II. Az elektrofiziológiai gyakorlatokon használt berendezések, és jelfeldolgozás II.1. Ingerlők, ingerlés elektrostimulátorral Elektromos ingerlés legegyszerűbben galvánárammal valósítható meg. Áramforrásként (kapocsfeszültsége Uk) galvánelemek, akkumulátorok vagy szárazelemek alkalmazhatók. Ingerléskor az áram formája a derékszögű áramlökés (négyszöginger) (7.1. ábra). Az áram belépési helyét anódnak, kilépési helyét katódnak nevezzük. Ingereket az áramkör zárása (felszálló ág) és megszakítása (leszálló ág) szolgáltat.
1. ábra. Ingerlés galvánárammal Ingerlés indukált árammal. A berendezés (2. ábra) két, egymáshoz közelíthető tekercsből, a primer tekercsre kapcsolt állandó áramforrásból, valamint egy kapcsolóberendezésből áll. Mivel a rendszer elektromotoros ereje (indukált feszültség, 2. ábra, a) a szekunder tekercs menetszámával egyenesen arányos, ezért a primer (kisebb menetszámú) tekercsre kapcsolt telep kis feszültségű (Uk) és nagy intenzitású árama nagyobb feszültségű és kisebb intenzitású árammá transzformálható. Az indukált áram intenzitása a tekercsek közelítésével fokozható, ily módon az ingerlés szabályozható. Kapcsolóberendezések (egyszerű megszakítók, Wagner-kalapács, elektromágneses inga, stb.) közbeiktatásával az ingerlések frekvenciáját lehet változtatni. A módszer kvantitatív vizsgálatokra - az egyes paraméterek nehéz ellenőrizhetősége miatt - nem alkalmas.
2. ábra. Ingerlés indukált árammal Kondenzátor-kisülésekkel való ingerlés esetén a csúcsfeszültség, a kisülések alakja és ideje pontosan meghatározható és szabályozható. A berendezés elvi kapcsolási vázlata a 3. ábrán látható. A rendszer egy egyenáramú (a töltő áramkört működtető) telepből (Uk), egy kondenzátorból (C) valamint egy kétállású megszakító kulcsból (K) áll. A töltőfeszültséget egy közbeiktatott ellenállással (potenciométerrel, P) változtathatjuk, valamint egy voltmérővel (V) ellenőrizhetjük. Több, eltérő kapacitású kondenzátor beiktatásával, valamint a töltőáram feszültségének változtatásával tetszés szerinti paramétereket állíthatunk be. Nehézséget jelent az ingerlő áramforma (a) csúcsának ellenőrzése annak rövid időtartama miatt.
3. ábra. Ingerlés kondenzátor-kisülésekkel Derékszöghullámú (négyszöghullámú) ingerlőkészülékek (elektrostimulátor, négyszögingerlő) használatakor a galvánáramos ingerléshez hasonló impulzusok állíthatók elő, azonban azok jellemző paraméterei (amplitúdó, frekvencia, jelszélesség) egymástól függetlenül is szabályozhatók. Így ezekkel a berendezésekkel a vizsgálatok széles skálája valósítható meg. A gyakorlatokon használatos elektrostimulátor (Supertech, Biostim) egy univerzális elektromos ingerlő, mellyel a gyakori és alapvető elektrofiziológiai mérések mind elvégezhetők. A feszültséggenerátoros konstrukció biztositja a mérés zavarmentességét az ingerlő felől, valamint az érintésvédelmi biztonságot. Az ingerlőnek mind analóg, mind digitalis kezelőpanellel rendelkező változata használatos. A továbbiakban az analóg kezelőpanel ismertetésével mutatjuk be egy isolator (ingerlő) működését. Az ingerlőkészülék kimenetén a következő típusú vizsgáló jelek állíthatók elő: 1. egyenfeszültség; 2. egyes (beállítható ideig tartó) impulzusok; 3. sorozatos (beállítható ismétlődési frekvenciájú és szélességű) impulzusok. A készülék működése a 4. ábrán látható egyszerűsített blokkvázlat alapján követhető. A készülék bekapcsolt állapotában az indító áramkör a start gomb megnyomásakor egy indítójelet állít elő, mely DC-IMP és E-S kapcsolók állásától függően az impulzusgenerátorhoz, illetve a végfokozathoz jut el. Ha DC-IMP kapcsoló DC állásban áll, akkor K1 állása tetszőleges és a kimeneten a start gomb megnyomásának ideje alatt egyenfeszültség jön létre. (az 1. típusú vizsgálójel előállítása). Az impulzusgenerátor egy beállítható időtartamú vezérlőjelet képes előállítani a végfokozat részére, ha a bemenetén egy indítójelet kapott. Az impulzusgenerátor indítójele két forrásból származhat, melyeket E-S kapcsolóval választhatunk ki.
E
P1
K1
S
IMP start
DC
Be
P2
K2
P3
K3
Ki
4. ábra. A gyakorlatokon használt, analóg kezelőpaneles biológiai ingerlő készülék előlapja Egyes (E) állásnál a start gomb indítja az impulzusgenerátort. Sorozat (S) helyzetben az alaposzcillátor beállítható ismétlődési frekvenciájú kimenő indító jelei vezérlik periodikusan az impulzusgenerátort (2. vagy 3. típusú vizsgálójel). A készülék fenti fő részegységei két beállító szervvel, egy-egy kapcsolóval (K1, K2 és K3), és egy-egy potenciométerrel (P1 és P2 és P3) rendelkeznek. A kapcsolók az adott paraméter értéktartományát egy dekáddal tolják el, míg a potenciométerek hitelesített skálájával az adott tartományon belüli pontos érték állítható be. A kapcsolók különböző állásaiban feltüntetett szorzót a potenciométer skáláján leolvasható értékhez hozzá kell rendelni. Ezek alapján a kapcsoló-párosokkal beállíthatók: 1. az alaposzcillátor frekvenciája (a kimenő impulzussorozat frekvenciája), 2. a generátor impulzusszélessége és 3. a kimenő feszültség. Az ingerlési paraméterek beállításakor a következő logikai sorrendet célszerű követni. A kimenő feszültséget mindenkor be kell állítani megfelelő értékűre. Ki kell választani az alapvető ingerlési módot. Egyenfeszültségű (DC) ingerléskor a többi kezelőszerv állása tetszőleges, csak a start nyomógombot kell használni (folyamatosan nyomni az ingerlés idején). Impulzusüzemű ingerlés választása esetén mindig be kell állítani az impulzusok időtartamát is. Impulzusüzem esetében a 2. és 3. módok közt is választani kell. Egyes állásban a frekvenciát meghatározó kezelőszervek állása tetszőleges, csupán a start nyomógomb szolgál az ingerlés indítására. Sorozatingerléskor (sorozat) az ismétlődési frekvenciát is be kell állítani. II.2. A biológiai erősítőrendszer felépítése Az izmokról, a perifériás idegekről, valamint a központi idegrendszerből a megfelelő körülmények között elvezetett bioelektromos jeleket erősíteni és szűrni kell feldolgozás előtt. Ezt a feladatot a gyakorlatban összetett erősítőrendszer látja el. Az elvezető elektródákról az elektromos jelek a tízszeres feszültségerősítésű előerősítőbe jutnak, ami zavarvédelmi okból tápfeszültségeit a főerősítőből kapja. Az előerősítő egység beépített kapacitás kompenzáló áramkörrel, elektróda impedancia mérővel és offsetfeszültség beállító áramkörrel rendelkezik. A főerősítő (Supertech, Bioamp) elektrofiziológiai vizsgálatokhoz kifejlesztett célberendezés. Az erősítő kalibrációs (cal) állásba vagy az előerősítőből (preamp) jeleket fogadó üzemmódba kapcsolva működtethető. Az előerősítőből érkező jel (preamp állás) a főerősítőben további erősítés (gain) után (V nagyságrend) a fokozatokban változtatható törésponti frekvenciájú felüláteresztő (high pass, DC-300 Hz), illetve aluláteresztő (low pass 200 Hz-10 kHz) szűrőkre, valamint a hálózati frekvenciára (50 Hz) hangolt lyukszűrőre (notch filter) kerül. Így kiválasztható a feldolgozás szempontjából értékes frekvenciatartomány, és biztosítható a zavarjelek elnyomása. Az erősített és megfelelően szűrt jel az erősítő analóg kimenetén jelenik meg tetszőleges előjelű (invert/noninvert állások) analóg jelként. Regisztráláskor az adatelemzés valós időben (direct állás) történik, de a szalagos (visszajátszása replay állásban) vagy számítógépes (analóg/digitális konverter interface-en keresztül) archiválás biztosítja az újabb szempontok szerinti későbbi feldolgozás lehetőségét.
Az 5. ábra egy, az élettani gyakorlatok során használatos biológiai erősítő készülék előlapját mutatja. Az erősítő nemcsak analóg, hanem impulzus-kimenettel is rendelkezik. A készülék impulzus kimenetén az analóg jelek (akciós potenciálok) csúcsaiból képzett uniformizált impulzus-sorozat jelenik meg. A csúcsdetektor (spike-detektor) állítja elő az analóg jelek csúcsaiból az azokat szimbolizáló impulzusokat, melyeket a TTL jelszintű kimeneten, a digitális leválasztón és I/O interface egységen keresztül jutnak a számítógépbe. A spikedetektor manuális (fokozatmentes beállítása a level potenciométerrel) és automatikus (auto) módban is üzemelhet. preamp
direct
cal notch
replay noninv gain
off
low pass
high pass
Hz
kHz
invert
spike detector auto
1 0
level
5. ábra A gyakorlatokon használatos biológiai erősítő készülék előlapja II.3. Az oszcilloszkóp A katódsugár-oszcilloszkópok az időben változó elektromos jelalakok megjelenítésére alkalmas berendezések. A vizsgálandó jel az erősítőn át a katódsugárcső függőleges lemezpárján polaritásának és nagyságának megfelelően eltérítést okoz. Majd a jelet egy fűrészrezgéskeltő generátor által előállított, és a katódsugárcső vízszintes kitérítő lemezpárjára bocsájtott fűrészfeszültség az időtengelyre leképezi. Az így kapott potenciál-idő diagram egy ernyőn jelenik meg. Ahhoz, hogy állóképet kapjunk, célszerű a potenciálgörbék vízszintes eltérítését az azokat kiváltó ingerlő impulzussal kívülről (external trigger üzemmód) indítani, tehát a fűrészgenerátort a vizsgált jelnek megfelelően szinkronizálni. Az oszcilloszkóp képernyője utánvilágításra és egy adott állapot fixálására is képes (storage üzemmód). Az így rögzített jelek a beépített interface egységre kapcsolható dotmatrix printerrel kinyomtathatók. Az előzőekben ismertetett erősítő analóg és impulzus kimenetének egyidejű megfigyelésére egy kétcsatornás oszcilloszkóp szolgál (Hameg, HM 205). Az egyik csatornán folyamatosan látható az erősítő kimenő jele, ami biztosítja, hogy az erősítő rendszer beállítható paramétereit (pl. az ideg- vagy izomsejtekről elvezetett akciós potenciáloknak megfelelően, 7.6. ábra) optimalizálni lehessen. A másik csatornán a potenciál csúcsokkal szinkronban megjeleníthetők az azokból képzett impulzusok, ami lehetővé teszi a spikedetektor pontos beállítását, illetve automatikus üzemmódban az ellenőrzést. Az oszcilloszkóp belső triggeráramkörét ilyenkor az analóg jelet fogadó csatornára célszerű állítani, így folyamatos képet adva működhet a vízszintes eltérítés.
6. ábra. Biolelektromos jel megjelenítése kétcsatornás oszciloszkóppal. Az ábrán egy idegsejt akciós potenciálja (CH1), valamint a csúcsdetektor által képzett TTL szinkronjel (CH2) figyelhető meg. Időkalibráció: A= 2 ms. II.4. Regisztrálás, regisztráló berendezések A fiziológiai folyamatok során létrejött mechanikai vagy elektromos változások közvetlen megfigyelése érzékszerveinkkel nem minden esetben lehetséges. A változások (izomkontrakció, ideg és izom elektromos potenciálváltozásai) maradandó rögzítése azonban a kísérletek értékelhetőségének feltétele. E célra számos eljárás ismeretes. A legegyszerűbben kivitelezhető eljárás a kimográffal történő grafikus regisztrálás. Kimográfot ma már nem használunk, itt csak történeti jelentősége miatt említjük meg. A szerkezet egy változtatható sebességgel forgatható hengerből (dob) áll, amit síma felszínű, kormozott papírréteg borít (7. ábra). A kormozást benzollal szennyezett vezetékes gáz (erősen kormozó) lángjában végezzük. A kimográf forgó hengeréhez érintett írókar hegye a papírrétegről a kormot ledörzsöli, így a mechanikai változás láthatóvá válik. Az írókar egy kétkarú emelő, ami a mozgásokat nagyítva regisztrálja. Az írókar nagyítása annak hossza (az íróhegytől a forgási tengelyig mért távolság; L) és a hatóerő karja (az erő hatásától a forgástengelyig mért távolság; l) ismeretében a kettő hányadosaként (L/l) adható meg. A kormozott felületre írt görbék a kísérlet végeztével fixálhatók (színtelen lakkok; Akrilan, hajlakkok, Plastubol Spray, stb), majd száradás után a kívánt részek kivághatók. A henger sugarának és az egy körülfordulás idejének ismeretében a forgás sebessége is meghatározható.
7. ábra. Izom mechanikai munkavégzésének (kontrakciós görbék) regisztrálása kimográffal A biológiában megfigyelhető mechanikai változások (erő, nyomás, stb.) számítógépes jelfeldolgozása is megvalósítható. A mechanikai változásokat (erő- és nyomásváltozások) azonban előbb elektromos jelekké kell alakítani erő-feszültség illetve nyomás-feszültség transzducerek segítségével. Az élettani gyakorlatokon általánosan használatos erő-feszültség transzducerek differenciál kapacitások (kapacitív "híd-kapcsolások") elvén működő berendezések. Két, sorba kapcsolt kondenzátor közös fegyverzetéhez (a berendezés érzékelő nyelve) rögzítve a vizsgálandó objektumot (pl. béka-szív, izom, stb.), az általa keltett erőhatások (max. ±200 N, 10-3 N pontosságal), a két kapacitást egymáshoz képest megváltoztatva elektromos feszültségkülönbséget hoznak létre. A keletkezett feszültségkülönbség ezután erősítő és egyenirányító áramkörökön keresztül a készülék kimenetén analóg jelként jelenik meg. A transzducerek vezérlő egységén (8. ábra) a jel erősítésének szabályozására (gain), valamint a kimenő jel relatív zéró szintjének (előfeszítés esetén) beállítására (set zero) potenciométerek szolgálnak. A berendezés kimenő jelének a relativ nulla szintje az AC-DC kapcsoló AC állásában a kimeneten is 0 V-ként jelenik meg. DC állásban azonban az előfeszítés mértéke (max. ±1000 N) a számítógépes feldolgozás számára elérhetővé válik. A készüléket emelett egy 10-3 N pontosságú LCD kijelző panellel (force in cN) is ellátták, ami azonban a gyors változások esetén csak tájékozódó megfigyelésekre és az előbeállítások ellenőrzésére alkalmas. A transzducerből kilépő analóg jelet a számítógépben található analóg/digitális konverziós interface egység fogadja, és nagyfrekvenciás mintavételezéssel digitális jelé alakítja. A jelfeldolgozás szoftverek segítségével történik. Jó példa transzducer segítségével történt jelátalakításra A xxxx. ábrán egy izolált izompreparátum mechanikai kontrakciós görbéi figyelhetők meg erő-feszültség transzdukció, majd számítógépes feldolgozás után.
8. ábra . A gyakorlatokon használatos erő-feszültség transzducer készülék vezérlő egységének előlapja
II. 5. Digitalizált adatok számítógépes feldolgozása. A Biosoft gyakorlatos program használatának alapelvei •
Indítsuk el a „BioSoft.exe” nevű fájlt!
(A felugró nagy ablak bal felső sarkában van egy fekete nyíl, ami a program futását jelzi, ha ez fehérre vált, akkor a program leállt, ekkor a nyíl megnyomásával a program újraindítható.) •
A felugró kicsi ablakban ki kell választanunk, hogy milyen mérést szeretnénk végezni.
(Ha rossz számot adunk meg, a program mindaddig újrakérdezi, míg nem adunk meg helyes választ.) •
A következő lépésként meg kell mondanunk, hogy új mérést fogunk indítani, vagy egy régit szeretnénk egy fájlból betölteni.
(Az alábbiakban a leírás az „új mérés indítása” alpontban folytatódik) •
A mérési adatok nevének megadása
(Nem kell feltétlenül kiterjesztést megadnunk, de hasznos a „txt”-t beírni. Lényegében egy szöveges ASCII állományt hoz létre, mely később bármikor, akár más szoftverekkel is megnyitható (pl.:Excel, Origin, stb.). A program mindaddig újrakérdezi az adatokat, míg azok nem helyesek.) • A mérési paraméterek beállítása - „Mintavételi frekvencia ...” a mintavételezés frekvenciája - „Grafikon mérete” hány másodpercet lehessen egyszerre látni a grafikonon - „STOP” ezzel a gombbal bármikor megszakíthatjuk a futást, valamint a fehérre változó nyíllal újra elindíthatjuk
- „Egy jel hossza” (kizárólag csak a vezetési sebességnél alkalmazható). Az ingerléstől számított időtartamot jelenti. •
A „Mérés indítása” gombra kattintva elkezdhetjük az adatok gyűjtését.
• A „Kurzor hozzáadása” gomb (Ennek segítségével megjelölhetjük az adott időpontot, ami a későbbi grafikonon látható) • Frissítési mód” funkció, (Beállíthatjuk, hogy milyen stílussal ábrázolja az adatokat.) • „Mérés leállítása” megnyomásával befejezhetjük a folyamatot. (Kis idő múlva megjelenik az összes mért adatunk egy grafikonon.) • „Grafikon kiválasztása” menüpont: (kijelölhetjük, hogy mely grafikonokat szeretnénk menteni, vagy esetleg az összes adatainkat, egy HTML oldalra) „Mentés módja” ( itt kiválaszthatjuk, hogy a nyomtatóra vagy pedig fájlba szeretnénk menteni) -Képformátum” amennyiben képet választottunk eldönthetjük,hogy „bmp”, vagy „jpg” formában szeretnénk megtenni. - „Mentés” gombra kattintva elindíthatjuk az archiválást STOP” gombbal megállíthatjuk a programot. (Ha szeretnénk újabb műveletet végezni, akkor a fehér nyíl segítségével újraindíthatjuk a folyamatot, vagy a jobb felső sarokban található X-el bezárhatjuk az ablakot.) Grafikonok extra funkciói
• Menü előhívása • A grafikon területén (fontos, hogy ne a skála fölött legyen a kurzor, mert akkor másik menüt kapunk) jobb oldali egérgombbal kattintunk. Ennek hatására a fenti képen látható fehér menüt kapjuk.
- „Export Simplified Image...” ezzel egy egyszerű fekete-fehér képet készíthetünk a grafikonról. - „AutoScale ...” itt ki- vagy bekapcsolhatjuk az adott skála automatikus átméretezését - „Visible Items” a grafikonhoz tartozó panelek láthatóságát állíthatjuk át PANELEK PLOT LEGEND
Az adatok ábrázolását állíthatjuk be vele, pl.: pontokkal v. vonallal jelenítse meg az adatokat, vonal-színe, -stílusa, -szélessége, skálák tulajdonsága … SCALE LEGEND
A skálák testreszabásában van segítségünkre. Az első mezőben megadhatjuk a neveket; a lakat (zárt állapotban) a skála méretét úgy módosítja, hogy az összes adat beleférjen a képernyőbe. Ha azt szeretnénk, hogy az y tengely fix legyen, akkor nyissuk ki a hozzátartozó lakatot, és a grafikonon a skála legalsó és legfelső beosztását írjuk át a kívánt értékre. GRAPH PALETTE
A három gombbal kiválaszthatjuk, hogy az egér segítségével mit csináljunk: a kereszttel a kurzorokat állíthatjuk be, a nagyítóval a zoom funkciókat érhetjük el, a kézzel pedig a grafikon egész területét mozgathatjuk. A zoom funkciók részletesen: - az első ikon kiválasztásával egy általunk kijelölt téglalap alakú területet nagyíthatunk ki - a másodikkal az x-tengely mentén nagyíthatunk ki egy szakaszt - a következővel ugyan ezt az y-tengely mentén - a bal alsóra kattintva az egész adatterületet megmutatja a grafikon - a következő a zoom in - majd a zoom out funkciók CURSOR LEGEND
A letett kurzorokat konfigurálhatjuk, vagy ha elkezdünk beleírni egy még szürke mezőbe, ezzel újat adhatunk hozzá, ha pedig törölni szeretnénk egy elemet, akkor arra a jobb egérgombbal kattintva a „Delete Element” menüpontot választva tehetjük meg. A panelen az első mező a címet, a második az x koordinátát, az utolsó pedig az y-t tartalmazza. A többi ikon segítségével pedig egyéb funkciók is elérhetők pl.: mozgathatóság, vonal-stílusa, -színe, -vastagsága, a pont igazításának stílusa X Scrollbar
A grafikonon látható adatterületet csúsztathatjuk el az x tengely mentén (Figyeljünk rá, hogy amennyiben több grafikon is van a képernyőn, akkor ez a funkció csak az alsón használható, ugyanis a többi automatikusan ehhez igazodik.)
