Proteomická analýza
Historické mezníky 1838
Název protein - Berzelius
1819-1904
Objevena v tšina aminokyselin
1926
Sumner – krystalizace ureázy v istém stavu – katalytický inek
1933
Tiselius – elfo jako metodika lení protein
1942
Martin a Synge – vývoj chromatografických technik
1951
Pauling a Corey – sekundární struktury protein
1955
Sanger – aminokyselinové složení insulinu
1963
Monod a spol. – alosterické zm ny v konformaci protein
PROTEIN J. J. Berzelius 1838 Proteios PROTEOMIKA Marc Wilkins 1994 PROTEOM Kompletní sada bílkovin p ítomných v daném okamžiku v bu ce, nebo tkáni, zahrnující veškeré jejich modifikace, vzájemné interakce, lokalizaci a metabolický obrat. PROTEOMIKA • kvantitativní a kvalitativní charakterizace úplné sady bílkovin organely, bun né linie, tkán nebo organismu • kvantitativní a kvalitativní porovnání proteomu za r zných podmínek
Vnit ní parametry Genetické dispozice
Vn jší parametry
Stárnutí
Onemocn ní
Lé iva
Životní prost edí
Bu ka
Geny
Genová analýza • SNP •Mutace •Sekvenace
mRNA
Proteiny
Analýza exprese
Analýza interakcí
•mRNA •Protein
• ProteinProtein-protein •AntigenAntigen-protilátka •EnzymEnzym-substrát •ProteinProtein-DNA •LigandLigand-receptor
Co je to proteomika? decký obor studující proteiny Proteomika PROTEin+genOME
Genomika Exprese
Genom
Proteom +posttransla ní modifikace +alternativní sest ih +alternativní zavinutí
Souhrn všech protein v daném organismu
Souhrn všech gen v daném organismu
Lidské t lo obsahuje miliony protein
Lidský genom obsahuje 20-25.000 gen
Exprese protein v rámci jednoho organismu se liší v r zných ástech t la, v r zných stádiích životního cyklu a v r zných podmínkách prost edí
Genom je konstantní celek
Cíle proteomiky Získat globální a integrovaný pohled na biologii studiem kompletní bílkovinné sít bu ky, spíše než studiem jednotlivých protein . Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zárove pochopit jejich funkci a strukturu a vytvo it 3D mapu bu ky (ur it lokalizaci jednotlivých bílkovin).
íklady obecných funkcí protein • • • • • • • • •
Enzym Strukturní protein Transportní protein Pohybový protein Zásobní protein Signální protein Receptorový protein Regula ní protein v genové expresi Proteiny se zvláštním posláním
Pro proteomika když máme genomiku? • nelze ur it funkci proteinu na základ sekvence DNA nebo mRNA • nelze popsat molekulární mechanismy pomocí studia genomu • 200 typ posttransla ních modifikací • existuje alternativní translace • !!!! špatná korelace hladin mRNA a skute ných hladin bílkovin !!! PRO PROTEOMIKA KDYŽ MÁME GENOMIKU ? PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁ EJÍ FENOTYP !
Jeden gen, mnoho bílkovin
Centrální dogma molekulární biologie
Základním stavebním kamenem bílkoviny je aminokyselina
Od RNA k proteinu • Jazyk RNA se p ekládá do jazyka protein . Genetický kód nazýváme tripletový, protože t i nukleotidy v RNA specifikují jednu aminokyselinu v proteinu • RNA se sestává ze ty „písmen“: A,U,G,C
Tripletový kód
• Genetický kód je tripletový • AUG je startovní kodón, kóduje metionin • UAA, UAG, UGA jsou stop kódony • Genetický kód je degenerovaný: ve tšin p ípad je jedna aminokyselina kódována víc než jedním tripletem (max. 6)
Genetický kód byl rozlušt n na po átku šedesátých let XX. století
Rozlušt ní genetického kódu • 1961: Marshall Nirenberg vytvo il um lou mRNA, která se sestával ze samých uracil : UUUUUUUUUUUUUUUU atd. • výsledkem translace byla bílkovina, sestávající ze samých fenylalanin : phe-phe-phe-phe atd. • Nirenberg uzav el: kodón UUU kóduje fenylalanin • do 1965 byl znám celý genetický kód
Genetický kód se musel vyvinout velmi dávno • Genetický kód je (tém ) univerzální, sdílí jej celá živá p íroda, od nejjednodušších bakterií po savce • p íjemným d sledkem je, že díky technikám genových manipulací jž dnes baktérie vyrábí látky d ležité pro lov ka (nap . insulin, STH)
Rostlinka tabáku, do které byl vložen gen pro luciferázu od sv tlušek.
Genetický kód se musel vyvinout velmi dávno Do t chto prasat byl vložen gen z medúzy a prasata ve tm sv télkují
Mitochondriální kód se v p ti trojicích liší
tecí rámec • kódony mezi sebou nemají mezery, ale p esto jsou teny jako t ípísmenková „slova“. tecí rámec specifikuje první písmeno, od kterého za ínáme íst a dává nám smysl ty: • d d jed med dj edm ed • anglická verse: – The red dog ate the cat – her edd oga tet hec at – nebo Why did the red bat eat the fat rat? – W hyd idt her edb ate att hef atr at
Translace v eukaryotické bu ce • Strukturní gen je epsán do pre-mRNA • Pre-mRNA je upravena do mRNA • mRNA opouští jádro • Na ribozómech podléhá mRNA translaci a vzniká polypeptidový et zec
V prokaryotické bu ce je transkripce spojena s translací
Iniciace translace
Elongace polypeptidového et zce Elongace za íná p len ním aminoacyl-tRNA ke správnému kodonu na A míst ribozomu
Elongace translace
Terminace translace
Na stop kodon se navazuje bílkovina zvaná „release factor“ a syntéza polypeptidu je ukon ena. Nov vzniklý polypeptid se uvolní od tRNA; tRNA se uvolní z ribozómu a dv ribozomální podjednotky se uvolní od mRNA
Syntéza polypeptidu pokra uje dokud není dosaženo stop kodonu
Terminace translace
Polysomy • Danou mRNA m že v daném ase íst více ribozóm • Tímto zp sobem je možné vytvo it sou asn mnoho polypeptid z jediné mRNA
Iniciace
Elongace
Terminace
Polyribozómy
Signální peptidy ur ují práv vzniklým protein m jejich bun nou destinaci
Signální peptid • signální peptid je tvo en sekvencí cca 20 aminokyselin na nebo poblíž N-konci vznikajícího peptidu • signální peptid je rozeznán tzv. SRP ásticí (signal-recognition particle). Tato ástice poutá peptid a ribosom k receptorovému proteinu v membrán ER. • receptorový protein v sob obsahuje pór, kterým peptid pronikne do ER. Enzymy potom signální peptid obyvkle odstraní • Ubikvitinylace
Transkripce a translace v eukaryotické bu ce ehled
Srpkovitá anémie
Nár st diverzity protein Posttransla ní modifikace Alternativní sest ih Alternativní zavinutí
Primární transkript mRNA p ed posttranskrip ní modifikací Alternativní sest ih
Posttransla ní modifikace Alternativní zavinutí
Posttransla ní modifikace Chemická modifikace protein po translaci 1. P ipojení funk ních skupin (acetát, fosfát, lipidy, cukry) 2. Modifikace amino skupin 3. Strukturní zm ny (tvorba disulfidických vazeb, proteolytické št pení)
Alternativní sest ih Z primárního transkriptu (1 genu) vzniká více mRNA a tedy více r zných protein
Alternativní zavinutí Protein se zavinuje tak, aby byla co nejmenší jeho volná energie Existuje však n kolik alternativních konformací.
Lokální minima (alternativní konformace) Globální minimum (nativní stav)
Schéma sou asné proteomiky
Sm s protein
Základní schéma analýzy užívané v proteomice 1. Separace 2D-PAGE
2. Izolace Št pení trypsinem
Jednotlivé proteiny
Peptidy 4. Sekven ní analýza Fragmentace peptid
3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie
Sekvence peptid 5. Porovnání s databází
Identifikace protein
Hmotnostní spektra peptid
Aplikace proteomiky v medicín (proteomika nemocí) Úloha protein ve vzniku nemocí
Exprese protein u nemocí
Biomarkery nemocí
Detekce protein vznikajících b hem nemoci je využita k diagnóze Alzheimerova choroba (amyloid ) Srde ní onemocn ní (interleukin-6 a 8, sérový amyloid A, fibrinogen, troponiny) Renální bun ní karcinom (karbonanhydrasa IX)
Vývoj nových lék
Informace o proteinech zp sobující onemocn ní je využita pro vývoj nových lék 1. Známá 3D struktura proteinu-po íta ová simulace-hledání léku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývoj individuálních lék
Úloha protein ve vzniku nemocí Alzheimerova choroba (AD) Neurodegenerativní onemocn ní charakterizované ztrátou neuron a synapsí Neuropatologické znaky jsou amyloid ß v senilních placích a neufibrilární vlákna intracelulárn Oxida ní stres Nerovnováha mezi tvorbou volných radikál a antioxida ním systémem sledky: Oxidace protein , lipid , DNA a cukr Oxidace protein Št pení peptidového et zce (Karbonyly protein )
Oxidace Ak zbytk (Nitrotyrosin)
Navázání produkt peroxidace lipid i glykoxidace
Schéma pokusu
Úloha protein ve vzniku nemocí
Výsledek Potvrzení úlohy oxida ního stresu u Alzheimerovy choroby Posttransla ní modifikace protein v mozku navozená oxida ním poškozením ispívá k rozvoji AD Identifikace poškozených protein , které jsou potenciální cíle pro lé bu
Biomarkery nemocí Plasmatické biomarkery u AD Diagnóza AD Klinické projevy+post mortem (histologie) Není žádný spolehlivý diagnostický test (cerebrospinální tekutina-CSF se špatn získává) Periferní krev Asi 500 ml CSF je absorbováno do krve každý den Plasma by mohla být zdroj biomarker Identifikace diagnostických biomarker v periferní krvi za pomocí proteomiky: Vzorky krve pacient s AD a kontrol byly analyzovány za pomocí 2D gelové elektroforézy Byly identifikovány body, které se lišily u pacient a kontrol Tyto proteiny byly analyzovány pomocí hmotnostní spektroskopie
Výsledek 15 bod signifikantn odlišných u nemocných a kontrol Analýza pomocí MS: nap . α2 makroglobulin, komplement faktor H
Vývoj nových lék Informace o proteomu vedou k identifikaci protein zp sobující onemocn ní 1. Po íta ový software tyto proteiny využije jako cíle pro vývoj nových lék Nap . protein zp sobující onemocn ní-3D struktura-po íta vyvine látku, která ho inaktivuje (navázání na aktivní místo inaktivuje enzym) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-po íta vyvine individuální lék, který je efektivn jší
Virtual ligand screening HIV 1-proteasa Št pí HIV protein na menší funk ní proteiny; virus nep ežije bez tohoto enzymu (nejvýznamn jší cíl lé by HIV)
Souhrn Proteomika studuje proteiny, hlavn jejich strukturu, funkci a interakce Genom byl již zmapován, nyní je na ad proteom (miliony protein ) Metod, které proteomika využívá je velké množství, mezi základní pat í 2D gelová elektroforéza a hmotnostní spektroskopie Proteiny ur ují fungování organismu a jejich patologie spouští nemoci; proto je proteomika zásadní pro zjiš ování p in chorob, diagnózu a lé bu
Proteinové databáze • www.expasy.ch
