37
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian berlangsung mulai September 2007 sampai dengan Juli 2010 dengan beberapa tahap percobaan (Gambar 4). Sampel tanah sawah diambil dari enam lokasi yang berada di Kabupaten Bogor, Kota Bogor dan Kota Tangerang, pengambilan dilakukan di dua titik pada setiap lokasi. Penelitian sebagian besar
Pengambilan sampel tanah
Isolasi bakteri dari biakan pengkayaan mengandung NO3-
Uji oksidatif/fermentatif
Uji reduksi NO3- dan akumulasi NO2-
Seleksi berdasarkan pertumbuhan dan kemampuan mereduksi N2O
Pengukuran kinetika pertumbuhan menggunakan N2O
Pengukuran kecepatan reduksi N2O dan pertumbuhan
Uji penurunan emisi N2O menggunakan tanah sawah
Karakterisasi dan identifikasi bakteri secara : - Morfologis - Fisiologis (API 20NE) - Molekuler (16S rRNA) Gambar 4 Bagan alir penelitian.
Analisis molekuler gen nosZ
38
dilakukan
di
Laboratorium
Mikrobiologi
Departemen
Biologi,
Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB), Bogor. Sebagian penelitian dilaksanakan di Microbial Ecology Laboratories, Department of Biological Sciences, University of Essex, United Kingdom. Gas N2O diukur menggunakan kromatografi gas di Laboratorium Bioteknologi Tanah Departemen Ilmu Tanah dan Sumber Daya Lahan IPB dan Laboratorium Balai Penelitian Lingkungan Pertanian, Jakenan, Pati. Sekuensing dilakukan di Research and Development Center Biotechnology Department PT Charoen Pokphand Indonesia dan 1st BASE Pte Ltd Singapura.
Bahan Sampel tanah diambil menggunakan siring tanpa jarum yang ujungnya dipotong. Panjang siring 5 cm dengan diameter 1 cm. Setelah berisi tanah, ujung siring ditutup rapat dengan plastik sampai kedap udara untuk menghindari masuknya oksigen (Lampiran 1a). Untuk keperluan isolasi, sampel dari dua titik pengambilan sampel dicampur. Sebelum digunakan sebagai sumber isolat, tanah diukur pHnya. Komposisi medium denitrifikasi yang digunakan adalah sebagai berikut (g L-1): NaNO3 2.55; CH3COONa.3H2O 2.72; K2HPO4 0.80; KH2PO4 0.30; NH4Cl 0.40; MgSO4.7H2O 5.20 dan larutan yang berisi unsur-unsur hara mikro 2 ml. Larutan unsur-unsur hara mikro mengandung (g L-1): NaEDTA 50; ZnCl2 1.41; CaCl2 5.50; MnCl2.4H2O 5.06; FeCl3.6H2O 4.86; (NH)4Mo7O24.4H2O 1.10; CuSO4.5H2O 1.57; CoCl2.6H2O 1.61 (Barford et al. 1999). Medium disterilisasi dengan suhu 121 °C selama 20 menit. Medium yang digunakan untuk pemeliharaan isolat dan uji aktivitas tidak menggunakan larutan unsur-unsur hara mikro seperti yang digunakan untuk isolasi tetapi medium ditambah ekstrak khamir 3 g L-1.
Isolasi Bakteri Biakan pengkayaan dibuat menggunakan 30 ml medium denitrifikasi cair yang diperkaya dengan NO3- dalam bentuk NaNO3- sebanyak 2.55 g L-1 dimasukkan ke dalam botol serum bervolume 70 ml dengan penutup karet
39
(Lampiran 1b). Kondisi anaerob dibuat dengan mengalirkan gas N2 ke medium dalam botol biakan selama 10 menit. Satu gram tanah sampel dibuat menjadi suspensi dengan menambahkan 4 mL akuades steril. Satu mililiter suspensi tanah dimasukkan ke dalam botol serum yang telah berisi medium steril dengan menggunakan siring steril. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang (28-30°C) selama 5-7 hari. Pertumbuhan bakteri ditandai dengan kekeruhan medium dan dihasilkannya gas yang dapat dilihat sebagai gelembung-gelembung di permukaan medium. Satu lup cairan biakan digoreskan ke permukaan medium agar-agar di cawan petri dan diinkubasi secara aerob maupun anaerob. Inkubasi anaerob dilakukan dengan menempatkan biakan dalam cawan anaerob. Koloni bakteri yang terpisah digoreskan kembali ke permukaan medium agar-agar yang baru. Bakteri hasil isolasi disimpan di medium agar-agar miring dalam tabung reaksi pada suhu 4 °C sebelum digunakan untuk perlakuan berikutnya.
Pembuatan Inokulum Inokulum dibuat dengan menumbuhkan isolat bakteri pada medium denitrifikasi cair dengan konsentrasi NO3- setengah dari konsentrasi NO3- yang digunakan untuk membuat medium pemeliharaan biakan. Biakan yang digunakan sebagai inokulum berada pada fase eksponensial dengan optical density (OD) 0.6 pada spektrofotometer (panjang gelombang 550 nm) atau turbiditas 80 pada nephelometer. Sebelum diinokulasikan, biakan inokulum disentrifugasi 4500 x g selama 10 menit kemudian sel yang didapatkan disuspensikan ke dalam akuades steril dengan volume yang sama dengan volume awal. Selanjutnya suspensi disentrifugasi lagi, sel yang didapatkan disuspensikan lagi dengan akuades steril. Inokulum ditambahkan sebanyak 2% dari medium yang digunakan dalam perlakuan.
Uji Oksidatif/Fermentatif Uji oksidatif/fermentatif dilakukan untuk memilih bakteri yang bersifat oksidatif karena bakteri denitrifikasi pada umumnya bersifat oksidatif dan juga untuk membedakan dengan bakteri fermentatif yang mereduksi NO3- menjadi
40
NH4+. Medium yang digunakan mengandung (g 100 mL-1) : pepton 2; NaCl 0.5; K2HPO4 0.03; biru brom timol 0.003; agar 0.3; glukosa 1, pH 7 (Hugh dan Leifson 1953). Sebanyak 5 mL medium dituang ke dalam tabung reaksi berpenutup ulir dengan volume 12 mL, kemudian isolat bakteri diinokulasikan secara tusukan. Di atas biakan dituangkan parafin cair untuk membuat kondisi anaerob. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 7 hari. Kelompok bakteri fermentatif akan menghasilkan asam sehingga warna hijau medium menjadi kuning. Pengukuran Reduksi NO3Bakteri ditumbuhkan dalam medium denitrifikasi cair tanpa NO3- dalam botol serum bertutup karet. Kondisi anaerob dibuat dengan mengalirkan gas N2 ke dalam medium selama 10 menit. Inokulum ditambahkan ke 40 mL medium yang mengandung NO3- 1500 µM dalam botol serum. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 3 hari. Pada hari ketiga diukur kadar NO3- dengan metode brusin (APHA 1975). Uji ini dilakukan untuk memastikan bahwa bakteri hasil isolasi merupakan bakteri pereduksi NO3- karena reduksi NO3- merupakan tahap awal dari denitrifikasi dan untuk mengetahui kemampuan isolat mereduksi NO3-. Percobaan dilakukan dengan dua ulangan. Biakan cair umur 3 hari ditambah 1 tetes HgCl2 0.1% untuk mematikan dan menggumpalkan sel. Satu mililiter bagian cair diambil dan diencerkan dua puluh kali. Dua mililiter hasil pengenceran ditambah 0.2 mL brusin 0.5% (Lampiran 2a) kemudian dihomogenkan menggunakan vorteks. Selanjutnya 4 mL asam sulfat (H2SO4) pekat ditambahkan, dihomogenkan kembali. Campuran didinginkan
sampai
berwarna
kuning.
Pengukuran
dilakukan
dengan
spektrofotometer Bausch-Lomb Spectronic 20 pada panjang gelombang 420 nm. Untuk menghitung konsentrasi NO3- dibuat kurva standar antara konsentrasi NO3(0, 2, 4, 6, 8, 10 mg L-1) dengan absorbansi (Lampiran 3a). Medium steril digunakan sebagai kontrol.
41
Pengukuran Akumulasi NO2Sampel untuk pengukuran NO2- diambil dari biakan yang sama untuk pengukuran NO3-. Lima mililiter biakan cair umur 3 hari yang telah ditambah HgCl2 0.1% dicampur dengan 0.1 mL sulfanilamida (C6H8N2O2S) 1% (Lampiran 2b) kemudian dihomogenkan dengan vorteks. Selanjutnya 0.1 mL N-1naftiletilendiamina (NED)(C6H12Cl2N2) 0.1% ditambahkan dan dihomogenkan kembali. Campuran biakan, sulfanilamida dan NED didiamkan sampai berwarna ungu kemerahan. Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer Bausch-Lomb Spectronic 20 pada panjang gelombang
540 nm (APHA 1975). Untuk
menghitung konsentrasi NO2- dibuat kurva standar antara konsentrasi NO2- (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg L-1) dengan nilai absorbansi (Lampiran 3b).
Seleksi Berdasarkan Pertumbuhan dan Kemampuan Mereduksi N2O Medium cair tanpa NO3- disiapkan dalam tabung reaksi bertutup karet Kondisi anaerob dibuat dengan mengalirkan gas N2 selama 10 menit ke medium dalam tabung biakan. Gas N2O ditambahkan ke udara di atas medium dalam botol (headspace) sehingga konsentrasi N2O di headspace sebesar 3.54 µmol ml-1. Biakan diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang (28-30 °C) (Lampiran 1c). Pada awal dan akhir perlakuan dilakukan pengukuran optical density (OD) dan konsentrasi N2O di headspace. Pengukuran OD dilakukan menggunakan spektrofotometer Bausch-Lomb Spectronic 20 pada panjang gelombang 550 nm sedangkan pengukuran konsentrasi N2O dilakukan dengan kromatografi gas Shimadzu 14B electron capture detector (ECD). Suhu kolom, injektor dan detektor pada kromatografi masing-masing 75, 100 dan 340 °C. Konsentrasi gas standar yang digunakan 9.45 ppm. Untuk pengukuran N2O, gas diambil dari headspace menggunakan siring, selanjutnya disuntikkan ke kromatografi gas. Tekanan dan suhu ruang pada saat pengukuran dicatat. Medium steril digunakan sebagai kontrol. Percobaan dilakukan dengan dua ulangan. Konversi konsentrasi gas ke molar dihitung dengan Hukum Gas Ideal (rumus 1): PV = nRT
(1)
42
dengan P menyatakan tekanan (atm), V menyatakan volume (L), n menunjukkan mol, T menunjukkan suhu (K) sedangkan R adalah konstanta gas (0.08206 L atm/mol K) (Reger et al. 2009).
Pengukuran Kinetika Pertumbuhan Menggunakan N2O Bakteri ditumbuhkan di medium denitrifikasi cair tanpa NO3- dalam tabung reaksi dengan kondisi anaerob. Gas N2O 10% disuntikkan ke headspace dengan empat tingkat konsentrasi masing-masing 1, 20, 40 dan 60% dari volume headspace sehingga N2O yang terlarut dalam medium terhitung masing-masing sebesar 88, 900, 1380 dan 1979 µM pada keadaan kesetimbangan. Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan. N2O yang terlarut dalam medium dihitung dengan rumus 2. S=αxHx
volume medium volume headspace
(2)
dengan S adalah N2O terlarut (µmol), α menyatakan kelarutan N2O dalam air pada suhu tertentu (cm3 N2O cm-3 H2O) sedangkan H menyatakan banyaknya N2O yang ada di headspace (µmol). Kelarutan N2O dalam air pada suhu 30°C sebesar 0.530 cm3 N2O cm-3 H2O (Carter 1993). Setelah penambahan inokulum, OD diamati setiap 2 jam menggunakan spektrofotometer Fisher Electrophotometer 11 pada panjang gelombang 525 nm. Kurva standar dibuat antara OD dengan jumlah bakteri. Jumlah bakteri dihitung dengan metode hitungan cawan. Kecepatan pertumbuhan spesifik atau µ (jam-1) dihitung dengan rumus 3.
µ=(∆lnN)/∆t
(3)
dengan N merupakan jumlah sel sedangkan t menunjukkan waktu (jam). Kecepatan pertumbuhan maksimum dan konstanta Monod dihitung berdasarkan persamaan Monod (rumus 4).
43
µ = µ max S
(4)
Ks + S dengan µmax (jam-1) menyatakan kecepatan pertumbuhan maksimum, S menyatakan konsentrasi substrat awal (µM) sedangkan Ks adalah konstanta Monod (µM jam-1) yang berhubungan dengan arah kesetimbangan reaksi pertumbuhan mikroba (Stainer et al. 1976; El Hassan et al. 1985; Liu et al. 2003b). Untuk mempermudah penghitungan µmax dan Ks digunakan transformasi linier dari persamaan Monod, yaitu dengan persamaan Hanes (Wilson dan Walker 2000) (rumus 5). Plot Hanes yang menempatkan konsentrasi substrat S di sumbu
S = Km µ µmax
+ S µmax
(5)
x dan S/µ di sumbu y menghasilkan garis lurus dengan kemiringan 1/ µmax. Perpotongan dengan sumbu x adalah Ks sedangkan perpotongan dengan sumbu y adalah Ks/ µmax.
Pengukuran Kecepatan Reduksi N2O dan Pertumbuhan Bakteri ditumbuhkan di medium denitrifikasi dalam tabung reaksi dengan suasana anaerob. Gas N2O ditambahkan ke headspace sehingga konsentrasi awal N2O terlarut dalam medium terhitung sebesar 12.75 mM. Inkubasi dilakukan di atas pemutar (roller) pada suhu 30 °C. Setiap 3 jam, konsentrasi N2O di headspace diukur menggunakan kromatografi gas Shimadzu 14A ECD. Pengukuran konsentrasi N2O dilakukan dengan mengambil udara dari headspace menggunakan siring kemudian disuntikkan ke kromatografi. Suhu kolom, injektor dan detektor masing-masing 35, 200 dan 340 °C. Konsentrasi gas yang digunakan 1000 ppm. Pertumbuhan diamati secara turbidimetrik menggunakan nephelometer EEL unigalvo DS29. Turbiditas dikonversi ke jumlah bakteri dengan pembuatan kurva standar (Lampiran 3c). Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan. Kecepatan reduksi N2O dihitung dengan rumus 7. vred = ∆S/∆t
(7)
44
dengan vred menyatakan kecepatan reduksi N2O, S menyatakan konsentrasi N2O terlarut sedangkan t menyatakan waktu. Kecepatan pertumbuhan dihitung dengan rumus 2 sedangkan waktu generasi (g) dihitung dengan rumus 6 (Stainer et al. 1976):
g = ln 2/µ = 0.693/ µ
(6)
Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Karakterisasi bakteri secara morfologis meliputi ciri koloni dan sel. Untuk pengamatan koloni, isolat ditumbuhkan di medium denitrifikasi agar-agar dalam cawan petri dengan metode cawan gores. Setelah 3 hari dilakukan pengamatan koloni. Pengamatan koloni meliputi bentuk, warna, elevasi dan tepian koloni. Pengamatan bentuk sel dan reaksi terhadap cat Gram diamati dengan pengecatan sel bakteri dengan cat Gram (Hadioetomo 1993) kemudian diamati di bawah mikroskop perbesaran 1000 kali dengan penambahan minyak imersi. Bila hasil pengecatan sel bakteri berwarna merah berarti sel bersifat Gram negatif sedangkan bila berwarna ungu menunjukkan sifat Gram positif. Pengamatan motilitas dilakukan terhadap sel bakteri yang masih hidup menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 kali dan minyak imersi. Karakterisasi dan identifikasi secara fisiologis menggunakan kit API 20NE (Biomérieux) meliputi uji reduksi NO3-; pembentukan indol; fermentasi glukosa; hidrolisis arginin, urea, eskulin, gelatin dan p-nitrofenil-β-galaktopiranosida serta asimilasi D-glukosa, L-arabinosa, D-manosa, D-manitol, N-asetil glukosamin, Dmaltosa, potasium glukonat, asam kaprat, asam adipat, asam malat, trisodium sitrat dam asam fenilasetat. Uji oksidase dilakukan menggunakan tetrametil fenil diamina dihidroklorida (McGrath et al. 1977). Hasil uji fisiologis berdasarkan API 20NE dan uji oksidase dianalisis dengan apiwebTM identification software. Identifikasi juga dilakukan secara molekuler menggunakan analisis sekuen gen penyandi 16S rRNA (subunit kecil dari ribosome ribonucleic acid). Analisis ini diawali dengan ekstraksi deoxyribonucleic acid (DNA) menurut metode Lazo (1987). Sebanyak 1.5 mL biakan cair disentrifugasi 9820 x g selama 5 menit. Sel
45
disuspensikan kembali dengan 1 mL bufer STE (Lampiran 2c) kemudian disentrifugasi 9820 x g selama 4 menit. Pembuatan suspensi diulang sekali lagi dengan penambahan lisozim (10 mg/mL). Selanjutnya 200 µL bufer STE dan 40 µL 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) ditambahkan, dibolak-balik perlahan, dan diinkubasi pada 65 °C selama 30 menit. Sampel didinginkan pada suhu ruang, ditambah 4 µL proteinase-K (10 mg/mL). Inkubasi dilakukan pada suhu 37 °C selama 3-4 jam. Selanjutnya 1x bufer STE ditambahkan sebanyak 200-400 µL, ditambah fenol:kloroform (3:5) sebanyak 250 µL, dibolak-balik sampai terbentuk emulsi. Sentrifugasi dilakukan pada 9820 x g selama 10 menit. Supernatan diambil, ditambah lagi dengan fenol:kloroform 250 µL, dibolak-balik sampai terbentuk emulsi dan disentrifugasi lagi (pengulangan 4-6 kali). Supernatan ditambah kloroform 200 µL dan disentrifugasi selama 10 menit (diulang 2x). Fase atas dambil, ditambah 1 mL etanol (EtOH) 95% dan 50 µL sodium asetat (NaOAC) 3 M, dibolak-balik kemudian disentrifugasi 9820 x g selama 10 menit. Larutan dibuang kemudian dibiarkan kering. Sebanyak 2 µL akuabides (ddH2O) diteteskan, kemudian diinkubasi pada suhu 65 °C selama 10 menit. Selanjutnya 2 µL RNAse ditambahkan, diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam. Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA menggunakan mesin polymerase chain reaction (PCR) Perkin Elmer GeneAmp dengan primer universal untuk prokaryot menurut Marchesi et al. (1998) yaitu 63F (5’ CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC) dan 1387R (5’ GGG CGG WTG GTA CAA GGC) serta DNA polimerase GoTaq Master Mix (Promega). Campuran reaksi terdiri atas DNA polimerase Master Mix 7 µL, primer 63F dan 1387R masing-masing 1.25 µL, DNA cetakan 3 µL dan ditambah ddH2O sampai volume 25 µL. Denaturasi awal dilakukan pada suhu 95 °C selama 5 menit, diikuti 30 siklus pada suhu 95 °C selama 30 detik, 55 °C selama 1 menit, 72 °C selama 1 menit dan selanjutnya pemanjangan akhir pada suhu 72 °C selama 5 menit. Produk PCR dikonfirmasi dengan elektroforesis menggunakan 1% gel agarosa dan 1 x bufer TAE (Lampiran 2d). Hasil PCR dilihat dengan ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystem, USA)-4 capillary dan kit sekuenser Big Dye Terminator v3.1. Data sekuen dibandingkan dengan sekuen yang ada di bank data The National Centre for
Biotechnology
Information
(NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
46
menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool untuk nukleotida (BLASTN). Pohon filogenetik dibuat menggunakan program Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) versi 4.0 (Tamura et al. 2007).
Analisis Molekuler Gen nosZ Analisis diawali dengan ekstraksi DNA. Selanjutnya amplifikasi untuk mendapatkan gen nosZ dilakukan menggunakan primer nosZ661F (5’ CGG CTG GGG GCT GAC CAA) dan nosZ1773R (5’ ATR TCG ATC ARC TGB TCG TT). Denaturasi awal menggunakan suhu 94 °C selama 5 menit, selanjutnya 35 siklus pada suhu 95 °C selama 30 detik, 56 °C selama 1.5 menit, 72 °C selama 2 menit dan diikuti pemanjangan akhir dengan suhu 72 °C selama 10 menit (Scala dan Kerkoff 1998). Enzim polimerase yang digunakan adalah DNA polimerase TaKaRa LA Taq. Campuran reaksi terdiri dari DNA polimerase 0.5 µL, 2 x bufer GC II 25 µL, MgCl2 5 µL, campuran dNTP 8 µL, primer nosZ661F dan nosZ1773R masing-masing sebanyak 2.5 µL, DNA cetakan 1.2 µL dan ditambah ddH2O sampai volumenya 50 µL. Hasil amplifikasi di-running menggunakan elektroforesis dalam 1% gel agarosa dan 1 x bufer TAE selanjutnya dilihat menggunakan transiluminator ultraviolet. Gel yang mengandung fragmen DNA yang diinginkan dipotong. DNA dipurifikasi dari potongan gel menggunakan gel extraction kit (Qiagen). DNA yang telah dimurnikan dari gel selanjutnya diligasikan ke plasmid vektor. Reaksi ligasi dibuat dengan komposisi (untuk volume total 10 µL): 2x bufer ligasi sebanyak 5 µL, vektor pGEM-T easy (50ng) 1 µL, DNA ligase T4 1 µL, DNA yang akan disisipkan 1 µL dan ddH2O 1 µL. Inkubasi dilakukan satu malam pada suhu 4 °C. Proses selanjutnya adalah transformasi. Koloni tunggal Escherichia coli DH5α ditumbuhkan dalam medium Luria Bertani cair (LB)(Lampiran 2e) dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 37 °C di inkubator berpenggoyang selama 16 jam. Selanjutnya biakan diambil 0.5 mL dan diinokulasikan ke medium LB yang bervolume 50 ml dalam erlenmeyer. Biakan dalam erlenmeyer diinkubasi pada suhu 37 °C di inkubator berpenggoyang selama 2 jam. Biakan diambil sebanyak 1.5 mL, dimasukkan ke dalam tabung mikro dan diinkubasi selama 10
47
menit dalam butiran es. Kemudian biakan dalam mikro disentrifugasi 3273 x g selama 10 menit. Supernatan dibuang, biakan disuspensi kembali dengan bufer transformasi (Lampiran 2f) sebanyak 1 ml. Biakan diinkubasi dalam butiran es selama 20 menit, selanjutnya disentrifugasi 3273 x g selama 10 menit. Bufer transformasi ditambahkan lagi dengan volume 250 µL, selanjutnya campuran diinkubasi di es selama 10 menit. DNA plasmid sebanyak 5 µL ditambahkan, diinkubasi lagi di es selama 45 menit. Kejutan panas dilakukan dengan cara memindahkan tabung mikro ke pemanas (heat block) bersuhu 42 °C selama 45 detik kemudian segera dipindahkan lagi ke dalam butiran es selama 5 menit. Sebanyak 5 mL medium LB ditambahkan, inkubasi dilakukan pada suhu 37 °C selama 60 menit dalam inkubator berpenggoyang, dilanjutkan sentrifugasi 6547 x g selama 2 menit. Medium LB ditambahkan lagi sebanyak 150 µL, sel disuspensi kembali dan disebar di atas permukaan medium Luria Bertani agar (LA) yang mengandung ampisilin dengan konsentrasi 100 µg/mL, X gal (5-bromo-4-kloro-3indolil-β-galaktosidase) 80µg/mL (Lampiran 2g) dan IPTG (isopropiltio-β-Dgalaktosidase) 0.5 mM (pGEM-T easy vector system technical manual, Promega 2009). Inkubasi dilakukan pada suhu 37 °C selama 16 jam di tempat gelap. Koloni putih yang tumbuh pada umumnya mengandung sisipan sedangkan koloni biru tidak mengandung sisipan. Plasmid selanjutnya diisolasi. Biakan transformasi umur 16 jam sebanyak 1.5 mL dimasukkan ke dalam tabung mikro. Isolasi plasmid menggunakan kit untuk isolasi plasmid (Geneaid). Hasil isolasi plasmid dicek menggunakan enzim restriksi EcoR1 (Fermentas) kemudian dilakukan elektroforesis. Gen target yang menyisip dianalisis susunan nukleotidanya menggunakan ABI Genetic Analyzer 3730 XL dengan kit Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystem). Primer yang digunakan adalah M13F-pUC (5’ GTTTTCCCAGTCACGAC 3’) dan M13RpUC (5’ CAGGAAACAGCTATGAC 3’). Data dibandingkan dengan sekuen yang ada di NCBI menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool untuk protein (BLASTX).
48
Uji Penurunan Emisi N2O Uji penurunan emisi N2O dilakukan dengan menggunakan tanah sawah yang digenangi air pada sistem tertutup (modifikasi dari Huang et al. 2007). Pengukuran dilakukan terhadap N2O di udara (headspace) dan air permukaan. Sampel tanah diambil dari sawah di daerah Sindang Barang Jero, Kota Bogor, dari sawah pada musim tanam. Tanah sawah dikeringanginkan dan disaring dengan saringan berukuran lubang berdiameter 2 ml. Air yang terkandung dalam tanah diukur dengan metode gravimetri (Or dan Wraith 2000). Dua ratus dua puluh gram tanah dimasukkan ke dalam botol bervolume 603 ml bertutup karet dengan ketinggian tanah dalam botol 6 cm (Lampiran 1d). Selanjutnya gas N2 dialirkan ke dalam botol selama 15 menit untuk mengurangi kandungan NO3- tanah (modifikasi dari Holtan-Hartwig et al. 2000). Tanah diinkubasi dua hari dalam keadaan botol tertutup. N2 dialirkan kembali ke dalam botol selama 15 menit untuk mengeluarkan N2O yang kemungkinan terbentuk. Akuades ditambahkan sampai ketinggian 2 cm dari permukaan tanah. Tanah didiamkan selama 7 hari dalam keadaan tutupnya terbuka untuk mengembalikan kondisi tanah ke keadaan sebelumnya yaitu kondisi tanah sawah tergenang. Sebelum digunakan untuk perlakuan, pH tanah diukur (Hanna pH 211 Microprocessor). NO3- ditambahkan dalam bentuk larutan NaNO3- sebanyak 0.6 mmol NO3- (setara dengan 70 kg N ha-1 dengan ketebalan 20 cm), sedangkan inokulum bakteri ditambahkan sebanyak 5x108 CFU sebagai suspensi dalam akuades steril. Kontrol dibuat tanpa penambahan inokulum. Selanjutnya botol ditutup rapat dengan penutup karet agar tidak ada udara yang masuk atau keluar. Pada jam ke 0, 3, 6 dan 9 dilakukan pengukuran konsentrasi N2O di headspace dan air permukaan (Gambar 5). Gas diambil dari headspace dan disuntikkan menggunakan siring ke kromatografi gas Shimadzu 14A ECD. Suhu kolom, injektor dan detektor masing-masing 60, 150 dan 350 °C. Gas standar yang digunakan 682 ppb. Pengukuran N2O di air dilakukan dengan cara mengambil 8 ml air di atas permukaan tanah menggunakan siring tanpa jarum yang ujungnya disambung dengan selang, selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi berpenutup karet. Sesaat sebelum udara dari headspace diambil untuk disuntikkan ke GC, tabung dikocok kuat agar gas dari air keluar semua ke headspace. Percobaan dilakukan dengan dua ulangan.
49
tanah sawah dikeringanginkan dan diayak
gas N2 dialirkan selama 15 menit
inkubasi 2 hari, kemudian dialiri lagi dengan N2
tanah dimasukkan dalam botol, ketinggian tanah 6 cm
NO3- dan inokulum bakteri ditambahkan
N2O di udara diukur pada jam ke-0, 3, 6, 9 dari sampel terpisah
akuades ditambahkan sampai ketinggian 2 cm dari permukaan tanah, diinkubasi 7 hari
N2O di air permukaan diukur pada jam ke-0, 3, 6, 9 dari sampel terpisah
tutup botol dibuka
Gambar 5 Uji penurunan emisi N2O menggunakan sedimen tanah sawah.
