Identifikasi Biohidrogen Secara Fermentatif Dengan Kultur Campuran Menggunakan Glukosa Sebagai Substrat Disusun Oleh : Rizkhi Agrinda Setya 1407 100 020 Pembimbing : Prof. Dr. Surya Rosa Putra, M.S Herdayanto Sulistyo Putro, M.Si
HIDROGEN
BIOLOGI
FISIKA
KIMIA
BIOHIDROGEN (Das dan Nejat, 2008)
BIOFOTOLISIS Cyanobacteria
FOTODEKOMPOSISI Purple Non-Sulfuric Bacteria
Lebih ramah lingkungan dan efisien karena menghasilkan uap air sbg emisi (Gupta, 2009). Memiliki kalor pembakaran 2,75 kali lebih besar dibanding dg bahan bakar hidrokarbon (Dong-Hon Kim et al., 2006)
FERMENTASI GELAP
HYBRID SYSTEM Microbial Fuel Cell
Produksi tanpa Cahaya
Substrat Bervariasi
Hemat Energi
FERMENTASI GELAP
• Genus Clostridium, Obligatif Anaerob - Adanya O2 akan menghambat kinerja Enzim Hidrogenase (Madigan, 2006). • Genus Enterobacter, Fakultatif Anaerob - Termasuk Bakteri Coliform, Kemungkinan Bersifat Enteropatogenik atau Toksigenik (Ferdiaz, 1993). • Selain Strain Tunggal, Kultur Campuran dapat juga menghasilkan H2 (Maintinguer et al., 2008; Patel et al., 2010; Singh et al., 2010)
Apakah kultur campuran yang digunakan dapat menghasilkan biohidrogen secara fermentatif dengan menggunakan glukosa sebagai substrat
Penelitian ini bertujuan untuk mengatasi kelemahan bakteri penghasil hidrogen seperti Clostridium dan Enterobacter dengan menggunakan kultur campuran dan mengetahui jumlah biohidrogen yang dihasilkan secara fermentatif dengan menggunakan substrat glukosa
Prosedur Kerja
• Pembuatan Media Padat dan Cair • Regenerasi Kultur Campuran • Pewarnaan Gram dan Uji Morfologi • Penentuan Kurva Pertumbuhan • Produksi Biohidrogen Secara Fermentatif dengan Kultur Campuran • Analisis Gas Hasil Fermentasi • Analisis Gula Pereduksi dan Jumlah Sel
Alat Botol, Tabung Reaksi, Pipet ukur, Magnetic stirrer, Hotplate strirrer, microtube, Thermoshaker, Mikroskop, Sentrifuge Hermle, Vortex, Spektrofotometer, Neraca analitik, Autoclave, Hydrogen bag, Hydrogen sensor, Kromatografi Gas
Bahan Nutrient Agar (Oxoid), Glukosa p.a (Merck), Ekstrak Ragi (Oxoid), FeSO4·7H2O p.a (Merck), NaOH, Metilen Blue, Asam 3,5-Dinitrosalisilat (Sigma Aldrich), Na-K tartat (Merck), Na-Metabisulfit (Merck), Gas Nitrogen, Aquades Steril dan Alkohol Teknis 70%.
1
Pembuatan Media Padat dan Cair Yeast Extract 0,5 % (w/v)
• Nutrien Agar 2 g • Aquades 100 mL
Glukosa 2 % (w/v)
Diautoclave pada 121 C selama15 menit
Media padat steril dan diinkubasi 1 hari dg posisi miring
Media Cair Steril didinginkan kemudian dicampur secara aseptis dlm Laminary Flow
2
Regenerasi Kultur Campuran Proses ini dilakukan dalam Laminary flow dengan teknik aseptik Diambil 1 ose dan di goreskan secara zigzag pada media padat steril
Strain Kultur Campuran
Diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam
Hasil regenerasi disimpan dalam lemari es
3
Pewarnaan Gram Sederhana dan Uji Morfologi Proses ini dilakukan dalam Laminary flow dengan teknik aseptik
Dibilas dengan Aquades steril
Diambil 1 ose dan digoreskan pada kaca preparat
Kaca preparat Steril Digoyang hingga merata dan kering
Ditetesi Metilen Blue pada goresan Dibilas sedikit dgn alkoholo 96%
Difiksasi diatas api
4
Penentuan Kurva Pertumbuhan Proses ini dilakukan dalam Laminary flow dengan teknik aseptik Di shaker selama 14 jam dengan suhu 40°C kec. 125 rpm
30 mL media cair atau (10% v/v)
FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)
Hasil inkubasi diinokulasikan lagi
Diambil 1 ose dan diinokulasi ke dalam media
Di shaker pada suhu 40°C kec. 125 rpm dan diambil sampel tiap jam Diukur absorbansinya pada λ = 600 nm
Media 270 mL atau 90% (v/v) + FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)
5
Produksi Biohidrogen secara Fermentasi menggunakan Kultur campuran
• Tahap pembuatan inokulum
Media Cair Steril 500 mL
FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v) dan magnetic stirrer steril
Dialiri gas nitrogen selama 1 menit
5 mL
Diinokulasi kedalam media 45 mL yang sblmnya dipreparasi seperti diatas Kemudian diinkubasi 45 mL
Proses ini dilakukan dalam Laminary flow dengan teknik aseptik
Diinkubasi dan di stirer selama 14 jam, suhu 40°C dg kec.125 rpm
Diambil 1 ose dan diinokulasi ke dalam media
5
Produksi Biohidrogen secara Fermentasi menggunakan Kultur campuran
• Tahap fermentasi
FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v) dan magnetic stirrer steril
Dialiri gas nitrogen selama 1 menit
50 mL media inokulum media 450 mL
Diambil sampel media tiap 6 jam
Hasil dianalisis
pH dimonitor dan diatur 6-5 dengan NaOH, Suhu 40°C, kec. 125 rpm
Rangkaian Alat
☺
Rangkaian Alat Pengadukan
Termometer
Fermentasi
Sistem
Batch
dengan
Selang Poliuretan Hydrogen Bag
Sumbat Karet
Indikator Gas berisi Aquades steril Hotplate stirrer
Magnetic stirrer
Metode Analisis
6
A. Analisis Gas
Gas yang dihasilkan
Volume
Uji Kualitatif
Uji Kuantitatif
3 2 Hidrogen bag 1
Botol berisi air vol. 1L dimodifikasi dengan infus 4
GC - TCD
Gelas ukur Hydrogen sensor
6
Metode Analisis
B. Analisis Jumlah sel
Sampel Fermentasi - diambil sampel tiap 6 jam sebanyak 1,5 mL - dimasukkan dalam microtube - disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm - dipisahkan secara dekantasi dan dimasukkan kedalam tabung
Biomassa
Supernatan
−biomassa dalam microtube ditambahkan aquades steril hingga 1,5 mL −disuspensikan dengan vortex −dituang ke dalam tabung berisi 3 mL aquades steril −disuspensikan dengan vortex −diukur absorbansi dengan panjang gelombang 600 nm
Hasil
6
Metode Analisis
C. Analisis Gula Pereduksi – Kurva Standar Glukosa Laruta Glukosa Stok 0,2 M
-Diambil sebanyak 1; 2; 3; 4; dan 5 mL -Diencerkan dengan aquades sampai 10 mL Laruta Glukosa Konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1 M
-Diambil masing-masing 0,2 mL dan ditambah 1,8 mL aquades -Ditambahkan 3 mL reagen DNS -Dipanaskan ke dalam air mendidih selama 10 menit -Didinginkan pada air dingin selama 10 menit -Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm -Dibuat kurva standar glukosa (Cglukosa vs A) Hasil
6
Metode Analisis
C. Analisis Gula Pereduksi
Supernatan -Diambil masing-masing 0,2 mL dan ditambah 1,8 mL aquades -Ditambahkan 3 mL reagen DNS -Dipanaskan ke dalam air mendidih selama 10 menit -Didinginkan pada air dingin selama 10 menit -Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm Hasil
Gambar 1. Hasil Regenerasi Kultur Campuran pada Media Padat
Menunjukkan Koloni kultur campuran berwarna putih, permukaan rata.
Gambar 2. Bentuk Morfologi Kultur Campuran
Dari hasil Foto mikroskopik dengan perbesaran 1000x, menunjukkan bahwa bakteri tersebut berbentuk batang atau bacil dengan ukuran yang berbeda, panjang dan pendek. Hal ini menunjukkan bahwa terbukti kultur campuran.
Lab. Mikrobiologi Unair
Lab. Mikrobiologi ITS
Bacillus cereus : Gram Positif, Fakultatif Anaerob
Bacillus subtilis: Gram Positif, Fakultatif Anaerob
Actinobacillus sp. : Gram Negatif, Fakultatif Anaerob
Pseudomonas fluorescence : Gram Negatif, Aerob
Hasil tersebut sesuai dengan (Holt et al., 1994)
• Hasil tersebut belum dapat ditentukan kebenarannya, sehingga harus diteliti secara biomolekular dengan Metode 16S RNA • Berdasarkan data tersebut, yang memungkinkan berpotensi penghasil hidrogen adalah golongan Bacillus sp. yaitu Bacillus cereus (Patel et al., 2010, Kotay dan Das, 206)
0.4 0.35
Densitas Optik (nm)
0.3 0.25 0.2
0.15
Fase log
Fase stasioner
Fase kematian
0.1 0.05 0 0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
Waktu (jam)
Gambar 4. Kurva Pertumbuhan selama Fermentasi
Adanya pertumbuhan sel selama fermentasi menunjukkan substrat yang digunakan tidak dikonversikan menjadi H2 secara maksimal
• Metabolisme Pemecahan Glukosa
• Berdasarkan data identifikasi strain, Golongan Bacillus sp. Seperti Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Actinobacillus sp. melakukan pemecahan glukosa melalui jalur EMP (EmbdenMayerhoff). Sedangkan dan Pseudomonas fluorescence melakukan pemecahan glukosa melalui jalur ED (EntnerDoudoroff) (Kim dan Gad, 2008). • Bakteri penghasil H2 biasanya bersifat fakultatif anaerob, sehingga data identifikasi dari ITS yang digunakan dalam penelitian ini. • Reaksi produksi H2 : Piruvat + CoA + 2Fd(oks) → Asetil-CoA + 2Fd(red) + CO2 2H+ + 2Fd(red) + enzim hidrogenase → H2 + Fd(oks) • Produk akhir : C6H12O6 + 2 H2O → 2 CH3COOH + 2 CO2 + 4 H2 C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + 2 CO2 + 2 H2
• Produksi Gas
Gambar 5. Kondisi media dan indikator saat terbentuknya gas
• Produksi gas dimulai pada jam ke- 13 dan optimum pada jam ke-20 dengan jumlah gelembung pada indikator mencapai 11x/menit • pH akhir sebesar 4. Hal ini disebabkan terbentuknya asam-asam organik • Volume gas yang dihasilkan sebanyak 970 ml • Uji kualitatif dengan Hydrogen sensor terbukti bahwa terbentuk gas H2
• Hasil Analisis H2
Gambar 6. Kromatogram hasil analisis H2
Hidrogen muncul pada waktu retensi 1,08 menit dengan luas peak 2,22x10-4. Kadar H2 yang dihasilkan yaitu sebesar 13,3 % sehingga H2 kumulatif sebanyak 148,41 mL.
• Kultur campuran yang digunakan dapat menghasilkan biohidrogen. • Uji kuantitatif dengan GC-TCD, kadar H2 yang dihasilkan yaitu sebesar 13,3 % sehingga H2 kumulatif sebanyak 148,41 mL. • Strain yang berpengaruh dalam produksi H2 adalah Bacillus cereus.
TERIMA KASIH
