HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar

Nama

: Sani Pradasari Afifah

NIM

: 1112102000004

Tanda Tangan

:

Tanggal

: Ciputat, 22 September 2016

iii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAIY PEMBIMBING

Nama NIM

: Sani Pradasari

Studi Judul Skripsi

: Farmasi

Afifah

:11121*2000004

Program

:Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolia Meagguaakan lV1etode Spektrofotometri IIV-Vis

Disetujui oleh:

d

Pembimbing

I

Pembimbing

II

# t,

Supandi.I\C,Si.. Apt.

Zilhadia. M.Si." Apt.

NIP.

NrP. 1 9730 8222A0812A07

Mengetahui

Ketua Prodi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan


Dr. Nurmeilis. M.Si.. Apt

^)4,

NIP. 197404302005012003

iv

Ulttl Syarif,Hidayatullah Jakarta

IIALAMAN PENGESAHAN Skripsi ini diaiukan

oleh

:

Nama


NIM

:1112102000004

Program Studi

: Farmasi

Judul Skripsi

:Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolin Menggunakan Metode Spektrofotometri tIV-Vis

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan unfuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan IImu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWA}{ PENGUJI Pembimbing

I

Zilhadia, M.Si., Apt.

(

)

Pembimbing

II

Supandi, M.Si., Apt.

(

) )

Penguji

I

Drs.Umar Mansur, M.Sc., Apt

(

Penguji

II

Nurhasni, M.Si.

{@^ey-

Ditetapkan di

Ciputat

Tanggal

22 September 2016


ABSTRAK

Nama


NIM

: 1112102000004

Program Studi

: Farmasi

Judul

:Validasi

Metode

Penetapan

Kadar

Asam

Amino

Hidroksiprolin Menggunakan Metode Spektrofotometri UV-Vis Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil modifikasi prolin yang dikatalisis oleh enzim prolil-4-hidroksilase (P4H) pada saat proses posttranslasi protein. Hidroksiprolin adalah salah satu asam amino yang terdapat dalam gelatin dan menjadi salah satu parameter kualitas gelatin. Selain itu hidroksiprolin juga dapat digunakan sebagai parameter untuk khasiat pengobatan luka bakar. Dalam penelitian ini telah dilakukan validasi metode penetapan kadar asam amino hidroksiprolin menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Hasil validasi metode selanjutnya dapat digunakan untuk penetapan kadar hidroksiprolin dalam sampel gelatin. Proses analisis hidroksiprolin menggunakan reagen ehrlich (paradimetilamino-benzaldehid), larutan oksidan (Chloramin-T-hidrat), NaCl, isopropanol, dan buffer asetat/sitrat pH 6. Parameter metode validasi dalam penelitian ini meliputi uji linearitas, uji batas deteksi, uji batas kuantitasi, uji akurasi dan uji presisi. Berdasarkan hasil penelitian didapat panjang gelombang maksimum hidroksiprolin yaitu 563,5 nm. Hasil kurva kalibrasi pada rentang 3-18 ppm memiliki koefisien korelasi r=0,9991. Dan diperoleh persamaan regresi y=0,0312x-0,0026. Metode yang digunakan mempunyai batas deteksi 0,691 ppm dan batas kuantitasi 2,094 ppm. Metode analisis memiliki nilai presisi kurang dari ±2% sedangkan nilai akurasi (% diff) yaitu -0,386%. Hasil analisis sampel gelatin menunjukan semua sampel mengandung hidroksiprolin. Sampel pertama mengandung hidroksiprolin sebesar 8,277 ppm, sampel kedua mengandung hidroksiprolin sebesar 13,886 ppm, sampel ketiga mengandung hidroksiprolin sebesar 10,126 ppm, sampel keempat mengandung hidroksiprolin sebesar 17,038 ppm dan sampel kelima mengandung hidroksiprolin sebesar 10,500 ppm. Kata kunci

: gelatin, hidroksiprolin, spektrofotometri UV-Vis.

vi


ABSTRACT

Nama


NIM

: 1112102000004

Program Studi

: Pharmacy

Judul

: Validation of Analytical Method of Acid Amino Hydroxyproline by Method Spectrofotometry UV-Vis.

Hydroxyproline is a modified amino acid (proline) catalyzed by the enzyme prolil -4-hydroxylase (P4H) during the process of posttranslation protein. Hydroxyproline is one of the amino acids contained in gelatin and became one of the quality parameters of gelatin. Besides, hydroxyproline can also be used as a parameter for the efficacy of the treatment of skin burns. This validation method in this study used spectrophotometry UV-Vis. The validation result then can be used to assay hydroxyproline in gelatin. Hydroxyproline is analysed by ehrlich reagent (para-dimethylamino-benzaldehyde), oxidant solution (Chloramine-THydrat), NaCl, isopropanol, and buffer acetat/citrate pH 6. Parameter validation method in the study include test linearity, test detection limit, test quantitation limit, test accuracy and precision test. Based on the research results obtained hydroxyproline maximum wavelength is 563.5 nm. The results of the calibration curve in the range of 3-18 ppm has a correlation coefficient r=0.9991. And the regression equation y=0,0312x-0,0026. The method used has a detection limit of 0.691 ppm and limit of quantitation of 2.094 ppm. The method of analysis has precision values less than ±2% while the value accuracy (% diff) of -0,386%. The results showed all gelatin samples contained hydroxyproline. The first sample contains hydroxyproline amounted to 8.277 ppm, a second sample containing hydroxyproline amounted to 13.886 ppm, third sample containing hydroxyproline amounted to 10.126 ppm, a fourth sample contains hydroxyproline of 17.038 ppm and fifth samples containing hydroxyproline of 10,500 ppm. Keywords

: gelatin, hydroxyproline, spectrophotometry UV-Vis.

vii


KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, rasa syukur serta pujian senantiasa kita panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayat-Nya serta segala anugerah-Nya berupa kesehatan, pemikiran dan ide sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Salawat serta salam semoga selalu tercurah kepada junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, serta para sahabat dan pengikutnya yang senantiasa mengikuti sunnahnya hingga akhir zaman. Skripsi ini penulis susun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian akhir guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Adapun judul skripsi ini adalah “Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolin Menggunakan Metode Spektrofotometri UV-Vis”. Penulis menyadari bahwa skripsi ini tidak akan selesai dengan baik tanpa bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. H. Arief Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Kepala Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt selaku Pembimbing I dan Bapak Supandi, M.Si., Apt selaku Pembimbing II yang telah meluangkan waktu tenaga dan pikiran serta dengan

sabar

membimbing

dan

mengajari

sehingga

penulis

dapat

menyelesaikan skripsi ini. 4. Ayahanda tersayang Samsul Zaman Sari dan Ibunda tersayang Nani Maryani terima kasih atas doa yang selalu tercurah untukku, kasih sayang, semangat dan dukungannya yang memberikan kekuatan kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

viii


5. Adikku tersayang Faruk Katili Basyaroh dan Sanasiu Fafe Sabasam yang dengan canda tawanya mampu memberikan keceriaan dan semangat di harihari penulis. 6. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akdemika Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 7. Untuk ka yaenab, ka eris dan kakak-kakak laboran di Laboratorium Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah membantu mengoperasikan alat dan berdiskusi tentang skripsi ini. 8. Rekan-rekan Program Studi Farmasi kelas A dan C angkatan 2012 Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri. Terimakasih atas tawa ceria dan kebersamaannya selama ini. 9. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, saran, kritik, dan masukan sangat diharapkan demi penyempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan para pembaca.

Ciputat, 22 September 2016

Penulis

ix


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama


NIM

: 1112102000004

Program Studi

: Farmasi

Fakultas

: Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya

: Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASAM AMINO HIDROKSIPROLIN MENGGUNAKAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis

untuk dipublikasi atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di

: Ciputat

Pada Tanggal : 22 September 2016

Yang menyatakan

Sani Pradasari Afifah

x


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ...........................................................................................ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ..............................................iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ...............................................iv HALAMAN PENGESAHAN.............................................................................v ABSTRAK ...........................................................................................................vi ABSTRACT..................................................................................... ...................vii KATA PENGANTAR........................................................................................ viii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ....................x DAFTAR ISI........................................................................................................xi DAFTAR GAMBAR.......................................................................................... xiii DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xv BAB I PENDAHULUAN....................................................................................1 1.1 Latar Belakang Masalah ..................................................................1 1.2 Rumusan Masalah............................................................................4 1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................4 1.4 Manfaat Penelitian ...........................................................................4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA.........................................................................5 2.1 Asam Amino Hidroksiprolin ...........................................................5 2.1.1 Sumber Asam Amino Hidroksiprolin.....................................6 2.1.2 Analisis Asam Amino Hidroksiprolin ....................................6 2.2 Asam Amino ....................................................................................7 2.2.1 Pembagian Asam Amino........................................................8 2.2.2 Analisis Asam Amino Secara Umum.....................................8 2.3 Gelatin..............................................................................................9 2.3.1 Komposisi Asam Amino dalam Gelatin.................................9 2.4 Validasi Metode Analisa..................................................................10 2.4.1 Parameter Validasi Metode ....................................................11 2.5 Spektrofotometri UV-VIS................................................................14 2.5.1 Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS ...............................15 2.5.2 Tipe Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS .......................18 BAB III METODOLOGI PENELITIAN .........................................................20 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian..........................................................20 3.2 Alat dan Bahan.................................................................................20 3.2.1 Bahan......................................................................................20 3.2.2 Alat ........................................................................................20 3.3 Prosedur Penelitian ..........................................................................21 3.3.1 Penyiapan Bahan Baku dan Pereaksi .....................................21 3.3.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum 9 ppm ...............23 3.3.3 Validasi Metode .....................................................................23 3.3.4 Analisis Sampel Gelatin Secara Kuantitatif ...........................26 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................27 4.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ....................................27

xi


4.2

Validasi Metode ...............................................................................30 4.2.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas ......................30 4.2.2 Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ..................................32 4.2.3 Uji Kecermatan (Akurasi).......................................................32 4.2.4 Uji Keseksamaan (Presisi) ......................................................33 4.3 Analisis Sampel Gelatin...................................................................35 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..............................................................38 5.1 Kesimpulan ......................................................................................38 5.2 Saran ................................................................................................38 DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................................39 LAMPIRAN.........................................................................................................43

xii


DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1 Perubahan Asam Amino Prolin Menjadi Hidroksiprolin yang Dikatalis Oleh Enzim Prolil 4 Hidroksilase....................................5 Gambar 2.2 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol..................................7 Gambar 2.3 Struktur Umum Asam Amino ...........................................................8 Gambar 2.4 Komposisi Asam Amino Gelatin dari Beberapa Jenis Bahan Baku .10 Gambar 2.5 Skema Kerja Alat Spektrofotometri UV-Vis ....................................15 Gambar 2.6 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Single Beam ........................18 Gambar 2.7 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Double Beam.......................18 Gambar 4.1 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol..................................29 Gambar 4.2 Panjang Gelombang Maksimum Hidroksiprolin ..............................29 Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin.........................................................31 Gambar 4.4 Grafik Hasil Analisis Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin 36 Gambar 5.1 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi...........58

xiii


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 4.1 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin ..............32 Tabel 4.2 Hasil Uji Rata-Rata % diff ....................................................................33 Tabel 4.3 Hasil Uji Rata-Rata Presisi ...................................................................34 Tabel 4.4 Hasil Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolin35 Tabel 5.1 Hasil Data Uji Linearitas Larutan Standar Hidroksiprolin ...................51 Tabel 5.2 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin ..............52 Tabel 5.3 Data Uji Akurasi (% diff) ......................................................................53 Tabel 5.4 Data Uji Keseksamaan Pada Tiga Konsentrasi Hidroksiprolin ............54 Tabel 5.5 Data Uji Kandungan Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin................55 Tabel 5.6 Rumus-Rumus.......................................................................................56

xiv


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1 Skema Pembuatan Reagen.................................................................43 Lampiran 2 Skema Kerja Pembuatan Larutan Blanko..........................................46 Lampiran 3 Bagan Skema Kerja ...........................................................................47 Lampiran 4 Skema Analisis Hidroksiprolin dalam Sampel Gelatin Secara .........50 Kuantitatif...........................................................................................50 Lampiran 5 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas.................................51 Lampiran 6 Batas Deteksi dan Kuantitasi.............................................................52 Lampiran 7 Uji Perolehan Kembali (Akurasi) ......................................................53 Lampiran 8 Uji Keseksamaan (Presisi).................................................................54 Lampiran 9 Uji Sampel Gelatin ............................................................................55 Lampiran 10 Rumus-Rumus .................................................................................56 Lampiran 11 Perhitungan Konsentrasi Hidroksiprolin .........................................57 Lampiran 12 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi .........58

xv


BAB I PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Masalah Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil modifikasi prolin yang dikatalisis oleh enzim prolil-4-hidroksilase (P4H) pada saat proses posttranslasi protein. Biasanya modifikasi posttranslasi pada protein bersifat reversibel (dapat kembali), tetapi pada asam amino prolin dapat melakukan modifikasi posttranslasi protein secara irreversibel. Asam amino hidroksiprolin dapat ditemukan pada domain protein kolagen, elastin, conotoxin, dan argonaute (Kelly et al., 2010). Asam amino hidroksiprolin juga terdapat pada dinding sel tanaman dan ganggang hijau (Cassab, 1998). Hidroksiprolin memiliki fungsi sebagai penstabil triple helix pada kolagen (Kelly et al., 2010). Penetapan kadar hidroksiprolin penting untuk divalidasi karena kandungan asam amino hidroksiprolin merupakan salah satu parameter kualitas gelatin. Gelatin merupakan protein yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen kulit, jaringan ikat putih dan tulang hewan (Rizky et al., 2013). Semakin tinggi asam amino hidroksiprolin maka semakin baik kualitas gelatin tersebut (Jaswir, 2007). Hidroksiprolin juga merupakan parameter yang digunakan untuk khasiat pengobatan luka bakar. Seperti yang dilakukan oleh Eriawan et al (2013) yang

mengaplikasikan

penetapan kadar hidroksiprolin untuk mengetahui efektifitas khasiat pengobatan luka bakar sediaan gel yang mengandung fraksi ekstrak pegagan. Hal ini dikarenakan kadar hidroksiprolin dalam jaringan dapat digunakan sebagai indeks parameter jumlah kolagen dalam kulit. Kolagen menjadi parameter terbentuknya jaringan atau regenerasi kulit yang tersusun atas dua jenis asam amino yakni hidroksilisin dan hidroksiprolin. Semakin tinggi kandungan hidroksiprolin dapat diindikasikan bahwa terjadi peningkatan sintesis kolagen yang berkorelasi dalam kecepatan proses penyembuhan luka. Ada tiga metode yang biasanya dilakukan untuk mengetahui kadar asam amino hidroksiprolin dalam sampel yakni menggunakan HPLC

1


2

(High Performance Liquid Chromathographic) (Pier et al., 1997; Tobias et al., 2007; Jun et al., 2014), Spektrofluorometri (Amin et al., 1982; Shila and Natasa, 2009) dan menggunakan Spektrofotometri UV-VIS (Rajesh et al., 2014; Daniela, 2014; Jitender et al., 2012). Masing-masing metode memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode HPLC memiliki kelebihan yakni cepat, sensitif, selektif, kolom pemisah dapat digunakan kembali dan dapat menggunakan bermacam-macam detektor (Ardianingsih, 2009). Metode ini memiliki kelemahan yakni apabila pengujian asam amino hidroksiprolin dilakukan bersamaan dengan asam amino lain, kadar asam amino hidroksiprolin secara tunggal sulit terderivatisasi oleh alat. Hasil yang akan didapatkan berupa kadar total antara hidroksiprolin dan prolin (Suzanne et al., 1998; Dhillon et al., 2014). Untuk itu analisis asam amino hidroksiprolin harus dilakukan secara terpisah, hal ini dapat menyebabkan kendala karena harus melakukan dua kali pengujian dengan kondisi optimum HPLC yang berbeda. Metode HPLC juga merupakan metode yang lebih komplek dan mahal dibandingkan metode lainnya. Metode lainnya menggunakan spektrofluorometri. Metode ini memiliki kelebihan yakni dapat mengukur konsentrasi sampel yang rendah, lebih selektif dan peka. Kelemahan dari metode ini yakni dapat terjadi pemadaman sendiri dan penyerapan sendiri molekul zat yang disebabkan oleh tabrakan-tabrakan antar molekul zat itu sendiri. Tabrakan ini dapat menyebabkan energi yang tadinya akan dilepaskan sebagai sinar fluorosensi ditransfer ke molekul lain akibatnya intensitas berkurang (Gholib dan Abdul 2007). Metode lain yang sering digunakan untuk analisa hidroksiprolin dalam sampel yakni metode Spektrofotometri UV-Vis. Metode ini memiliki kelebihan yakni dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam jumlah kecil, cukup sensitif dan selektif, pengerjaannya mudah dan sederhana, biaya yang relatif murah dan mempunyai kepekaan analisis yang cukup tinggi (Munson, 1991). Namun metode ini juga mempunyai kelemahan yakni senyawa yang akan dianalisa harus memiliki gugus kromofor dan ausokrom agar senyawa dapat terdeteksi pada daerah


3

ultraviolet dan daerah visible (Harmita, 2006). Selain itu hasil yang diperoleh juga dipengaruhi oleh kebersihan kuvet dan sinar yang digunakan harus monokromatis (Gholib dan Abdul, 2007). Metode

yang

akan

digunakan

pada

penelitian

ini

yaitu

menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Metode ini dipilih karena memiliki kelebihan dibandingkan dengan metode lain yang sering digunakan dalam analisis asam amino hidroksiprolin yakni metode ini lebih mudah pengerjaannya dan lebih sederhana dibandingkan metode spektrofluorometri dan HPLC. Dalam analisis sampel metode ini mampu mengukur zat dalam jumlah kecil, memiliki kepekaan analisis yang cukup tinggi, cukup sensitif dan selektif serta biaya pengerjaan yang relatif murah (Munson, 1991). Selain itu derivatisasi hidroksiprolin dengan metode spektrofotometri UV-Vis lebih mudah dibandingkan dengan metode spektrofluorometri dan HPLC. Suatu metode harus divalidasi untuk mendapatkan data atau hasil penelitian yang memenuhi persyaratan dan dapat dipertanggung jawabkan kebenarannya. Validasi metode juga dapat mengevaluasi suatu kerja metode analisis, menjamin suatu prosedur analisis, menjamin keakuratan dan keterulangan hasil prosedur analisis serta mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin timbul (Wulandari, 2007). Berdasarkan uraian diatas maka penelitian ini ditujukan untuk memvalidasi hidroksiprolin

metode

mengenai

menggunakan

penetapan

metode

kadar

asam

spektrofotometri

amino UV-Vis.

Selanjutnya hasil penelitian ini diaplikasikan pada penentuan kadar hidroksiprolin dalam sampel gelatin.


4

1.2

Rumusan Masalah 1. Apakah hasil validasi metode penetapan kadar asam amino hidroksiprolin

menggunakan

metode

spektrofotometri

UV-VIS

memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan? 2. Berapakah kadar asam amino hidroksiprolin yang terdapat pada sampel gelatin?

1.2

Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri UV-VIS yang digunakan untuk validasi asam amino hidroksiprolin telah memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan. 2.

1.4

Untuk mengetahui berapakah kadar asam amino pada sampel gelatin.

Manfaat Hasil Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat membantu para peneliti lain dalam hal menentukan metode yang tepat untuk menentukan kadar asam amino hidroksiprolin pada suatu sampel dengan metode yang lebih efektif dan efisien dan telah divalidasi menggunakan metode spektrofotometri UVVIS.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Asam Amino Hidroksiprolin Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil dari modifikasi asam amino prolin yang dikatalisis oleh enzim prolil 4 hidroksilase (P4H) pada saat proses posttranslasi protein. Reaksi enzim prolil 4 hidroksilase berlangsung di lumen retikulum endoplasma. Biasanya modifikasi posttranslasi pada protein bersifat reversibel (dapat kembali), tetapi hal ini berbeda pada asam amino prolin yang dapat melakukan modifikasi posttranslasi pada protein secara irreversibel. Fungsi hidroksiprolin pada kolagen yaitu sebagai penstabil triple helix (Kelly et al., 2010). Fungsi hidroksiprolin pada gelatin yaitu sebagai penstabil jaringan gel (Bustillos et al., 2006) Pembentukan prolin menjadi hidroksiprolin sangat bergantung pada pengaktifan enzim prolil-4-hydroksilase. Enzim ini dapat aktif dengan adanya vitamin C (kofaktor enzim prolil-4-hydroksilase). Kekurangan vitamin C dapat memicu terpecah-pecahnya kolagen atau dengan kata lain kolagen yang kurang sempurna dalam pembentukannya dan hal ini dapat meyebabkan timbulnya gejala penyakit sariyawan (scurvy) yang ditandai oleh kerusakan pernbuluh darah serta struktur kulit (Sidik, 2009).

Gambar 2.1 Perubahan asam amino prolin menjadi hidroksiprolin dikatalis oleh enzim prolil-4-hidroksilase (Yan et al., 2014).

5


6

2.1.1

Sumber Asam Amino Hidroksiprolin Hidroksiprolin berhasil ditemukan dalam hidrolisat gelatin oleh Emil Fischer (Fischer, 1902). Hidroksiprolin juga dapat ditemukan pada domain protein kolagen, elastin, conotoxin, dan argonaute (Kelly et al., 2010). Selain terdapat pada jaringan hewan hidroksiprolin juga merupakan komponen utama protein pada dinding sel tanaman dan ganggang hijau (Cassab, 1998). Isomer dari 4-hidroksiprolin juga ditemukan pada produk bakteri seperti antibiotik gentamisin dan antibiotik actinomysin, tetapi belum ada laporan yang mengkonfirmasi bahwa 4-hidroksiprolin termasuk kedalam struktur komponen sel bakteri (Elijah and Leonard, 1980).

2.1.2

Analisis Asam Amino Hidroksiprolin Salah satu prosedur penentuan hidroksiprolin didasarkan pada interaksi analit dengan ninhidrit (1,2,3-trioxidena hidrat), interaksi dengan senyawa yang mengandung gugus amino akan memberikan produk berwarna. Karena semua asam amino dapat bereaksi dengan ninhidrit, pertama larutan uji diberi natrium ninhidrit dengan tujuan mengoksidasi semua jenis asam amino dengan pembentukan alkohol dan alkena. Tetapi prosedur ini memiliki kerugian utama yaitu penentuan konsentrasi total hidroksiprolin dan prolin tidak dapat ditentukan secara terpisah satu sama. Selain itu terdapat hipotesis bahwa tidak terjadi transformasi asam amino pada saat dekomposisi asam amino, hal ini disebabkan amin sekunder pada asam amino dapat bereaksi dengan asam nitrat untuk membentuk Nnitrosamin (N. Yu. Ignat’eva et al., 2007). Prosedur lain untuk penentuan hidroksiprolin didasarkan pada reaksi reagen Ehrlich dengan proses oksidasi hidroksiprolin. Mekanisme kimia dari proses ini dapat digambarkan sebagai berikut. Proses ini melibatkan oksidasi dari asam imino menjadi pirol-2-karboksilat atau pirol, kemudian pembentukan kromofor dengan penambahan reagen Ehrlich (p-dimetilamino-benzaldehida) (Darwin and Sidney, 1960). Senyawa yang dihasilkan berupa senyawa quinoid yang sangat berwarna


7

(warna tergantung pada substituen dan bervariasi dari orange-ungu) (N. Yu. Ignat’eva et al., 2007).

Gambar 2.2 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol (Darwin and Sidney, 1960).

Chloramin-T-hidrat

(N-kloro-4-Toluensulfonamida,

garam

natrium) merupakan bahan kimia yang biasanya digunakan sebagai agen pengoksidasi. Di antara keuntungan yang tidak diragukan sebagai agen pengoksidasi adalah inexpensivenes, tidak mudah terdekomposisi dan tidak ada pengurangan produk berwarna. Reaksi oksidasi dilakukan dalam larutan buffer dengan pH 6 karena reagen ehrlich larut pada air dengan pH tertentu (N. Yu. Ignat’eva et al., 2007).

2.2

Asam Amino Asam amino adalah senyawa organik yang terdiri dari asam karboksilat dan yang mempunyai gugus amino. Asam amino dapat ditemukan pada keadaan bebas atau sebagai rantai linear pada peptida dan protein (Bailey, 1990). Asam amino terdiri dari sebuah gugus amino, gugus karboksil, atom hidrogen dan gugus R yang terikat pada atom C yang dikenal sebagai karbon alfa (Cα). Gugus R sebagai rantai samping. Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut pada pelarut organik non polar seperti eter, aseton, kloroform (Poedjiadi, 2009).


8

Gambar 2.3 Struktur Umum Asam Amino (Merinda, 2013).

2.2.1

Pembagian Asam Amino Berdasarkan sifat kimia rantai sampingnya, asam amino dapat dibagi menjadi empat kelompok, yaitu asam amino yang bersifat basa lemah, asam lemah, hidrofilik jika polar dan hidrofobik jika nonpolar (Almatsier, 2006). Tidak semua asam amino dapat dibuat dalam tubuh kita apabila ditinjau dari segi pembentukannya asam amino dibagi menjadi dua golongan yaitu asam amino eksogen dan asam amino endogen. Asam amino eksogen disebut juga asam amino esensial dan asam amino endogen disebut juga asam amino non esensial (Winarno, 2008).

2.2.2 Analisis Asam Amino Secara Umum Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi asam amino atau kandungan protein dan peptida. Untuk mengidentifikasi adanya asam amino, terlebih dahulu kita perlu menghidrolisis ikatan amin dengan sempurna untuk memperoleh asam amino dalam keadaan bebas, kemudian kita memisahkan, mengidentifikasi dan menghitungnya. Hidrolisis dapat dilakukan pada kondisi asam dan basa yang kuat atau menggunakan enzim spesifik untuk memperoleh asam amino. Pada hidrolisis asam unsur yang diperlukan adalah HCl 6 M pada suhu 110oC. Reaksinya biasanya dilakukan ditabung kaca yang tertutup. Sementara itu pada hidrolisis basa, ikatan amida dapat diputus dengan perlakuan peptida menggunakan NaOH 2M pada suhu 100oC. Hidrolisis basa menghasilkan destruksi arginin, sistein, serin, dan treonin. Selain itu ada pula hidrolisis enzim. Peristiwa ini terjadi didalam tubuh. Untuk menghancurkan makanan perut memiliki enzim dengan kadar tertentu yang dapat dikatalisasi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal peptidase.


9

Aminopeptidase bekerja cepat dan efisien dalam hidrolisis ikatan peptida sekaligus memotong suatu residu asam amino mulai dari ujung N. Tahap selanjutnya yaitu pemisahan. Pemisahan yang umum dilakukan adalah dengan cara kromatografi (Bailey, 1990)

2.3

Gelatin Gelatin merupakan campuran heterogen polipepetida yang diperoleh melalui hidrolisis parsial kolagen dari jaringan ikat hewan dengan perlakuan asam atau basa (Fischer, 2012). Gelatin merupakan protein yang larut yang bisa bersifat sebagai gelling agent (bahan pembuat gel) atau sebagai non gelling agent. Sumber bahan baku gelatin dapat berasal dari sapi (tulang dan kulit), babi (kulit) dan ikan (kulit). Gelatin memiliki fungsi yang masih sulit untuk digantikan dalam industri pangan maupun obat-obatan. Hal ini dikarenakan gelatin memiliki fungsi yang banyak yaitu bisa berfungsi sebagai bahan pengisi, pengemulsi (emulsifier), pengikat, pengendap, pemerkaya gizi, sifatnya juga dapat membentuk lapisan tipis yang elastis, membentuk film yang transparan dan kuat, kemudian memiliki sifat penting lainnya yaitu daya cernanya yang tinggi (Dewi and Iriane, 2007).

2.3.1

Komposisi Asam Amino dalam Gelatin Gelatin sangat kaya dengan asam amino glisin (Gly) (hampir sepertiga dari total asam amino), prolin (Pro) dan 4-hidroksiprolin (4Hyp). Struktur gelatin yang umum adalah -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyp-GlyPro-. Kandungan 4-hidroksiprolin (4-Hyp) juga berpengaruh pada kekuatan gelatin. Semakin tinggi asam amino ini, kekuatan gel juga lebih baik. Meskipun gelatin mayoritas diturunkan dari hewan, gelatin sebenarnya tergolong memiliki nilai biologis yang rendah dan sering juga dianggap sebagai protein yang tidak lengkap. Pasalnya, gelatin kekurangan kandungan triptopan (Trp) yang merupakan salah satu asam amino esensial, serta rendah dalam sistein (Cys) dan tirosin (Tyr) (Jaswir, 2007).


10

Berikut beberapa komposisi asam amino yang terdapat dalam gelatin dengan berbagai sumber bahan baku yang berbeda:

Gambar 2.4 Komposisi Asam Amino Gelatin dari Beberapa Jenis Bahan Baku (Fischer, 2012).

2.4

Validasi Metode Analisa Syarat utama dari suatu penelitian yang dapat diterima dan layak untuk dipublikasi terutama untuk penelitian yang bersifat kuantitatif yaitu data yang diperoleh harus valid, data atau hasil dari penelitian tersebut harus memenuhi persyaratan dan dapat dipertanggung jawabkan kebenarannya untuk mendapatkan suatu data yang valid maka dibutuhkan metode yang valid pula. Salah satu cara agar suatu metode dikatakan valid adalah dengan cara melakukan suatu validasi metode. Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu,

berdasarkan

percobaan

laboratorium,

untuk

membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Beberapa manfaat validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi suatu kerja metode analisis, menjamin suatu prosedur analisis, menjamin keakuratan dan keterulangan hasil prosedur anlisis dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin timbul (Wulandari, 2007).


11

2.4.1

Parameter Validasi Metode Menurut Harmita (2004) ada beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis, yaitu:

1. Kecermatan (Accuracy) Kecermatan adalah ukuran yang menunjukan kedekatan hasil yang diperoleh dari hasil pengamatan dengan hasil yang sebenarnya. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat dan sesuai prosedur. Untuk

mendokumentasikan

akurasi,

ICH

(2005)

merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi). Uji akurasi dinyatakan dengan persen differensial (% diff). Syarat akurasi yang baik jika nilai rata-rata % diff tidak lebih dari ±2% (Harmita, 2006). Perhitungan untuk menentukan % diff adalah sebagai berikut:

% diff =

Keterangan: B = konsentrasi hasil analisis A = konsentrasi sesungguhnya

2. Keseksamaan (Precision) Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (%RSD). Keseksamaan dapat


12

dinyatakan

sebagai

keterulangan

(repeatability)

atau

ketertiruan

(reproducibility). Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV) sebesar ≤ ±2% dan standar deviasi (SD) sebesar ≤ ±2 (Harmita, 2004). Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut: Jika hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,..............xn, maka simpangan bakunya adalah: SD = √

) )

Simpangan baku relatif (RSD) adalah:

RSD = (Harmita, 2004)

3. Selektifitas (Spesifitas) Selektifitas atau Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias). Cara yang dapat digunakan untuk menentukan selektifitas adalah dengan cara membandingkan

hasil sampel yang mengandung

bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dengan hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Penyimpangan hasil dapat terlihat apabila ada selisih dari hasil uji kedua sampel.


13

4. Linearitas dan Rentang Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 0-200%. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier y=a+bx. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b=0 dan r=+1 atau –1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis instrumen yang digunakan. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah sebesar ≥ 0,9970 (ICH, 2005), ≥ 0,9700 (SNI) atau ≥ 0,9980 (AOAC, 2002)

5. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon


14

blangko beberapa kali. Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Rumus untuk menghitung batas deteksi (LOD): LOD = Dan batas kuantitasi (LOQ): LOQ = Dimana Simpangan baku (Sb) sama dengan simpangan baku residual (Sy/x.). Sy/x = √

2.5

)

Spektrofotometri UV-VIS Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik

yang sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi

spektrofotometri ultraviolet, cahaya tampak, infra merah, dan serapan atom. Menurut Ditjen POM (1995) daerah spektrum dapat dibagi menjadi dalam: 1. Daerah ultraviolet

: 190-380 nm

2. Daerah cahaya tampak

: 380-780 nm

3. Daerah infra merah dekat : 780-3000 nm 4. Daerah infra merah

: 2,5-40 µm atau 4000-250 cm-1

Spektrofotometri UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur serapan yang dihasilkan dari interaksi kimia antara radiasi elektromagnetik dengan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada daerah UV-Vis (Ditjen POM, 1995). Spektrofotometri UV-Vis adalah teknik analisa spektroskopi yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu metode yang sering digunakan baik untuk analisa kualitatif maupun kuantitatif karena metode ini memiliki beberapa keuntungan, yaitu:


15

1. Dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam jumlah kecil 2. Cukup sensitif dan selektif 3. Pengerjaannya mudah dan sederhana 4. Biaya yang relatif murah 5. Dan mempunyai kepekaan analisis yang cukup tinggi (Munson, 1991).

2.5.1

Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS

Gambar 2.6 Skema Kerja Alat Spektrofotometri UV-Vis (Sumber : wocono.wordpress.com)

Komponen spektrofotometri UV-Vis terdiri atas (Gholib dan Abdul, 2007; Harmita, 2006) 1.

Sumber lampu Sumber lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang 190-380 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (panjang gelombang antara 380-780 nm).

2. Monokromator Monokromator digunakan untuk mendispersikan sinar kedalam komponen-komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan dipilih oleh celah (slit). Monokromator akan memisahkan radiasi cahaya putih yang polikromatis menjadi cahaya monokromatis (mendekati monokromatis). 3. Kuvet Wadah atau cell untuk menempatkan larutan.


16

4. Detektor Mengubah energi radiasi yang mengenainya menjadi suatu besaran yang dapat diukur. 5. Amplifer Fungsinya untuk memperkuat sinyal listrik 6. Rekorder Alat untuk mencatat dapat berupa gambar atau angka-angka

Prinsip kerja instrumen spektrofotometri UV-Vis : Prinsip kerja dari spektrofotometri UV-Vis berdasarkan pada penyerapan cahaya atau energi oleh suatu larutan. Jumlah cahaya atau energi radiasi yang diserap memungkinkan pengukuran jumlah zat penyerap dalam larutan secara kuantitatif. Cahaya adalah suatu bentuk energi radiasi yang mempunyai sifat sebagai gelombang dan partikel. Sifatnya sebagai gelombang dapat dilihat dengan terjadinya pembiasan dan pemantulan cahaya oleh suatu medium sedangkan sifatnya sebagai pertikel dapat dilihat dengan terjadinya efek foto listrik. Sedangkan energi radiasi terdiri dari sejumlah besar panjang gelombang elektromagnetik dengan panjang gelombang yang berbeda-beda (Pecsok et al., 1976; Skoog and West, 1971). Pada instrumen spektrofometer ultraviolet dan visible, suatu sumber cahaya akan dipancarkan melalui monokromator. Monokromator menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya tersebut menjadi pitapita panjang gelombang yang diinginkan untuk pengukuran suatu zat tertentu, dan menunjukkan bahwa setiap gugus kromofor mempunyai panjang gelombang maksimum yang berbeda. Dari monokromator tadi cahaya atau energi radiasi diteruskan dan diserap oleh suatu larutan yang akan diperiksa di dalam kuvet. Kemudian jumlah cahaya yang diserap oleh larutan akan menghasilkan signal elektrik pada detektor, yang mana signal elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut. Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai angka (Pecsok et al., 1976; Skoog and West 1971).


17

Metode Spektrofotometri ultraviolet dan visible berdasarkan pada hukum LAMBERT-BEER. Hukum tersebut menyatakan bahwa jumlah radiasi cahaya tampak, ultraviolet dan cahaya-cahaya lain yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan. Hukum ini secara sederhana dapat dinyatakan dalam rumus berikut: A = log (Io/I1) = a b c

Io = Intensitas sinar datang I1 = Intensitas sinar yang diteruskan a = Absorbsivitas b = Panjang sel atau kuvet c = Konsentrasi (g/l)

Persyaratan suatu sampel dapat dianalisa menggunakan spektrofotometri UV-Vis adalah : 1. Bahan mempunyai gugus kromofor 2. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor tapi berwarna 3. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dan tidak berwarna, maka ditambahkan pereaksi warna (Vis) 4. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dibuat turunannya yang mempunyai gugus kromofor (UV). (Harmita, 2006).

Sampel yang sering dianalisis dengan metode spektroftometri UVVis adalah senyawa organik yang memiliki gugus kromofor dan ausokrom. Gugus kromofor adalah gugus fungsional tidak jenuh yang memberikan serapan pada daerah ultraviolet atau cahaya tampak. Hampir semua kromofor mempunyai ikatan rangkap seperti alkena (C=C), C=O, NO2, benzen, dan lain-lain. Sedangkan ausokrom adalah gugus fungsional seperti –OH, -NH2, -X, yaitu gugus yang mempunyai elektron nonbonding dan tidak mengabsorpsi radiasi pada λ diatas 200 nm (Harmita, 2006).


18

2.5.2

Tipe Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS Tipe instrumentasi dari spektrofotometri UV-Vis terbagi menjadi dua (Harmita, 2006): 1. Spektrofotometri Single Beam Pada spektrofotometer UV-Vis tipe singel beam absorbsinya berdasarkan pada sinar tunggal dimana sampel akan ditentukan jumlahnya pada satu panjang gelombang atau fix wave lenght. Hasil biasanya dibandingkan dengan blanko (biasanya pelarut).

Gambar 2.6 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Single Beam (Sumber: www.slideshare.net)

Keterangan gambar skema spektrofotometri tipe single beam: 1. Dari celah mengeluarkan satu sinar monokromatis 2. Wadah atau kuvet yang dapat dilalui sinar hanya satu 3. Setiap perubahan panjang gelombang alat harus dinolkan

2. Spektrofotometri Double Beam Pada spektrofotometri UV-Vis tipe double beam absorpsinya siasanya mempunyai variabel panjang gelombang atau multi wave length. Hasilnya bisa langsung dibandingkan dengan blanko

Gambar 2.7 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Double Beam (Sumber: www.slideshare.net)


19

Keterangan gambar skema spektrofotometri tipe double beam: 1. Dari celah mengeluarkan dua sinar monokromatis 2. Sinar melalui dua wadah atau kuvet sekaligus 3. Alat hanya di auto zero satu kali dengan cara mengisi kedua kuvet dengan larutan blanko.


BAB III METODE PENELITIAN

3.1

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium kimia obat dan laboratorium penelitian II di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta sejak bulan maret hingga agustus 2016.

3.2

Alat dan Bahan

3.2.1 Bahan Kimia Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah Standar Asam

Amino

Hidroksiprolin

(Trans-4-Hidroksi-L-Prolin)

(Sigma),

Natrium Asetat Trihidrat (Merck), Asam Sitrat Monohidrat (Merck), Asam Asetat Glasial (Merck), Asam Klorida 36,7% (J.T.Baker), Natrium Hidroksida (Merck), Natrium Klorida (Merck), Isopropanol (Merck), Chloramin T Hidrat (Sigma), 4-dimetilamino-benzaldehid (PDAB) (Merck), Etanol Absolute (Merck), Asam Sulfat (Merck), Aquades dan Sampel Gelatin.

3.2.2

Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Instrumen Spektrofotometri UV-Vis Double Beam, timbangan analitik, shakingbath, oven, vortex, micropipet dan tip, labu erlenmeyer, labu ukur, gelas kimia, tabung reaksi, pH meter, batang pengaduk, alumunium foil, spatula, pipet volume, dan pipet tetes.

20


21

3.3

Prosedur Penelitian

3.3.1

Penyiapan Bahan Baku dan Pereaksi 1. Pembuatan larutan HCl 6 N Larutan HCl 36,7% (12 N) dipipet sebanyak 50 ml kemudian masukkan larutan ke dalam labu ukur 100 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

2. Pembuatan larutan NaOH 4 N Serbuk NaOH ditimbang sebanyak 16 gram kemudian masukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

3. Pembuatan buffer asetat/sitrat pH 6 (George, 2009) Masukkan 70 ml aquades ke dalam labu ukur 100 ml, tambahkan 1,2 ml asam asetat glasial ke dalam labu secara perlahan, tambahkan 5 gram asam sitrat monohidrat, 12 gram natrium asetat trihidrat dan 3,4 gram natrium hidroksida, kocok sampai homogen dan tambahkan aquades sampai 90 ml, cukupkan pH sampai 6 dengan menambahkan HCl atau NaOH kemudian tambahkan aquades sampai 100 ml dan cek pH kembali.

4. Pembuatan NaCl 0,3 M Serbuk NaCl ditimbang sebanyak 8,775 gram diatas timbangan analitik, masukkan serbuk ke dalam labu ukur 500 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

5. Pembuatan larutan chloramin T 7% (w/v) Serbuk Chloramin ditimbang sebanyak 350 mg diatas timbangan analitik, masukkan serbuk ke dalam labu ukur 5 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.


22

6. Pembuatan larutan oksidan (Chloramin T 7% (w/v) dan buffer asetat/sitrat pH 6 rasio 1:4 (v/v)) Larutan Chloramin 7% dipipet sebanyak 2 ml, masukkan larutan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian tambahkan buffer asetat/sitrat pH 6, sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

7. Pembuatan reagen ehrlich (George, 2009) Serbuk

p-dimetilamino-benzaldehid

(PDAB)

ditimbang

sebanyak 12 gram kemudian tambahkan 20 ml etanol absolut (larutan A), selanjutnya larutan asam sulfat dipipet sebanyak 2,74 ml kemudian tambahkan 20 ml etanol absolut (larutan B). Tambahkan larutan B ke dalam larutan A kemudian aduk sampai homogen lalu masukkan larutan ke dalam kulkas dan tunggu larutan sampai terbentuk kristal.

8. Pembuatan larutan induk hidroksiprolin 1000 ppm Serbuk standar hidroksiprolin ditimbang sebanyak 10 mg diatas timbangan analitik, kemudian masukkan serbuk ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

9. Pembuatan larutan standar 100 ppm Dipipet sebanyak 5 ml dari larutan induk hidroksiprolin 1000 ppm secara kuantitatif, kemudian masukkan larutan ke dalam labu ukur 50 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

10. Pembuatan larutan hidroksiprolin konsentrasi 3, 6, 9, 12, 15, dan 18 ppm Dipipet sebanyak 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, dan 1,8 ml dari larutan standar hidroksiprolin 100 ppm, kemudian masing-masing larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen. Masukkan masing-masing


23

larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat pH 6 dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

3.3.2

Penentuan Panjang Gelombang Maksimum 9 ppm Larutan standar hidroksiprolin 100 ppm dipipet sebanyak 0,9 ml, kemudian masukkan larutan ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen. Masukkan semua larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat pH 6 dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda batas dan kocok sampai homogen. Pipet sebanyak 1 ml larutan yang telah dibuat dan masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup lalu tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm.

3.3.3

Validasi Metode 1. Pembuatan kurva kalibrasi 3, 6, 9, 12, 15, 18 ppm dan penentuan linearitas Larutan hidroksiprolin konsentrasi 3 ppm dipipet sebanyak 1 ml kemudian masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup lalu tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 6, 9, 12, 15, dan 18 ppm. Kemudian dibuat kurva kalibrasi sampai didapat persamaan linear y=a+bx. Linearitas dari kurva kalibrasi dilihat dengan menghitung koefisien korelasi (r) dari persamaan regresi linear.


24

2. Penentuan batas deteksi / limit of detection (LOD) dan batas kuantitasi/ limit of quantitation (LOQ). LOD dihitung melalui persamaan garis regresi linear dari kurva kalibrasi dengan rumus: LOD =

Sedangkan LOQ dihitung dengan rumus: LOQ =

Dimana Simpangan baku (Sb) sama dengan simpangan baku residual (Sy/x.), b adalah slope dari persamaan regresi. Sy/x = √

3. Uji kecermatan (Akurasi) Pada uji kecermatan dibuat larutan dengan konsentrasi 5, 10 dan 16 ppm dari larutan standar hidroksiprolin 100 ppm. Untuk konsentrasi 5 ppm, dipipet sebanyak 0,5 ml dari larutan standar hidroksiprolin 100 ppm, masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades sampai tanda batas kocok sampai homogen. Lalu untuk konsentrasi 10 ppm dipipet sebanyak 1 ml larutan standar hidroksiprolin 100 ppm masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades sampai tanda batas kocok sampai homogen. Kemudian untuk konsentasi 16 ppm dengan mengukur 1,6 ml larutan standar hidroksiprolin 100 ppm, masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades sampai tanda batas kocok sampai homogen. Labu ukur yang digunakan volume 10 ml. Masukkan masing-masing larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat pH 6 dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda batas dan kocok sampai

homogen.

Masing-masing

konsentrasi

dibuat

3

kali

pengulangan sehingga diperoleh 9 larutan.


25

Dari masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 1 ml larutan yang telah dibuat dan masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup lalu tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm. Nilai akurasi dapat diperoleh dengan menghitung nilai % diff, dengan cara mengurangi nilai konsentrasi dari hasil analisis dengan nilai konsentrasi yang sebenarnya dibagi nilai konsentrasi sebenarnya dan dikali seratus persen. Syarat % diff yang dapat diterima yaitu tidak lebih dari ±2% (Harmita, 2006).

% diff =

4. Uji keseksamaan (presisi) Dibuat larutan hidroksiprolin dengan konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, dan 16 ppm. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali pengulangan sehingga diperoleh 9 larutan. Setelah dipreparasi sesuai prosedur. Larutan hidroksiprolin diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Kemudian dihitung standar deviasi (SD) dan persentase simpangan baku relatif atau %RSD (Relative Standard Deviation) dari masing-masing konsentrasi dengan nilai ≤ ±2% (Harmita, 2004).

SD = √

Simpangan baku relatif (RSD) :

RSD =


26

3.3.4

Analisis Sampel Gelatin Secara Kuantitatif Kandungan hidroksiprolin dalam sampel gelatin ditentukan menggunakan metode ISO (1978) dengan sedikit modifikasi (Rafik et al., 2011). Sampel gelatin ditimbang sebanyak 10 mg diatas timbangan analitik. Sampel gelatin dihidrolisis dengan HCl 6 N sebanyak 5 ml dan diinkubasi selama 12 jam pada suhu 110oC di dalam oven. Setelah diinkubasi larutan sampel dinetralkan dengan cara menambahkan NaOH 4 N. Larutan yang telah netral kemudian dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan larutan buffer asetat/sitrat pH 6 sebanyak 2 ml dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda batas dan kocok sampai homogen. Larutan sampel dipipet sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi tertutup lalu tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian vortex larutan selama 4 menit. Selanjutnya tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml dan inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm. Kadar asam amino hidroksiprolin dalam sampel dapat dihitung menggunakan persamaan regresi dari kurva kalibrasi yang telah dibuat.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Hidroksiprolin merupakan asam amino turunan dari prolin. Asam amino ini adalah hasil dari reaksi prolin yang dikatalisis oleh enzim prolil4-hidroksilase di lumen retikulum endoplasma pada saat posttranslasi protein. Hidroksiprolin dapat ditemukan pada jaringan hewan, sel tanaman dan ganggang hijau. Selain itu hidroksiprolin juga dapat ditemukan dalam gelatin dan merupakan salah satu parameter dalam menentukan kualitas suatu gelatin. Pada gelatin hidroksiprolin memiliki fungsi sebagai penstabil triple helix. Semakin tinggi asam amino hidroksiprolin maka semakin baik kualitas gelatin tersebut. Gelatin juga memiliki fungsi yang masih sulit untuk digantikan dalam industri pangan dan obat-obatan. Hal ini dikarenakan gelatin memiliki fungsi yang banyak yaitu dapat berfungsi sebagai pengisi, pengemulsi, pengikat tablet, pengendap, pemerkaya giji, dan dapat membentuk lapisan tipis yang elastis. Validasi metode penetapan kadar asam amino hidroksiprolin pada penelitian ini menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis. Metode spektrofotometri UV-Vis merupakan metode yang pengerjaannya mudah dan sederhana namun cukup sensitif dan selektif serta dapat mengukur kadar dalam jumlah yang kecil. Selain itu metode ini juga mempunyai kepekaan analisis yang cukup tinggi dan pengerjaannya yang relatif murah. Syarat suatu senyawa dapat diukur serapannya dengan alat spektrofotometri UV-Vis adalah senyawa tersebut memiliki gugus kromofor dan ausokrom sehingga dapat diukur serapannya pada daerah ultraviolet dan daerah visible. Daerah UV-Vis berada pada daerah 190-780 nm. Asam amino hidroksiprolin merupakan asam amino yang tidak mempunyai gugus kromofor sehingga tidak mempunyai serapan pada daerah UV-Vis. Gugus kromofor merupakan gugus kovalen tidak jenuh yang memberikan serapan pada daerah ultraviolet dan daerah visible.

27


28

Hampir semua gugus kromofor memiliki ikatan rangkap seperti C=C, C=O, NO2, cincin benzen dan lain-lain. Oleh karena itu pada penetapan kadar asam amino hidroksiprolin harus dilakukan derivatisasi. Derivatisasi bertujuan untuk mengubah hidroksiprolin menjadi berwarna dan dapat dibaca serapannya oleh alat spektrofotometri UV-Vis. Proses derivatisasi pada penelitian ini dilakukan dengan cara membuat larutan hidroksiprolin dengan konsentrasi yang diinginkan. Selanjutnya dilakukan penambahan reagen untuk mengubah larutan

hidroksiprolin

tersebut

menjadi

berwarna.

Reagen

yang

ditambahkan ke dalam larutan hidroksiprolin yaitu buffer asetat/sitrat pH 6, NaCl, isopropanol, larutan oksidan, dan reagen ehrlich. Penambahan larutan buffer atau larutan penyangga ke dalam larutan hidroksiprolin berfungsi untuk mempertahankan nilai pH (derajat keasaman) agar tidak banyak berubah selama reaksi berlangsung dengan penambahan sedikit asam kuat atau basa kuat serta pengenceran oleh air. Pada penelitian ini buffer yang digunakan yaitu larutan buffer asetat/sitrat dengan pH 6 karena reaksi yang ideal terjadi pada pH 6. Larutan NaCl ditambahkan agar larutan hidroksiprolin lebih stabil sehingga serapan yang terbaca oleh alat spektrofotometri UV-Vis lebih stabil. Penambahan larutan isopropanol berfungsi untuk membantu pelarutan oksidan yang akan ditambahkan ke dalam larutan hidroksiprolin yang telah dibuat sehingga larutan yang akan terbentuk lebih homogen. Larutan oksidan terdiri atas chloramin T hidrat dan larutan buffer asetat/sitrat pH 6. Penambahan larutan oksidan berfungsi untuk mengubah hidroksiprolin menjadi pirol-2-karboksilat atau pirol. Selanjutnya larutan hidroksiprolin ditambahkan reagen ehrlich yang terdiri dari PDAB (para-dimetilaminobenzaldehid), etanol absolut dan asam sulfat. Penambahan reagen ehrlich berfungsi

untuk

mengubah

larutan

menjadi

berwarna.

Larutan

hidroksiprolin yang telah ditambahkan reagen ehrlich akan berwarna kuning. Setelah larutan di inkubasi pada suhu 60oC selama 25 menit larutan akan berubah menjadi berwarna merah, fungsi dari pemanasan sendiri agar reaksi terjadi lebih cepat. Semakin tinggi kadar hidroksiprolin


29

maka warna merah yang dihasilkan akan semakin pekat. Hidroksiprolin hasil dari derivatisasi mempunyai serapan pada daerah visible. Daerah visible berada pada daerah 380-780 nm.

Gambar 4.1 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol

Penelitian didahului dengan proses penentuan panjang gelombang maksimum atau serapan maksimum dari larutan hidroksiprolin yang sebelumnya telah diderivatisasi sehingga menjadi berwarna menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada rentang panjang gelombang 400-800 nm. Menurut beberapa literatur hidroksiprolin yang telah diderivatisasi memiliki panjang gelombang maksimum pada 560 nm (George, 2009), 660 nm (Rafik et al., 2011), 558 nm (Jitender et al., 2012).

Gambar 4.2 Panjang Gelombang Maksimum Hidroksiprolin Setelah dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimum sebanyak 3 kali pengulangan dihasilkan panjang gelombang maksimum


30

pada serapan 563.5 nm. Spektrum hidroksiprolin pada spektrofotometri UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 4.2. Penentuan panjang gelombang maksimum hidroksiprolin dilakukan agar dapat mengetahui daerah dimana hidroksiprolin memberikan serapan warna maksimal yang dapat diabsorbsi oleh alat spektroftometri UV-Vis, sehingga dapat dihasilkan nilai berupa absorbansi.

4.2

Validasi Metode Syarat utama dari suatu penelitian yang dapat diterima dan layak untuk dipublikasi terutama untuk penelitian yang bersifat kuantitatif yaitu data yang diperoleh harus valid. Untuk mendapatkan suatu data yang valid maka dibutuhkan metode yang valid pula. Salah satu cara agar suatu metode dikatakan valid adalah dengan cara melakukan suatu validasi metode. Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu,

berdasarkan

percobaan

laboratorium,

untuk

membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter validasi yang akan ditetapkan pada penelitian ini yaitu pembuatan kurva kalibrasi dan uji lineariras, LOD (Limit of Detection), LOQ (Limit of Quantitation), uji akurasi (% diff), uji presisi (%RSD dan SD).

4.2.1

Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas Pada validasi metode diawali dengan pembuatan kurva kalibrasi. Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara nilai absorbansi terhadap konsentrasi. Kurva kalibrasi yang dihasilkan dapat digunakan untuk uji linearitas. Tujuan dari uji linearitas yaitu untuk membuktikan adanya hubungan linear antara konsentrasi zat yang sebenarnya dengan respon alat. Linearitas atau kecenderungan korelasi antara dua variabel biasanya dinyatakan dalam koefisien korelasi (r). Linearitas yang baik atau adanya korelasi yang erat ditunjukan dengan harga koefisein korelasi mendekati atau sama dengan 1. Menurut AOAC (2002) syarat uji linearitas yang baik yaitu dengan nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,9980.


31

Pada pembuatan kurva kalibrasi dibuat deret larutan standar hidroksiprolin dari larutan induk hidroksiprolin 100 ppm. Konsentrasi yang digunakan pada kurva kalibrasi adalah 7 konsentrasi yang bertingkat yaitu 0 ppm, 3 ppm, 6 ppm, 9 ppm, 12 ppm, 15 ppm dan 18 ppm.

Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin 0,6

Absorbansi

0,5 y = 0,0312x - 0,0026 R² = 0,9991

0,4 0,3

Series1

0,2

Linear (Series1)

0,1 0 -0,1

0

5

10

15

20

Konsentrasi

Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin Berdasarkan hasil kurva yang didapat pada Gambar 4.3 menunjukan bahwa nilai absorbansi yang dihasilkan meningkat sejajar dengan peningkatan konsentrasi hidroksiprolin. Dari kurva kalibrasi hidroksiprolin didapatkan persamaan linier antara konsentrasi dan absorbansi yaitu y=0,0312x-0,0026 dengan nilai koefisien korelasi yaitu r=0,9991. Berdasarkan hasil yang diperoleh nilai koefisien korelasi yang didapat telah memenuhi persyaratan AOAC (2002) yaitu ≥ 0,9980. Persamaan linear yang dihasilkan dapat digunakan untuk mencari konsentrasi hidroksiprolin dalam sampel dengan memasukkan nilai absorbansi. Data hasil percobaan dapat dilihat selengkapnya pada lampiran 5 tabel 5.1.


32

4.2.2

Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Setelah didapatkan kurva kalibrasi

yang telah memenuhi

persyaratan selanjutnya data yang diperoleh dapat diolah untuk menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ). Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko (Harmita, 2004). Sedangkan batas kuantitasi adalah kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi (LOD) dari pengujian yaitu 0,691 ppm sedangkan batas kuantitasi (LOQ) yaitu 2,094 ppm. Data mengenai uji batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dilihat pada tabel 4.1 dan data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada lampiran 6 tabel 5.2. Parameter

Nilai 0,00021361

S (y/x)

0,006536207

LOD (Limit of Detection)

0,691 ppm

LOQ (Limit of Quantitation)

2,094 ppm

Tabel 4.1 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin

4.2.3

Uji Kecermatan (Akurasi) Selanjutnya dilakukan uji kecermatan atau uji akurasi. Kecermatan adalah ukuran yang menunjukan kedekatan hasil yang diperoleh dari hasil pengamatan dengan hasil yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai % diff. ICH Guideline (2005) merekomendasikan uji akurasi dilakukan dengan menggunakan minimal 9 kali penentuan terhadap minimal 3 tingkat konsentrasi yang mencakup rentang konsentrasi yang telah ditetapkan. Pada penelitian ini uji kecermatan dilakukan dari 3 konsentrasi berbeda hidroksiprolin yaitu 5 ppm, 10 ppm dan 16 ppm. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali pengulangan sehingga diperoleh


33

9 larutan. Selanjutnya masing-masing larutan diukur serapannya menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

Kadar

Rata-rata

(ppm)

% diff

5

0,384

10

-1,089

16

-0,454

Rata-Rata % diff

-0,386

Tabel 4.2 Hasil Uji Rata-Rata % diff Dari percobaan yang dilakukan didapatkan nilai rata-rata % diff masing-masing konsentrasi yaitu untuk konsentrasi 5 ppm nilai rata-rata % diff sebesar 0,384%, untuk konsentrasi 10 ppm nilai rata-rata % diff sebesar -1,089%, untuk konsentrasi 16 ppm nilai rata-rata% diff sebesar -0,454%. Syarat nilai % diff yang baik yaitu tidak lebih dari +2% dan -2% (Harmita, 2006). Hasil rata-rata % diff semua konsentrasi yaitu -0,386%. Dari hasil percobaan yang dilakukan diperoleh data yang telah memenuhi persyaratan sehingga dapat dikatakan memberikan hasil uji akurasi yang baik sehingga metode analisis yang dilakukan cukup akurat dan dapat memberikan hasil yang baik pada pengukuran sampel. Hasil uji akurasi dapat dilihat pada Tabel 4.2 Data hasil uji presisi selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 7 tabel 5.3.

4.2.4

Uji Keseksamaan (Presisi) Uji selanjutnya yang dilakukan yaitu uji keseksamaan (uji presisi). Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari ratarata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Pada uji presisi dilakukan pada 3 konsentrasi yaitu 5 ppm, 10 ppm, dan 16 ppm. Dibuat 3 kali pengulangan masing-masing konsentrasi sehingga diperoleh 9 larutan. Selanjutnya


34

masing-masing larutan diukur serapannya menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

Kadar (ppm)

Rata-rata kadar yang diperoleh (ppm)

SD

RSD (%)

5

5,019

0,178

0,035

10

9,891

0,215

0,021

16

15,927

1,477

0,092

0,623

0,050

Rata-rata

Tabel 4.3 Hasil Uji Rata-Rata Presisi Dari percobaan yang dilakukan untuk konsentrasi 5 ppm diperoleh nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,035% dan nilai SD (Standard Deviation) sebesar 0,178, untuk konsentrasi 10 ppm diperoleh nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,021% dan nilai SD (Standard Deviation) sebesar 0,215, dan untuk konsentrasi 16 ppm diperoleh nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,092% dan nilai SD (Standard Deviation) sebesar 1,477. Syarat uji presisi yang baik yaitu nilai %RSD (Relative Standard Deviation) ≤ ±2% dan nilai SD (Standard Deviation) sebesar ≤ ±2 (Harmita, 2004). Hasil rata-rata %RSD semua konsentrasi yaitu 0,050% dan rata-rata standar deviasi semua konsentrasi yaitu 0,623. Dari hasil percobaan yang telah dilakukan diperoleh data yang telah memenuhi persyaratan sehingga dapat dikatakan memberikan hasil presisi atau keseksamaan yang baik. Hasil uji presisi dapat dilihat pada Tabel 4.3. Data hasil uji presisi selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 8 tabel 5.4.


35

No

Parameter

Hasil

Persyaratan

1.

Koefisien korelasi (r)

0,9991

2.

LOD (Limit of Detection)

0,691 ppm

0,9980 (AOAC, 2002) -

3.

LOQ (Limit of Quantitation)

2,094 ppm

-

4.

Akurasi

% diff

-0,384

≤ ±2% (Harmita, 2006)

% RSD 5.

0,050

≤ ±2% (Harmita, 2004)

Presisi SD

0,623

≤ ±2 (Harmita, 2004)

Tabel 4.4 Hasil Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolin Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa semua hasil uji yang didapat telah memenuhi syarat sebagai parameter uji validasi metode penetapan kadar hidroksiprolin. Sehingga metode yang digunakan untuk penetapan kadar hidroksiprolin dikatakan valid dan dapat memberikan hasil yang baik dalam pengukuran sampel selanjutnya.

4.3

Analisis Sampel Gelatin Pada proses preparasi sampel gelatin, dilakukan reaksi hidrolisis asam terlebih dahulu menggunakan HCl 6 N pada suhu 110oC selama 12 jam dalam tabung kaca tertutup agar sampel tidak menguap pada saat di inkubasi dalam oven. Hidrolisis ini dilakukan untuk memecah ikatan amin pada asam amino sehingga diperoleh asam amino dalam keadaan bebas. Setelah sampel dihidrolisis dengan HCl 6 N sampel dinetralkan dengan penambahan NaOH 4 N. Larutan yang telah netral dipreparasi sesuai prosedur. Larutan sampel yang mengandung hidroksiprolin akan berubah warna menjadi merah. Selanjutnya masing-masing larutan sampel diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang maksimal 563,5 nm.


36

Grafik Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin

18 16 14 12

10 8 6 4 2 0 1 Sampel 1

Sampel 2

Sampel 3

Sampel 4

Sampel 5

Gambar 4.4 Grafik Hasil Analisis Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin

Hasil dari penetapan kadar dari seluruh sampel yang telah diperiksa akan menghasilkan data absorbansi. Kadar hidroksiprolin dalam sampel dapat dihitung menggunakan persamaan linier yang didapat dari kurva kalibrasi yaitu y=0,0312x-0,0026 dengan cara memasukkan nilai absorbansi sampel. Sampel pertama yaitu sampel sapi dan diperoleh ratarata absorbansi setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,255 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 8,277 ppm. Sampel kedua yaitu sampel babi dan diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,430 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 13,886 ppm. Sampel ketiga yaitu sampel sapi dan diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,313 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 10,126 ppm. Sampel keempat yaitu sampel sapi dan diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,529 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 17,038 ppm. Sampel kelima yaitu sampel kambing dan diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran


37

sebesar 0,325 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 10,500 ppm. Semua sampel mengandung hidroksiprolin dengan kadar yang berbeda-beda karena menggunakan sumber bahan baku yang berbeda yaitu sapi, babi dan kambing. Pada sampel nomor 1, 3, dan 4 menggunakan bahan baku yang sama yaitu sapi tetapi proses ekstraksi bahan baku menjadi gelatin dilakukan dengan cara yang berbeda sehingga diperoleh kandungan kolagen pada gelatin yang berbeda pula. Hal ini mengakibatkan kadar hidroksiprolin dalam gelatin juga tidak sama. Hasil uji analisis sampel dapat dilihat pada Gambar 4.4. Data hasil analisis hidroksiprolin pada sampel dapat dilihat selengkapnya pada lampiran 9 tabel 5.5.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan 1. Parameter validasi untuk penetapan kadar asam amino hidroksiprolin meliputi uji linearitas, LOD (batas deteksi), LOQ (batas kuantitasi), uji akurasi (% diff), dan uji presisi (relatif standar deviasi dan standar deviasi). Berdasarkan hasil validasi metode tersebut dapat disimpulkan bahwa metode analisis hidroksiprolin yang digunakan dalam penelitian ini valid karena telah memenuhi persyaratan. 2. Sampel pertama mengandung hidroksiprolin sebesar 8,277 ppm, sampel kedua sebesar 13,886 ppm, sampel ketiga sebesar 10,126 ppm, sampel keempat sebesar 17,038 ppm dan sampel kelima sebesar 10,500 ppm.

5.2

Saran Sebaiknya pada penelitian selanjutnya dilakukan analisis penetapan kadar hidroksiprolin dalam produk yang beredar dipasaran seperti kapsul lunak dan kapsul keras.

38


DAFTAR PUSTAKA

Almatsier, S. 2006. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama. Amin, B., Viviane, P., Alain, R., Jacques, P.B. 1982. A New Sensitive Method for the Quantitative Evaluation of the Hydroxyproline Isomers. Analytical Biochemistry, 122:52-57. Anonim. 2005. ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of Analytical Procedures : Text and Methodology. Ardianingsih, Retno. 2009. Penggunaan HPLC Dalam Deteksi ION. Berita Dirgantara, 4 (10):101-104. Association of Analytical Communities. 2002. AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplement and Botanicals. Bailey, P.D. 1990. An Introduction to Peptide Chemistry. Wiley Interscience. New York. Bustillos, R.J.A., C.W. Olsen., D.A. Olson, B. Chiou, E. Yee, P.J. Bechtel and T.H. McHugh. 2006. Water vapor permeability of mammalian and fish gelatin films. Journal of Food Science, 4(71):202-207. Cassab, Gladys I. 1998. Plant Cell Wall Protein. Plant Mol Biol, 49:281-309. Daniela, O.A. 2014. Study and determination of meat products quality. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies, 20(4):363-368. Darwin, J.Prockop and Sidney, Udenfriend. 1960. Specific Method for the Analysis of Hydroxyproline in Tissues and Urine. Analytical Biochemistry, 1:228-239. Dewi, H., and Iriane, S. 2007. Pengenalan dan Proses Pembuatan Gelatin. Jurnal ilmu-ilmu pertanian, 1(3):39-48. Dhillon, M.K. Sandeep,K., G.T,Gujar. 2014. A Common HPLC-PDA Method For Amino Acid Analysis In Insects and Plants. Indian Journal of Experimental Biologi, 52:73-79. Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Jakarta. Elijah, Adams and Leonard, Frank. 1980. Metabolism of Proline And The Hydroxyproline. Ann. Rev. Biochem, 49:1005-1061.

39


40

Eriawan, R., Idah, R., Prasetyawan, Y., Olivia, B., Erna, Y. 2013. Efektifitas Khasiat Pengobatan Luka Bakar Sediaan Gel Mengandung Fraksi Ekstrak Pegagan Berdasarkan Analisis Hidroksiprolin dan Histopatologi Pada Kulit Kelinci. Bul Penelit Kesehatan, 1(41):45- 60. Fischer, E. 1902. Gelatin Manufacturers Institute of America.USA. 35:2660-2665. George, Carlson. 2009. Determination of Hydroxyproline Content as a Measure of Fibrosis in Nondystrophic and Dystrophic Skeletal Muscle. Gholib, Ibnu dan Abdul, Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar. Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksananaan Validasi Metoda Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, 3(1):117-135.

dan

Cara

Harmita. 2006. Analisa Fisikokimia. Jakarta : UI Press. Jaswir, Irwandi. 2007. Memahami Gelatin, http//www.BeritaIptek.Com. Jitender, K.J., A. Devi, Varaprasad, Reddy, Sunita,M, Hanjabam, M.D., G. Vidya Sagar Reddy and G. Venkateshwarlu. 2012. Characterization of fish gelatin from Blackspotted Croaker (Protonibea diacanthus). Archives of Applied Science Research, 4(3):1353-1358. Jun, G., Yi, Z., Guiyou,Z., Chengyin,W., Qishu,Q., Xiaoya,H,. Guoxiu,W. 2014. Determination of Proline, Hydroxyproline, and N–Ethylglycine In Urine By Using A New HPLC Labeling Reagent and its Application In Detection of Tumor Markers. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. Kelly, L., Gorres, Ronald, T., Raines. 2010. Review Artikel Prolyl 4-hydroxylase. USA. University of Wisconsin Madison. Merinda, H. 2013. Analisis Kadar Protein dan Identifikasi Asam Amino Pada Ikan Patin. Jurusan Kimia Universitas Jember. (Skripsi). Munson, J.W. 1991, Analisis Farmasi Metode Modern. Surabaya : Airlangga University Press. N. Yu. Ignat’eva., N. A. Danilov., S. V. Averkiev., M. V. Obrezkova., V. V. Lunin., E. N. Sobol,. 2007. Determination of Hydroxyproline in Tissues and the Evaluation of the Collagen Content of the Tissues. Journal of Analytical Chemistry, 1(62):51-57.


41

Pecsok, R.L., L.D.Shileds, T. Cairns, and I.G. Mcwilliam. 1976. Modern methods of chemical analysis. 2nd ed. John Wiley and Sons, Inc.. New York. Pier, A.B., Luca, M.C., Maria, R.S. 1997. A New Procedure for the Specific High-Performance Liquid Chromatographic Determination of Hydroxyproline. Journal of Chromatographic Science, Vol. 35. Poedjiadi, A. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press. Rafik, B., Mourad, J., Assaad, S., Nabil, S., Naima, N.A., Didier, G., Moncef, N. 2011. Extraction and functional properties of gelatin from the skin of cuttlefish (Sepia officinalis) using smooth hound crude acid protease-aided process. Journal Food Hydrocolloid. Rajesh, Kamble, Shrangdher, S.T., Koli, J.M. 2014. Physico-Chemical Properties Of Gelatin Extracted From Calta Skin (Calta Catla) (Hamilton, 1822). Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences, 4:328-337. Rizky, A.R., Fatimah,N., Elok,M. 2013. Ekstraksi Gelatin dari Tulang Tenggiri Melalui Proses Hidrolisis Menggunakan Larutan Basa. Jurusan Farmasi UHAMKA Jakarta. Sidik, Abubakar. 2009. Struktur dan Fungsi Protein Kolagen. Jurnal Pelangi Ilmu 5(2). Shila, G. and Natasa, S.B. 2009. Wound healing properties of Carica papaya latex: In vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology, 121:338–341. Skoog, D.A. and D.M. West. 1971. Principles of instrumental analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc., New York. Suzanne, M., et al. 1998. High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Amino Acid- and Peptide-Derived Chloramines. Journal of Chromatographic Science, Vol. 36. Tobias, L., Natividad, G.V., Ralf, H. 2007. Analysis of hydroxyproline isomers and hydroxylysine by reversed-phase HPLC and mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 847:282-288. Winarno, FG. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Wulandari, N. 2007, Validasi Metode Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet untuk Penentuan Reserpin dalam Tablet Obat, Departemen Kimia FMIPA IPB, Bogor. (Skripsi). Yan, X., Xin, W., Xiao, J., Nai, Y., Kuo, C. 2014. Predicting Hydroxyproline and Hydroxylysine in Proteins by Incorporating Dipeptide Position Specific


42

Propensity into Pseudo Amino Acid Composition. International Journal of Molecular Sciences, 15:7594-7610.


43

LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema Pembuatan Reagen a.

Skema pembuatan HCl 6 N Dipipet sebanyak 50 ml larutan HCl 36,7%

Masukkan ke dalam labu ukur 100 ml

Tambahkan aquades sampai tanda batas

Kocok sampai homogen b.

Skema pembuatan NaOH 4 N Ditimbang sebanyak 16 gram NaOH



Kocok sampai homogen c.

Skema pembuatan NaCl 0,3 M Ditimbang sebanyak 877,5 gram NaCl



Kocok sampai homogen


44

d.

Skema pembutan larutan chloramin T 7%

Ditimbang sebanyak 350 mg chloraminT-hidrat



Kocok sampai homogen e.

Skema pembuatan larutan oksidan

Dipipet sebanyak 2 ml larutan chloramin T

Masukkan larutan ke dalam labu ukur 10 ml

Tambahkan buffer asetat/sitrat pH 6 sampai tanda batas

Kocok sampai homogen f.

Skema pembuatan buffer asetat/sitrat pH 6 Masukkan 70 ml aquades ke dalam labu ukur 100 ml

Ditambah 1,2 ml asam asetat glasial ke dalam labu secara perlahan

5 gram asam sitrat monohidrat

Tambahkan aquades sampai 90 ml

3,4 gram natrium hidroksida

12 gram natrium asetat trihidrat

Cukupkan pH sampai 6

Tambahkan aquades sampai 100 ml dan cek pH kembali


45

g.

Skema pembuatan reagen ehrlich

PDAB ditimbang sebanyak 12 gram

Larutan asam sulfat dipipet sebanyak 2,74 ml

Tambahkan 20 ml etanol absolut

Tambahkan 20 ml etanol absolut

Larutan A

Larutan B

Tambahkan larutan B ke dalam larutan A

Aduk sampai homogen lalu masukkan larutan ke dalam kulkas

Tunggu larutan sampai terbentuk kristal


46

Lampiran 2 Skema Kerja Pembuatan Larutan Blanko

Pipet aquades sebanyak 10 ml larutan


Tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat pH 6

Pipet larutan sebanyak 1 ml larutan


Tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda batas

Masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup

Tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl

Vortex selama 4 menit

Inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC diatas shakingbath

Tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml

Amati serapan dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm


47

Lampiran 3 Bagan Skema Kerja a.

Skema pembuatan larutan baku hidroksiprolin

Larutan Baku

Larutan baku induk hidroksiprolin 1000 ppm

Larutan baku kerja 100 ppm

Ditimbang sebanyak 10 mg standar hidroksiprolin

Dipipet sebanyak 5 ml dari larutan induk hidroksiprolin 1 mg/ml

Masukkan serbuk ke dalam labu ukur 10 ml

Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen




48

b.

Skema penentuan panjang gelombang maksimum 9 ppm

Dipipet sebanyak 0,9 ml larutan standar hidroksiprolin 100 ppm




Masukkan semua larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml




Pipet sebanyak 1 ml larutan






Amati serapan dengan spektrofotometri UVVis pada panjang gelombang 400-800 nm


49

c.

Skema kerja pembuatan kurva kalibrasi 3, 6, 9, 12, 15, 18 ppm dan penentuan linearitas

Pipet sebanyak 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, dan 1,8 ml dari larutan standar hidroksiprolin 100 ppm

Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml




Masukkan masingmasing larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml


Pipet masingmasing larutan sebanyak 1 ml larutan

Masukkan masingmasing larutan ke dalam tabung reaksi tertutup







50

Lampiran 4 Skema Analisis Hidroksiprolin dalam Sampel Gelatin Secara Kuantitatif

Timbang sebanyak 10 mg sampel

Hidrolisis sampel dengan menambahkan HCl 6 N sebanyak 5 ml

Inkubasi sampel selama 12 jam pada suhu 110oC di dalam oven


Pipet larutan sampel sebanyak 1 ml larutan

Sampel dinetralkan dengan cara menambahkan NaOH 4 N






Pipet larutan sebanyak 1 ml larutan






51

Lampiran 5 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas Tabel 5.1 Hasil Data Uji Linearitas Larutan Standar Hidroksiprolin Konsentrasi (ppm)

Absorbansi

0

0

3

0,089

6

0,185

9

0,280

12

0,368

15

0,455

18

0,568

Keterangan : Persamaan regresi

: y=0,0312x-0,0026

Koefisien korelasi (r)

: 0,9991

Panjang gelombang maksimum

: 563,5 nm


52

Lampiran 6 Batas Deteksi dan Kuantitasi Tabel 5.2 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin Konsentrasi (ppm)

Absorbansi (y)

y'

y - y'

(y - y')2

0

0

-0,0026

0,0026

0,00000676

3

0,0895

0,091

-0,0015

2,25E-06

6

0,1850

0,1846

0,0004

1,6E-07

9

0,2805

0,2782

0,0023

5,29E-06

12

0,3685

0,3718

-0,0033

1,089E-05

15

0,4555

0,4654

-0,0099

9,801E-05

18

0,5685

0,559

0,0095

9,025E-05 0,00021361

Jumlah

S(y/x) = √

=√

=√

=√

LOD =

=

= 0,691 ppm

LOQ =

=

= 2,094 ppm

= 0,006536207


53

Lampiran 7 Uji Kecermatan (Akurasi) Tabel 5.3 Data Uji Akurasi (%diff) Kadar (ppm)

5

10

16

Absorbansi

Kadar yang diperoleh (ppm)

% diff

0,148

4,826

-3,461

0,159

5,179

3,589

0,155

5,051

1,025

0,300

9,698

-3,012

0,320

10,339

3,397

0,298

9,634

-3,653

0,521

16,782

4,887

0,503

16,205

1,282

0,459

14,794

-7,532

Rata-rata

Rata-rata % diff

0,384

-1,089

-0,454

-0,386


54

Lampiran 8 Uji Keseksamaan (Presisi) Tabel 5.4 Data Uji Keseksamaan Pada Tiga Konsentrasi Hidroksiprolin

Kadar (ppm)

Kadar yang Absorbansi

diperoleh

x-x'

(x-x')2

SD

RSD (%)

0,178

0,035

0,215

0,021

1,477

0,092

0,623

0,050

(ppm) (x) 0,148

4,826

-0,192

0,036

0,159

5,179

0,160

0,025

0,155

5,051

0,032

0,001

5

x’ = 5,019

∑ = 0,063

0,300

9,698

-0,192

0,036

0,320

10,339

0,448

0,201

0,298

9,634

-0,256

0,065

10

x’ = 9,891

∑ = 0,304

0,521

16,782

0,854

0,730

0,503

16,205

0,277

0,077

0,459

14,794

-1,132

1,282

16

x’ = 15,927 Rata-rata

∑ = 2,090


55

Lampiran 9 Uji Sampel Gelatin Tabel 5.5 Data Uji Kandungan Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin

Sampel

Absorbansi

Rata-rata absorbansi

0,280 Sampel 1

Sampel 2

Sampel 3

Sampel 4

Sampel 5

0,247

Kadar (ppm)

0,255

8,000 7,775

0,450

14,506 0,430

12,935

0,441

14,217

0,275

8,897

0,345

0,313

11,141

0,320

10,339

0,500

16,109

0,587

0,529

18,897

0,500

16,109

0,322

10,403

0,334 0,319

kadar (ppm)

9,057

0,240

0,401

Rata-rata

0,325

10,788

8,277

13,886

10,126

17,038

10,500

10,307


56

Lampiran 10 Rumus-Rumus Tabel 5.6 Rumus-Rumus

Nama Rumus

Sb

Formula

Sy/x = √

LOD

LOD =

LOQ

LOQ =

%diff

SD

%RSD

% diff =

SD = √

RSD =


57

Lampiran 11 Perhitungan Konsentrasi Hidroksiprolin

Konsentrasi awal = 10 mg dalam 10 ml aquades = 1000 ppm Konsentrasi untuk larutan kerja 100 ppm 5 ml Hidroksiprolin 1000 ppm dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, kemudian dicukupkan dengan aquades hingga tanda batas. V1 x C1 V1 x 1000 ppm V1

=

V2 x C2

=

50 ml x 100 ppm

=

5000 / 1000

=

5 ml

Dari larutan kerja 100 ppm, kemudian diambil beberapa ml dan dicukupkan dengan aquades hingga garis batas pada labu 10 ml sehingga diperoleh larutan yang mengandung 3 ppm, 6 ppm, 9 ppm, 12 ppm, 15 ppm dan 18 ppm. Contoh untuk larutan hidroksiprolin yang mengandung 9 ppm V1 x C1

=

V1 x 100 ppm = V1 = =

V2 x C2 10 ml x 9 ppm 900 / 100 9 ml


58

Lampiran 12 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi

Penambahan Buffer asetat/sitrat pH 6 Nacl Isopropanol Chloramin T

Penambahan Reagen ehrlich

Setelah inkubasi selama 25 menit suhu 60oC

Gambar 5.1 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi


HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Recommend Documents