IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM KROM(VI) REDUKTASE
NINA HERMAYANI SADI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM KROM(VI) REDUKTASE adalah karya saya sendiri dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Agustus 2009 Nina Hermayani Sadi NIM. G851070031
ABSTRACT NINA HERMAYANI SADI. Identification of Cr(VI)-Resistant Bacteria and the Study of Its Cr(VI)-Reductase Activity. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI and YOPI. Cr(VI) (chromate) is a toxic, soluble environmental contaminant. A Gram-negative, Cr(VI)-resistant bacterium, has been isolated from effluent of electroplating wastewater treatment reactor. This strain had maximum identity value as high as 96% to Ralstonia pickettii and Ralstonia sp. M2S3. This value indicated that the strain was a species of Ralstonia genera. Because of this reason, the strain was designated as Ralstonia sp. Cr6NS. Ralstonia sp. Cr6NS was able to grow aerobically in 250 ppm Cr(VI) and had Cr(VI) reducing-capacity as high as 4,11 x 10-8µg Cr(VI)/hour/cell. From the study of enzymatic activity, Ralstonia sp. Cr6NS showed the activity of Cr(VI)reductase both in periplasmic and sitoplasmic content. The highest activity was found in periplasmic matrix. However, the strain seemed not secreting this enzyme to the external medium. Keywords: Cr(VI) resistant bacterial, 16S rRNA, Cr(VI)-reductase enzyme , periplasm, sitoplasm
RINGKASAN Nina Hermayani Sadi. Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) dan Pengujian Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan YOPI. Krom(VI) adalah ion logam berat toksik karena sifatnya sebagai oksidator kuat dan bersifat mutagenik. Masuknya Cr(VI) ke lingkungan akan menimbulkan polusi bagi lingkungan tersebut. Industri logam dan pelapisan logam merupakan industri yang menghasilkan limbah yang mengandung Cr(VI) dalam kisaran 0,1100 mg/L. Salah satu alternatif sistem pengolahan limbah Cr(VI) adalah pengolahan secara biologis dengan menggunakan bakteri sebagai agen bioremediasi. Cr(VI) yang toksik direduksi secara enzimatis menjadi Cr(III) yang kurang toksik dalam sistem ini. Oleh sebab itu, bakteri yang dapat digunakan sebagai agen bioremediasi Cr(VI) adalah bakteri tahan Cr(VI) yang memiliki aktivitas enzim Cr(VI) reduktase. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri tahan Cr(VI) dari reaktor pengolahan limbah pelapisan logam yang terdapat di Laboratorium Pengendalian Pencemaran Puslit Limnologi LIPI, menyeleksi dan mengidentifikasi isolat unggul, serta menguji aktivitas enzim Cr(VI) reduktase dari ekstrak kasar enzim ekstraseluler, enzim periplasma, dan enzim sitoplasma. Isolat unggul dipilih berdasarkan nilai daya penyisihan Cr(VI) tertinggi. Identifikasi isolat unggul dilakukan melalui pengamatan morfologi bakteri dan analisis 16 rRNA. Sebagai substrat pada uji aktivitas enzim digunakan larutan K2CrO4 dengan konsentrasi akhir 0,2 mM. Diamati juga pengaruh NADH sebagai donor elektron terhadap aktivitas enzim Cr(VI) reduktase. Hasil penelitian mendapatkan bahwa 95 isolat bakteri tahan Cr(VI) berhasil diisolasi dari efluen reaktor pengolahan limbah pelapisan logam. Dari ke95 isolat tersebut ternyata isolat nomor 15 memiliki nilai daya penyisihan Cr(VI) tertinggi dibanding isolat uji lainnya, yaitu 4,11 x 10-8 µg Cr(VI)/jam/sel bakteri. Oleh sebab itu isolat nomor 15 dijadikan isolat unggul dan digunakan dalam uji selanjutnya. Isolat no.15 memiliki bentuk sel batang dan merupakan bakteri Gram negatif. Bakteri ini merupakan anggota dari genus Ralstonia karena memiliki kemiripan sebesar 96% dengan dua bakteri dari genus Ralstonia, yaitu Ralstonia pickettii 12D dan Ralstonia sp. M2S3. Berdasarkan hal ini, isolat nomor 15 selanjutnya diberi nama Ralstonia sp. Cr6NS. Hasil uji aktivitas enzim menunjukkan bahwa enzim Cr(VI) reduktase terdapat di daerah periplasma dan sitoplasma bakteri. Aktivitas spesifik enzim terbesar ditemukan di daerah periplasma dengan nilai aktivitas spesifik 27,30 unit/mg protein. Penambahan NADH dalam uji aktivitas enzim meningkatkan aktivitas enzim sebesar 17,88% pada enzim periplasma dan 306,21% pada enzim sitoplasma. Walau di daerah periplasma terdapat enzim pereduksi Cr(VI), enzim ini tidak disekeresikan ke luar sel karena dalam medium kutur tidak ditemukan adanya reduksi Cr(VI) dalam uji aktivitas enzim. Kata kunci: Bakteri tahan Cr(VI), 16S rRNA, enzim Cr(VI) reduktase, periplasma, sitoplasma
© Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
IDENTIFIKASI ISOLAT BAKTERI TAHAN KROM(VI) DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM KROM(VI) REDUKTASE
NINA HERMAYANI SADI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
Judul Tesis Nama NIM
: Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) dan Pengujian Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase : Nina Hermayani Sadi : G851070031
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Laksmi Ambarsari, M.S. Ketua
Dr. Yopi Anggota
Diketahui Ketua Program Studi Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.Si.
Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.
Tanggal Ujian: 21 Agustus 2009
Tanggal Lulus:
PRAKATA Alhamdulillahirabbil’alamin, segenap puja dan puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya yang telah dilimpahkan kepada penulis sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Tesis ini mengambil tema mengenai identifikasi bakteri tahan krom(VI) dan pengujian aktivitas enzim pereduksi krom (VI) yang diisolasi dari isolat bakteri tersebut. Penyusunan tesis bukanlah pekerjaan yang mudah. Tanpa adanya dukungan dari berbagai pihak tentu sukar bagi penulis untuk menyelesaikan tugas ini. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih dengan tulus dan penghargaan setinggi-tingginya kepada: Ibu Dr. Laksmi Ambarsari, M.S., dan Bapak Dr. Yopi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan masukan dan pengetahuan baru kepada penulis; Ibu Dr. Ir. Gadis Sri Haryani selaku Kepala Puslit Limnologi LIPI dan Bapak Dr. Tri Widiyanto, M.Si., selaku Kepala Bidang Poduktivitas Perairan Darat Puslit Limnologi LIPI yang telah memberikan dukungan dan fasilitas untuk terlaksananya penelitian ini; Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. atas koreksi dan masukannya bagi perbaikan tesis ini; Tanoto Foundation, yang memberi kepercayaan melalui pemberian beasiswa kepada penulis; Bapak Ahmad Thontowi, S.Si, M.Si., yang telah membimbing penulis selama melakukan analisis 16S rRNA di Laboratorium Bioremediasi Puslit Bioteknologi LIPI, Cibinong; Ibu Sekar Larasati, S.Si., M.Si., Ibu Dra. Djamhuriyah S. Said, M.Si., Ibu Evy Susanti, S.Si., M.Si., Bapak Drs. Tjandra C., M.Sc., Adisty Juniar dan rekan-rekan di Laboratorium Mikrobiota Puslit Limnologi LIPI, Cibinong; suami tercinta Ir. Gunawan Pratama Yoga, M.Sc., ayahanda, ibunda, anak-anakku tersayang Mbak Ajeng dan Pipiet, dan seluruh keluarga untuk kasih sayang, doa, dan dukungannya selama penulis menjalankan studi. Penulis menyadari bahwa karya ini masih memiliki banyak kekurangan dalam berbagai sisi. Karena itu, saran dan kritik bagi penulis akan sangat berharga untuk perbaikan-perbaikan di masa yang akan datang. Semoga sekelumit pengetahuan yang penulis tuangkan dalam karya ini dapat bermanfaat.
Bogor, Agustus 2009
Penulis
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 1 April 1974 dari ayah Let.Kol.Pol.(Purn.) Emon Sadi dan ibu Nunung R. Pada tanggal 10 Agustus 1997 penulis menikah dengan Ir. Gunawan Pratama Yoga, M.Sc., dan saat ini telah dikaruniai dua orang putri yaitu Ajeng Meiwita Nurrizky dan Vitaya Nur Khaleeda. Setelah lulus dari Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor pada tahun 1993, penulis bekerja di Puslit Limnologi LIPI sebagai analis kimia air. Perkenalan dengan dunia bakteri dimulai pada tahun 2002 ketika penulis ditugaskan di Laboratorium Mikrobiota pada puslit yang sama. Pada awalnya penulis banyak ‘bersentuhan’ dengan bakteri fotosintetik anoksigenik dan metabolisme sulfidanya dalam penerapannya sebagai agen bioremediasi perairan. Pada tahun 2000 penulis mendapat kesempatan melanjutkan pendidikan sarjana pada Program Studi Kimia FMIPA Universitas Pakuan, Bogor. Dengan mengambil tema skripsi mengenai karakteristik penyerapan beberapa logam berat pada bakteri fotosintetik anoksigenik (BFA), penulis lulus dan memperoleh gelar Sarjana Sains pada tahun 2005. Atas dukungan dari Dr. Tri Widiyanto, M.Si., sebagai Kepala Bidang Produktivitas Perairan Darat Puslit Limnologi LIPI, tahun 2007 penulis melanjutkan pendidikan pascasarjana S2 pada Program Studi Biokimia, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Selama mengikuti perkuliahan di Program Studi Biokimia, penulis sangat tertarik pada bidang enzimologi. Artikel mengenai pemanfaatan enzim dalam pengolahan limbah pestisida yang dibuat penulis dan dimuat pada majalah Warta Limnologi tahun 2008, telah di ulas oleh harian Koran Jakarta pada bulan Oktober 2008. Saat menjalani studi pascasarjana, pada tahun 2008 penulis mendapat kepercayaan dari Tanoto Foundation berupa pemberian beasiswa kepada penulis. Pada tahun yang sama penulis menjadi anggota dari Perhimpunan Biokimia dan Biologi Molekuler.
DAFTAR ISI Halaman Daftar Tabel
i
Daftar Gambar
ii
Daftar Lampiran
iii
PENDAHULUAN.......................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Tahan Krom ......................................................................... Reduksi Krom (VI) secara Enzimatis pada Beberapa Bakteri ......... 16S RNA Ribosoma (rRNA) .....……………………….................. Reaktor Pengolah Limbah Pelapisan Krom .....................................
6 8 11 13
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ Alat dan Bahan ................................................................................ Metode Penelitian ............................................................................
17 17 18
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) ....................................................... Hasil Identifikasi Isolat Unggul Tahan Cr(VI) ............................... Aktivitas Enzim Cr(VI) Reduktase .................................................
25 28 31
SIMPULAN DAN SARAN ......................................................................
36
DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................
37
LAMPIRAN ..............................................................................................
42
DAFTAR TABEL Halaman 1. Nilai Km dan Vmax dari enzim pereduksi Cr(VI) yang diisolasi dari beberapa jenis bakteri 2. Hasil pengujian aktivitas enzim Cr(VI) reduktase pada ekstrak kasar enzim dari isolat Ralstonia sp. Cr6NS
11 33
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Kerangka pemikiran penelitian .......................................................... 2. Pohon filogenetik rDNA .................................................................... 3. Disain reaktor kolom dan instalasi reaktor kolom pengolahan limbah cair pelapisn logam dan limbah dari kegiatan analisis Laboratorium Hidrokimia Puslit Limnologi LIPI .............................. 4. Ukuran Fe(0) yang digunakan dalam reaktor kolom.......................... 5. Pertumbuhan koloni di tepi kertas saring pada uji resistensi terhadap Cr(VI) 250 mg/L ................................................................. 6. Bentuk koloni ke enam isolat bakteri tahan Cr(VI) ........................... 7. Bentuk kurva pertumbuhan ke enam isolat bakteri tahan Cr(VI) ...... 8. Nilai daya penyisihan isolat bakteri tahan Cr(VI) .............................. 9. Hasil elektroforesis amplikon ............................................................. 10. Hasil pensejajaran urutan basa dari primer 9F pada program BLASTN ............................................................................................ 11. Hasil analisis taksonomi dari genus Ralstonia pada program BLASTN ............................................................................................ 12. Kurva pertumbuhan Ralstonia sp. Cr6NS dalam medium PYECr-25 100% .................................................................................................. 13. Mekanisme penyerapan Cr(VI) oleh sel hidup O. anthropi ............... 14. Pengaruh penambahan NADH sebagai donor elektron terhadap aktivitas enzim Cr(VI) reduktase .......................................................
5 12
14 15 25 26 27 28 29
30 30 32 34 35
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. 2. 3. 4. 5.
Komposisi medium Peptone Yeast Extract (PYE) ........................... Analisis protein (metoda Bradford) .................................................. Analisis kadar krom(VI) dengan metoda difenilkarbazida ............... Bentuk koloni dan bentuk sel isolat bakteri tahan Cr(VI) ................ Kromatogram hasil sekuens 16S rDNA ............................................
42 43 44 45 60
