campuran CH3COONa dengan H3BO3, dan NaOCH3. Data pergeseran pita serapan sebelum dan sesudah ditambahkan pereaksi geser menentukan jenis senyawa golongan flavonoid.
tabung reaksi lalu ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol, dan dikocok kuat. Uji positif flavonoid menghasilkan warna kuning atau jingga pada lapisan amilalkohol.
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Uji Golongan Flavonoid (Harborne 1987)
Alkaloid Sebanyak 0.1 g ekstrak dilarutkan dalam 10 mL CHCl3 dan 4 tetes NH4OH. Larutan disaring dan filtratnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak CHCl3 dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2 M dan lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner, dan DragendoRf yang akan menimbulkan endapan berturut-turut berwarna putih, cokelat, dan merah jingga jika terdapat alkaloid.
Sebanyak 0.5 g ekstrak dilarutkan dengan 10 mL metanol-HCl 1 N (1:1) dan dipanaskan pada suhu 95 °C selama 1 jam. Setelah itu, didinginkan dan disaring, lalu filtratnya diekstraksi dengan etil asetat.
Saponin Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian dikocok selama 10 detik dan didiamkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil. Triterpenoid dan Steroid Sebanyak 0,1 g ekstrak dilarutkan dengan 25 mL etanol panas (50 °C). Larutan disaring dalam pinggan porselen dan diuapkan sampai kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak eter dipindahkan ke dalam lempeng tetes. Kemudian ditambahkan 3 tetes anhidrida asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (uji Lieberman-Buchard). Warna merah atau ungu menunjukkan kandungan triterpenoid, sedangkan warna hijau atau biru menunjukkan kandungan steroid. Tanin Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 mL air panas, dididihkan selama 5 menit, dan disaring. Sebagian filtrat yang diperoleh ditambahkan larutan FeCl3 1%. Hasil positif ditunjukkan oleh warna hijau kehitaman. Flavonoid Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam
Antosianidin Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat ditambahkan 3 tetes CH3COONa lalu diamati, kemudian ditambahkan 3 tetes FeCl3 dan diamati lagi. Antosianidin dengan CH3COONa memberikan warna merah atau ungu dan bila ditambahkan FeCl3 menjadi biru. Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat ditambahkan Na2CO3 lalu diamati. Antosianidin memberikan warna ungu, biru, atau hijau. Flavon, Kalkon, Auron, dan Flavonol Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat ditambahkan 3 tetes CH3COOPb lalu diamati warnanya. Flavon memberikan warna jingga hingga krem, kalkon memberikan warna jingga tua, dan auron memberikan warna merah. Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat ditambah 3 tetes NaOH 0,1 N lalu diamati warnanya. Flavon memberikan warna kuning, flavonol memberikan warna kuning, jingga hingga krem, dan kalkon memberikan warna krem hingga merah tua.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Penentuan kadar air dilakukan dengan metode gravimetri evolusi tidak langsung. Bobot air dihitung setelah proses pengeringan dengan suhu 105 °C pada periode waktu tertentu sampai diperoleh bobot yang konstan. Menurut Harjadi (1993), air yang terikat secara fisik dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 100–105 °C. Salah satu kegunaan penentuan kadar air adalah untuk mengetahui ketahanan suatu bahan dalam penyimpanan.
4
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk daun dandang gendis. Kadar airnya diperoleh sebesar 9.74% (Lampiran 2). Menurut Winarno (1997), sampel dapat disimpan dalam jangka waktu lama jika memiliki kadar air di bawah 10%. Nilai kadar air yang diperoleh kurang dari 10%. Hal ini menunjukkan bahwa sampel memiliki masa simpan yang relatif lama. Isolasi Senyawa Golongan Flavonoid Tahap pertama dalam isolasi senyawa golongan flavonoid adalah maserasi sampel dengan pelarut etanol 70%. Etanol 70% digunakan karena flavonoid bersifat polar, dengan sejumlah gugus hidroksil, baik yang terikat ataupun yang tidak terikat gula (Markham 1988). Selain itu, berdasarkan Macari et al. (2006), aktivitas antioksidan tanaman obat dalam etanol 70% lebih tinggi dibandingkan dengan beberapa pelarut lainnya. Maserasi dilakukan berulang kali sampai filtrat tidak berwarna hijau lagi, sehingga dapat dianggap semua senyawa yang berbobot molekul rendah telah terekstraksi (Harborne 1987). Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap putar sehingga diperoleh ekstrak kasar etanol. Rendemen yang dihasilkan dari 200.04 g serbuk daun dandang gendis yang dimaserasi adalah 31.24 % (Lampiran 3). Ekstrak daun dandang gendis kemudian dipartisi cair-cair menggunakan pelarut nheksana untuk menghilangkan kandungan lemak. Tahapan selanjutnya adalah hidrolisisasam terhadap ekstrak bebas-lemak. Hidrolisis bertujuan memutus gula dari aglikon flavonoid. Hasil hidrolisis kemudian dipartisi dengan etil asetat untuk memisahkan aglikon flavonoid dengan gulanya. Aglikon flavonoid akan berada dalam fraksi etil asetat dan gula dalam fraksi air (Markham 1988). Pemisahan aglikon flavonoid dilakukan dengan KLT preparatif menggunakan eluen BAA dengan nisbah 4:1:5 (Markham 1988). Noda pemisahan diamati di bawah lampu UV 254 nm, dan diperoleh 3 noda (Gambar 4). Nilai Rf untuk fraksi 1, 2, dan 3 berturutturut adalah 0.25, 0.52, dan 0.85. Setiap fraksi dikerok, kemudian dilarutkan dengan etanol hingga jumlah setiap fraksi mencukupi untuk analisis kualitatif, uji aktivitas antioksidan, dan analisis senyawa golongan flavonoid.
F3 Rf 0.85 F2 Rf 0.52 F1 Rf 0.25
(a)
(b)
Gambar 4 Noda pemisahan di bawah lampu UV 254 nm: KLT (a), KLT preparatif dengan eluen BAA (b). Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat dan ketiga fraksi hasil KLT preparatif dilakukan dengan metode DPPH (Lampiran 4). Metode ini dipilih karena mudah digunakan, cepat, dan cukup teliti (Prakash 2001). Aktivitas antioksidan metode DPPH dinyatakan dengan nilai IC50, yakni konsentrasi sampel yang mampu menghambat aktivitas DPPH sebesar 50%. Ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 178.40 mg L-1. Fraksi 2 (F2) hasil KLT preparatif menunjukkan nilai IC50 yang paling kecil, yakni 52.93 mg L-1. Semakin kecil nilai IC50, semakin tinggi pula aktivitas antioksidan (Molyneux 2004). Fraksi 1 (F1) dan fraksi 3 (F3) memiliki aktivitas antioksidan yang kecil. Nilai IC50 cukup besar yakni 43932.07 mg L-1 dan 9226.48 mg L-1. Menurut Hanani et al. (2005), suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi jika memiliki nilai IC50 kurang dari 200 mg L1 . Namun, jika dibandingkan dengan BHT sebagai kontrol positif, aktivitas antioksidan F2 masih lebih rendah. Nilai IC50 untuk BHT sebesar 16.71 mg L-1 (Tabel 3). Tabel 3 Aktivitas antioksidan Larutan uji IC50 (mg L-1) BHT 16.71 Ekstrak etil asetat 178.40 F1 43932.07 F2 52.93 F3 9226.48 Golongan Flavonoid Fraksi Aktif Analisis F2 sebagai fraksi teraktif dari ekstrak daun dandang gendis dilakukan
5
dengan merekam spektrum UV-tampak. Identifikasi senyawa golongan flavonoid didasarkan pada perubahan panjang gelombang setelah ditambahkan pereaksi geser (Lampiran 5). Spektrum UV-tampak F2 dalam pelarut metanol (Gambar 5) menunjukkan serapan maksimum pita 1 pada panjang gelombang 332 nm dan pita 2 pada panjang gelombang 274 nm.
A b s o r b a n s
Panjang gelombang (nm) NaOCH3 NaOCH3 setelah 5 menit
Gambar 6 Spektrum F2 dengan penambahan pereaksi geser NaOCH3 dan NaOCH3 setelah 5 menit.
Panjang gelombang (nm)
Gambar 5
A b s o r b a n s
Spektrum F2 dalam pelarut metanol. Berdasarkan puncak serapan pada pita 1 dan 2, F2 diduga merupakan senyawa flavonoid golongan flavon atau flavonol. Menurut Markham (1988), flavon dan flavonol memiliki serapan maksimum pita 2 di 250–280 nm. Sementara untuk pita 1, flavon memiliki serapan maksimum pada 310 –350 nm dan flavonol pada 330–360 nm. Pita 1 berasal dari cincin B dan C, dan pita 2 berasal dari konjugasi pada cincin A. Penambahan pereaksi geser NaOCH3 pada F2 menyebabkan pergeseran batokromik sebesar 64 nm pada pita 1 (Gambar 6). Markham (1988) melaporkan bahwa pergeseran serapan maksimum sebesar 45–65 nm dengan kekuatan serapan yang tidak menurun menunjukkan adanya gugus hidroksil di C-4'. Karena itu, dapat disimpulkan bahwa senyawa flavonoid pada F2 memiliki gugus hidroksil pada C-4'. Selain itu, terbentuk pita baru pada 326.5 nm yang menunjukkan adanya gugus hidroksil di posisi C-7. Menurut Markham (1988), pita serapan baru pada 320–335 nm muncul jika terdapat gugus hidroksil pada C-7.
Tidak terdapatnya gugus hidroksil di C-3 ditunjukkan dengan tidak adanya pergeseran batokromik pada pita 1 sejauh 50–60 nm (Markham 1988) pada spektrum AlCl3/HCl (Gambar 7). Tidak adanya gugus hidroksil pada C-3 manunjukkan bahwa F2 merupakan senyawa flavonoid golongan flavon. Pergeseran batokromik sejauh 17 nm pada pita 1 menunjukkan adanya gugus hidroksil di posisi C-5. Penambahan AlCl3 akan membentuk kompleks dengan gugus hidroksil di C-5 dan gugus karbonil sehingga terjadi geseran batokromik. Tidak terbentuknya kompleks antara AlCl3 dengan gugus odihidroksi pada cincin B menyebabkan tidak teramati geseran hipsokromik yang diakibatkan penguraian kompleks tersebut ketika ditambahkan HCl (Markham 1988). A b s o r b a n s
Panjang gelombang (nm) AlCl3 AlCl3/HCl
Gambar 7 Spektrum F2 setelah penambahan pereaksi AlCl3 dan AlCl3/HCl.
6
Penambahan pereaksi CH3COONa menyebabkan pergeseran batokromik sejauh 8.5 nm (Gambar 8) pada pita 2 yang menunjukkan adanya gugus hidroksil di C-7. Berdasarkan Markham (1988), intensitas yang tidak menurun menunjukkan tidak adanya gugus yang peka terhadap basa, seperti 6,7diOH; 7,8-diOH dan 3',4'-diOH. Pada spektrum dengan penambahan H3BO3 (Gambar 8), tidak terjadi pergeseran batokromik yang menunjukkan tidak adanya gugus o-diOH pada cincin A dan B. Pergeseran batokromik sejauh 12 sampai 36 nm pada pita 1 akan terjadi jika ada gugus tersebut (Markham 1988).
(Gambar 9) lebih baik karena hanya menunjukkan satu noda tunggal. Karena itu, dapat ditarik simpulan bahwa F2 merupakan senyawa flavonoid golongan flavon.
Eluen 1 BAA
Eluen 2 BEA
Gambar 9 Kromatogram 2 arah F2 dengan eluen BAA dan BEA. A b s o r b a n s
Uji Fitokimia dan Golongan Flavonoid Uji fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol (Tabel 4), sedangkan uji golongan flavonoid dilakukan terhadap ekstrak etanol, ekstrak etil asetat, dan F2 (Tabel 5). Panjang gelombang (nm)
Tabel 4 Uji fitokimia ekstrak etanol
CH3COONa CH3COONa 5 menit H3BO3
Gambar 8 Spektrum F2 setelah penambahan pereaksi NaOMe, NaOMe 5 menit, dan H3BO3. KLT 2 arah dilakukan untuk menguji tingkat kemurnian F2. Dibandingkan dengan KLT 2 arah yang dilakukan Akbar (2010) yang menunjukkan dua berkas noda, hasil KLT 2 arah dengan eluen BAA dan BEA
Golongan senyawa
Hasil uji
Alkaloid Saponin Flavonoid Steroid Triterpenoid Tanin
+++ + +++ + -
Keterangan: (+) menunjukkan intensitas warna, (-) menunjukkan tidak terdapat senyawa tersebut dalam ekstrak etanol.
Tabel 5 Uji golongan flavonoid ekstrak etanol, etil asetat dan F2 Pereaksi
Ekstrak
F2
Golongan flavonoid
Krem Kuning
Krem Kuning
Flavon Flavon, flavonol
Jingga
-
Jingga Cokelat
Kuning kecokelatan Kuning Cokelat
Kuning Cokelat
-
Jingga
Kuning
Kuning
-
Etanol
Etil asetat
CH3COOPb NaOH 0,1 N
Krem Kuning
H2SO4
Cokelat
CH3COONa CH3COONa+FeCl3 Na2CO3
Keterangan : (-) Tidak terdeteksi adanya senyawa golongan flavonoid.
Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun dandang gendis mengandung senyawa tanin, steroid, flavonoid, dan saponin (Tabel 4). Uji golongan flavonoid terhadap ekstrak etanol,
ekstrak etil asetat, dan F2 menunjukkan senyawa flavon atau flavonol. Berdasarkan hasil identifikasi dengan sinar UV-tampak, dapat disimpulkan bahwa senyawa aktif antioksidan yang terkandung dalam daun
7
dandang gendis adalah flavon dengan gugus hidroksil yang terletak pada C-4', C-5, dan C7 (Gambar 10). OH
HO
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bermawi N, Kristina NN. 2003. Penyimpanan in vitro tanaman obat potensial. Perkembangan Teknol TRO 15:51-60.
O
Blois MS. 1958. Antioxidant determinations by the use of stable free radical. Nature 181: 1199-1200. OH
Gambar 10
O
Struktur senyawa flavonoid hipotesis F2.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak etil asetat daun dandang gendis memiliki aktivitas antioksidan. Fraksi 2 menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan dengan 2 fraksi lainnya dengan nilai IC50 sebesar 52.93 mg L-1. Hasil uji golongan flavonoid, dan spektrum UVtampak memperlihatkan bahwa fraksi 2 dihipotesiskan adalah senyawa flavonoid golongan flavon dengan gugus hidroksil yang terletak pada C-4', C-5, dan C-7. Saran Perlu diadakan analisis lebih lanjut dengan spektrometer inframerah, resonans magnetik inti 1H, 13C, dan spektrometer massa untuk mengidentifikasi senyawa pasti dalam fraksi 2.
DAFTAR PUSTAKA Akbar HR. 2010. Isolasi dan identifikasi golongan flavonoid daun dandang gendis (Clinachantus nutans) berpotensi sebagai antioksidan [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Hanani E, Abdul M, Ryany S. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Maj Ilmu Kefarmasian 2:127133. Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Kristio 2007. Tanaman obat Indonesia. http:// toiusd. Multiply. com/ journal? &page_start=160. [23 Mar 2010] Macari PdAT, Portela CN, Polhit AM. 2006. Antioxidant, cytotoxic, and UVBabsorbing activity of Maynetus guyanensis Klotzch (Celastraceae) bark extract. Acta Amazonica 36:513-518. Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Padmawinata K, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Techniques of Flavonoid of Identification. Molyneux P. 2004. The use of stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimazing antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol 26:211-219.
Amic D, Beslo D, Trinajstic N, Davidovic. 2003. Structure-radical scavenging activity relationship of flavonoids. Croatia Chem Acta 76:55-61.
Pannangpetch et al. 2007. Antioxidant activity and protective effect against oxidative hemolysis of Clinachantus nutans (Burm.f) Lindau. Songklanakarin J Sci Technol 29:1-9.
Andriani A. 2008. Uji potensi larvasida fraksi ekstrak daun dandang gendis terhadap larva instar III nyamuk Aedes aegypti [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
Prakash A. 2001. Antioxidant activity. Medallion Laboratories Analytical Progress 19(2).
8
