5. Polymorfismus 5.1. Úvod Pojem polymorfismus resp. polymorfie (z řeckého: polys = mnohý, morfé = tvar) použil poprvé Mitscherlich v roce 1822. Všiml si, že u některých arseničnanů a fosforečnanů může jedna sloučenina, určitého chemického složení, vykrystalovat ve více krystalových tvarech. Dnes polymorfismus definujeme jako možnost molekuly krystalovat ve více krystalových strukturách neboli polymorfech. Pokud se do struktury při krystalizaci zabudují i molekuly solventu (nejčastěji vody), hovoříme o solvátech (hydrátech). Solváty se také označují jako pseudopolymorfy nebo solvatomorfy, ale tyto pojmy jsou stále předmětem diskuse. Pevná forma určité molekuly může být též amorfní a v poslední době je snaha rozlišovat i mezi několika amorfními formami jedné molekuly – tzv. polyamorfismus. Rozeznáváme dva základní typy polymorfismu: pakovací a konformační. Pakovací polymorfismus znamená, že molekula je rigidní a polymorfy se liší pouze jejím pakováním v krystalové struktuře. Konformační polymorfismus vzniká tehdy, když je molekula flexibilní a tvoří konformery, které odlišně krystalují. V praxi se setkáváme jak s čistým pakovacím nebo konformačním polymorfismem, tak se smíšenými typy (obr. 5.1, 5.2.).
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a z l e.infekcí) a její dva pakovací slN O Sý(léčba kbakteriálních á Obr. 5.1. Molekula sulfapyridinu, C H o t m k z lů interakcemi polymorfy (z celkových 6 popsaných), sevliší pospojováním molekulárními a š o a en které z k ké Pr če je m ň l molekul o se,v zhruba vúposledních u organických Jev polymorfismu letech, azačaldvaceti p s k r o y promítl do farmaceutického vývoje, výzkumu, výroby a kontroly, kde být podrobně m o d Vve farmacii jsou ýpořádány tsamostatné o monitorován. Nadtéma polymorfismu konference a u ů in v rocea 1995, po patentovém o Význam polymorfismu j r t psány monografie. prudce stoupl sporu o n u k mezi firmami as ranitidinu hydrochloridu, formy ob týkajícížisetídimorfismu Te Glaxo a Novopharm, l h iu u u d o so u p t s o ez h e b 1 k Je 11
11
3
2
I, II (léčba žaludečních vředů). To, že nešlo o záležitost zanedbatelnou, svědčí i výše celosvětových prodejů ranitidinu (léčivo Zantac® , Glaxo), které v roce 1993 dosáhly částky 3,44 mld USD.
Obr.5.2. Dva rotamery L-glutamové kyseliny a odpovídající konformační polymorfy
Ve farmaceutické praxi se stalo zvykem zahrnovat všechny polymorfy, solváty a polyamorfáty jedné API pod pojem pevné formy, příp. pod rozšířený pojem polymorfy a označovat je např. římskými číslicemi (např. prednisolon forma I – V) nebo písmeny (chloramfenikol forma A, B; indomethacin forma α,β,γ), symetrií (cyklosporin A, tetragonální prostorová grupa P 41 nebo monoklinická prostorová grupa P 21) aj. Je třeba počítat i s tím, že značení polymorfů je bohužel někdy nejednotné, vzniká historicky a tak občas různí autoři označí dva rozdílné polymorfy stejně. Problémem farmaceutických výrobců jsou polymorfní přechody v organických soustavách, které jsou často hysterezní, špatně definované a často probíhají přes kapalnou fázi („solvent-mediated“). Polymorfní přechody mohou proběhnout ve všech technologických stupních výroby léčiva (při finální krystalizaci API, vlhké granulaci, mikronizaci, tabletaci nebo v hotové tabletě např. působením pomocných látek, tzv. excipientů). Národní regulační autority (např. v ČR SÚKL = Státní ústav pro kontrolu léčiv nebo v USA FDA = Food and Drug Administration) vyžadují při registraci léčiva na farmaceutických firmách popis všech jeho pevných forem a možných fázových přechodů, stejně jako předepsanou garanci polymorfní čistoty produktů. V současnosti tvoří okolo 85 % produkce farmaceutických firem právě pevné lékové formy (tablety) a proto si žádný producent nemůže dovolit problém polymorfismu u svých výrobků ignorovat.
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o kteréymusí řešit farmaceutické r m o 5.2. Problémy s polymorfismem, firmy o d t ý V d n au ů i o j r t Každá ofirma produkujícíí kpevné lékové n farmaceutická u formy musí řešit následující s e b problémy: o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 2 h b e ke J
1) Jaká je frekvence výskytu polymorfů u určité, farmaceuticky zajímavé molekuly? 2) Lze polymorfismus teoreticky předpovědět? 3) Jak lze připravit zvolený polymorf dostatečně robustní, kontrolovanou a reprodukovatelnou technologií? 4) Jaké jsou podobnosti a rozdíly ve vlastnostech jednotlivých polymorfů? Neohrozí záměna polymorfu zdraví pacienta? 5) Jaké, dostatečně citlivé a validované techniky se hodí k identifikaci, rozlišení a stanovení polymorfů? 5.2.1. Frekvence výskytu polymorfů Počet pevných forem, které určitá API může vytvářet je dán počtem možných interakcí mezi molekulami v molekulárním krystalu (H-vazby, van der Waalsovy síly, π-π interakce atd.). Některé malé organické molekuly, na kterých je především založen současný farmaceutický průmysl, mohou vytvářet až několik desítek pevných forem. Např. u současného nejprodávanějšího léku na světě – atorvastatinu (léčba zvýšené hladiny krevního cholesterolu, prodeje v roce 2004, 12 mld USD), je popsáno okolo 30 pevných forem a u sulfathiazolu je známo dokonce přes 100 pevných forem. To jsou však extrémní případy (nehledě na možný překryv výsledků u různých autorů), maximální počet „čistých“ polymorfů, od jedné molekuly, zřídka převyšuje 5. Pokud je molekula protonizována (např. sertralin hydrochlorid nebo tergurid hydrogenmaleát) a ještě solvatována, potom počet dalších intermolekulárních kontaktů stoupá a tím stoupá i počet možných pevných forem. Solvent (nejčastěji H2O) se může (častější případ) nebo nemusí (je volně pohyblivý - řidší případ) zapojit do systému vodíkových vazeb v krystalové struktuře pevné formy. Právě o organických molekulách provokativně prohlásil již v roce 1963 McCrone, že „… každá molekula je potenciálně polymorfní, počet jejích polymorfů závisí pouze na množství peněz, času a energie, investovaných do jejího výzkumu“. Zdá se, že toto tvrzení platí dokonale, počty nově popsaných pevných forem rostou úměrně tomu, jak je studovaná molekula v centru pozornosti. Na druhé straně však, u tak dlouho známých sloučenin, jakými jsou naftalen a sacharosa, polymorfismus pozorován dosud nebyl. Rozumné vysvětlení zde chybí. Ve farmacii je zhruba používáno celkem asi 4 500 různých molekul (ročně jich přibude jen několik desítek). Tento odhad je přibližný, protože relevantní databáze neshromažďují molekuly, ale aktivní substance (API) a od jedné molekuly může být používáno několik jejích solí (např. estradiolum, estradiolum hemihydricum, estradiolum benzoicum, estradiolum dipropionicum, estradiolum valericum). Výsledky ze 150 „screeningových“ studií ukázaly, že 87 % aktivních substancí se vyskytuje ve více než jedné formě (51 % existuje ve více než jednom polymorfu, 39 % se vyskytuje i v amorfní formě, 37 % tvoří hydráty a 31 % solváty). Protože databáze specializovaná na polymorfii neexistuje, Bernstein provedl inspekci také v Cambridgské strukturní databázi (CSD) a zjistil, že k listopadu 2002 bylo ze všech 272 066 organických struktur 9201 označeno jako „polymorph“, „phase“ nebo „modification“ a 61 029 jako „solvate“ nebo hydrate“, tj. celkem 25,8 % z celkového počtu se vyskytuje ve více fázích. Tato informace je ovšem zkreslená směrem dolů, protože většina laboratoří publikuje strukturu pouze jedné formy, kterou se podaří vykrystalovat.
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 3 h b e ke J
Odpověď na otázku, zda je polymorfie častým jevem u farmaceuticky využívaných molekul, zní ano. Každý farmaceutický výrobce musí provádět průběžný „screening“ (mapování) a rešerši na polymorfii svých aktivních substancí. Komplexní „screening“ na polymorfii zvolené API může zahrnovat až několik tisíc krystalizačních experimentů provedených kombinatoriálně při použití 20 a více rozpouštědel (Tab. V.1.) a jejich směsí, včetně variace dalších krystalizačních podmínek (viz Tab.V.2.). „Screening“ se většinou provádí pomocí krystalizačních automatů. Tabulka V.1. Přehled 20 nejpoužívanějších rozpouštědel při mapování polymorfismu (kromě vody)
N, N-dimethylformamid (DMF) dimethylsulfoxid (DMSO) dioxan p-xylen benzen tetrahydrofuran (THF) acetonitril kyselina octová tetrachlormethan toluen
dichlormetan chloroform methanol aceton i-propanol cyclohexan ethylacetát ethanol diethylether hexan
o k Existence polymorfismu a důvody, které vedou k jeho výskytuja jsou a je cké fundamentální povahy, detailní vysvětlení zatím neznáme. Predikce polymorfie r o možná zní gi v zásadě predikcí krystalové struktury. Současná odpověd, zda je tato predikce t u nikoliv i když se v této oblasti velmi intenzivně pracuje. V současnosti nejlepším o a l programovým balíkem je systém Cerius Materials Studio, který obsahuje i modul o mDílčíml úspěchem n je Polymorph Predictor, vycházející z molekulárních simulací. e h á s c i experimentální předpověď existence třetího polymorfu paracetamolu aljeho a následné r te e í h potvrzení. t n o a u Predikce polymorfismu je spíše akademická záležitost, o kterou k farmaceutickéíře o m c s i firmy nejeví velký zájem. Důvodem je fakt, žeepři patentových sporech nemá predikce š í m í n s j prakticky žádnou váhu. š i Celý etento proces trváaokolo l 8o í záležitost. h d ž Vývoj nového léčiva je dlouhá a nákladná c n ddoba stále u skturostoucíy konkurenci á let a stojí okolo 800 mil. dolarů. Vzhledem se tato o a z l snažíe.blokovat generickéáfirmy, sl výrobce zkracuje, ale náklady rostou. Originální se proto o ý t m kvšechny vnákladů ša kčasu tím,azže patentově které generikum uvedou na trh n za zlomek ochrání a ů o l e z r všechny možné formy substance. Lze ovšem jednoznačně formy, které k ké předpovědět e pevné e č P m ň j l sopředpovědět může určitá molekula u vytvořit? Myšlenka krystalové struktury všech forem ú lákavá. v a Pokud by tato p k r jedné aktivní substance teoreticky, ze základní principů, je velice o y m o o dby originální ývšechnyutmožné formy patentovat V výrobce mohl predikce byla spolehlivá, tak d n ještě před uvedením ji u a to léčiva naotrh.rů n k í las t ob Te i ž uh u i u d o so u p t s o ez h e b 4 k Je 5.2.2. Predikce polymorfismu
Při predikci neznámého polymorfu je v prvním kroku nutné předpovědět prostorovou grupu. To je poměrně snadný úkol, protože organické látky obvykle krystalizují pouze v několika málo grupách z 230 možných. Výběr je navíc omezen chiralitou molekuly. Většina chirálních organických molekul krystaluje v grupě P 21, P 1 nebo P 212121. Achirální látky obvykle krystalizují v grupách P 21/c , P⎯1, P na21 a C 2/c, směsi enantiomerů v grupách P 21/c , P⎯1 , C 2/c nebo P bca. Tyto předpoklady o symetrii splňuje přibližně 78 % látek obsažených v CSD. Ve druhém kroku je nutné předpovědět mřížkové parametry. Na základě statisticky ověřeného předpokladu o stabilní velikosti pakovacího koeficientu pro jeden nevodíkový atom organické molekuly (hodnota 19,4) lze poměrně přesně odhadnout objem základní buňky. Velikosti mřížkových parametrů musí být zvoleny tak, aby tomuto objemu odpovídaly. Přesnější predikce hodnot mřížkových parametrů založená na statistice existujících struktur, je bohužel značně nespolehlivá. Získají se pouze určité intervaly, ve kterých mřížkové parametry pravděpodobně leží. Posledním a nejdůležitějším krokem predikce struktury je určení pozic molekul v elementární buňce. Zde se ale u běžných organických látek naráží na tři zásadní problémy. První problém se týká výpočtu slabých molekulárních interakcí, které drží krystal pohromadě. Pro předpověď krystalové struktury je nutné mít k dispozici přesný popis všech silových působení mezi molekulami v krystalu a zejména popis energetických změn, ke kterým při těchto interakcích dochází. Optimální by byl popis kvantově-mechanickými metodami na úrovni ab-initio. Čím slabší interakce chceme popsat, tím přesnější musí být výpočet a tím více efektů do něho musíme nutně zahrnout (např. korelační energie). Kvantově-mechanický výpočet slabých interakcí je díky tomu mnohem náročnější než běžně prováděné výpočty. Výpočetní náročnost roste exponenciálně s počtem elektronů zahrnutých do zpracování. I při nasazení té nejvýkonnější techniky lze v současné době rutinně řešit slabé interakce pouze v systémech o několika desítkách atomů. Pro potřeby predikce je ale nutné tento výpočet opakovat pro různá uspořádaní celého komplexu molekul, čímž se výpočetní náročnost neúnosně zvyšuje. Algoritmy pro přímé vyhledání lokálních minim, případně globálního minima energetické hyperplochy jsou ve stádiu výzkumu a uspokojivé řešení dosud není k dispozici. Problém se dá částečně řešit metodou molekulárních simulací s použitím empirických potenciálů, založených na značné aproximaci popisu silových působení. Příkladem je klasická Lennardova-Jonesova funkce 6-12 (člen atrakce r-6 a člen repulze r-12 , kde r je vzdálenost) pro popis VdW interakcí. Tvarový průběh funkcí těchto potenciálů je většinou odvozen z úvah podložených kvantově-mechanickými výpočty. Empirické koeficienty, určující vlastnosti určitého atomu, jsou odvozené z experimentu, zejména ze strukturních dat již vyřešených krystalových struktur. Popis interakcí pomocí empirických potenciálových funkcí funguje spolehlivě většinou pouze pro molekuly charakterem blízké těm, které byly použity pro kalibraci empirických konstant daného potenciálu. Výsledkem molekulární simulace je výpočet nejstabilnější konfigurace. Druhý zásadní problém, spojený s předpovědí krystalové struktury, je identifikace správného řešení. Předpověď krystalové struktury probíhá většinou podle následujícího schématu: při výpočtu je generována řada možných elementárních buněk v rozumném rozmezí mřížkových parametrů. Pro zvolené prostorové grupy je do takové buňky umisťována molekula a je provedena minimalizace energií vazebných interakcí. Celý postup se zkouší pro velké množství jak elementárních buněk, tak výchozích pozic molekuly. V případě flexibilní molekuly může být dalším parametrem, který je nutné měnit, např. torzní úhel této molekuly. Výsledkem celého výpočtu je pak řada potenciálních
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 5 h b e ke J
řešení, jejichž kvalita se dá ohodnotit velikostí energie intermolekulárních sil a v případě flexibilní molekuly i potenciální energií výsledné konformace molekuly. Funkce pro hodnocení správného výsledku má většinou velice plochý průběh. Rozdíly v energiích jednotlivých řešení jsou většinou velmi malé, okolo 4 kJ.mol-1. Navíc se do jejího průběhu promítají chyby, způsobené použitím empirických potenciálů nebo kvantově-mechanických výpočtů na nedostatečné úrovni přesnosti. Tímto způsobem se pro běžné molekuly obsahující několik desítek nevodíkových atomů vygenerují tisíce možných řešení, z
Obr.5.3. Graf znázorňující vypočtenou mřížkovou energii vynesenou proti objemu molekuly (objem elementární buňky dělený počtem molekul v buňce) pro 30 možných krystalových struktur benzenu
kterých je obtížné vybrat ta reálná (obr.5.3). Reálná řešení nemusí mít vždy nejnižší energii z celého souboru. Třetím, těžkým problémem je výpočet entropického členu (G = H – TS), který se projeví při každém krystalovém pakování nad teplotou absolutní nuly a zvláště při polymorfních přechodech vyvolaných zahříváním. Entropický člen se většinou statisticky odhaduje. Kromě toho je nutné vzít do úvahy i dynamickou povahu krystalizačního procesu. To, jaká forma ve skutečnosti při krystalizaci vznikne, není dáno pouze termodynamikou, ale i kinetikou krystalizace. Farmaceutická firma musí vedle formy patentovat i její přípravu. Pro přesnou predikci by tedy bylo nutné modelovat jak kinetické aspekty, tak nukleační procesy při krystalizační teplotě a teprve až na základě těchto informací identifikovat, zda daná fáze (polymorf) opravdu vykrystalizuje. Celou věc dále komplikuje možná solvatace. Dalším přístupem k predikci je považovat krystal za supramolekulu. Při krystalizaci (supramolekulární reakci) se jednotlivé stavební částice (molekuly) navzájem rozpoznávají („recognition“) a určitým způsobem samoskladně uspořádávají („self-assembly“). Je zajímavé, že směry těchto interakcí často koincidují se šroubovými osami nebo skluznými rovinami v krystalu. Z hlediska supramolekulární chemie chápeme stavební částice (molekuly) jako tzv. supramolekulární synthony, které přenášejí informaci o svém tvaru do krystalové struktury. Většinou se určitá konformace molekuly v roztoku přenese i do krystalu. Současný stav v oblasti možnosti predikce krystalových struktur ukazuje slepý test, který byl zorganizován v roce 1999 a 2001 v rámci workshopu v Cambridgském krystalografickém datovém centru (CCDC). Organizace pokusu byla následující: 11
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 6 h b e ke J
různých pracovišť dostalo informace o konektivitě čtyř různých sloučenin jejichž krystalové formy byly známé, ale dosud nepublikované. Všechny sloučeniny byly poměrně malé rigidní molekuly. Součástí zadání byla informace, že látka krystaluje v některé z běžných prostorových grup a že všechny modifikace obsahují pouze jednu molekulu v asymetrické části buňky. Úkolem bylo pro každou látku navrhnout maximálně tři krystalové struktury a seřadit je podle pravděpodobnosti existence. Z celkového počtu 105 předpovědí (některé postupy nebyly pro daný typ látky vhodné) odpovídalo celkem 7 předpovědí skutečným strukturám. Z těchto sedmi předpovědí bylo jen 5 označeno jako nejvíce pravděpodobných ze všech navržených. Tzn., že predikce struktury měla úspěšnost 4,8 %. Pozitivní je, že pro každou látku se podařilo získat, alespoň jedním postupem, správnou předpověď. To, že dosud neexistuje univerzální postup predikce se projevilo také v tom, že správný výsledek byl pro každou látku získán jinou pracovní skupinou s použitím zcela jiného programového vybavení. Za zmínku stojí také informace, že správnou predikci krystalové modifikace té nejjednodušší molekuly (propanu) se podařilo zjistit pouze s pomocí kvantově-mechanických výpočtů na úrovni ab-initio. 5.2.3. Polymorfní přechody a cílená výroba zvoleného polymorfu V polymorfním systému je za definovaných podmínek vždy jeden polymorf nejstabilnější. Nejstabilnější polymorf je charakterizován: • • • • •
nejnižší Gibbsovou energií nejnižší rozpustností v libovolném rozpouštědle nejnižší rozpouštěcí rychlostí nejnižší biodostupností nejnižší reaktivitou
o k ja é a k Problémem farmaceutického průmyslu jsou nekontrolovatelnéorpolymorfní c t polymorfy, gi přechody. Při krystalizaci v polymorfním systému nejdříve krystalují nestabilní u o které se posléze transformují na jednu nejstabilnější formu (obr. 5.4.). Katéto samovolné l o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za k v m lňčistých opolymorfů j (c). Forma II ú u Obr. 5.4. a), b) Nukleace a krystalizace I a II a polymorfní přechod a p s k o r y m je stabilnější protože o má nižší rozpustnost o d t ý V d u polymorfu je jeho ů innejstabilnějšího o a j transformacit nikdy nedochází robráceně. Výhodou o a reprodukovatelnost n uale nevýhodou je jeho nejnižší k šarží, relativněesnadná robustní výroba s b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 7 h b e ke J
rozpustnost a tudíž nejnižší biodostupnost. Proto při výběru vhodného polymorfu musí farmaceutická firma zvážit všechny aspekty dané technologie. Hnací silou polymorfní (fázové) transformace je, stejně jako u chemické reakce, záporná hodnota změny Gibbsovy energie, ve směru: nestabilní polymorfy → nejstabilnější polymorf. Možnost polymorfních transformací v polymorfním systému vyplývá tedy z nestejné stability polymorfů. Polymorfní transformace je fázovým přechodem prvního řádu, kdy se skokově mění entropie a objem, tzn. první derivace Gibbsovy energie podle teploty a tlaku: (∂G/∂T)p = -S, (∂G/∂p)T = V. Fázová přeměna může být rychlá nebo pomalá, je spojena s překonáním energetické bariéry (∆G) a probíhá v roztoku či v suspenzi („solvent-mediated“) nebo v pevné fázi. V polymorfních systémech rozlišujeme dva typy přechodů: enantiotropní a monotropní (obr.5.5.). Při enantiotropii je možná polymorfní přeměna v pevném stavu,
o k ja é a k r c to je většina gi při monotropii je polymorfní přeměna možná pouze v roztoku. Ve farmacii u o přechodů monotropních. a l o O tom, jaký polymorf vykrystalizuje se rozhoduje v prenukleačním stadiu, tedy u m n l e klastrů, na základě kompetice kinetických a termodynamickýchsfaktorů. á hk tomu, c a eriVzhledem e že energetické rozdíly mezi polymorfy jsou velmi malé (viz lpodkap.5.1.2.), snadno se může tkrystalizaci í h t stát, že vykrystaluje jiný polymorf, než si přejeme. Faktorů, které ovlivňují n o a u k je mít všechnyíře osubtilní,ma je obtížné (nukleaci) je celá řada (Tab. V.3). Některé jsou velmi c s i š dokonale a reprodukovatelně pod kontrolou ve e výrobním íměřítku. I u technologie, která í n m s j š byla doposud bezproblémová a vedla vždy kípožadovanému i polymorfu, e může dojítalk jevu, o h d ž který Dunitz a Bernstein nazvali „disappearing polymorph“ (ztracený polymorf). Dlouho n c d u u t a ázá lo ý s oly . s e ům ak t krystalizaci k polymorfu v z Tabulka V.2. Hlavní faktory ovlivňující určitého n š o a e k é P r č el j e z k m ň l krystalizace ú ra o (nukleace) u Faktory v p s k o Vy m míchání o o roztoku t ý teplota a tlak při d krystalizacid intenzita u ů inzvolenéarozpouštědlo (srážedlo) o ochlazení roztoku j rychlost a stupeň r t o ve finálním í k pHsroztoku n(jiného kosolventu) u obsah vody e b o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 8 h b e ke J Obr. 5.5. Enantiotropie (vlevo) a monotropie (vpravo)
rozpouštědle přítomnost nečistot, cizích iontů v roztoku doba krystalizace doba stání produktu v matečném roztoku stupeň přesycení roztoku
koncetrační a teplotní gradienty v roztoku zvukové, ultrazvukové, mikrovlnné, laserové nebo jiné rázy
vyráběný polymorf se najednou nedaří reprodukovat. Příčinou je zřejmě skutečnost, že (náhodou??) vzniknou mikroskopická prenuklea jiného polymorfu, která kontaminují krystalizační zařízení, příp. jsou přítomná ve vzduchu a tak může tvrdošíjně krystalovat vždy nechtěný polymorf a pokusy vykrystalovat jiný na stejném místě jsou dlouhodobě neúspěšné. Pokud se zjistí, že výrobní šarže obsahuje jiný polymorf, je nutné zpětně dohledat, jak byly nastaveny (dodrženy) všechny krystalizační parametry. Zvládnutí krystalizace určitého polymorfu ve výrobním měřítku (tzv. „crystal engineering“ ) může být velkým problémem, zvláště když není k dispozici krystalizační očko. Univerzální technika, jak usměrnit polymorfní chování určité API žádaným směrem, tj. robustně a reprodukovatelně vyrábět určitý polymorf, neexistuje. Někdy lze použít očkování podobnou strukturou („tailor-made impurities“) , které sníží nukleační bariéru (viz dále). Jinou technikou, jak vůbec přinutit určitou substanci krystalovat, je syntetizovat tzv. kokrystal. Kokrystal je obecná sloučenina typu hostitel-host, kdy původní hostitelskou strukturu substance synteticky doplníme hostem, který není solventem. Host ze struktury kokrystalu snadno nevytěká (nedesolvatuje) a tím se kokrystaly liší od solvátů. Je popsáno mnoho kokrystalů, např. močoviny s anorganickými a organickými hosty (kyselinou hexahydrogentellurovou, ketony, karboxylovými kyselinami, 2-aminopyridinem atd). Jiným příkladem je kokrystal mezi acetaminofenem a piperazinem. Stechiometrický poměr mezi hostitelem a hostem kokrystalu je různý, např. 1:1, 1:2 nebo 2:1, a často se mezi složkami vytváří pevné H-můstky. Kokrystal je ovšem z hlediska registrační procedury léčiva jiná sloučenina než původní API. V případě komplikovaných polymorfních systémů, může zjednodušení spočívat v přechodu na vhodnou sůl, pokud lze substanci převést na kyselou nebo zásaditou formu. Např. u námelového alkaloidu terguridu (léčba parkinsonismu) je známo 7 krystalových forem, zatímco u protonizované formy (báze), terguridu hydrogenmaleátu, polymorfie pozorována dosud nebyla. Léková forma Mysalfon® (Zentiva), kde aktivní substancí je tergurid, je formulována právě z hydrogenmaleátu. Obejití problému polymorfismu však není jediným důvodem pro volbu soli. Soli mají obecně vyšší rozpustnost a biodostupnost než volné báze nebo kyseliny. Dále mají jiné fyzikálně-chemické a technologické vlastnosti (stabilitu, hygroskopičnost, tekutost neboli sypnost práškovitého stavu atd.) a proto jsou pro farmacii velmi zajímavé. Volbou různých solí od jedné substance tak můžeme měnit výsledné vlastnosti léčiva. Nejzastoupenější aniontovou solí je ve farmacii hydrochlorid, ale spektrum se stále rozšiřuje, takže se můžeme setkat se sulfáty, methansulfonáty (mesyláty), maleáty, naftalensulfonáty (napsyláty) aj. a na druhé straně se solemi vápenatými (např. atorvastatin vápenatý), sodnými, lithnými aj. Přibližně polovina všech substancí je uváděna na trh v podobě solí. Např. analgetikum propoxyfen bylo originálně formulováno jako hydrochlorid a užíváno spolu s aspirinem. Aspirin se však v přítomnosti propoxyfenu hydrochloridu snadno rozkládal, byl nestabilní. Teprve po přeformulování na propoxyfen napsylát (obr. 5.6.) se
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 9 h b e ke J
aspirin stabilizoval. Kromě toho propoxyfen napsylát má ve srovnání s propoxyfenem hydrochloridem
Obr.5.6. Propoxyfen napsylát monohydrát (Darvocet)
poloviční orální toxicitu, jak bylo zjištěno na krysách a myších, a delší dobu účinku (jiný farmakokinetický profil). V poslední době je snahou kontrolovat prenukleační a nukleační mechanismy přímo v molekulárním měřítku. K tomuto účelu se využívají různé, nukleaci vyvolávající povrchy, např. polymery, Blodgett-Langmuirovy filmy, grafit, specificky orientované krystalové plochy substrátů atd. Tyto povrchy specificky interagují s prenukleačními klastry. Pokud má určitý polymorf podobnou geometrii mřížky jako substrát, nastává epitaxiální růst. U polymorfu, který vůči substrátu vykazuje značnou mřížkovou inkoherenci (nesouměřitelnost) se růst zablokuje. To znamená, že substrátový povrch má zde funkci polymorfně selektivní. Jako příklad lze uvést selektivní nukleaci 6 konformačních polymorfů 5-methyl-2-[(2-nitrofenyl)amino]-3-thiofencarbonitrilu na různých plochách monokrystalu kyseliny pimelové. K farmaceutické výrobě se zpravidla vybere termodynamicky nejstabilnější polymorf (příp. hydrát nebo solvát), u kterého je zaručena reprodukovatelnost výrobních šarží a stabilita jak při formulaci, tak do expirace lékové formy. Termodynamicky nejstabilnější polymorf vyplývá z fázového diagramu soustavy energie-teplota. Generické firmy, právě z důvodu obcházení patentové ochrany, volí někdy polymorf méně stabilní, resp. jiný solvát, sůl nebo amorfní fázi. Metastabilní a amorfní formy mají na jedné straně vyšší rozpouštěcí rychlosti ve srovnání s nejstabilnější fází, což vede k rychlejšímu nástupu účinku léčiva, ovšem na druhé straně je nutné počítat s přísnou technologickou kázní při robustní výrobě a lékové formulaci, horšími mechanickými vlastnostmi, obtížnějším analytickým stanovením a kratší dobou expirace.
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz 5.2.4. Vlastnosti polymorfů t n kov é š raz elů za e Ačkoliv je biologický e s cílovým č jléčiva P úmolekuly k vinterakcí ň API ovyvolán l um účinek receptorem (vytvořeníkkomplexu droga/receptor), kdy se především vlivem a konformačních p s r o y m o chemismus změn ovlivní přirozený je pacientovi d Vbuňky, je důležiténýv jaké upevné taleo i formě léčivo podáváno.dTo znamená, žeůzáleží nejenom na imolekulové, krystalové struktuře a jrychlostu rozpouštění to struktura totižorvýrazně ovlivňuje API. Krystalová léčiva a tím jeho n k s e b farmakokinetický profil (obr. 5.6.) a biodostupnost. í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 10 h b e ke J
Obr.5.6. Farmakokinetický profil léčiva
Různé polymorfy se u jedné API mohou lišit v rychlosti rozpouštění až o řád, (např. premafloxacin I/III nebo chloramfenikol A/B viz obr. 5.7. ), takže se u nejméně rozpustné (nejstabilnější) formy nedosáhne ani minimální léčivé koncentrace. Průměrná hodnota poměru rozpouštěcích rychlostí dosahuje mezi polymorfy různých API okolo 2, ale i to
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d u (A, B) ůprofily dvou polymorfů in chloramfenikolu o a j r t Obr.5.7. Farmakokinetické o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 11 h b e ke J
může výrazně ovlivnit biodostupnost léčiva. Na druhé straně amorfní forma může mít až 10x větší rozpouštěcí rychlost než nejstabilnější polymorf. Velké rozdíly v rozpustnosti a rozpouštěcí rychlosti polymorfů mohou být příčinou velkých rozdílů v jejich distribuci v organismu. Nízká plasmatická koncentrace může způsobit, že se neúplně obsadí příslušné membránové receptory v místě účinku a jsou zablokovány substrátem nebo že se změní charakter účinku z agonisty na antagonistu nebo naopak. Rychlost rozpouštění není jediným důležitým parametrem, ve kterém se polymorfy liší. Rozdíly ve velikosti a tvaru krystalů ovlivňují mlecí, tabletovací, filtrovací, sypné a další důležité technologické parametry. Rozdíly nalézáme i v chemické reaktivitě, termální stabilitě, hydroskopicitě, hustotě, tvrdosti atd. (Tab. V.4.). Tabulka V.4. Hlavní vlastnosti, ve kterých se polymorfy liší a jejich dopad na farmakologické a výrobní parametry
Vlastnost rozpustnost, disoluční profil velikost a tvar krystalů chemická reaktivita termální stabilita hydroskopicita hustota tvrdost barva bod tání
Odpovídající parametry farmakokinetický profil, biodostupnost mletí, tabletace, filtrovatelnost, sypnost stabilita vůči excipientům expirace expirace suspenzní formulace, lyofilizace mletí léková formulace stabilita
o k ja é a k r c to vlastností gi Ačkoliv zatím není známo, že by podcenění, resp. zanedbání rozdílných u polymorfů způsobilo neštěstí podobné „conterganové aféře“ v 50.a letech 20. stoletílo o (plodové malformace způsobené záměnou enantiomeru), farmaceutické firmy jsou velmi m n l s výskytem e problémům h opatrné. Např. firma Abbott Laboratoires, kvůli nezvládnutým á s c i a r e l polymorfismu u ritonaviru, léková forma Norvir (inhibitor HIV-proteasy), byla t nucena po ní e formu. h t třech letech prodeje k přeformulování pevné lékové formy na kapalnou o a k přeměn přímo ře ou m Na významu nabývá rovněž sledování případných polymorfních c í s i š í e v lékové formě během expirace a studium faktorů, které tuto transformaci mohou vyvolat í s tablet:ikomprimace jn emv suchém stavulšnebo í (např. použití různých technologií při lisování h ovlivnit di apřítomnéno ž APIuvdtabletě cmohou vlhká granulace). Polymorfní transformace u á yse může a excipienty a jejich vlastní polymorfismus, vyskytovat v několika lo ýnapř.stmanitol z l . s á o zevlastnostmi. krystalových formách, které se lišít strukturou i technologickými m k k v a n e ko é š Pra čelů e z mpro identifikaci ň oka stanovení j l ú u v 5.2.5. Analytické techniky polymorfů a p s k o r y m o o d t ý V Vzhledemdk rozdílům v krystalové struktuřein a vlastnostech u polymorfů existuje i ů o a j r t velký počet technik pro jejich identifikaci, rozlišení a stanovení. Některé jsou o stanovení n analytických k nebosuhustoty. Podstatné je však, které e b velmi citlivé, jiné méně - např. bodu tání í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 12 h b e ke J ®
analytické techniky jsou uznávány regulačními autoritami. Podle směrnice FDA (Food and Drug Administration) ICH Q6A k nim patří: • • • • • • •
RTG prášková (fázová) analýza Spektroskopie pevného stavu (NMR, IČ, Ramanova) Termální analýza (TGA, DSC, mikrokalorimetrie) Mikroskopie (optická, termooptická, SEM, AFM) Mikrometrie (granulometrie, povrch částic, porozita, hustota) Stanovení rozpustnosti a rozpouštěcí rychlosti Sorpce/desorpce vlhkosti
Nejpoužívanější metodikou je RTG prášková analýza. RTG difraktogramy různých pevných forem mají odlišné RTG práškové difraktogramy (obr.5.8.). Podobně je tomu i u ostatních metodik. Kromě toho je samozřejmě uznávána i RTG strukturní analýza z monokrystalu. Ovšem krystalická API je vyráběna ve formě polykrystalického prášku o zrnitosti 10-50 µm. K rutinní RTG strukturní analýze však potřebujeme monokrystal o velikosti řádově 0,1 mm (výjimečně stačí i okolo 0,01 mm). Vypěstování monokrystalu od určitého polymorfu může být někdy problém. Z výsledků RTG monokrystalové strukturní analýzy je možné vypočítat teoretický RTG práškový difraktogram a porovnat ho s experimentálně získaným RTG práškovým difraktogramem výrobní šarže. Tak je např. monitorována shoda, že je vyráběn požadovaný polymorf . Vedle validovaných analytických technik jsou vyvíjeny i jiné postupy. K velmi zajímavým patří metodika tzv. skanovací transitiometrie (spojení kalorimetrie a dilatometrie), kdy se kontinuálně mění tlak a/nebo teplota (typické skanovací rychlosti: T: 8x10-4 K.s-1, p: 2 kPa.s-1 ) a měří se přímo objemové, entalpické a tlakové změny indikující polymorfní přechody. Validované analytické techniky musí, kromě stanovení čisté API, být schopné stanovit polymorf také v lékové formě – nejčastěji v tabletě. Zde samozřejmě ruší excipienty a pokud není k dispozici v celém spektru (záznamu) vhodné „okno“, ve kterém registrujeme signál pouze od substance a které je pro substanci dostatečně reprezentativní,
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 13 h b e ke J
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c Obr. 5.8. RTG práškové difraktogramy různých pevných foremafananserinui (antidepresivum) l ter -te í h n o a u e o m ick ř í potom je identifikace a stanovení nemožné (obr.5.9).s š e kterýchjnjeí nutném í Regulační autority vypisují detekční limity, dosáhnout při stanovení s š i hVelmi e citlivá je Ramanova l o í k vyššídcitlivosti. polymorfů. Ty se samozřejmě stále zpřesňují a ž c čistoty. I RTGd prášková n u polymorfní spektroskopie, kde se udává detekčníou limit 0,1% t á y a s l precizována z l ePhilips analýza byla pro farmaceutické aplikace firmou ke stejnému álimitu. . s o ý t m k byl k azo různých Měřením směsí dvou forem azithromycinu (antibiotikum) koncetracích a n ov formy š ů l z dosažen detekční limit 0,1%eformy IIkvedle I. Podobně obdivuhodný je r če je dosažený é P k m ň detekční limit 1 % při stanovení amorfní (excipient) její krystalické ú rvedle o laktosy u pl spodílu v a fáze nalezený rovněž k RTG difrakcí. m to o do Vy ý d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 14 h b e ke J
Obr. 5.9. RTG difraktogram čisté API (atorvastain, forma I) a difraktogram její lékové formy (Sortis®, Pfizer). Příslušné registrační okno je znázorněno oválem. Ostatní difrakční linie API jsou v tabletě překryty difrakcemi excipientů nebo pozadím
Zajímavou metodikou pro „screening“ a identifikaci polymorfů je kapilární technika. Tímto způsobem je možné provádět polymorfní přeměny v jedné kapiláře a měřit charakteristiky polymorfů in situ.
o k ja é a k r Finální léková formulace musí být sestavena s ohledem na zvolený polymorf. Jestliže c o (např. gi texpirace je zvolen nestabilní polymorf, pak má během výroby lékové formy i během u a hrozí přechodolo v tabletě) tendenci přecházet na nejstabilnější polymorf. Při mokré granulaci na stabilnější hydrát, při tabletaci může dojít k polymorfnímu přechodu vloženého m vlivem n l e h tlaku, při zvýšené teplotě (sušení) hrozí desolvatace atd. Solvatační a desolvatační procesy á s c a eri přeměnu mění velikost částic, což také ovlivní biodostupnost. lPolymorfní te mohou ní h t „katalyzovat“ i excipienty, které mohou být rovněžupolymorfní. Protože o polymorfní ře a k o transformace může dramaticky změnit vlastnostis výsledného m léčiva, c je proto velmiší i í e důležité, aby v hotové formulaci byla monitorována polymorfní čistota (viz podkap. í n m s j š i e l í 5.2.5.). a no h stabilizovány dpřídavkem ž ud formulaci c Metastabilní a amorfní formy musíubýt v lékové á o ss tnejstabilnější y formou. a stabilizátorů pro dosažení srovnatelnélexpirace Taková stabilizace z l . s ánapř. o vezvhodném ý kAPI e může být dosažena vytvořenímt pevné vdisperze polymeru, m k a n š (PAA) ů z inhibovat polyvinylpyrrolidon (PVP) ae kyselinaopolyakrylová a majíelschopnost r é k krystalizaci amorfního acetaminofenu č efektjespočívá jednak k v PStabilizační ň (paracetamolu). l ú o ums polymerem v chemické interakcikAPI a potom v antiplastickému aefektu polymeru. p s r o y m Fázový přechod je o totiž spojen d s plastickou to kurz Úvod do studia ý u(viz V deformacínmateriálu d materiálů). ji u a rů to o n k í las t ob Te i ž uh u i u d o so u p t s o ez h e b 15 k Je 5.3. Polymorfy v lékových formách
o k ja é a k r c i to g u a lo o m l n e h á s c a eri te l í h at o n u e o m ick ř í s š e j ní m í s š l o í di h e a ž d án u stu y c o a sl ý kol e. m káz t en kov é š Praz čelů e za m lň ok v j ú u a p s k o r y m o o d t ý V d ů in au o j r t o n k su e b í o T it hla ž u i u ou d o p zs tu s o e 16 h b e ke J
