23
III. METODE PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung dari bulan Januari sampai dengan bulan April tahun 2014.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: cawan petri, tabung reaksi, rak tabung, kapas, autoklaf, laminar air flow, mikroskop, magnetic stirrer, oven, vortex mixer, pembakar bunsen, timbangan, inkubator, colony counter, water bath, mikropipet, mortar, timbangan analitik, plastik tahan panas, plastik zipack, kertas kopi, dan spidol.
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu media pertumbuhan untuk isolasi kapang yaitu medium Potato Dextrose Agar (PDA). Komposisi Potato Dextrose Agar (PDA) dalam 1000 ml yaitu 4 g Potato extract, 20 gram glukosa, dan 15 gram agar. Alkohol 70%,
24
aquades, garam fisiologis, inokulum tape, air gula, bawang putih, jeruk nipis, lengkuas, lada putih, cabe jawa, tepung beras putih, aluminium foil, isolat Bacillus sp. (koleksi Laboratorium Mikrobiologi), inokulum tempe dan ampas kelapa.
C. Metode Penelitian
1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan pengacakan yaitu Rancangan Acak Lengkap ( RAL ) dan rancangan perlakuan faktorial 2 x 4 x 4. Faktor A adalah perlakuan dengan 2 taraf suhu yaitu penyimpanan pada suhu 27 OC dan penyimpanan pada suhu 37 OC. Faktor B adalah perlakuan dengan 4 taraf penyimpanan pada jenis kemasan yaitu aluminium foil, kertas kopi, plastik tahan panas dan plastik zipack. Dan faktor C adalah perlakuan dengan 4 taraf lama penyimpanan yaitu 0, 1, 2 dan 3 bulan. Setiap perlakuan dilakukan 3 kali pengulangan. Inokulum probiotik disimpan selama 3 bulan untuk diuji ketahanannya dengan menggunakan metode lempeng agar tuang ( pour plate method) untuk menentukan jumlah koloni hidup. Hasil penelitian berupa total jumlah kapang pada setiap 1 bulan, kemudian diidentifikasi secara makroskopis dan mikroskopis.
25
2. Analisis Data
Dalam penelitian ini ata yang telah diperoleh kemudian dianalisa dengan Analisis Sidik Ragam( Anara ) kemudian dilanjutkan pada uji Beda Nyata Terkecil (BNT) dengan tingkat kesalahan 5%.
D. Pelaksanaan Penelitian.
1. Pembuatan Inokulum Probiotik
Pembuatan inokulum probiotik terdiri dari 3 komponen yaitu komponen A (inokulum khamir ), komponen B (inokulum kapang ) dan komponen C ( bakteri Bacillus sp.). Pembuatan inokulum probiotik ini dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : a. Pembuatan Komponen A Langkah-langkah pembutan komponen A adalah menyiapkan 100 g tepung beras, 33,3 g lada putih, 0,5 g lengkuas, 3,33 g bawang putih dan 3,33 g cabe jawa. Bahan – bahan tersebut dibersihkan terlebih dahulu bagian yang tidak dibutuhkan. Setelah itu bahan-bahan tersebut ditimbang sesuai dengan komposisi yang dibutuhkan, kemudian bahan-bahan tersebut dihaluskan. Selanjutnya dicampur menjadi satu dan ditambah 1 g ragi tape komersial yang sudah disiapkan sebagai starter. Kemudian diadon dengan air perasan jeruk nipis dan air gula sehingga dapat dibentuk bulatan-bulatan pipih. Bulatan - bulatan yang sudah dibentuk kemudian diletakkan di atas nampan dan ditutup dengan plastik. Selanjutnya diinkubasi pada suhu
26
ruang selama 48 jam hingga mikroorganisme tumbuh dan berkembang biak. Kemudian adonan yang telah ditumbuhi mikroorganisme dikeringkan dengan cara dijemur oleh bantuan sinar matahari selama 2-4 hari. Inokulum yang sudah kering dan disimpan ditempat yang kering dan sudah siap untuk digunakan. b. Pembutan Komponen B Ampas kelapa direbus dengan akuades hingga mendidih, kemudian ampas kelapa dipress hingga kering, selanjutnya ditaburi inokulum tempe secukupnya dan diaduk hingga merata, lalu dimasukan ke dalam plastik yang sudah dilubangi sama seperti pembutan tempe dan diinkubasi 2-3 hari pada suhu ruang, hingga kapang tumbuh. Setelah kapang tumbuh dengan padat, ampas kelapa dipotong kecil-kecil (ukuran 1 x 5 cm) agar waktu penjemuran ampas lebih singkat. Potongan yang sudah kering ditumbuk hingga halus, agar siap digunakan. c. Pembuatan Komponen C Sebanyak 10 mL kultur bakteri Bacillus sp. yang berumur 24 jam, ditempatkan di dalam tabung rekasi yang berisi 1000 mL Nutrient Broth (NB), kemudian diinkubasi pada suhu 37OC selama 24 jam di dalam water bath shaker. Setelah diinkubasi biakan digunakan untuk membuat inokulum probiotik.
Kompenen A dan B yang telah dihaluskan dicampur dengan komponen C, kemudian diaduk sampai seluruhnya merata dan dibentuk bulatan pipih
27
(diameter 15 cm). Inokulum probiotik disimpan dalam inkubator pada suhu 50 0C selama 5 hari sampai inokulum mengering, lalu dihaluskan.
2. Uji Viabilitas Inokulum Probiotik.
Inokulum probiotik dikemas menggunakan 4 jenis kemasan yaitu aluminium foil, kertas sampul, plastik tahan panas, dan plastik zipack. Sebanyak 5 g inokulum ditempatkan di setiap jenis kemasan, dan setiap kemasan dibuat 3 kali ulangan. Keempat jenis kemasan disimpan pada suhu ruang 27 OC, dan 4 jenis kemasan lagi disimpan pada inkubator suhu 37 OC selama 3 bulan, setiap bulan dilakukan perhitungan jumlah kapang dengan interval waktu 0, 1, 2 dan 3 bulan.
3. Perhitungan Kapang
Sebanyak 1 g inokulum probiotik dari 8 kemasan ditimbang, diencerkan dengan tingkat pengenceran 10-1 sampai dengan 10-6, dengan menggunakan larutan garam fisiologis steril. Setiap pengenceran 10-4, 10-5, dan 10-6 dibuat cawan tuang pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu ruang selama 35 hari.
Perhitungan dilakukan dengan menggunakan metode Standard Plate Count (SPC) yaitu menggunakan colony counter dengan syarat jumlah koloni setiap cawan Petri antara 30-300 koloni, dan tidak ada koloni yang ukurannya hingga menutupi lebih dari setengah luas cawan Petri (Ferdiaz 1992). Perbandingan jumlah kapang dari hasil pengenceran yang
28
berturut-turut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya. Jika hasil perbandingan ≤ 2 maka hasilnya dirata-rata, tetapi jika ≥ 2, maka yang digunakan adalah jumlah kapang pada pengenceran sebelumnya.
4. Identifikasi Kapang
Setelah masa inkubasi, kemudian dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan koloni kapang secara makroskopis dan mikroskopis. Hasil isolasi dinyatakan positif bila pada media PDA terdapat koloni kapang. Kapang yang sudah diperoleh kemudian dilakukan identifikasi berdasarkan penampakan makroskopis dan mikroskopis. a. Karakterisasi makroskopis kapang Karakterisasi makroskopis kapang dilakukan dengan mengamati pertumbuhan kapang pada media PDA berumur 3 hari. Pengamatan kapang meliputi bentuk, warna, margin dan elevasi koloni. b. Karakterisasi mikroskopis kapang Karakterisasi kapang dilakukan dengan cara membuat preparat pada kaca objek dengan pewarnaan lactofenol cotton blue dari kultur kapang berumur 3 hari. Pengamatan kapang meliputi sekat hifa, pigmen hifa (tidak berwarna, coklat kehijauan, hitam atau kelabu), bentuk hifa (spiral, bernodul, atau mempunyai rhizoid), bentuk spora aseksual (konidia atau sporangiospora), jenis spora seksual (askospora, basidiospora dan zigospora) dan modifikasi hifa.
29
E. Diagram Alir
Komponen A
Komponen C
Komponen B
Pencampuran semua inokulum menjadi inokulum probiotik
Uji daya tahan mikroba dengan kemasan berbeda Plastik zipack, plastik tahan panas, aluminium, foil dan kertas sampul.
Analsis Data
Pour Plate PDA (jumlah kapang)
Suhu ruang Suhu 37 0C 0, 1, 2, 3 bulan
Identifikasi
