II. Neformální proteomické setkání 30. listopadu - 1. prosince 2012 Olomouc
Kniha výtahů
Proteomická sekce ČSBMB s finanční podporou:
O1 Purifikace bazických peptidů a jejich detekce hmotnostní spektrometrií Danihlík J, Lenobel R, Šebela M, Petřivalský M Katedra biochemie PřF UP, Olomouc Antimikrobiální peptidy jsou významnou součástí humorální imunitní odpovědi včel. Jejich cílem jsou patogenní mikroorganismy, které přes fyzikální bariéry (kutikula, epitel střeva) proniknou až do hemolymfy včel. Publikované práce zabývající se detekcí antimikrobiálních peptidů včel byly založeny na HPLC analýze s UV-VIS detekcí. Cílem této práce bylo vyvinout metodiku zpracování vzorku včel a purifikace bazických peptidů umožňující následnou hmotnostně-spektrometrickou detekcí. Purifikace antimikrobiálních peptidůje založena na vysoké hodnotě izoelektrického bodu: 11,71 pro apidaecin a a 10,45 pro abaecin. Purifikace peptidů z komplexní matrice (homogenát celých těl včel) zahrnuje vysrážení proteinů 0,1% TFA, přečištění peptidové frakce kationtoměničovou chromatografií a odsolení na reverzní fázi. Finální detekce a kvantifikace zahrnuje nanokapilární chromatografii on line spojenou s hmotnostněspektrometrickou detekcí s využitím syntetických standardů peptidů. Optimalizovaná metoda detekce a kvantifikace antimikrobiálních peptidů bude použita při výzkumu produkce těchto peptidů po nákaze specifickými patogeny včel. Dosažené výsledky přispějí k novým poznatkům o imunitě včel jako hospodářsky a ekologicky důležitého hmyzu.
1
O2 2-DE. Zralá dáma, její vrtochy a dejá vu Jiří Petrák Ústav patologické fyziologie, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze; Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha Proč je uctíván O´Farrell a ne Smithies s Poulíkem ? Jaká je reálná citlivost 2-DE? Kolik proteinů je jeden spot? Kolik spotů je jeden protein? Proč pořád nacházíme enolázu, heat-shock proteiny, protein disulfid isomerázu a annexiny? Žádná z těchto otázek nebude uspokojivě zodpovězena, ale všechny budou nakousnuty. S laskavou podporou GAČR 305/09/1390 a MŠMT - PRVOUK P24/LF1/3.
2
O3 Metoda ‘Parallel Reaction Monitoring’ pro cílenou kvantifikaci peptidů Michaela Ščigelová Thermo Fisher Scientific, Hanna-Kunath-Str. 11, 28199 Bremen, Germany;
[email protected] Cílená kvantifikace peptidů je velmi dynamická oblast proteomiky, která se těší značné pozornosti. Na základě analogie s oblastí analýzy malých molekul byly i v proteomice zprvu použity hmotnostní spektrometry typu trojitého kvadrupolu v režimu ‘selected reaction monitoring’ (SRM). Zkušenosti však ukázaly některá omezení tohoto přístupu, která se v oblasti cílené analýzy peptidů jeví jako značně závažná. Za prvé, existuje horní limit zhruba stovky peptidů, které je možné v jedné SRM metodě monitorovat s dostatečnou citlivostí. Avšak pro účely většiny studií proteinových biomarkerů je nutné počet peptidů monitorovaných v jedné metodě navýšit na několik set. Za druhé, ve vzorcích se setkáváme s neobyčejně bohatou matricí, která při použití trojitého kvadrupolu s jednotkovým hmotnostním rozlišením negativně ovlivňuje selektivitu měření. Nedávno publikované výsledky napovídají, že použití hmotnostního spektrometru s vysokým rozlišením může poskytnout řešení obou výše zmíněných problémů. Metoda nazvaná ‘parallel reaction monitoring’ (PRM) vychází z použití technologie moderních hmotnostních spektrometrů, které kombinují kvadrupol a detektor s vysokým rozlišením (Orbitrap). V metodě PRM, ve schématu přístroje trojitého kvadrupolu, je třetí kvadrupol jednoduše nahrazen hmotnostním analyzátorem s vysokým rozlišením. Ten dovoluje monitorovat veškeré možné fragmenty cíleného analytu v jediném detekčním kroku. Kvantitativní analýzy pomocí metody PRM vykazují, v přítomnosti pozadí tvořeného enzymatickým zpracováním buněčného lyzátu, širší dynamický rozsah než metoda SRM. To se děje právě z důvodu vysoké selektivity v doméně m/z a díky paralelní detekci veškerých možných fragmentů. Dosažitelná linearita ve kvantifikovatelném rozsahu koncentraci je pro obě metody statisticky ekvivalentní. Mnohem důležitěji však je, že PRM vyžaduje minimální vývoj metody. Navíc, přístroj spojující kvadrupol s Orbitrapem umožňuje tzv. ‘multiplexing’, čehož lze s velké míře využít právě pro cílené proteomické analýzy. Tento PRM přístup se plně osvědčil v experimentu monitorujícím 770 peptidů během 60-ti minutové analýzy na pozadí proteomu lidské moči. Odkazy: Targeted Proteomic Quantification on Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Gallien et al., MCP 2012, O112.019802 Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Peterson et al., MCP 2012, O112.020131
3
O4 Proteomická identifikace potenciálních markerů intraamniálního zánětu a infekce u pacientek se spontánním předčasným porodem Vojtěch Tambor1, Juraj Lenčo2, Marie Vajrychová2, Marian Kacerovský1 a Ramkumar Menon3 1) Centrum Biomedicínského Výzkumu, Fakultní nemocnice Hradec Králové 2) Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany 3) University of Texas Medical Branch at Galveston Úvod: Intraamniální infekce (MIAC) a histologická chorioamnionitida (HCA) jsou časté komplikace spojené se spontánním předčasným porodem (sPTB). Většina těchto komplikací bohužel probíhá subklinicky a v současné době neexistuje žádný specifický marker pro jejich časnou detekci. V naší práci jsme využili kvantitativní proteomický přístup pro studium změn v proteomu plodové vody, ke kterým dochází na podkladě HCA a MIAC, s cílem nalézt proteiny, které by mohly být využity pro diagnózu těchto komplikací. Design projektu: Do projektu bylo zařazeno 31 sPTB pacientek bez HCA a MIAC a 26 sPTB pacientek s HCA a MIAC. Vlastní proteomická analýza byla rozdělena na explorativní a verifikační fázi. V první části jsme ke snížení komplexity vzorků použili multidimenzionální frakcionaci a separaci, zahrnující imunoafinitní depleci, techniku CysTRAQ (kombinující obohacení cysteinových peptidů a iTRAQ kvantifikaci) a 2D LC separaci peptidů. Jednotlivé frakce byly analyzovány pomocí LC-MALDI. Ve fázi verifikační jsme pak využili techniku Selected Reaction Monitoring (SRM) pro cílenou detekci a kvantifikaci proteinů k potvrzení nalezených změn. Výsledky: Díky kombinaci frakcionačních a separačních kroků a iTRAQ kvantifikace se nám podařilo identifikovat 13.259 peptidů a pomocí těchto peptidů bylo nalezeno 1019 proteinů (5% FDR). Z této skupiny mělo 25 proteinů změněnou hladinu mezi oběma skupinami pacientek (p≤0.05). Ve verifikační fázi jsme technikou SRM ověřili 5 vybraných proteinů (lipocalin, antileukoproteináza, histon H4, myeloperoxidáza a dermcidin) v 50 vzorcích plodové vody. Podařilo se nám potvrdit výsledky z explorativní fáze, nicméně množství žádného z těchto 5 proteinů se mezi oběma skupinami pacientek statisticky významně (p≤0.05) nelišilo. Závěr: V této práci jsme získali data o změnách v plodové vodě, k nimž dochází na podkladě infekce a zánětu během spontánního předčasného porodu. Z relativně velkého množství proteinů identifikovaných v explorativní fázi se pouze 25 proteinů lišilo mezi oběma skupinami pacientek (p≤0.05). Tento nízký stupeň dysregulace byl potvrzeni i výsledky z verifikačního fáze.
4
O5 Cílená proteomická analýza potenciálních biomarkerů hypertrofické kardiomyopatie Helena Řehulková1, Alena Fučíková2, Lenka Zídková1, Juraj Lenčo2, Pavel Řehulka2, Radek Pudil1, Jiří Stulík2 1) I. interní kardioangiologická klinika, Lékařská fakulta UK v Hradci Králové, Šimkova 870, 500 38 Hradec Králové 2)Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové Hypertrofická kardiomyopatie je nejčastější autozomálně dominantní dědičné kardiovaskulární onemocnění s prevalencí 1:500. Dnes je známo více než 200 mutací na 10 genech kódujících zejména sarkomerické proteiny spojených s touto nemocí. Příznaky nemoci se vyznačují velkou různorodostí: zcela asymptomatický průběh, srdeční arytmie, dušnost, synkopa, cévní mozková příhoda i náhlá smrt.Náhlá srdeční příhoda v mládí je nejčastější příčinou úmrtí. Diagnostika onemocnění pomocí elektrokardiografie, echokardiografie nebo biopsie nemusí být průkazná a v případě genetického vyšetření je náročná jak finančně, tak časově. Cílem této práce je aplikace alternativního přístupu k diagnostice hypertrofické kardiomyopatie s využitím moderních proteomických nástrojů. Analýza je zaměřena na kvantifikaci proteinů v lidské plasmě, jejichž koncentrace by mohla být ovlivněna studovaným onemocněním. Mezi kandidátní proteiny budou zahrnuty jak proteiny mající již známý vztah k danému onemocnění, tak i proteiny, které vykázaly rozdílnou koncentraci ve srovnávací proteomické studii založené na relativní kvantifikaci pomocí činidla iTRAQ. Cílená proteomická analýza bude založena na depleci 14 nejvíce zastoupených proteinů pomocí afinitní kolony MARS, enzymatické digesci proteinů, kapalinové chromatografii vzniklé peptidické směsi s následnou hmotnostně-spektrometrickou analýzou typu SRM a finálním vyhodnocením získaných dat pro soubory kontrolní skupiny pacientů a skupiny pacientů trpících hypertrofickou kardiomyopatií. Příkladem potenciálního proteinového markeru tohoto onemocnění je fibronektin vykazující rozdílnou koncentraci ve skupině pacientů, která byla potvrzena jak cílenou kvantitativní SRM analýzou pomocí isotopicky značených peptidů, tak i pomocí ELISA testu. Práce byla podpořena grantem IGA MZČR NT/13721 a je spolufinancovaná Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky, registrační číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/30.0022.
5
O6 Aplikace SILAC metody pro relativní kvantifikaci proteomu primárních myších dendritických buněk diferencovaných z kostně-dřeňových progenitorů Ivo Fabrik1, Marek Link1, Pavel Řehulka1, Anetta Härtlová2, Adéla Strašková3, Jiří Stulík1 1)Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany, Třebešská 1575, Hradec Králové, 500 01, Česká republika 2) Department of Molecular Biology, Umeå University, SE-90185 Umeå, Švédsko 3) Centrum pokročilých studií, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany, Třebešská 1575, Hradec Králové, 500 01, Česká republika Dendritické buňky (DC) stojí na počátku procesu formování antigen-specifické odpovědi adaptivní imunity, určují její typ a ve výsledku ovlivňují chování imunitního systému na úrovni celého organismu. I přes velké pokroky ve fyziologii imunitního systému se však často nedaří experimentální výsledky logicky zakomponovat do naší představy o chování DC. Značným přínosem by v tomto směru bylo využití systémových přístupů („-omics“) poskytujících nezkreslenou komplexní informaci na úrovni buňky. Bohužel, tyto metody vyžadují větší množství vstupního materiálu, což vzhledem k heterogenitě populace DC in vivo představuje další úskalí. Ačkoli existují buněčné linie s charakteristikami DC, jejich použití je z hlediska biologické relevance sporné. DC získané diferenciací ex vivo izolovaných kostně-dřeňových progenitorů nabízejí přijatelnou alternativu těmto buněčným modelům. Optimalizovaný protokol poskytuje homogenní populaci CD11c+ buněk odpovídající zánětlivým DC in vivo.Tento model tedy představuje vhodný výchozí bod pro discoverydriven přístup k výzkumu DC a našim cílem bylo otestovat aplikovatelnost SILAC metody pro semikvantitativní analýzu celobuněčného proteomu těchto primárních buněk. Pro potřeby metabolického značení však bylo ještě dále nutné modifikovat výchozí protokol tvorby DC. Indukce diferenciace kostně-dřeňových progenitorů byla navozena in-house produkovaným GM-CSF. Kultivační postup byl upraven tak, aby nedocházelo ke spontánní aktivaci DC, ale zároveň bylo dosaženo efektivní inkorporace izotopicky značených aminokyselin Arg+10[13C6, 15N4] a Lys+6[13C6]do proteomu buňky. Pro posouzení účinnosti metabolického značení byly digesty celobuněčných lyzátů DC analyzovány shotgun proteomickým přístupem na LC-MS. Výsledky ukázaly na nedostatky v inkorporaci izotopických značek a intenzivní Arg+10→Pro+6 konverzi, která je častou komplikací u SILAC experimentů. MS signály izotopových klastrů peptidů navíc vykazovaly nepřirozené rozložení zastoupení a posun k vyšším hmotám. Příčinou tohoto jevu byl 15N dusík ze značeného Arg+10, který se pravděpodobně metabolicky začlenil do neesenciálních aminokyselin. Po úpravě složení kultivačního média byly zmíněné problémy převážně odstraněny a nově upravený protokol kultivace poskytuje primární DC s efektivitou inkorporace značených aminokyselin >90% pro většinu proteinů.
6
O7
Identifikace transmembránových proteinů na základě jejich transmembránových úseků Ondřej Vít1; Lucie Lorková1; Jana Pospíšilová1; Petr Man2; Alan Kádek2; Vojtěch Melenovský3; Jiří Petrák1,4 1) Ústav patologické fyziologie, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze; 2) Mikrobiologický ústav, Akademie věd České republiky v.v.i., Praha 3) Institut klinické a experimentální medicíny, Praha 4) Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha Transmembránové proteiny (TMP) představují pro proteomiku značný technický problém. Téměř třetina genů v eukaryotických buňkách kóduje právě TMP, jež se následně účastní zásadních procesů, jako je mezibuněčná signalizace, transport látek přes membránu, buněčná adheze, a mnoho dalších. Z tohoto důvodu je značná část léčiv je zaměřena na povrchové TMP. TMP jsou však v běžných proteomických analýzách zastoupeny jen minimálně, a to především vlivem jejich nízké hladiny exprese a jejich amfipatické povahy. Byly vyvinuty metody pro nabohacení TMP, přetrvávajícím problémem u nich však zůstává značná kontaminace nemembránovými proteiny. Pro překonání těchto obtíží byly vyvinuty postupy, zaměřené pouze na hydrofilní nebo pouze na hydrofobní domény TMP. Transmembránové alfa helixy chráněné fosfolipidickou dvouvrstvou mohou být izolovány pomocí kompletní proteolytické digesce nechráněných solubilních domén a dalších, nemembránových proteinů [1,2]. Tuto původní metodu jsme modifikovali a náš postup je založen na jednokrokovém nabohacení hrubé membránové frakce, následovaném otevřením membránových váčků při vysokém pH a digesci veškerých dostupných proteinů či proteinových domén trypsinem. „Oholené“ membrány jsou následně solubilizovány a transmembránové peptidy doštěpeny pomocí CNBr. Vzorek je delipidován a hydrofobní transmembránové peptidy jsou identifikovány pomocí LC-MS/MS. Tuto metodu jsme testovali na lidských lymfomových buňkách a srdeční tkáni z potkana. TMP tvoří téměř 80% všech identifikovaných proteinů a zahrnují TMP z plazmatické membrány, mitochondrií, ER, Golgiho aparátu a jiných membránových buněčných struktur. Většina proteinů byla identifikována na základě peptidů, které se překrývají s predikovanými transmembránovými segmenty. Tento postup, doplněný o kvantitativní rozměr, např. pomocí SILAC, může sloužit jako důležitá doplňující metoda k standardním metodám diferenciální proteomiky a může pomoci zkompletovat chybějící data o funkcích a struktuře membránových proteinů. Podporováno Grantovou agenturou Univerzity Karlovy: GAUK 253284 700712 a 251180 111210, Grantovou agenturou České republiky 305/09/1390, MŠMT ČR - SVV 264507/2012 and PRVOUK P24/LF1/3. Reference: 1. A.R. Blackler, A.E. Speers, M.S. Ladinsky, C.C. Wu. J. Proteome. Res., 7, 3028-34 (2008) 2. C.C. Wu, M.J. MacCoss, K.E. Howell, J.R. Yates 3rd. Nat. Biotechnol. 21(5), 532-8 (2003)
7
O8 Povrchové a sekretované proteiny neurálních progenitotových buněk J. Tyleckova1, K. Mairychova1, K. Jarkovska1, R. Hrabakova1, S. Marsala2, M. Marsala2, B. Wollscheid3, S.J. Gadher4, H. Kovarova1 1) Institute of Animal Physiology and Genetics AS CR, v.v.i., Libechov, Czech Republic 2) Anesthesiology Research Laboratory, UCSD San Diego, USA 3) Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich, Switzerland 4) Life Technologies, Frederick, MD 21704, USA Pluripotentní buňky se schopností diferencovat do různých buněčných typů představují slibný zdroj buněk pro léčbu mnoha chorob včetně míšního poškození a neurologických chorob. V současnosti je možné získat z pluripotentních buněk neurální progenitorové buňky, které v preklinických experimentech vykázaly positivní terapeutický efekt při transplantaci. Problémem ale zůstává získání homogenní populace samotných neurálních progenitorových buněk, které by byly zvlášť vhodné pro terapeutické využití. Aplikovali jsme technologii Cell Surface Capturing (CSC) v kombinaci s label-free kvantifikací k charakterizaci povrchových glykoproteinů neurálních progenitorů odvozených z lidských embryonálních buněk HUES-7 a sledování změn v průběhu neuronální diferenciace těchto progenitorů. Analýza identifikovala 680 povrchových N-glykoproteinů, které kromě CD anotovaných proteinů zahrnovaly non-CD proteiny, ze kterých jsme vybrali set neznamých nebo dosud nezkoušených povrchových proteinů, které by mohly hrát roli v neuronální diferenciaci. Dále jsme analyzovali sekretované proteiny, které představují unikátní zdroj informace o stavu buněk v daném stadiu, a nabízejí možnost sledování terapeutického efektu transplantovaných buněk u léčby různých chorob buněčnou terapií. Multiplexní xMAP Luminex technologií jsme analyzovali sekretom neurálních progenitorů v průběhu neuronální diferenciace. Výsledky ukázaly, že chemokiny CXCL a CCL tříd mohou mít význam při udžování neurální “niche”, diferenciaci primárních neurálních progenitorů a regulaci synapsí. Výsledky mohou přispět k posunu transplantačního výzkumu u míšního poškození a devastujících neurologických onemocnění člověka. Podpora: Ministerstvo školství, mládeže a sportu(ME 10044), Výzkumný záměr RVO:67985904.
8
O9 Technika SWATH v proteomice: kvantitativní digitální záznam všech peptidů v jednom nástřiku LC/MS/MS Tomáš Korba AB SCIEX, Praha
9
O10 Studium kovalentních modifikací lidské karbonyl reduktasy CBR1 pomocí hmotnostní spektrometrie Juraj Lenčo1, Vojtěch Tambor2, Tereza Hartmanová3 1) Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany 2) Centrum biomedicínského výzkumu, Fakultní nemocnice Hradec Králové 3) Katedra biochemických věd, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze Úvod: Lidská karbonyl reduktasa CBR1 se podílí na metabolismu řady endogenních látek a xenobiotik včetně důležitých léčiv. Jedním z popsaných endogenních substrátů je Snitrosoglutathion (GSNO). Při in-vitro inkubaci CBR1 s fyziologickými koncentracemi GSNO dochází ke snížení aktivity enzymu, kterou však lze obnovit inkubací s DTT. Jelikož se v aktivním místě enzymu vyskytují dva cysteiny, ztráta aktivity byla vysvětlována tvorbou glutathion disulfidu. Cíl: Cílem této studie bylo potvrdit tvorbu glutathion disulfidu a/nebo odhalit jiné/další možné reverzibilní modifikace CBR1, které by mohly být zodpovědné za ztrátu aktivity při inkubaci s GSNO. Metody: In-silico digest odhalil, že 4 z pěti cysteinů je možné zachytit v tryptických peptidech, které jsou vhodné pro následnou analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie. Pomocí MALDI-TOF/TOF hmotnostního spektrometru jsme nejprve porovnali MS spektra tryptických peptidů CBR1 před a po inkubaci s GSNO. V dalším fázi jsme modifikace CBR1 proteinu odhalené pomocí MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrometrie kvantifikovali na QqQ přístroji v SRM módu. Výsledky: Analýza na MALDI-TOF/TOF hmotnostním spektrometru poukázala na možný vznik disulfidického můstku mezi cysteiny 226 a 227, které se nacházejí v aktivním místě enzymu a to již při inkubaci s 2mM GSNO. Možná tvorba glutathion disulfidu byla na MALDI-TOF/TOF přístroji potvrzena až při extrémně vysoké koncentraci GSNO. Cílená SRM analýza nemodifikovaných a modifikovaných peptidů, které nesou cysteiny, potvrdila koncentračně závislou tvorbu jak disulfidického můstku mezi cysteiny v aktivním místě tak tvorbu glutathion disulfidu na všech pokrytých cysteinech proteinu. Závěr: Kromě předpokládané tvorby glutathion disulfidu jsme odhalili také tvorbu disulfidického můstku mezi sousedními cysteiny v aktivním místě CBR1 enzymu. Míra vzniku obou modifikací je úměrná použité koncentraci GSNO.
10
O11 Proteomická a biochemická analýza peľníc kukurice po predošetrení chladom a indukci androgenézy T. Takáč1, Ľ. Uváčková2, N. Boehm3 and J. Šamaj1 1) Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědelský výzkum, Oddělení buněčné biologie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, Šlechtitelů 11, CZ-783 71 Olomouc 2) Ústav genetiky a biotechnológií rastlín, Slovenská akadémia vied, Akademická 2, P. O. Box 39A, 950 07, Nitra, Slovensko 3) Experimental Ophthalmology, Department of Ophthalmology, University Medical Center Mainz, Langenbeckstr. 1, 55131 Mainz, Germany Vývin mikrospór a skorých peľových zŕn môže byť v stresových podmienkach preprogramovaný z peľového vývinu na embryogénny prostredníctvom androgenézy. Androgenéza má veľký význam ako modelový proces pre štúdium embryogenézy. Je významná aj pre šľachtenie, pretože z androgénnych embryí môžeme získať homozygotné dihaploidné rastliny. Cieľom tejto práce bolo analyzovať zmeny v abundancii proteínov počas predošetrenia chladom a následnej kultivácie peľníc kukurice na indukčnom médiu pomocou dvojdimenzionálnej elektroforézy v kombinácii s MS/MS hmotnostnou spektrometriou. Simultánne mikroskopické pozorovania ukázali, že prvé bunkové delenie nastalo v mikrospórach na tretí deň po indukcii androgenézy. Z tohoto dôvodu bol dôraz kladený na proteíny, ktorých zastúpenie vzrástlo práve v tomto čase. Zmeny v zastúpení vybraných antioxidačných enzýmov boli overené špecifickým farbením enzýmovej aktivity na natívnych PAGE géloch. Spomenutý proteomický prístup umožnil identifikáciu 19 proteínov, ktoré boli klasifikované do 8 skupín podľa ich funkcie. Najpočetnejšie boli proteíny metabolizmu, syntézy proteínov a bunkovej štruktúry. Významným výsledkom bolo aj zvýšenie zastúpenia askorbát peroxidázy, enzýmu odbúravajúceho peroxid vodíka. Izozýmová analýza potvrdila výsledok proteomickej analýzy, pričom sme zistili zvýšenie aktivity izozýmov peroxidáz počas androgénnej indukcie. Analýza izozýmového zloženia superoxiddizmutázy (SOD) ukázala zvýšenie aktivity mangánového izozýmu SOD MnSOD, ktorý poskytuje substrát (peroxid vodíka) pre peroxidázové reakcie, vrátane askorbát peroxidázy. Tieto výsledky poukazujú na úlohu antioxidačných enzýmov počas indukcie androgenézy kukurice. Táto práca bola finančne podporená grantom č.P501/11/1764 z GAČR a grantom č. ED0007/01/01 Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědelský výzkum, Univerzita Palackého, Olomouc.
11
O12 Hovězí trypsin není sám aneb další proteolytičtí gurmáni a jejich využití pro štěpení vzorku Marek Šebela, Pavel Řehulka, Vojtěch Franc, Michaela Pečová Katedra biochemie a Centrum Regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc Trypsin je díky svým vlastnostem specifické proteasy enzymem číslo jedna používaným pro štěpení vzorku v proteomické analýze. Jako komerční materiál je k dispozici trypsin z hovězího či vepřového pankreatu, stejně jako enzym modifikovaný. Modifikace trypsinu se provádí za účelem potlačení autolýzy a teplotní stabilizace enzymu, častá je například methylace aminoskupiny postranního řetězce lysinu. V naší laboratoři je dlouhodobě používán trypsin modifikovaný glykací, tedy navázáním sacharidových molekul na lysinové zbytky pomocí chemické reakce. Pro další zlepšení vlastností trypsinu jsme zkoušeli jeho imobilizaci na nanočástice v přirozené i modifikované formě nebo přečištění afinitní chromatografií pro odstranění autolytických fragmentů a nečistot. Byl rovněž chromatograficky izolován trypsin z baktérie Streptomyces griseus a jeho vlastnosti ve smyslu štěpení proteinů porovnány s hovězím trypsinem. Zabývali jsme se rovněž využitím prolylendoproteasy z Aspergillus niger a studovali její vlastnosti, zejména rozsah glykosylace. Na závěr bude zmíněn pseudotrypsin (ΨT), který vzniká autolytickým štěpením trypsinu. Přestože byl ΨT popsán před více než čtyřiceti lety, jeho proteolytické vlastnosti s proteinovými substráty nebyly tehdy analyzovány s výjimkou působení na přírodní peptid glukagon. ΨT jsme izolovali podle původního protokolu, testovali jeho použití pro štěpení proteinových vzorků a získali předběžné výsledky. Potvrdilo se, že ΨT působí na odlišná štěpná místa a poskytuje bohatší peptidové směsi.
12
O13 Výhody komplementarity ESI a MALDI technik v proteomice Michal Boháč Bruker, Brno
13
MIKROPREZENTACE FORMÁTU 333
3331 Myeloperoxidáza v plodové vodě jako marker zánětlivých komplikací u předčasného odtoku plodové vody Vajrychová M.1, Tambor V.2, Kacerovský M.2,3, Lenčo J.1 1) Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany, Hradec Králové 2) Centrum biomedicínského výzkumu, Fakultní nemocnice Hradec Králové 3) Porodnická a gynekologická klinika, Univerzita Karlova v Praze, Fakulta medicíny, Hradec Králové a Fakultní nemocnice Hradec Králové Téměř jedna třetina spontánních předčasných porodů je charakterizována předčasným odtokem plodové vody (PPROM). Ve více jak třetině případů je PPROM doprovázen mikrobiální invazí do děložní dutiny (MIAC), která vyvolává infiltraci neutrofilů a dalších imunitních buněk do plodových obalů, placenty a pupečníku.Dochází k rozvoji tzv.histologické chorioamnionitidy (HCA). Aktivacea degranulace neutrofilů vede ke zvyšování hladiny myeloperoxidázy (MPO) obsažené v neutrofilních granulech. Myeloperoxidáza tvoří jeden z nástrojů první obranné linie proti invadujícím mikroorganismům a zároveň je ukazatelem aktivity neutrofilů. MIAC a HCA jsou důležité faktory ovlivňující problematiku PPROM těhotenství. Porozumění celému procesu a nalezení vhodných ukazatelů je tedy nezbytné pro optimální klinický management těhotenství komplikovaných PPROM. Naše předchozí explorativní proteomické studie identifikovaly MPO jako jeden z nejvíce dysregulovaných proteinů v plodové vodě u PPROM těhotenství komplikovaných MIAC a HCA. Do této retrospektivní kohortní studie bylo zahrnuto 181 pacientek s jednočetným těhotenstvím v gestačním věku od 24+0 do 36+6. MIAC byla potvrzena u 61 pacientek (34%) a HCA u 115 (64 %) pacientek. Současná přítomnost MIAC a HCAbyla pozorována u 45 pacientek (25%).Koncentrace MPO v plodové vodě byla stanovena metodou ELISA pro lidskou myeloperoxidázu. U pacientek s MIAC byla nalezena vyšší hladina MPO v porovnání s pacientkami bez MIAC (medián 149.2 ng/mL vs. 54.6 ng/mL; p=0.0006). Stejný výsledek byl zjištěn u pacientek s HCA v porovnání s pacientkami bez HCA (medián 103.7 ng/mL vs. 50.0 ng/mL; p=0.0001). Výrazně vyšší hladina MPO byla nalezena u pacientek současně s MIAC a HCA v porovnání s pacientkami, u kterých byla jedna z těchto komplikací vyloučena (medián 456.0 ng/mL vs. 52.9 ng/mL; p<0.0001).Na základě ROC křivky byla jako nejlepší hraniční koncentrace MPO v plodové vodě stanovena hodnota 324.5 ng/ml pro identifikaci PPROM těhotenství komplikovaných MIAC a HCA.
14
3332 In vitro proteomické profilování buněčné linie CEM cisplatinou, karboplatinou, oxaliplatinou, daunorubicinem a vinkristinem. T. Oždian1, D. Holub1, P. Džubák1, G. Rylová1, M. Kollaredy1, J. Řehulka1, D. Cahová1, V. Havlíček2 a M. Hajdúch1 1) Laboratoř experimentální medicíny, Ústav molekulární a translační medicíny, Lékařská fakulta Univerzity Palackého a Fakultní nemocnice Olomouc, ČR. 2) Mikrobiologický ústav, Akademie věd České Republiky, v.v.i., Praha, ČR Platinová léčiva jsou již dlouhou dobu neodmyslitelnou součástí protinádorové léčby. Přes svou chemickou i biologickou podobnost se však liší ve spektru karcinomů, jež jsou těmito látkami léčeny, tak i toxicitou. Naším cílem bylo charakterizovat a porovnat proteomické profily těchto léčiv. Aby porovnání získalo vyšší výpovědní hodnotu, přidali jsme do porovnání vinkristin a daunorubicin jako chemicky a funkčně nepříbuznou kontrolu. Zvolili jsme si buněčnou linii CCRF-CEM odvozenou od akutní lymfoblastické leukemie, která se vyznačuje tím, že je dostatečně citlivá na širokou škálu běžně používaných cytostatik. Buněčnou linii jsme nechali růst na médiu s izotopicky značnými aminokyselinami a po 5 pasážích ji ošetřili léčivem o koncentraci 5xIC50 a nechali působit polovinu času do apoptózy. K takto ošetřeným buňkám jsme přidali stejný počet neznačených buněk jako kontrolu, zlyzovali je a výsledný lyzát jsme v prvním rozměru separovali pomocí SDS-PAGE elektroforézy. Jednotlivé elektroforetické frakce jsme podrobili štěpení trypsinem a analyzovali pomocí HPLC-MS. Pro získání co nejvyššího záchytu jsme použili dva hmotnostní spektrometry – jeden přístroj MALDI-TOF/TOF a jeden přístroj ESI-IT, jelikož se data z těchto přístrojů považují za komplementární. Získaná hmotnostní spektra byla vyhodnocena v databázovém systému Proteinscape a vyhledána algoritmy Mascot a Phenyx. Celkově jsme identifikovali 646 ± 133 proteinů metodou ESI a 312 ± 85 proteinů metodou MALDI na jeden experiment. Identifikované a kvantifikované proteiny jsme statisticky vyhodnotili metodami hierarchického clusterování, heatmapami a analýzou hlavní komponenty. Metodou hierarchického clusterování jsme zjistili dle očekávání blízkou příbuznost cis a karboplatiny, překvapením však byla odlehlost oxaliplatiny, která se svým proteomickým profile odchýlila od větve platinových léčiv a vytvořila vlastní větev. Analýzou hlavní komponenty byly určeny proteiny odpovědné a tento stav. Tento projekt byl podpořen interním grantem Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci (LF_2012_018); infrastrukturální část tohoto projektu (Ústav molekulární a translační medicíny) byl podpořen z Operačního programu Věda a výzkum pro inovace (projekt CZ.1.05/2.1.00/01.0030).
15
3333 Proteom piva po IEF prefrakcionaci Hana Konečná Centrální laboratoř – Proteomika, Středoevropský technologický institut CEITEC, Kamenice 5, 625 00 Brno 2D elektroforéza v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií byla použita ke studiu proteomu piva. Významného zvýšení počtu identifikovaných proteinů bylo dosaženo po IEF prefrakcionaci v roztoku (OFFGEL) a následné aplikaci jednotlivých frakcí na úzká pH rozmezí IPG stripů.
3334 Objasnění mechanismu rezistence na cytarabin u lymfomu z plášťové zóny L. Lorková1, J. Pospíšilová1, O. Vít1, M. Klánová1, B. C. Maswabi1, P. Klener1, J. Petrák 1,2 1) Ústav patologické fyziologie, 1. lékařská fakulta, Karlova univerzita v Praze 2) Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha Lymfom z plášťových buněk (mantle cell lymphoma MCL) je nevyléčitelá forma Bnehodgkinského lymfomu charakterizována deregulací cyklinu D1 jako výsledku chromozomální translokace t(11;14)(q13;q32). V současné době se k léčbě MCL často využívá nukleotidový analog cytarabin (Ara-C, cytosine arabinoside). Dlouhodobým působením Ara-C na buňky MCL však dochází ke vzniku rezistence na tento analog. K pochopení molekulárního mechanismu Ara-C rezistence v MCL na úrovni proteinů jsme studovali čtyři MCL buněčné linie a z nich odvozené Ara-C rezistentní subklony. Pomocí 2DE-MS jsme provedli proteomickou analýzu Ara-C rezistentních MCL subklonů. Nejzásadnějším zjištěním bylo snížení exprese deoxycytidin kinázy (dCK) v Ara-C rezistentních buňkách. Deoxycytidin kinasa hraje zásadní roli v aktivaci deoxynukleosidů v šetřící (salvage) dráze purinů a pyrimidinů a jejich analogů, katalyzuje vzik jejich monofosfátů. Zásadně sníženou expresi dCK jsme ověřili i v dalších čtyřech Ara-C rezistentních MCL subklonech. Kromě Ara-C rezistence vykazují námi odvozené a studované MCL subklony křížovou rezistenci na další purinové (fludarabin) i pyrimidinové analogy (gemcitabin) využívané v léčbě MCL. Vzhledem k tomu, že Ara-C, gemcitabin i fludarabin jsou aktivovány právě dCK, důvodně předpokládáme, že hlavní příčinou rezistence MCL buněk na Ara-C je snížená exprese dCK, která je rovněž zodpovědná také za křížovou rezistenci k ostatním zmíněným nukleotidovým analogům. Podpořeno Grantovou agenturou Univerzity Karlovy: GAUK 253284 700712 a 251180 111210, a MŠMT- PRVOUK P24/LF1/3.
16
3335 Marker NHERF1 a dysregulovaná dráha WNT jako terapeutický cíl při rezistentní CML Ondřej Toman1, Ondřej Vít2 , Daniel Vyoral1, Jiří Petrák1,2. 1) Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2) Ústav patologické fyziologie, 1. lékařská fakulta, Karlova univerzita v Praze Léčbu chronické myeloidní leukémie (CML) provází komplikace při vzniku rezistence na klinicky používané tyrosin kinásové inhibitory (TKI), např. imatinib. Zabýváme se hledáním zásahových míst s terapeutickým potenciálem u rezistentních buněčných linií CML. Linie CMLT1 rezistentní na imatinib byly izolovány dlouhodobým selekčním tlakem zvyšující se koncentrace imatinibu v kultivačním mediu. Srovnávací proteomickou analýzou senzitivních a rezistentních linií CMLT1 buněk (2DE, MALDI MS) bylo u rezistentní linie identifikováno 12 diferenciálně exprimovaných proteinů. Výrazné bylo 3,5 násobné zvýšení syntézy proteinu NHERF1 (sodium exchange regulatory factor 1). Tento protein obsahující PDZ doménu byl recentně popsán při regulaci kanonické dráhy wnt signalizace. Dráha wnt u CMLT1 rezistentních buněk se oproti senzitivním buňkám projevila zvýšenou aktivitou hlavního signalizačního proteinu Dvl3 s PDZ doménou a vypnutím efektorů nekanonické dráhy wnt (transkripční faktor NFAT). Linie CMLT1 rezistentní na imatinib byly v sérii buněčných esejí testovány na přítomnost zásahových míst s terapeutickým významem.Lék amilorid (inhibitor NHERF1) vykazoval srovnatelný inhibiční účinek proti senzitivním a rezistentním buňkám. Cyklosporin A naopak projevil selektivní inhibiční účinek proti rezistentním buňkám. Cyklosporin A zabraňuje defosforylaci NFAT fosfatázou calcineurinem v cytoplasmě a následné translokaci aktivní formy NFAT do jádra. Tato část wnt signalizace se tak jeví jako vhodné zásahové místo s terapeutickým významem u buněk CML rezistentních na imatinib. Protein NHERF1 s PDZ doménou jsme dále detekovali v buněčných jádrech, a to pouze rezistentní linie.V současné době se zabýváme ověřováním přímé souvislosti mezi NHREF1 a wnt signalizací. 3336 Vyhlídky proteomiky rostlin na Mendelově univerzitě v Brně Martin Černý a Břetislav Brzobohatý Mendelova univerzita v Brně, CEITEC MENDELU, Zemědělská 1, 613 00 Brno Proteomická analýza rostlin představuje řadu komplikací. Ať již se jedná o přítomnost buněčné stěny, produkci celé škály sekundárních metabolitů, či ne zcela zanedbatelný fakt, že rostlinná proteomika není tak atraktivní, jako výzkum s potenciálním přímým uplatněním v medicíně. Během posledních let se naší skupině podařilo úspěšně zavést řadu metod pro obohacování rostlinného proteomu, které nám umožnily sledovat reakce modelového organismu Arabidopsis thaliana a blíže pochopit signalizaci rostlinných hormonů cytokininů. Nalezli jsme propojení mezi vnímáním změn teploty a hladinou těchto hormonů a objevily některé mechanismy, kterými se rostlina snaží modulovat odpověď spojenou s výrazně změněnou koncentrací cytokininů v jejích pletivech. Podpořeno z OP VK 2.2. „Postdoktorandi v oborech biologických věd na MENDELU“ CZ.1.07/2.2.00/28.022.
17
