenu pro vazbu značené sekundární protilátky   na druhou antigenní determinantu a vytvoří se tak sendvič s antigenem mezi  124

dvěma různými protilátkami.  Po skončené inkubaci je všechna volná značená  protilátka odstraněna prostou dekantací kapaliny Radioaktivita vázané frakce je protilátka odstraněna prostou dekantací kapaliny. Radioaktivita vázané frakce je  stanovena změřením radioaktivity zkumavek.  Nejjednodušeji se IRMA provádí tak, že jsou obě protilátky (primární i sekundární)  přidány najednou. Reagencie pro IRMA Neznačená (primární) protilátka je adsorbována na pevném podkladě. Při IRMA se  nejčastěji používají monoklonální protilátky. Kalibrační křivka pro IRMA Čím je vyšší je množství vázaného izotopu, tím vyšší je koncentrace látky ve vzorku. Při nadbytku imubilizované primární protilátky je zajištěno, že všechen přidaný antigen ze vzorku se naváže na protilátku. Po přidání nadbytku sekundární značené protilátky opět dojde k obsazení všech specifických antigenních determinant na antigenu a radioaktivita této vázané formy protilátky je přímo úměrná koncentraci antigenu.

125

Impulzy/m min

koncentrace Citlivost IRMA je nižší u RIA. IRMA stanovení je jednodušší.  Je možné měřit v širších  koncentračních rozmezích. 

126

Imunoenzymatické metody (EIA)

1971 – Engvan a Perlmann Existuje poměrně velké množství imuenzymatických metod, ale základní rozdělení lze provést: • EIA v kapalné fázi • EIA na pevné fázi EIA metody v kapalné fázi • Na hapten p jje navázán enzym y jjako značka. • hapten je titrovaný protilátkou a dochází k reakci mezi značeným haptenem a protilátkou. • probíhající reakce vede ke změně aktivity enzymu navázaného haptenu • s narůstající koncentrací stanovovaného haptenu

127

Užití enzymu jako značky protilátky nebo antigenu: • Enzym je kovalentně vázán na některý z imunoreaktantů (antigen, (antigen hapten, protilátka, sekundární protilátka) a nebo je přidáván do reakční směsi až po vytvoření imunokomplexu. Heterogenní EIA x Homogenní EIA

V praxi převážně využívané

V praxii málo ál využívané ží é

128

Enzymová imunoanalýza na pevné fázi (ELISA) Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay • Jeden z imunoreaktantů je vázán na pevný nosič (tyčinky, (tyčinky kuličky kuličky, stěny zkumavek, membrány, stěny mikrotitračních destiček. • Nekompetetivní ELISA – pracuje se přebytkem imunoreaktantů, aby bylo zachyceny co nejvíce analytu a dosaženo co největšího signálu při měření enzymové aktivity. • Kompetetivné ELISA – snižováním koncentrace imunoreaktantů se zvyšuje citlovost ((do jjisté míry), y), p protože snožování koncentrací imunoreaktantů vede ke snížení rychlosti tvroby imunokomplexu a snižuje se přesnost stanovení. Nekompetativní ELISA s imobilizovanými protilátkami Imobilizace protilátek nebo jejich fragmentu Fab na pevnou fázi ve častý způsob stanovené antigenů pomocí ELISA metody. Antigen musí mít alespoň dva epitopy. V některých případech se používájí metody využívající sekundárních protilátek. 129

Nejčastější upořádání pro finální imunokomplex vázaný na pevný nosič: 1. Neimunochemická vazba

E- enzym PL – protilátka AG – stanovovaný antigen

PL-AG-PL*E Imunochemická vazby

2.

Neimunochemická vazba

PL-AG-PL-PL2*E

E- enzym PL – protilátka PL2 – sekundární protilátka AG – stanovovaný antigen

Imunochemická vazby 130

3.

Neimunochemická vazba

Fab-AG-PL-PL2*E

E- enzym E Fab – fragment protilátky PL – protilátka PL2 – sekundární protilátka AG – stanovovaný antigen

Imunochemická vazby

•Sekundární protilátka – tvoří imunokoplex se specifickou protilátkou (interagující s antigenem). •Sekundární Sekundární protilátka se připraví tak, že jako imunogen se použije Ig frakce ze séra živočišného druhu, jehož imunizací byla připravena specifická protilátka, a touto frakcí je imunizován jedinec jiného živosčišného druhu ((králík – myš, y , králík – p prase). )

131

Nejčastěji používanou variantou v praxi je varianta využívající enzymem značenou protilátku. p

YYYY

YYYY Y Y Y

YYYY

E

Y

E

Y

Y – imobilizovaná protilátka Y Y Y YE

E E

YYYY

- antigen

E - Protilátka značená enzymem 132

Y

Nekompetetivní ELISA s imobilizovaným antigenem Pří á a nepřímá Přímá ří á metoda t d 1. Přímá metoda Imobilizovaný antigen reaguje přímo s přebytkem protilátky značené antigenem • Detekce proteinů po imunoblottingu Z gelové vrsty po elektroforéze se získá otisk separovaných proteinů na nitrocelulozovou membránu a na tomto otisku se antigen zviditelní reakcí se specifickou protilátkou značenou enzymem a následně změnou barvy chromogenní látky při enzymové reakci reakci. 2. Nepřímá metoda Využívána pro stanovení protilátek. protilátek Imobilizovaný antigen nejdříve reaguje se specifickou protilátkou a potom je přidána sekundární protilátka značená enzymem.

133

Neimunochemická vazba

PL-AG-PL-PL2*E

E- enzym y PL – protilátka PL2 – sekundární protilátka AG – stanovovaný antigen

Imunochemická vazby

Kompetetivní p ELISA s imobilizovanými ý p protilátkami Kompetice antigenu značeného enzymem s antigenem (haptenem) s testovaného vzorku o omezený počet vazebných míst na protilátce. PL

PL-Ag*E

PL

PL A *E PL-Ag*E

PL PL

+ 8 Ag*E + 4 Ag

PL-Ag PL-Ag*E

+ 5 Ag*E + 3 Ag 134

Enzymová aktivita na pevné fázi je nepřímo úměrná množství stanovovaného neznačeného antigenu g = tzv. rovnovážná saturační metoda. Další možné uspořádání: Kompetice mezi antigenem ze vzorku a antigenem značeným enzymem o vazebná místa na protilátce tak, že jsou přidávany do reakční směsi postupně = tzv. sekvenční saturační metoda. V úzkém rozsahu koncentrací je dosaženo vyšší citlivosti. Musí se ale přesně dodržovat doby inkubací. Kompetetivní ELISA s imobilizovaným antigenem (haptenem) 1. Přímá metoda Ag

Ag-PL*E

A Ag

A Ag

Ag Ag

+ 6 PL*E + 6 Ag

Ag Ag-PL*E

+ 4 Ag-PL*E + 2 Ag

135

2. Nepřímá metoda V první fázi (kompetetivní fáze) se použije specifická protilátka neznačená enzymem a kvantifikace imobilizovaných imunokomplexů se provede sekundární enzymem značenou protilátkou.

Ag

Ag-PL-PL2*E

A Ag

A Ag

Ag

+ 6 PL + 4 Ag

+ 6 PL2*E

Ag

Ag Ag-PL-PL2*E

+ 4 PL2*E

136

inkubace + promytí • vyšší citlivost • možnost využívat enzymem značenou sekundární protilátku univerzálně v nepřímé ELIS jakéhokoliv antigenu. Enzymem značené protilátky jsou komerčně dostupné. 136

Homogenní EIA Nekompetetivní Kompetetivní Nekompetetivní: • 2 monoklonální protilátky specifické vůči dvěma epitopům jednoho antigenu se označí každá jiným enzymem. • Enzymy jsou voleny tak, aby produkt enzymové reakce jednoho z nich sloužil jako substrát druhého enzymu (glukosoxidasa – peroxidasa). peroxidasa) • Měřitelná enzymová aktivita takového spřaženého systému je detekovatelná pouze tehdy, pokud jsou obě protilátky navázány na antigen a tím se dostanou do blízkosti i molekuly obou enzymů.

P

S

E1 PL2

E1 PL1

Konečný produkt

Je možné místo 2 enzymů použít dvojici enzym - luminofor

Antigen

137

Další vhodné dvojice enzymů: Hexokinasa – Glukosa-6-P-dehydrogenasa Glukosa 6 P dehydrogenasa NAD oxidoreduktasa – luciferasa Fosfofruktokinasa – fosfoenolpyruvátkarboxyláza Peroxidasa - luminol Kompetetivní EIA – více možných přístupů EMIT – Enzym Multiplied Immunoassay Technique • Roztok R t k známého á éh množství ž t í značeného č éh h haptenu t nebo b antigenu ti se standardním t d d í (nebo neznámým stanovovaným množstvím) neznačeného haptenu reaguje s limiítovaným počtem molekul protilátky v roztoku. Interakce protilátky s enzymem značenou protilátkou ovlivňuje výslednou enzymovou aktivitu (obvykle dochází ke snížení aktivity). • Není tedy nutné provádět separaci imunokomplexu se značeným haptenem od volného značeného haptenu haptenu. • Měří se pouze změna enzymové aktivity v roztoku.

138

Enzym jako značka v imunoanalýze Je nutné vybrat co nejvhodnější enzym pro účely značení protilátky nebo antigenu (haptenu). • enzym musí být stabilní. stabilní • struktura enzymu musí umožnit vytvoření kovalentní vazby s protilátkou či antigenem a nesmí dojít k výraznému ovlivnění katalytické aktivity y enzymu. • enzym by měl mít co nejnižší molekulovou hmotnost, aby velikost molekuly neovlivňovala imunochemické reakce. •p produkt enzymové y reakce musí být ý snadno detegovatelný g ý i ve velmi nízkých koncentracích. • enzym by měl mít co nejvyšší katalytickou aktivitu. • enzym by měl být dostupný v potřebné čistotě.

Náročným požadavkům vyhovuje velmi málo enzymů

139

Např. křenová peroxidasa, alkalická fosfatasa, acetylcholinesterasa, glukoamylasa ureasa glukoamylasa, ureasa, malátdehydrogenasa malátdehydrogenasa. Fluorescenční imunoanalýza ý Jako značka se používá vhodný fluorofor emitující fluorescenční záření po excitaci zářením vhodné vlnové délky. • fluoresceinisothiokyanát (FITC) • tetramethylrodamiisothiokyanát (TMRITC) • umbeliferon • fluoreskamin • fykoertrin Uvedené fluorofory emitují záření o vlnové délce o 30 až 80 nm vyšší než byla původní excitační vlnová délka. Pracuje se nejčastěji homogenní kompetetivní metodou Navázání p protilátky y na značený ý antigen g mohou zapříčinit p určité změny ve fluorescenčních vlastnostech značky.

140

Využívá se tedy následujících jevů: • fluorescenční polarizace p • excitační přenos fluorescence • stupňování fluorescence • zhášení fluorescence Citlivost těchto metod limituje interferce balastních látek z biologických vzorků. Používají j se ke stanovení vyšších y koncentračních hladi řádově mg/l a hapteny µg/l. Heterogenní kompetetivní FIA = DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluoro-Immuno-Assay • využívá ke značení chelátu Eu3+, který emituje intenzivní fluorescenci s maximem 613 nm. • zvýšení ýš í citlvosti itl ti až ž o 5 řádů řádů.

141

Chemiluminiscenční imunoanalýza (CIA) Jako značka se využívá luminofor: • luminol • isoluminol • akridinové k idi é estery

Luminol

Uvedené látky při oxidaci vyzařují světlo • heterogenní CIA – častěji využívaná • homogenní CIA

142

Ostatní značky používané v imunoanalýze • spinová značka – stabilní volné radikály (dinitrofenyl – měří se magnetický moment pomocí spinové rezonance) • latexy • baktriofágy • liposomy ( g, Au,, Fe,, Mn • kovyy (Ag, Imunosenzory Elektronické zařízení, které umožňují přímo nebo nepřímo sledovat interakce mezi protilátkou a antigenem (analytem). • Přímé – monitotují změnu koncentrace analytu v médiu • Nepřímé – využívají potenciometrii či amperometrii pro kvantifikaci enzymové imunoanalýzy

143

Přímé imunosenzory Měření elektrických či optických vlastností ve vrstvě z materiálu materiálu, na kterém jsou imobilizované protilátky po jejich interakci s antigenem. Změny v elektrických či optických vlastnostech jsou dány odlišnou konformací, či odlišným nábojem molekul Ig po interakci s antigenem. Výhody: 1 Rychlost analýzy 1. 2. Nevyžadují separační kroky 3. Minimální množství potřebných reagentů Nepřímé imunosenzory Měřen je výsledek interakce mezi protilátkou a enzymem značeným antigenem. Je nutné zařadit inkubační a promývací kroky kroky. Amperometricky je možné stanovit následující produkty enzymové reakce – peroxid vodíků, kyslík, fenol

144

Využití imunoanalytických metod v praxi Pročč využívat P ží t imunoanalytické i l ti ké metody: t d • citlivé metody • specifické metody • kapacita (vysoká prostupnost vzorků) • náklady na analýzu jsou nízké • automatizace • jednoduché provedení • bez nutnost používat kroky vedoucí k úpravě vzorků (extrakce, clean-up apod.) Proč nepoužívat imunoanalytické metody: 1. KAŽDÝ ANALYT VYŽADUJE PŘÍPRAVU JINÉ PROTILÁTKY, KTERÁ JE VĚTŠINOU KOMPLIKOVANÁ. KOMPLIKOVANÁ 2. Citlivost imunoanalytických technik je tak nízká, že ji nelze konfirmovat jinou analytickou technikou, což může vést k produkci falešně p pozitivních výsledků. ý

145

Oblasti využití imunometod: • humáníí a veterinární lékařství • toxikologie • analýza polutantů v životním prostředí • potravinářství • kontrola výroby (léčiva, pesticidy..) • mikrobiologie

146

Zkuste sami navrhnout jjak byste y p provedli RIA, ELISA stanovení včetně přípravy protilátek?

147