Gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus és daganatellenes hatása molekuláris mechanizmusának vizsgálata

Gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus és daganatellenes hatása molekuláris mechanizmusának vizsgálata Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés Dr. Rozmer Zsuzsanna

Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Pintér Erika Programvezető: Prof. Dr. Gregus Zoltán Témavezető: Prof. Dr. Perjési Pál Konzulens: Prof. Dr. Gregus Zoltán Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Gyógyszerészi Kémiai Intézet Pécs 2014.

0

Tartalomjegyzék I.

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................ 3

II. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS ......................................................... 5 II.1. TERMÉSZETES KALKONOK ÉS BIOLÓGIAI HATÁSAIK .......................................... 7 II.2. SZINTETIKUS KALKONSZÁRMAZÉKOK ............................................................. 10 II.2.1. Kalkonok szintetikus előállítása ........................................................... 10 II.2.2. Szintetikus kalkonszármazékok biológiai vizsgálatának célja és háttere ............................................................................................... 11 II.2.3. Gyűrűs kalkonanalógok szintézise és szerkezete.................................. 15 II.2.4. Gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus hatása és szerkezete közötti kapcsolat ................................................................................... 17 II.2.5. Gyűrűs kalkonszármazékok daganatellenes hatása .............................. 19 III. CÉLKITŰZÉSEK.................................................................................................. 21 IV. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ............................................................................. 24 IV.1. KALKONSZÁRMAZÉKOK LOGP ÉRTÉKEINEK MEGHATÁROZÁSA ...................... 24 IV.1.1. Vizsgált anyagok................................................................................... 24 IV.1.2. Fordított-fázísú vékonyréteg-kromatográfiás módszer ......................... 25 IV.2. GYŰRŰS KALKONSZÁRMAZÉKOK HATÁSMECHANIZMUSÁNAK VIZSGÁLATA ... 25 IV.2.1. Kísérleti anyagok és sejtkultúra ............................................................ 25 IV.2.2. Sejtkezelési protokoll ............................................................................ 26 IV.2.3. „Túlélés”-vizsgálat................................................................................ 26 IV.2.4. Áramlási citometriai módszerek ........................................................... 26 IV.2.4.1. Az áramlási citometria ......................................................................................... 26 IV.2.4.2. Sejtszaporodásra gyakorolt hatás vizsgálata ........................................................ 27 IV.2.4.3. Sejtciklus-vizsgálat .............................................................................................. 28

IV.2.5. A vegyületek in vitro antioxidáns hatásának vizsgálata dezoxiribóz degradációs módszerrel ..................................................... 28 IV.2.6. A kalkonanalógok celluláris redox-homeosztázisra gyakorolt hatásának vizsgálata .............................................................................. 29 IV.2.6.1. Az intracelluláris ROS-aktivitás meghatározása .................................................. 29 IV.2.6.2. Mitokondriális funkciókra gyakorolt hatás vizsgálata.......................................... 30

1

IV.2.6.3. A celluláris tiolszint meghatározása ..................................................................... 30 IV.2.6.4. A celluláris redukált és oxidált glutationszint vizsgálata ..................................... 31

IV.2.7. A kalkonszármazékok glutationnal való reaktivitásának vizsgálata .............................................................................................. 33 IV.2.7.1. A kalkon-glutation reakció vizsgálata sejtmentes körülmények között ............... 33 IV.2.7.2. A kalkon-glutation reakció vizsgálata Jurkat T sejtekben HPLC-MS módszerrel 33

V. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK .................................................... 35 V.1. KALKONANALÓGOK LIPOFILITÁSÁNAK JELLEMZÉSE ....................................... 35 V.2. GYŰRŰS KALKONSZÁRMAZÉKOK HATÁS-VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI ....... 41 V.2.1. Az (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-benzoszuberon és 4-metilanalógjának sejtproliferációra és sejtciklusra gyakorolt hatása .................................................................................................... 41 V.2.1.1. A kalkonanalógok apoptózist indukálnak Jurkat T sejtekben ................................ 41 V.2.1.2. A vizsgált származékok eltérő módon befolyásolják a sejtciklust ......................... 45

V.2.2. A kalkonszármazékok in vitro antioxidáns hatással bírnak .................. 50 V.2.3. A kalkonszármazékok hatással vannak a Jurkat T sejtek redox státuszára..................................................................................... 53 V.2.3.1. A vegyületek befolyásolják a ROS-aktivitást ........................................................ 53 V.2.3.2. A kalkonszármazékok hatással vannak a mitokondriális funkciókra .................... 55 V.2.3.3. A kalkonanalógok befolyásolják a celluláris SH-szintet ....................................... 57 V.2.3.4. A kalkonszármazékok hatása a Jurkat sejtek glutation státuszára ......................... 58

V.2.4. A kalkon-glutation konjugációs reakció vizsgálata .............................. 61 V.2.4.1. A vizsgált kalkonszármazékok intrinsic aktivitást mutatnak glutationnal ............. 61 V.2.4.2. A kalkonanalógok és glutation konjugációs reakciójának vizsgálata Jurkat T sejtekben ................................................................................................................ 63

VI. ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA, MEGBESZÉLÉS........................ 67 VII. IRODALOMJEGYZÉK ...................................................................................... 71 VIII. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK .................................................................................... 85 IX. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................... 89

2

I.

Rövidítések jegyzéke ATP

adenozin-5’-trifoszfát

ADP

adenozin-5’-difoszfát

BCA

bicinkoninsav

BSA

marha szérum albumin (bovine serum albumin)

CHI

kalkon-izomeráz

CHS

kalkon-szintáz

CYP

citokróm-P450 enzimrendszer

C4H

fahéjsav-4-hidroxiláz

DAD

diódasoros detektor

DCFH-DA

2’,7’-diklorofluoreszcein-diacetát

DMBA

7,12-dimetil-benz[α]antracén

DMSO

dimetil-szulfoxid

DNS

dezoxiribonukleinsav

DTNB

5,5'-ditiobisz-(2-nitrobenzoesav)

EDTA

etiléndiamin-tetraecetsav

EpRE

electrophile response element

ESI

elektrospray-ionizáció

FITC

fluoreszcein-izotiocianát

FCS

fötális borjú savú (fetal calf serum)

FSC

besugárzó fény irányával megeegyező irányú fényszóródás (forward scatter)

GC

gázkromatográfia

GCL

glutamát-cisztein-ligáz

GGT

gamma-glutamil-transzpeptidáz

GSH

redukált glutation

GSSG

oxidált glutation

GST

glutation-S-transzferáz

HPLC

nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

IR

infravörös spektroszkópia

KE

karboxiláz enzim

Keap1

Kelch-like ECH-associated protein 1

3

logP

megoszlási hányados logaritmusa

MALDI

mátrix közvetítésével végzett lézer deszorpciós ionizáció

MS

tömegspektrometria

NADPH

redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát

NEM

N-etilmaleimid

NMR

mágneses magrezonancia

Nrf2

nuclear factor erythroid 2-related factor 2

OPA

orto-ftálaldehid

PAH

policiklusos aromás szénhidrogén

PAL

fenilalanin-ammónia-liáz

PBS

NaCl-tartalmú foszfát-tompítóoldat (phosphate buffered saline)

PGEE

prosztaglandin E1-etilészter

PI

propidium-jodid

RNS

ribonukleinsav

ROS

reaktív oxigénszármazék

RP-HPLC

fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

RP-TLC

fordított fázisú vékonyréteg-kromatográfia

RPMI

Roswell Park Memorial Institute sejttenyésztő médium

SF

shake-flaske method

SH

tiolcsoport

SDS

nátrium-laurilszufát

SSC

fény oldalirányú szóródása (side scatter)

TBA

tiobarbitursav

TGSH

totál glutation

TOF-MS

time of flight / repülési idő tömegspektrometria

UDP

uridin-5’-difoszfát

VRK

vékonyrétegkromatográfia

4CL

4-kumarát-koenzimA-ligáz

γGCS

gamma-glutamil-cisztein-szintáz

4

II. Bevezetés, irodalmi áttekintés A daganatos megbetegedések korunk egyik legaggasztóbb népegészségügyi problémája. Magyarországon, mint az iparilag fejlett országokban általában, a legtöbb ember a szív és keringési rendszert érintő betegségekben hal meg, de a daganatos betegségek a halálokok gyakoriságának sorrendjében a második helyen állnak, az összhalálozás közel egynegyedét teszik ki. A főbb daganatos halálokok nemenként különbözőek: férfiak esetén a daganatos halálokok több mint háromnegyedét az emésztőrendszeri és a légzőszervi daganatok teszik ki, míg a nők között az emésztőszervi, a légzőszervi, valamint az emlő- és méhdaganatok közel egyenlő százalékban okoznak halált. A daganatos halálozás abszolút számait tekintve a hazai érték mindkét nem körében magasabb, mint az európai átlag. (1) Mindezek a jelenségek előtérbe helyezik a daganatos megbetegedések megelőzésére és kezelésére irányuló lehetőségek és módszerek az eddigieknél még hatékonyabb kutatását. A daganatos megbetegedések kialakulása, vagyis a karcinogenezis egy hosszú, többlépcsős folyamat, melynek során a daganatsejtben mind több mutáció és hiba halmozódik fel, és egyre jobban elvész a sejszaporodás kontrollja. A folyamat első fő stádiuma az iniciáció, amikor spontán, vagy mutagén behatások mutációt váltanak ki a genomban. A promóció során rögzülnek a genetikus hibák, hiszen promóterek hatására a károsodott DNS expresszálódik, sejt-elfajulásokat okozva. Az invázió a rögzült genetikus hibáknak az utódsejtek egyre nagyobb számában történő megjelenése, malignus tumorok kialakulása. A progresszió egy komplex folyamat, amely ahhoz vezet, hogy az elfajult sejtek elszaporodnak, klinikai daganat alakul ki, metasztázisok jelennek meg. (2; 3) (1. ábra) A karcinogenezis folyamatába több ponton történhet beavatkozás. (1. ábra) A daganatos megbetegedések elsődleges megelőzését a kockázati tényezők elkerülése, vagy legalábbis csökkentése, a kemoprevenció és az egészségnevelés jelentik. A kemoprevenció a DNS állomány károsítására alkalmas karcinogén formák, a DNS nukleofil centrumaival szemben nagy reakciókészséget mutató elektrofil tulajdonságú részek képződésének gátlása és/vagy eliminációjuk elősegítése, vagyis a genommal történő interakciójuk meggátlása. A tudatos kemoprevenció lényege, hogy természetes eredetű vagy szintetikus anyagokat hosszú időn keresztül fogyasztunk annak érdekében, hogy a daganat

5

kialakulását megelőzzük, vagy a még reverzibilis folyamatot visszafordítsuk. Számos epidemiológiai tanulmány döntő bizonyítékot nyújt néhány étrendi összetevő (pl. vitaminok,

fenolos

és

nem-fenolos

antioxidánsok,

omega-3-zsírsavak

stb.)

kemopreventív hatásáról. Többek között a friss zöldségekben és gyümölcsökben nagy mennyiségben előforduló polifenolok (főként flavonoidok) is csökkentik a rák kialakulásának rizikóját. (4; 5)

1. ábra A karcinogenezis többlépcsős folyamata – beavatkozási lehetőségek, preventív stratégiák (3) A karcinogenezis folyamatának egy másik stádiumába történő beavatkozási lehetőséget jelentenek a kemoterápiás gyógyszerek. A citosztatikumok különböző hatásmechanizmus révén, de végső soron apoptózis indukciója és ezáltal a daganatnövekedés gátlása útján hatnak. Szelektív toxicitásuk alapja, hogy a daganatos sejtek osztódása gyorsabb, mint az egészséges sejteké, de alkalmazásuk során jelentős mellékhatásokkal kell számolni. Bár folyamatosan számos új kemoterápiás szer kerül

6

bevezetésre, a hatékonyságot és a vegyületek szelektív toxicitását növelő kutatások továbbra is a daganatellenes kutatások intenzív területét képezik.

II.1. Természetes kalkonok és biológiai hatásaik A természetes növényi hatóanyagok egyik gyógyászati szempontból is széles körben vizsgált csoportját képezik a flavonoidok. Nagyobbrészt ezek okozzák a virágok és termések sárga, piros és kék színét. A flavonoidok formailag a difenilpropánból levezethető (C6-C3-C6 alapszénváz) vegyületek, a két benzolgyűrű általában egy oxigéntartalmú heterocikluson keresztül kapcsolódik. (6) A flavonoidok csoportján belül

számos

alcsoportot

(flavonok,

flavonolok,

flavanonok,

flavanonolok,

antocianidinek, proantocianidinek, katechinek, kalkonok, auronok) különböztethetünk meg, ugyanis az alapszerkezet nagy változatosságot biztosít mind a gyűrűk kapcsolódási típusa, mind az összekapcsoló gyűrű szerkezete, mind a szubsztituensek tekintetében. (2. ábra)

2. ábra A flavonoidok kapcsolódási típusai A flavonoidok főként fenolos hidroxil- és metoxicsoportokat tartalmazó természetes vegyületek, az alapvázhoz (aglikon) különböző – minőségű, számú és helyzetű – cukormolekulák kapcsolódhatnak, így glükozidokat hozhatnak létre, amelyek sokkal gyakrabban fordulnak elő a természetben, mint aglikonjaik. A növényi flavonoidok szerepéről, kémiai szerkezetéről, élettani hatásairól rendszeresen jelennek meg összefoglaló tanulmányok. (7; 8; 9; 10; 11) Igen széles körű biológiai aktivitással rendelkeznek, például a citrusfélékben nagy mennyiségben megtalálható heszperidin antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatása mellett értonizáló. (12) A máriatövis hatóanyagai (pl. szilimarin, szilibin) májvédő hatásúak (13), a kerti ruta (Ruta graveolens L., hatóanyaga a rutin, ami a kvercetin rutinózzal alkotott glikozidja) gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatása révén szintén régóta használt reumás megbetegedések, dermatitisz kezelésében, valamint görcsoldóként. (14)

7

A flavonoidok jellegzetes szerkezetű csoportját képezik a kalkonok. A kalkonok szerkezetüket tekintve 1,3-diaril-2-propén-1-on alapvázzal rendelkező vegyületek. (3. ábra)

3. ábra A kalkon szerkezete A növényi kalkonok további átalakulásaik révén a flavonoidok előanyagainak is tekinthetők. A kalkonok és flavonoidok biogenezisére a legvalószínűbbnek és általánosan elfogadottnak a 4. ábra vázolt bioszintetikus út tekinthető. (15; 16; 17) A kalkonok bioszintézisének első lépéseiben fenilalaninból, fenilalanin-ammónialiáz (PAL) enzim által katalizált dezaminálással fahéjsav képződik, melynek hidroxilezését membránhoz kötött P450 monooxigenáz (fahéjsav-4-hidroxiláz, C4H) végzi. Az így kialakult p-hidroxikumarilsav aktiválását 4-kumaroil-CoA-vá a 4kumarát-koenzimA-ligáz (4CL) végzi. A kalkonok B-gyűrűje 4-kumaroil-CoA-ból a kalkon-szintáz segítségével (CHS) képződik, míg az A-gyűrű három – acetil-CoA-ból és CO2-ból acetil-CoA-karboxiláz enzim (KE) hatására képződő – malonil-CoA egységekből épül fel. (18) A kalkonok sztereospecifikus gyűrűzáródása a kalkon-izomeráz (CHI) enzim hatására következik be, és flavanonszármazékok keletkeznek, melyek megfelelő enzimkatalízissel további flavonoidokká és izoflavonoidokká alakulhatnak tovább. A kalkonszármazékok előfordulása általános a magasabbrendű növényekben. Irodalmi adatok alapján a Leguminosae család több mint 70 fajtájából izoláltak különböző szerkezetű kalkonokat, de az Asteraceae és Moraceae családok számos képviselőjében is megtalálhatóak. (18) Ugyanakkor egyes növényfajták igen nagyszámú, különböző kalkont tartalmaznak egymás mellett. A Cannabaceae családba tartozó Humulus lupus gyantájában például 18 fajta kalkonszármazék fordul elő. A Glycyrrhiza inflata gyökeréből 15 féle, az Angelica keiskei gyökeréből 25 kalkonanalógot különítettek el. (18)

8

4. ábra A kalkonok bioszintézise A növényi kalkonok főként hidroxil- és metoxiszubsztituált származékok, de metil-, prenil-, geranilcsoportokat hordozó analógok, kromén- és benzofurán heterociklusokat tartalmazó származékok, valamint kalkon-dimerek és dihidrokalkonszármazékok is előfordulnak a természetben. A vegyületek sokrétű biológiai hatással rendelkeznek. Kalkonban gazdag növényi drogokat, például az édesgyökeret (Liquorice), évszázadok óta használják Kínában gyomor- és duodenális fekély kezelésére, különböző bőrproblémák, többek között ekcéma és urtikária, valamint asztma terápiája során. (19) A távol-keleti országokban tradícionálisan használják a buteint fájdalomcsillapításra, gasztritisz kezelésére, különböző paraziták okozta fertőzésekben. (20; 21) A leggyakrabban vizsgált természetes származékok az izoliquiritigenin, a butein, az izobavakalkon, a

9

xantoangelol, a likokalkon-A és a 4-hidroxi-lonhokarpin. (18) A természetes kalkonok között megtalálhatóak antibakteriális (22), gombaellenes (23), vírusellenes (24), protozonellenes (25) és tumorellenes (citotoxikus) hatású (26; 27) származékok, úgymint kemoprotektív (28), kardioprotektív (29), antidiabetikus (30) hatással bíró vegyületek. Az irodalmi eredmények alapján a leghatékonyabb tumorellenes hatású származékoknak az izoliquiritigenin és butein bizonyultak.

II.2. Szintetikus kalkonszármazékok II.2.1. Kalkonok szintetikus előállítása A kalkonszármazékok laboratóriumi előállítására több lehetőség is rendelkezésre áll. Kalkonok szintézise történhet Claisen-Schmidt féle kondenzációs reakció útján. (5. ábra) (31) A reakció keresztezett aldoldimerizációs reakciónak tekinthető, amelynek során a megfelelő keton és aldehid között nukleofil addíció játszódik le, és vízkihasadással a megfelelő kalkonszármazék keletkezik.

5. ábra Claisen-Schmidt féle kondenzációs reakció A kalkonok szintézisére alkalmas ún. Makaiyama-típusú aldolkondenzációs reakció a Claisen-Schmidt féle reakcióhoz hasonló mechanizmussal játszódik le. (32) A Suzuki-reakción alapuló eljárások szintén lehetőséget teremtenek kalkonok előállítására. (6. ábra) (33) A Suzuki-reakció cinnamoil-klorid és fenil-bórsav, illetve benzoil-klorid és fenilvinil-bórsav között, palládium katalizátor jelenlétében lejátszódó keresztkapcsolási reakció.

10

6. ábra A Suzuki-féle kalkonszintézis egyenletei Dihidrokalkonok szintézise, palládium katalizátor jelenlétében, 1-aril-2-propén-1ol és orto-halogénszubsztituált-fenol összekapcsolása révén történhet. (7. ábra) (34)

7. ábra Dihidrokalkonok szintézisének egyenlete

II.2.2. Szintetikus kalkonszármazékok biológiai vizsgálatának célja és háttere A növényekből izolált kalkonok vizsgálata mellett nagyszámú szintetikus származék biológiai vizsgálatáról is beszámoltak, több összefoglaló közlemény is megjelent a témában. (22; 35; 36; 37) A szerteágazó biológiai hatások közül kiemelhető a citotoxikus és kemoprotektív hatás. A szintetikus kalkonszármazékok szintézisének és biológiai vizsgálatainak egyik előnye, hogy a rokon szerkezetű vegyületek összehasonlító vizsgálata során adatok nyerhetők a szerkezet-hatás közötti kapcsolatról. Így a szintetikus származékok kiemelt kutatási célja a természetes vegyületeknél hatékonyabb, főként a daganatterápiában eredményesen alkalmazható analógok előállítása. Az erre irányuló kutatások kémiai hátterében az áll, hogy a kalkonok, mint α,βtelítetlen karbonilvegyületek (3. ábra) lágy elektrofilek, viszonylag könnyen reakcióba léphetnek celluláris tiolokkal (lágy nukleofilek), ugyanakkor nem reagálnak amino- és hidroxilcsoportokkal. (38) Mivel kémiailag nem reagálnak nukleinsavakkal, így a

11

kalkonszármazékok nem rendelkeznek genotoxikus hatással, ami a daganatterápiában alkalmazott alkiláló típusú szerek egyik nemkívánt mellékhatása. (39)

A glutation szerepe A sejtekben levő tiol (SH)-csoportok nagy többsége glutationból (GSH) származik. A GSH intracellulárisan viszonylag nagy mennyiségben jelen levő nem-protein típusú tiol, glicint, ciszteint és glutaminsavat tartalmazó tripeptid. (8. ábra)

8. ábra A glutation (GSH) szerkezete A sejtek redox homeosztázisában igen fontos az intracelluláris redukált glutationszint fenntartása. A GSH kofaktora az oxigéntartalmú szabadgyökök, hidrogén-peroxid, illetve egyéb organikus peroxidok eliminációjában részt vevő glutation-peroxidáz enzimnek. A redukált glutation (GSH) oxidációja során két glutationmolekula diszulfid híddal összekapcsolódhat és oxidált glutation (GSSG) keletkezik. A GSSG redukcióját glutation-reduktáz enzim katalizálja NADPH felhasználásával. Normál körülmények között az egyensúly a redukált forma irányába tolódik 500:1 arányban. A redukált glutation koncentrációja magas a sejtekben, akár 5 mM is lehet. (40) A glutation továbbá részt vesz a májban történő detoxikációs folyamatokban is, a szervezetbe kerülő elektrofil vegyületek egy része a májban glutationnal konjugálódik. A két szakaszban zajló folyamat első lépése a glutationnal való kapcsolódás, amit a glutation-S-transzferáz enzim katalizál. A konjugáció a cisztein tiolcsoportján keresztül valósul meg. Ezt követően előbb a γ-glutamil-transzpeptidáz hatására a glutaminsav, majd a dipeptidáz hatására a glicin is lehasad a molekuláról, és a megmaradt konjugált cisztein aminocsoportja acetilálódhat. A konjugáció révén az eredetileg toxikus metabolitok vagy oldhatatlan vegyületek kiválasztásra kerülhetnek. (40)

12

A GSH funkciója tehát igen összetett: többek között detoxikáló folyamatokban vesz részt, antioxidáns, cisztein-rezervoár és szabályozó szerepe van jelátviteli folyamatokban. (41)

A kalkonok citotoxikus hatása A kalkonok citotoxikus hatásának hátterében egyrészt a sejtek glutation-státuszának a befolyásolása állhat. A kalkonszármazékok glutationnal történő reakcióját több kutatócsoport is vizsgálta. (42; 43) A konjugált karbonil-funkcióval rendelkező vegyületek jellegzetes Michaelreakciós akceptorok, így könnyen reakcióba lépnek glutationnal. (44) A kalkonok szerkezetükből adódóan - feltételezhetően szintén reakcióba lépnek GSH-val, főként konjugációs reakció révén. (42) (9. ábra)

9. ábra A kalkon, mint Michael-reakciós akceptor reakciója nukleofil tiollal (GSH) Ugyanakkor, főként a hidroxilszubsztituált származékok, és a belőlük képződő fenoxigyökök, oxidálhatják a GSH-t oxidált glutationná (GSSG), így előidézve a GSHszint csökkenését. (43) A GSH-szint megváltozása az intracelluláris redox-státusz változását vonhatja maga után, ami befolyásolhatja többek között a DNS szintézis folyamatát, a sejtciklus szabályozását, valamint enzimaktivációt, szelektív gén expressziót válthat ki. (45) A kalkonok citotoxikus aktivitásának hátterében még számos más tényező is állhat. A B-gyűrűn elektronszívó szubsztituenst is hordozó hidroxikalkon-analógok kiemelkedő tumorellenes hatást mutattak, amihez hozzájárul az angiogenezist gátló

13

hatásuk is. (46) Ugyanakkor, számos vegyület apoptózist indukál (47; 48), befolyásolja a sejtciklust (48; 49; 50), valamint a mitokondriális membránpotenciál összeomlását eredményezi (43). Az antioxidáns hatású flavonoidok – ideértve a kalkonokat is – citotoxikus hatása összefüggésbe hozható azok esetleges prooxidáns hatásával is. (35; 37; 51) A Fentonreakcióban keletkező hidroxilgyökök (HO˙) és aromás vegyületek reakciója során fenolos-származékok

keletkezhetnek.

(52)

A

keletkező

metabolitok

további

biotranszformációja egy ún. „redox-cycling” reakcióban reaktív oxigén származékok (ROS) képződését eredményezheti, ami oxidatív stressz kialakulásához vezethet, és így az eredetileg antioxidáns vegyület prooxidáns hatású metabolittá válhat. (53) Összeségében

elmondható,

hogy

számos

kalkonszármazék

mikromólos

tartományban (IC50 < 50 μM) citotoxikus aktivitást mutat különböző tumor sejtvonallal szemben. (37)

A kalkonok citoprotektív hatása A daganatsejtekkel szemben mutatott toxicitásuk mellett, a kalkonok citoprotektív hatása is jól dokumentált. A citoprotektív hatás hátterében egyrészt az állhat, hogy a kalkonok és rokon szerkezetű Michael-reakciós akceptorok egyes, a fázis 2 biotranszformációkban részt vevő enzimeket indukálnak. (10; 54; 55) Ezen enzimek, mint például a glutation-S-transzferáz (GST), az UDP-glükuronil-transzferáz, a NAD(P)H:kinon-oxidoreduktáz (fázis 1 enzim) a celluláris védekező mechanizmus meghatározó enzimei, és alapvető szerepet töltenek be a sejtek makromolekuláinak kémiai módosítására irányuló elektrofil vegyületek reaktivitásának eliminálásában. (56) Az antioxidáns és citoprotektív enzimek, fehérjék megnövekedett expressziójának hátterében főként az Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) által aktivált folyamatok állhatnak. Normál fiziológiás körülmények között az Nrf2 a citoplazmában a Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), ciszteinben gazdag, homodimer cink metalloproteinhez kapcsolódik, és inaktív formában van. (57; 58) Oxidatív stressz hatására az Nrf2-Keap1 komplex felbomlik, és az Nfr2 aktív formába kerül. Ugyanakkor lágy elektrofil molekulák, mint az α,β-telítetlen aldehidek és ketonok is, kovalens kötéssel a Keap1 fehérjék tiolcsoportjaihoz kötődnek, ami az Nrf2-Keap1 komplex bomlásához vezet. A szabad Nrf2 molekulák mennyisége megnő, a sejtmagba kerülnek, ahol Maf proteinekkel heterodimert képeznek és a promóter szakaszukban

14

EpRE (electrophile response element) részt tartalmazó, a detoxikációs folyamatokban fontos szerepet betöltő enzimeket kódoló géneket aktiválnak. (59; 60) A kalkonok kemopreventív hatásában az is szerepet játszhat, ha a vegyület gátolja azon onkogéneknek, például a c-myc onkogén expresszióját, amelyek megnövekedett megjelenése hozzájárul a karcinogenezis folyamatához. (61) Számos xenobiotikum toxikus hatása abból fakad, hogy citokróm P450 1A enzim aktiválásán keresztül elősegítik promutagének metabolikus aktivációját (10), illetve megnövelik a reaktív oxigéngyökök mennyiségét, ezzel oxidatív stresszt előidézve. Főként a hidroxi- és metoxiszubsztituált kalkonszármazékok gátolják a CYP1A aktivitását, antioxidáns hatással rendelkeznek, valamint pozitív hatással vannak az intercelluláris kommunikációra (gap junctional intercellular communication, GJIC), így ígéretes kemoprotektív hatással bíró molekulák. (62) Az antioxidáns aktivitás hátterében elsősorban a reaktív oxigéngyök-fogó tulajdonság állhat, ami főként a hidroxiszubsztituált származékok esetén kifejezett. (37) Az α- és β-szénatom közötti kettőskötés geometriai izomerek jelenlétét feltételezi. Az (E)-izomer termodinamikai szempontból stabilisabb, szinte minden kalkon ebben a formában izolálható. A 3-hidroxi-3’-metilkalkon (E)-izomerjének metanolos oldatában ugyanakkor fény hatására fotoizomerizáció történik, és a (Z)-forma jelenik meg. (63) A (Z)-izomer antitumor aktivitása nagyobb, mint az eredeti (E)-izomeré, tehát fotoizomerizáció hatására is megváltozhat a vegyületek biológiai aktivitása.

II.2.3. Gyűrűs kalkonanalógok szintézise és szerkezete Korábbi kísérleti eredmények szerint a két aromás gyűrű egymáshoz viszonyított térbeli helyzete alapvetően befolyásolja a kalkonok bioaktivitását. Bár a kalkonok konjugált molekulák, eléggé flexibilisek ahhoz, hogy oldatban több konformációt is felvegyenek. A kalkonok vizsgálata így nem teszi lehetővé az optimális térszerkezet és biológiai hatás közötti kapcsolat vizsgálatát. Ezen kapcsolat alaposabb megismerése céljából történt a kalkonokkal szerkezeti rokonságban

álló

gyűrűs

telítetlen

karbonilvegyületek

szintézise,

kémiai

reaktivitásának, elektron- és térszerkezetének, valamint biológiai hatásainak vizsgálata. (64)

15

A kalkon (1) kevéssé flexibilis analógjainak tekinthetők az (E)-2-benzilidén-1indanonok (2), -tetralonok (3) és -benzoszuberonok (4). (10. ábra)

10. ábra A kalkon és gyűrűs származékainak szerkezete A 2-4 vegyületek és B-gyűrűn szubsztituált származékaik 1-indanon, 1-tetralon és 1-benzoszuberon,

valamint

a

megfelelő

aromás

aldehid

Claisen-Schmidt

kondenzációjával állíthatók elő. (11. ábra)

11. ábra Gyűrűs kalkonszármazékok szintézise Claisen-Schmidt kondenzációval (1-indanon: n=1; 1-tetralon: n=2; 1-benzoszuberon: n=3) A

vegyületek

szerkezetét,

térszerkezetét

elemanalízissel, valamint IR, 1H NMR és

13

(konfiguráció

és

konformáció)

C NMR módszerekkel igazolták. (64; 65;

66) A gyűrűs kalkonanalógok nukleofil reaktánsokkal szemben mutatott eltérő reaktivitásának értelmezése céljából Perjési és mtsai megvizsgálták a vegyületek tér- és 13

elektronszerkezetét. Az infravörös (IR) és segítségével

megállapították,

hogy

az

C-NMR spektroszkópiai módszerek

arilidéncsoport

elektronküldő,

illetve

elektronszívó szubsztituensei hatással vannak a vegyületek telítetlen karbonil (enon)-

16

fragmensének elektroneloszlására, így annak nukelofil reagensekkel szemben mutatott reaktivitására. (67; 68) A két aromás gyűrű egymáshoz viszonyított térbeli helyzetén kívül az aromás gyűrű szubsztituenseinek szterikus, elektronszerkezeti és hidrofób tulajdonságai szintén fontos szerepet játszanak a biológiai hatás kialakításában.

II.2.4. Gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus hatása és szerkezete közötti kapcsolat A különböző szubsztituensekkel bíró gyűrűs kalkonszármazékok in vitro citotoxicitásának vizsgálata P388, L1210 leukémia sejtekkel, valamint Molt 4/C8 és CEM T-limfocitákkal szemben történt. (64; 69) A 2-4 sorozat vegyületeinek vizsgált sejtekkel szemben meghatározott IC50 (a sejtek szaporodásának 50%-os gátlásához szükséges koncentráció; μM) értékei alapján számított ún. „Átlagos Potenciál” (ÁP, μM) értékeket az 1. táblázat tartalmazza. A

négy

teszt

alapján

számított

ÁP

értékek

összehasonlítása

alapján

megállapították, hogy a 7-tagú gyűrűs (E)-2-(X-benzilidén)-1-benzoszuberon (4) származékok a leghatékonyabb citotoxikus analógok.

P388 sejtek

L1210 sejtek

Molt 4/C8 limfociták

CEM limfociták

Indanon (2)

42,9

127

267

155

Tetralon (3)

20,9

135

158

115

Benzoszuberon (4)

11,2

85,2

66

47

Sorozat

1. táblázat A 2-4 sorozat „Átlagos Potenciál” (ÁP; μM) értékei a vizsgált egér és humán daganatos sejtvonalakkal szemben (64) Dimmock szubsztituálatlan

és

mtsai ciklikus

kvantumkémiai

számításokkal

kalkonszármazékok

is

meghatározták

energetikailag

a

legkedvezőbb

konformációját az aromás gyűrűk térbeli elhelyezkedésének vizsgálata céljából. (64) Az öttagú-gyűrűs analóg esetén az arilidéncsoport térbeli elhelyezkedése lényegesen eltér a másik két vegyületétől, ami alapjául szolgálhat a 2, valamit a 3 és 4 sorozat tagjai eltérő citotoxikus hatásának.

17

A vegyületek térszerkezete mellett az in vitro citotoxikus hatás nagymértékben függ a cinnamoil molekulafragmensen található szubsztituens természetétől és helyzetétől. (2. táblázat) Ezt támasztja alá, hogy minden vizsgált tumorsejtvonallal szemben a 4-es, vagyis para-helyzetben metoxi-, valamint dimetilamino-szubsztituenst hordozó 2-(X-benzilidén)-1-benzoszuberonok bizonyultak a sorozat leghatékonyabb származékainak. (64)

P388 sejtek

L1210 sejtek

Molt 4/C8 limfociták

CEM limfociták

H

12,7

106,0

42,7

28,9

4-CH3

11,8

25,0

21,3

11,4

3-Cl

8,2

52,3

23,8

4-Cl

9,5

51,8

33,0

15,1

4-F

11,1

60,3

53,6

20,0

Vegyület (X)

9,44

4-OCH3

1,6

0,34

0,47

0,35

4-N(CH3)2

1,9

1,87

5,25

3,05

melfalán

0,22

2,13

3,24

2,47

2. táblázat Néhány (E)-2-(X-benzilidén)-1-benzoszuberon (4) in vitro IC50 értéke (μM) (64) A

4

sorozat

szubsztituensei

elektronszerkezeti,

hidrofób

és

térbeli

tulajdonságainak vizsgálata során megállapították, hogy a vegyületek P388 és L1210 sejtekkel, valamint humán daganatos sejtekkel szemben mutatott citotoxicitása negatív korrelációt mutatott az arilidén molekularész szubsztituenseinek Hammett-szigma értékeivel, ugyanakkor pozitív korrelációt mutatott a szubsztituensek moláris refraktivitás (MR) értékeivel. (64) A vegyületek citotoxicitása egyetlen vizsgált sejtvonalon sem mutatott korrelációt a szubsztituensek lipofilitását jellemző Hanschféle π-értékkel. Röntgenkrisztallográfiás vizsgálatok támasztották alá, hogy a két aromás gyűrű által bezárt szög – amit szintén befolyásol a B-gyűrűn levő szubsztituens jellege – növekedése, vagyis a molekula koplanaritásának csökkenése a citotoxikus hatás növekedését eredményezi. A legaktívabb 7-tagú gyűrűs származékok (4-OCH3 és 4-N(CH3)2-vegyületek) esetén mért értékek (19° illetve 23°) a hatás szempontjából az optimális értékeket jelenthetik. Összességében az mondható el, hogy a vizsgált vegyületek közül a para-helyzetben nagyméretű, elektronban gazdag szubsztituens hordozó 7-tagú gyűrűs analógok bizonyultak a leghatásosabbnak.

18

Néhány reprezentatív vegyület (4-CH3; 4-OCH3 és 4-N(CH3)2-szubsztituált 2-(X)benzilidén-1-benzoszuberon) hatásmechanizmusának előzetes vizsgálati eredményei azt mutatták, hogy in vitro humán Jurkat-T sejttenyészetben gátolják az RNS- és a fehérjeszintézist és a sejtek apotózisát váltották ki. A vizsgált koncentrációban (IC80) a vegyületek RNS- és fehérjeszintézist gátló hatása, valamint azok Jurkat T-sejtekkel szemben mutatott citotoxicitása között azonban nem állapítható meg korreláció. (64)

II.2.5. Gyűrűs kalkonszármazékok daganatellenes hatása A kiemelkedő citotoxikus hatást mutató 7-tagú gyűrűs, 4-helyzetben metoxiszubsztituált kalkonanalóg in vivo daganatellenes hatását vizsgálták Perjési és mtsai. Az experimentális toxikológiai kísérletek során az egyik gyakran alkalmazott ún. policiklusos aromás szénhidrogén (PAH) a 7,12-dimetilbenz[α]antracén (DMBA), amely állatkísérletekben erősen rákkeltőnek bizonyult, és feltételezett humán karcinogén. A kísérleti állatok DMBA-val történő kezelése emlőtumort, tüdőtumort, hólyagtumort és leukémiát eredményezhet. (70) Az (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1benzoszuberon in vivo daganatellenes hatásának vizsgálata során a vegyület – a rövid idejű „short-term” (24 és 48 órás) eredmények alapján – hatékonyan csökkentette onko/szupresszor gének (H-ras, c-myc és p53) DMBA-indukálta expresszióját a kísérleti állatok (CBA/Ca egér) májában, tüdejében, veséjében és nyirokcsomójában, különösen akkor, ha azt a DMBA adását megelőzően, vagy azzal egyidőben alkalmazták. (71; 72) A policiklusos aromás szénhidrogének, így a DMBA is, genotoxikus hatású karcinogének. A genotoxikus hatás kialakulásának előfeltétele a vegyületek citokróm P450 enzimek által katalizált metabolizmusa, melynek eredményeképpen az aromás szénhidrogének reaktív dihidrodiol-epoxid származékokká alakulnak át, és kémiai reakcióba lépnek a sejt nukleofil molekuláival, így fehérjékkel és DNS bázisokkal. (73; 74) A DMBA genotoxikus hatásának másik lehetséges mechanizmusa a DMBA metabolizmusa során keletkező 7-OH-DMBA származék – ami a citoszolban található szulfotranszferáz enzim szubsztrátja - elektrofil szulfát-észterének keletkezése, ami a DNS adenin és guanin bázisainak aminocsoportjait támadja meg. (75; 76) Monostory és mtsai igazolták, hogy az (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-benzoszuberon DMBA-indukálta génexpresszióra gyakorolt hatásának kialakulásában szerepet játszhat a vegyületnek a DMBA-t metabolizáló CYP1A izoenzimre gyakorolt gátló hatása. (77)

19

Ezen kísérleti tapasztalatok alapján a vizsgált metoxiszármazék, valamint analógjai a policiklusos aromás szénhidrogének okozta karcinogenezissel szemben alkalmazható kemopreventív szerek lehetnek.

20

III. Célkitűzések Az irodalmi adatok, valamint a korábbi kísérleti eredmények arra engednek következtetni, hogy a kalkonok (1) és gyűrűs kalkonszármazékok (2-4) ígéretes kiindulási anyagok lehetnek a citotoxikus és/vagy citoprotektív hatással rendelkező vegyületek kutatásában. A számos, különbözőképpen szubsztituált és eltérő gyűrűtagszámú kalkonanalóg előzetes, in vitro sejtproliferációt gátló hatásának vizsgálata során nyilvánvalóvá vált, hogy a vegyületek biológiai hatása nagymértékben függ a gyűrűtagszámtól, valamint a szubsztituens pozíciójától és jellegétől, ami a vegyület elektron- és térszerkezetét alapvetően befolyásolja. Munkánk során fő célul a gyűrűs kalkonszármazékok fizikaikémiai tulajdonságainak és a citotoxikus/citoprotektív hatás hátterében álló molekuláris mechanizmusoknak alaposabb megismerését tűztük ki. Az elektron- és térszerkezeti jellemzők mellett a vegyületek biológiai hatásának, illetve hasznosíthatóságának fontos paramétere a molekulák lipofilitása, melynek számszerű jellemzésére leggyakrabban a vegyületek oktanol-víz megoszlási hányadosának logaritmusát (logP) használják. (78) A logP meghatározásának több kísérleti módszere is ismeretes az irodalomban. (79) Célunk az 1-4 sorozat különböző szubsztituenseket hordozó tagjai logP értékének meghatározása egy korábban beállított, ún. „helyettesítő” módszer, alapvetően fordított fázisú vékonyrétegkromatográfiás technika (RP-TLC) alkalmazásával. (80) A logP értékek ismeretében a molekulák lipofilitása és szerkezete közötti esetleges összefüggéseket kívánjuk vizsgálni. A gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus és daganatellenes hatásának kialakulásában szerepet játszó mechanizmusok alaposabb megismerése céljából a korábbi in vitro toxicitásvizsgálatok során kiemelkedő hatást mutató 7-tagú gyűrűs (E)-2-(4metoxibenzilidén)-1-benzoszuberont (4a) és kevéssé toxikus 4-metilszubsztituált analógját (4b) választottuk a tervezett vizsgálatok elvégzéséhez. (12. ábra)

21

12. ábra A vizsgált kalkonszármazékok szerkezete

Munkánk során az alábbi célokat tűztük ki: 1.

A vizsgált vegyületek in vitro sejtszaporodást gátló hatásának vizsgálata humán Jurkat T sejtekkel szemben a vegyületek közel ekvitoxikus dózisával történő kezelést követően, tripánkékkel történő festési eljárással. Az élő, a korai apoptotikus

fázisban

levő

és

az

apoptotikus/nekrotikus

sejtek

mennyiségének/arányának meghatározása áramlási citometriai módszerrel. 2.

A vegyületek sejtosztódásra, sejtciklusra gyakorolt hatásainak áramlási citometriai módszerrel történő vizsgálata Jurkat T sejtekben, a vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás kezelést követően.

3.

A vizsgált kalkonanalógok in vitro antioxidáns (hidroxilgyök „scavenger”), illetőleg esetleges prooxidáns hatásának vizsgálata, annak időbeli függése a Fentonreakció inicializálta dezoxiribóz degradációs teszt alkalmazásával. A vizsgálatok során kísérletet kívánunk tenni a vegyületek hidroxilgyökökkel lejátszódó reakciójában esetlegesen képződő termékek azonosítására is.

4.

A vegyületek antioxidáns/prooxidáns jellegének tanulmányozása céljából sejtes körülmények között, Jurkat T sejtekben is vizsgáljuk az analógok ROS (reaktív oxigénszármazék)-aktivitásra, vagyis a celluláris redox-státuszra gyakorolt hatását. A vizsgálatokhoz a diklorofluoreszcein-tesztet kívánjuk alkalmazni.

5.

A mitokondriális funkciók alapvetően befolyásolják a sejtek működését. Xenobiotikumok citotoxikus és antineoplasztikus aktivitásához hozzájárulhat a mitokondriális funkciók megváltozása. Vizsgálni kívánjuk a kalakonanalógok mitokondriális respirációra és ATPáz-aktivitásra gyakorolt hatását.

22

6.

Az élő sejtek redox-homeosztázisát alapvetően meghatározza a sejt SH-státusza. Célunk a vegyületek SH-szintre, majd glutation-szintre gyakorolt hatásának vizsgálata Jurkat T sejtekben. A redox-státusz jellemzésére a sejtek redukált és oxidált glutation arányának, illetve azok mennyiségének a meghatározása is szükséges.

7.

A vegyületek kémiai szerkezete alapján feltételezhető, hogy tiolcsoportokkal konjugációs reakcióba is léphetnek, ezért vizsgálni kívánjuk a vegyületek redukált glutationnal szemben mutatott reaktivitását, mind sejtmentes, mind sejtes körülmények

között.

Az

esetlegesen

képződő

konjugátumok

jelenlétét

vékonyrétegkromatográfiás módszerrel, ún. „kettős-előhívást” alkalmazva kívánjuk kimutatni. Az esetleges pozitív reakciót követően RP-HPLC-hez csatolt tömegspektrometriás eljárással kivánjuk a létrejövő konjugátumok szerkezetét igazolni.

23

IV. Vizsgálati módszerek IV.1. Kalkonszármazékok logP értékeinek meghatározása A 1-4 sorozat különféle szubsztituensekkel bíró tagjai logP értékének meghatározása egy korábbi, a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézetével kialakult kooperációs munka során alkalmazott fordított-fázisú vékonyréteg-kromatográfiás technika alkalmazásával történt. (80)

IV.1.1. Vizsgált anyagok A vizsgált vegyületek az 1-4 sorozatok tagjai, szintézisük és tisztításuk korábban leírtak szerint történt. (64) A kalibrációs sorozat tagjainak szerkezete a 3. táblázatban látható. (81) A módszer validálásához használt progeszteron és diazepam gyógyszerkönyvi minőségűek, a prosztaglandin E1-etilésztert (PGEE) a Sanofi-Synthelabo-Chinoin Zrt. (Budapest, Hungary) bocsátotta rendelkezésünkre. A vizsgálatokhoz használt metanol és n-oktanol HPLC minőségűek, a többi vegyszer analitikai tisztaságú.

R1

R2

R3

CH3

CH2-C6H5

H

CH2- CH2- CH2- CH2- CH2

H

H

H

CH3

H

C6H5

CH3

H

C6H5

H

CH3

C2H5

H

3. táblázat A logP meghatározáshoz használt kalibrációs sorozat tagjainak szerkezete

24

IV.1.2. Fordított-fázísú vékonyréteg-kromatográfiás módszer A korábbi meghatározások (80) folytatásaként 29 kalkonszármazék vizsgálata történt. A meghatározáshoz szilanizált szilikagél 60F254 (20 cm x 20 cm) rétegeket (Merck, Germany) használtunk. A vizsgálatok előtt a rétegeket metanollal mostuk, szárítottuk, majd 1 órán keresztül 160 °C-on aktíváltuk. A vizsgálandó anyagokat, valamint a kalibrációs és validációs sorozat tagjait metanol-kloroform 1:1 arányú elegyében oldottuk (2 mg/ml), majd vittük fel a lemezre. Mozgófázisként metanol-víz (60+40) elegyet használtuk. A rétegek kifejlesztése előtt a szűrőpapírral bélelt futtató kádakat fél órán át telítettük a mozgófázissal. A kifejlesztést (150 mm) követően a foltok előhívása UV-fényben (λ = 254 nm), valamint jód-gőzben történt. Minden mérési eredmény három párhuzamos meghatározásból származik. A para-szubsztituált vegyületek logPCLOGP értékének számolásához a Chem3D Ultra 9.0.1. szoftver (CambridgeSoft, Cambridge, MA, USA) CLOGP alkalmazását használtuk.

IV.2. Gyűrűs kalkonszármazékok hatásmechanizmusának vizsgálata IV.2.1. Kísérleti anyagok és sejtkultúra A vizsgálni kívánt gyűrűs kalkonszármazékok (4a és 4b) szintézise és tisztítása a korábban leírtak szerint történt. (64) 4a vegyület összegképlete: C19H18O2, moláris tömege: 278,35 g/mol. 4b vegyület összegképlete: C19H18O, moláris tömege: 262,35 g/mol. Mindkét származék halványsárga, tűkristályos vegyület, amely metanolban jól oldódik. A használt vegyszerek mindegyike analitikai tisztaságú volt, és – amennyibben az külön nincs jelezve – beszerzése a Sigma-Aldrich (Budapest, Hungary) cégtől történt. A humán Jurkat T limfocita sejtek (ATCC, E6-1 klón) az LGC Promochemtől (Teddington, UK) származnak. A Jurkat T sejtek tenyésztése 37 °C-on, megfelelő páraés 5% CO2-tartalmú környezetben, RPMI 1640 tápoldatban (pH = 7,4) történt, amit kiegészítettünk 10% FCS-el (magzati borjú szérum, Gibco), penicillinnel (100 U/ml) és sztreptomicinnel (100 μg/ml).

25

IV.2.2. Sejtkezelési protokoll A Jurkat T sejtek kezelése (5 x 105 db sejt / 1,0 ml RPMI 1640 tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a vizsgálati módszereknek megfelelően 1, 4, 8, 24 illetve 48 órán keresztül történt. A koncentrációértékek az előzetesen meghatározott IC80 dózisértékeknek felelnek meg. (64) A kalkonszármazékokat DMSO-ban oldottuk, és az elkészült DMSO-oldatból 10 μl-t adtunk 1,0 ml sejteket tartalmazó tápoldathoz, így mindig 1% DMSO-t tartalmazott a kezelt sejtszuszpenzió. A kontroll sejtszuszpenzókat nem kezeltük, illetve minden esetben készítettünk egy olyan kontrollt is, ami csak 1% DMSO-t tartalmazott, kalkon nélkül. (Jelölése: DMSO 1%)

IV.2.3. „Túlélés”-vizsgálat A Jurkat T sejtek kezelése (5 x 105 db sejt / 1,0 ml RPMI 1640 tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerint történt. A 8, 24 és 48 órás sejtkezelést követően az összes sejt, valamint az életképes sejtek számolása a sejtek tripánkékkel történő festését követően hemocitométer használatával történt. (82) Az eredmények négy párhuzamos mérésből származnak.

IV.2.4. Áramlási citometriai módszerek IV.2.4.1. Az áramlási citometria Az áramlási citometria egy olyan eljárás, amely alkalmas vegyes sejtpopulációkban az egyes sejtcsoportok elkülönítésére azok nagysága és a sejtalkotók összetettsége (granularitás) alapján, valamint egy-sejt szinten, több hullámhosszon mérve, azok fluoreszcens jelének detektálására. (83) A vizsgált sejtszuszpenziót a készülékben a köpenyfolyadék egy kapillárisban, az ún. áramlási cellában áramoltatja. A kapillárisban haladó sejteket a készülék nagyságtól függetlenül számlálja. Ezzel párhuzamosan hagyományos fényforrással megvilágítva a sejteket kétféle jelet detektálunk: a besugárzó fény irányával megeegyező irányú fényszóródás (forward scattered light, FSC) a sejtek nagyságáról ad információt, a fény oldalirányú szóródása (side scattered light, SSC) pedig a sejtek granularitásával arányos. A jeleket két detektor érzékeli és alakítja digitális jellé, amit egy számítógépes program diagrammon jelenít meg.

26

Amennyiben a vizsgálandó sejt valamely felszíni vagy citoplazmatikus markeréhez/markereihez

közvetlenül,

vagy

közvetett

módon

(monoklonális

ellenanyag(ok)hoz kötve) fluoreszcens festéket kötünk, úgy a készülékben elhelyezett lézerek (számuktól és a gerjesztő fényük hullámhosszától függően) alkalmasak az adott fluoreszcens festékmolekulák gerjesztésére. A fluoreszcens festékek fényemisszióját detektorok mérik adott hullámhosszakon (FL-1, FL-2, FL-3, FL-4 csatornákon). A jelet átalakítva és ábrázolva lehetőség nyílik egy-sejt szinten egyszerre több molekula fluoreszcens jelének detektálására. A módszer nagy előnye, hogy rövid idő alatt nagyszámú (105-106 db) sejtről kapunk többféle információt.

IV.2.4.2. Sejtszaporodásra gyakorolt hatás vizsgálata A korai apototikus fázisban levő, illetve apoptotikus sejtek mennyiségének meghatározása a következők szerint történt. A Jurkat T sejteket (5 x 105 db sejt / 1,0 ml tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerinti 8, 24 és 48 órás kezelését és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően kétszer mostuk 1,0 ml hideg PBS-pufferben, majd 1,0 ml annexin-kötő pufferben (10 mM Hepes/NaOH; pH = 7,4; 140 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2). A sejteket 100 μl annexin-kötő pufferben vettük fel és 2 μl fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelölt annexin V-oldattal (Annexin V-FITC) (BD Biosciences) és 10 μl 50 μg/ml koncentrációjú propídium-jodid (PI)-oldattal inkubáltuk szobahőmérsékleten, fénytől védve, 15 percig. Az inkubációs idő lejárta után a mintákat 400 μl annexin-kötő pufferrel higítottuk, majd 30 percen belül vizsgáltuk áramlási citométerrel. A 48 órán keresztül kezelt sejtek jelölése az előzőkhöz hasonlóan, de csak propídium-jodiddal történt. Az áramlási citometriás mérést és analízist a FACSCalibur (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA) áramlási citométeren a CellQuest (BD Biosciences) software segítségével végeztük. A vizsgálatkor nem használtunk kapuzást. Az annexin V-FITC-el jelölt sejteket (zöld fluoreszcencia) az FL-1 csatornán (525 nm), a propídium-jodiddal jelölt sejteket (piros fluoreszcencia) az FL-2 csatornán (575 nm) detektáltuk. Mintánként 50 000 eseményt mértünk. A két emissziós spektrum átfedésének kiküszöbölésére elektronikus kompenzációt használtunk. A kezeletlen kontroll sejtek esetén beállított kvadráns statisztikai paramétereket használtuk a további vizsgálatokhoz. Az FL-1/FL-2 csatornákon mérhető fluoreszcencia intenzitás alapján

27

megkülönböztethetünk élő sejteket (annexin V-negatív + PI-negatív), korai apoptotikus fázisban levő sejteket (annexin V-pozitív + PI-negatív) és apototikus (vagy nekrotikus, azaz elpusztult) sejteket (annexin V-pozitív + PI-pozitív). (84; 85) Az eredmények négy párhuzamos mérésből származnak.

IV.2.4.3. Sejtciklus-vizsgálat A kalkonanalógok sejtciklusra gyakorolt hatásának vizsgálatához a Jurkat T sejteket (5 x 105 db sejt / 1,0 ml tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerinti 8, 24 és 48 órás kezelését és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően kétszer mostuk 1,0 ml hideg PBS-pufferben, majd 300 μl 4% paraformalehidoldattal fixáltuk 20 percen keresztül. Ezt követően a sejteket kétszer mostuk 2,0 ml PBS-pufferben, majd 1,0 ml szaponin-pufferben (PBS/0,1% BSA/0,1% szaponin), végül 300 μl propídium-jodid-oldatban (50 μg/ml PI; 100 Kunitz units RNase A/ml szaponin pufferben) vettük fel. 30 perc inkubálási időt követően az áramlási citometriás mérést és analízist a FACSCalibur (BD Biosciences) áramlási citométeren a CellQuest (BD Biosciences) software segítségével végeztük. A jelölt sejtek DNS-mennyiségének meghatározása az FL-2 csatornán (575 nm) történt, lineáris erősítés mellett. Mintánként 10 000 eseményt mértünk. A kezeletlen kontroll sejtek esetén beállított kapukat használtuk a további vizsgálatokhoz. Az eredmények négy párhuzamos mérésből származnak.

IV.2.5. A vegyületek in vitro antioxidáns hatásának vizsgálata dezoxiribóz degradációs módszerrel A vizsgált kalkonanalógok in vitro antioxidáns (hidroxilgyök scavenger), esetleges prooxidáns hatásának vizsgálatához a Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs tesztet alkalmaztuk. (86; 87) 30 mM foszfát-puffer (pH=7,4), 9 mM 2-dezoxi-D-ribóz, 40 mM nátrium-klorid, 30 µM vas(II)-szulfát-oldat elegyéhez adtuk a 4a, illetve 4b vegyületet az össztérfogat 1%-nak megfelelő térfogatú DMSO-ban oldva, valamint 50 µM H2O2-ot. A kalkonok végkoncentrációja 200 µM volt. A vizsgálatokat EDTA hozzáadása nélkül, illetve EDTA (36 μM) jelenlétében is elvégeztük. Az elegyeket jól záró kémcsövekben 37 oCon inkubáltuk, majd a degradációs reakció időbeli követéséhez a 20 percenként (4 órán

28

át) vett mintákban meghatároztuk a tiobarbitursav (TBA)-reaktív anyagok mennyiségét. A kontroll-oldat a kalkonok DMSO-val készült oldata helyett csak a vizsgált anyagok oldószereként használt DMSO-t tartalmazta. A keletkezett TBA-reaktív anyagok meghatározása céljából az inkubátumok 1,0 ml térfogatához 0,5 ml tiobarbitursav-reagenst (1% (w/v) TBA 50 mM NaOH-ban oldva) és 0,5 ml 5,6%-os (w/v) triklórecetsav-oldatot adtunk, majd az elegyet jól záró kémcsőben 8 percig 100 oC-os glicerines fürdőben inkubáltuk. A szobahőmérsékletre hűtött oldat abszorbanciáját 532 nm-en mértük, a megfelelő vak-oldat hasonló körülmények között derivatizált oldatával szemben. A vak-oldat összetétele minden esetben megegyezett a vizsgált minta összetételével, de nem tartalmazott vas(II)szulfátot és hidrogén-peroxidot. Minden oldat frissen készült, kétszeresen desztillált víz felhasználásával. Minden mérési eredmény három párhuzamos kísérletből származik.

IV.2.6. A kalkonanalógok celluláris redox-homeosztázisra gyakorolt hatásának vizsgálata IV.2.6.1. Az intracelluláris ROS-aktivitás meghatározása A vizsgált kalkonszármazékok intracelluláris reaktív oxigéngyök (ROS) termelésre gyakorolt hatását az oxidációra érzékeny 2’,7’-diklórfluoreszcein-diacetátot (DCFHDA) felhasználva vizsgáltuk. (88; 89) A Jurkat T sejteket (5 x 105 db sejt / 1,0 ml tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerinti 1, illetve és 4 órás kezelését és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően 1,0 ml hideg PBS-pufferben mostuk, majd 1,0 ml PBS-pufferben vettük fel. A sejteket 10 μM DCFH-DA-val, 37 °C-on 20 percig sötétben inkubáltuk, majd kétszer 1,0 ml PBS pufferrel mostuk és 1,0 ml pufferbe reszuszpendáltuk. A diklórfluoreszcein fluoreszcencia-intenzitásának meghatározását FACSCalibur (BD Biosciences) áramlási citométeren a CellQuest (BD Biosciences) software segítségével végeztük. A mérés az FL-1 csatornán történt, lineáris erősítés mellett. Mintánként 10 000 eseményt mértünk. Az eredmények a minták, és a kezeletlen kontroll sejtek fluoreszcencia intenzitásának összehasonlításából származnak. Minden érték négy párhuzamos mérésből származó átlag ± szórás. A statisztikai értékelés a Student-t teszt (p < 0,05) használatával történt.

29

IV.2.6.2. Mitokondriális funkciókra gyakorolt hatás vizsgálata A kalkonszármazékok mitokondriális funkciókra gyakorolt hatásainak vizsgálatát a kassai P. J. Šafarik Egyetem Orvosi Kémiai és Biokémiai Intézetével kooperációban végeztük. A kísérletekhez hím Wistar patkányok (250-300 g) (Velaz, Praha, Czech Republic) májából, Johnson és Lardy módszere alapján izolált mitokondriumot használtunk. (90) A mitokondriális fehérjemennyiség meghatározása Lowry módosított módszere szerint történt. (91) Az izolált mitokondrium oxigénfogyasztásának mérése polarográfiás módszerrel, Clark-típusú oxigénelektróddal (WTW oxi 325 (Germany)), 25°C-on, ún. respirációs médiumban történt. A respirációs médium összetétele: 80 mM KCl, 300 mM KH2PO4, 300 mM K2HPO4, 15 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, 0,78 mM EDTA desztillált vízben oldva; pH = 7,4. A respirációs médiumhoz adtunk 20 mg/ml koncentrációban mitokondrium-szuszpenziót, respirációs szubsztrátként 50 mM nátrium-szukcinátot, 0,5 mM ADP-t, valamint a vizsgált kalkonszármazékot, melynek mennyisége 70 nmol/mitokondriális fehérje mg. Az oxigénfogyasztás (nmol O2 x min-1 x mg-1 fehérje), valamint az ATPáz aktivitás meghatározása 1 órás inkubáció után történt. (92) A respirációs kontroll-hányados (RCR; respiratory control ratio) az „oxigénfogyasztás a 3as állapotban (state 3)” (ADP jelenlétében) és az „oxigénfogyasztás a 4-es állapotban (state 4)” (ADP hozzáadása előtt) hányadosa. A vegyületek ATPáz-aktivitásra gyakorolt hatásának vizsgálata Meissner szerint történt. (93) Minden érték három párhuzamos mérésből származó átlag ± szórás. A statisztikai értékelés a Student-t teszt (p < 0,05) használatával történt.

IV.2.6.3. A celluláris tiolszint meghatározása A kalkonszármazékok celluláris tiol-szintet befolyásoló hatását vizsgáltuk Jurkat T sejteken, tápanyag-mentes és tápanyagokat tartalmazó környezetben. A mért SH-szintet a minták fehérjemennyiségére vonatkoztattuk. A 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel kezelt Jurkat T sejteket (2 x 106 db sejt) egyrészt 1,0 ml PBS-pufferben inkubáltuk (tápanyagmentes környezet) 1 órán át, másrészt 1,0 ml RPMI 1640-tápoldatban (10% FCS) 4 és 8 órán át. A kezelést és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően a sejteket kétszer mostuk 0,9%-os NaCl-

30

oldatban, majd 500 μl TRIS-pufferben (50 mM Trisz-HCl; 0,1% SDS; pH = 7,4) vettük fel és ultrahangos szonikáció (3 perc) révén lizáltuk. A sejtlizátumokat centrifugáltuk (13 000g, 5 perc), a tiszta felülúszót használtuk a tiol-szint, illetve a fehérjemennyiség meghatározásához. A szabad celluláris SH-szintet a DTNB- (5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoesav)) módszer szerint határoztuk meg, redukált glutation használva standardként. (94) A fehérjekoncentráció meghatározása a BCA (bicinkoninsav)-módszer alkalmazásával történt. (95) A fehérjeméréshez BSA (bovine serum albumine) standard oldatsorozatot használtunk. Mindkét meghatározás esetén Dynatech MR 7000 microplate (ELISA) reader-t használtunk abszorbancia mérésre. Minden érték négy párhuzamos mérésből származó átlag ± szórás. A statisztikai értékelés a Student-t teszt (p < 0,05) szerint, SPSS 12.0 for Windows szoftver használatával történt.

IV.2.6.4. A celluláris redukált és oxidált glutationszint vizsgálata A kalkonszármazékok celluláris glutation-szintet befolyásoló hatását vizsgáltuk Jurkat T sejteken, ami magába foglalja a redukált GSH-szint, valamint az oxidált glutation (GSSG)-szint meghatározását. A mért glutation-szinteket a minták fehérjemennyiségére vonatkoztattuk. A Jurkat T sejteket (2 x 106 db sejt / 5,0 ml RPMI 1640 tápoldat) 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a IV.2.2 protokoll szerint 4 órán át kezeltük. Az inkubálást és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően a sejteket kétszer mostuk 0,9%os NaCl-oldatban, majd 400 μl TRIS-pufferben (50 mM Trisz-HCl; 0,1% SDS; pH = 7,4) vettük fel és 3 egymást követő „freeze-and-thaw ciklust” alkalmazva (fagyasztás 80 °C-on 30 percig, majd lassú olvasztás szobahőmérsékleten) lizáltuk. A sejtlizátumokat centrifugáltuk (13 000g, 5 perc), a tiszta felülúszót használtuk a fehérjemennyiség, illetve a glutation-szintek meghatározásához. A fehérjemennyiség meghatározása a BCA (bicinkoninsav)-módszer szerint, BSA standard oldatsorozat felhasználásával történt. (95) Abszorbancia mérésre Dynatech MR 7000 microplate (ELISA) reader-t használtunk. A redukált és oxidált glutation-szint meghatározása Kand’ár és mtsai által kidolgozott

módszer

kisebb

változtatása

szerint

történt.

(96)

A

minták

fehérjementesítéséhez a sejtfelülúszókat 6%-os perklórsavval elegyítettük (300 μl

31

felülúszó + 210 μl HClO4-oldat ), majd a kicsapódott fehérjét centrifugálással (10 000g, 4 perc) eltávolítottuk. A mintákat 1 M KOH-oldattal semlegesítettük, a kicsapódott KClO4 csapadékot centrifugálás révén (3000g, 3 perc) eltávolítottuk. Az itt kapott felülúszóból történt a redukált és oxidált glutation-szint meghatározása. A redukált glutation-szint (GSH) meghatározásához 100 μl mintát 1,0 ml 0,1% EDTA-t tartalmazó 0,1 M foszfát-pufferrel (pH = 8,0) hígítottuk. Ennek 20 μl-éhez 300 μl foszfát-puffert (0,1 M, pH = 8,0, 0,1% EDTA) és 20 μl metanollal készült 0,1%-os orto-ftálaldehid-oldatot (OPA) adtunk. A mintákat szobahőmérsékleten, 15 percig sötétben inkubáltuk, majd a vizsgálatig 4 °C-on tároltuk. Az oxidált glutation-szint meghatározásához (GSSG) 200 μl mintát 200 μl 40 mM N-etilmaleimid-oldattal (NEM), 25 °C-on, 25 percig sötétben inkubáltuk, majd 750 μl 0,1 M NaOH-oldattal hígítottuk. A hígított minta 20 μl-éhez 300 μl 0,1 M NaOHoldatot és 20 μl metanollal készült 0,1%-os OPA-oldatot adtunk. A mintákat szobahőmérsékleten, 15 percig sötétben inkubáltuk, majd a vizsgálatig 4 °C-on tároltuk. Referenciaként frissen készült, TRIS-pufferben (50 mM Trisz-HCl; 0,1% SDS; pH 7,4) oldott, redukált és oxidált glutationt tartalmazó standard sorozatot használtunk. Az minták GSH és GSSG-tartalmát az OPA-val történő derivatizálást követően nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerrel határoztuk meg. A vizsgálatokat Agilent 1100 HPLC-készüléken, fluoreszcens detektálás mellett végeztük. Az elválasztást Poroshell 120 EC-C18 oszlopon (150 x 4,1 mm; szemcseméret: 2,7 μm) végeztük (előtétoszlop: TR-C-160-K1, ABLE&Jasco), 0,4 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az injektált térfogat 10 μl volt. Az izokratikus elválasztáshoz használt eluens összetétele: 15% metanol és 85% 25 mM foszfát-puffer (pH 6,0). A fluoreszcens jel intenzitásának detektálásakor az excitációs hullámhossz 350 nm, az emissziós hullámhossz 420 nm volt. Az adatok gyűjtését és a kromatogramok értékelését Agilent ChemStation (Rev. A. 10. 02) szoftver segítségével végeztük. A

kezeletlen

és

kalkonokkal

kezelt

minták

glutation-koncentrációjának

meghatározása a standard sorozat mintáinak meghatározása során felvett kalibrációs egyenesek segítségével történt. (GSH-standard: y(csúcs alattti terület) = 7,298x + 60,69 (μM) (r2 = 0,989); GSSG-standard: y(csúcs alattti terület) = 297,96x + 21,28 (μM) (r2 = 0,995)) A

meghatározott

redukált

és

oxidált

glutation-szinteket

a

minták

fehérjemennyiségére vonatkoztattuk. Minden étrék öt párhuzamos mérésből származó átlag ± szórás. A statisztikai értékelés a Student-t teszt (p < 0,05) használatával történt.

32

Annak vizsgálatára, hogy a NEM valóban megvédi-e a GSH-t az oxidációtól, a redukált glutation standard oldatát, a NEM-es reakciót követően, a GSSG-szint meghatározásához

használt

módszer

szerint

derivatizáltuk

és

vizsgáltuk

a

kromatográfiás rendszerben.

IV.2.7. A kalkonszármazékok glutationnal való reaktivitásának vizsgálata IV.2.7.1. A kalkon-glutation reakció vizsgálata sejtmentes körülmények között A vizsgált kalkonszármazékok és redukált glutation (GSH) között esetlegesen lejátszódó spontán reakciót vizsgáltuk. A glutation 0,01M foszfát-pufferrel (pH = 5,5; pH = 7,4 és pH = 9,0) készült oldatát ugyanakkora mennyiségű 4a és 4b frissen készült metanolos oldatával elegyítettük. A GSH és kalkonok végkoncentrációja 5 x 10-3M volt. A reakcióelegyeket 37 °C, illetve 50 °C-os vízfürdőben inkubáltuk és a reakcióelegy összetételét 1 és 3 órát követően vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) módszerrel vizsgáltuk. A TLC-futtatáshoz Kieselgel F254 (Merck, Germany) lapokat használtunk állófázisként. A kifejlesztő elegy összetétele: n-butanol : ecetsav : víz (40 : 10 : 20, v/v%). A kromatogram előhívása egyrészt UV-fényben (λ = 254 nm) történt, majd ninhidrin-előhívó oldattal történő bepermetezés révén. Az kalkon-GSH inkubátumok, valamint a tiszta 4a, 4b és GSH-oldatok VRK futtatásakor kapott foltok Rf értékei a következők: GSH: Rf = 0 (UV negatív, ninhidrin pozitív), 4a: Rf = 0,95 (UV pozitív, ninhidrin negatív), „4a-GSH konjugátum”: Rf = 0,42 (UV pozitív, ninhidrin pozitív), 4b: Rf = 0,96 (UV pozitív, ninhidrin negatív), „4b-GSH konjugátum”: Rf = 0,46 (UV pozitív, ninhidrin pozitív).

IV.2.7.2. A kalkon-glutation reakció vizsgálata Jurkat T sejtekben HPLCMS módszerrel A Jurkat T sejtekben esetlegesen lejátszódó kalkon-glutation konjugációs reakció vizsgálata céljából a PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézetével kooperációban HPLC-MS módszert dolgoztunk ki.

33

A Jurkat T sejteket (2 x 106 db sejt / 5,0 ml tápoldat) a 4a (5,6 μM), illetve 4b (23,3 μM) vegyületekkel a protokoll (IV.2.2) szerint 4 órán inkubáltuk. A kezelést és centrifugálását (1000g, 5 perc) követően a sejteket kétszer mostuk 0,9%-os NaCloldatban, majd 600 μl TRIS-pufferben (50 mM Trisz-HCl; 0,1% SDS; pH 7,4) vettük fel. A sejtlízist ultrahangos szonikáció (3 perc) mellett végeztük. A sejtlizátumokat centrifugáltuk (13 000g, 5 perc), a tiszta felülúszót és az üledéket -80 °C-on tároltuk a további vizsgálatokig. A sejtes üledék feltárását nagy energiájú ultraszonikátorban (UIS250V) (6 x 10 másodperc) végeztük, jeges hűtést alkalmazva a ciklusok között. A mintákat vortexeltük és centrifugáltuk (10 000g, 10 perc). A minták fehérjementesítéséhez a felülúszókat és a feltárt üledékeket centrifugális szűrőbe (Amicon Ultra with 10K „cut off” membrane, Merck-Millipore, Germany) tettük, és centrifugáltuk (10 000g, 30 perc). A filtrátumok fehérjetartalmát ellenőriztük, és amennyiben fehérjét találtunk a mintában, a szűrést új szűrőn ismételtük. A fehérjementes mintákhoz 0,1% hangyasavat adtunk a HPLC-MS vizsgálatokhoz. A vizsgálatokat Ultimate 3000 (Dionex, Sunyvale, USA) mikro HPLC-készüléken és Bruker micro-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) tömegspektrométeren végeztük. A készülékek ellenőrzése Hystar 3.2 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) és Bruker micro-TOF control 1.3 szoftverekkel történt. Az adatok gyűjtését és a spektrumok értékelését Brucker Data analysis 4.1 szoftver segítségével végeztük. Az elválasztást Kinetex C-18 oszlopon (150 x 2,1 mm; szemcseméret: 2,6 μm) (Phenomenex, Torrance, USA) végeztük, 0,2 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az injektált térfogat 1 μl volt. A grádiens elválasztáshoz „A” eluenst (99,9% metanol + 0,1% trifluorecetsav) és „B” eluenst (99,9% víz + 0,1% trifluorecetsav) használtunk. A grádiens-profil a következő volt: 0-5 percig 40% „A” eluens + 60% „B” eluens; 5-15 percig lineáris grádiens 40% → 90% „A” eluens + 60% → 10% „B” eluens; 15-20 percig 90% „A” eluens + 10% „B” eluens. A tömegspektrometrás mérés elektrospray-ionizáció (ESI) mellett történt. ESI pozitív ionizációs módot, N2 ütközőgázt (áramlás: 8 dm3/perc, 201 °C) használtunk 3,8 kV véglemez potenciál mellett. Porlasztógáz nyomása 20 psi. A spektrumokat 50 – 2.000 tömeg/töltés (m/z) tartományban értékeltük.

34

V. Eredmények és következtetések V.1. Kalkonanalógok lipofilitásának jellemzése A lipofilitás a biológiailag aktív molekulák egyik legfontosabb, és igen régóta használatos fizikai-kémiai paramétere, amely, mint anyagi tulajdonság, a vegyületek apoláris (lipofil) környezethez való affinitását jellemzi. A lipofilitás az a tulajdonság, amely nagyban befolyásolja egy vegyület felszívódását, eloszlását, fehérjekötődését, kiürülését, másrészt a receptorral való kölcsönhatását is, tehát jelentős mértékben meghatározza

egy

molekula

sorsát

a

szervezetben.

Mindezek

alapján

a

gyógyszertervezés kiemelt paramétere is, hiszen változtatásával befolyásolhatók az ADME tulajdonságok. (97; 98) Egy molekula lipofilitását számszerű adatokkal jellemezhetjük, aminek kialakításában azok a kölcsönhatások játszanak szerepet, amelyek a szervezetben is létrejönnek a molekula és környezete között. Egy megoszlási folyamat során a vegyület megoszlik két egymással nem elegyedő, de bőségesen érintkező oldószer között. Az anyag megoszlási hányadosán a két egymással nem elegyedő oldószerben mért aktivitásának (híg oldatok esetén a koncentrációknak) az arányát értjük, mely adott hőmérsékleten és nyomáson az egyensúlyi állapot elérése után konstans érték. A lipofilitás általános jellemzésére választott oktanol/víz oldószer-rendszerre vonatkozó megoszlási hányadost P betűvel jelöljük, leginkább ennek logaritmusát alkalmazzuk (logP). A lipofilitás meghatározására jelenleg a leggyakrabban alkalmazott eljárások az indirekt, másnéven alternatív meghatározási módszerek. (79; 99) Az indirekt eljárások előnye, hogy az igen nagy és nagyon kis lipofiltású vegyületek is mérhetők, a módszerek gyorsak és egyszerűek, ami nagyon fontos szempont a gyógyszerkutatás korai fázisában. A kromatográfiás vizsgálatoknál alapvető olyan kromatográfiás rendszer felállítása, ahol a vegyületek retenciója nagy pontossággal megállapítható, ugyanakkor az adott kromatográfiás állófázissal minél hitelesebben lehessen karakterizálni a membrán kettősréteget. (100) A logP meghatározás elvi alapját a folyadék/folyadék megoszláson alapuló kromatográfiás retenció és a megoszlási hányados között fennálló összefüggés adja meg. A módszer lényege, hogy az eljárás során a lipofilitástól függő kromatográfiás

35

paramétert (a retenciós faktorral közvetlenül összefüggésben álló ún. RM értéket: RM = log(1/Rf – 1)) határozzuk meg, majd kalibrációs egyenes felhasználásával logP értéket számolunk (logP = aRM + b). A kromatográfiás logP meghatározás lényege tehát, hogy egy kiválasztott standard anyagsorozat esetén, melynek oktanol/víz logP értéke ismert, meg kell határozni az aktuális kromatográfiás rendszerben érvényes RM értékeket, amely értékeket felhasználva a fenti egyenlet állandói megismerhetők. Ennek alapján egyéb vegyületek logP értéke számítható. Vizsgálatainkhoz, standard sorozatként, az ismert logP értékekkel rendelkező pirido[1,2-a]pirimidin-származékokat (3. táblázat) használtunk. Bár a vegyületek kémiai szerkezete különbözik a kalkonok szerkezetétől, fizikai-kémiai tulajdonságaik nagyon hasonlóak: lipofilek és közel semlegesek (nagyon gyenge bázisok, és alkalmazott RP-TLC kondíciók mellett deprotonált állapotban vannak (80)). A kalibrációs sorozat tagjai vékonyréteg-kromatográfiás futtatásának eredményeképpen kapott kalibrációs egyenes egyenlete: logP = 4,007 RM + 1,373 (n = 6, r = 0,9935, s = 0,09, F = 304) Az optimalizált kromatográfiás rendszer validálása három, ismert logP értékkel rendelkező gyógyszermolekula (diazepám, progeszteron és PGEE) felhasználásával történt. Az RP-TLC módszer során, a fenti kalibrációs egyenes segítségével meghatározott logPTLC értékek közel megegyeznek a vegyületek rázótölcséresmódszerrel meghatározott logPSF értékeivel (80). (4. táblázat)

logPSF

logPTLC

∆ logP

Diazepám

2,77

2,80

0,03

Progeszteron

3,54

3,42

0,12

PGEE

4,08

4,02

0,06

Minta

4. táblázat A logP meghatározás során használt validációs sorozat tagjainak rázótölcséres módszerrel (logPSF), illetve RP-TLC módszerrel (logPTLC) történt logP értékeinek összehasonlítása

36

A validálás során használt három vegyület logPTLC értékeivel kibővítettük a kalibrációs sorozatot, így a következő kalibrációs egyenes egyenletet kaptuk, amit a kalkonanalógok logP értékének számolásához használtunk fel. logP = 4,115 RM + 1,362 (n = 9, r = 0,9973, s = 0,08, F = 1316) A vizsgált (illetve korábban vizsgált) kalkonszármazékok kísérletes úton meghatározott logPTLC értékeit az 5. táblázat tartalmazza. (101) A vegyületek igen lipofilek, logP értékük viszonylag széles tartományba (logP = 2,53 - 5,35) esik, a gyűrű tagszámának valamint a szubsztituens minőségének, jellegének és helyzetének függvényében. Mivel a lipofilitásbeli különbség minden bizonnyal a biológiai hatás kialakulásában is szerepet játszik, meghatározása már a gyógyszertervezés korai szakaszában igen fontos. A gyűrűtagszám lipofilitást befolyásoló hatását a para-helyzetben szubsztituált kalkonanalógok kísérletesen meghatározott logP értékeinek összehasonlítása révén figyelhetjük meg. (6. táblázat) A gyűrű tagszámának növekedése a ciklikus kalkonanalógok lipofilitásának növekedésével jár. Egy további metiléncsoport beépülése a gyűrűbe átlagosan 0,4 egységgel növelte meg a logPTLC értéket. Az 1 és 2 sorozat tagjai, valamint a 3 és 4 sorozat tagjai közötti lipofilitásbeli különbség kisebb, mint a 2 és 3 sorozat tagjai között. Mindezek arra utalnak, hogy az intra- és intermolekuláris interakciók, valamint a térszerkezet is befolyással vannak a lipofilitásra. A 6. táblázat a kísérletes úton meghatározott logPTLC értékeken kívül, számolás útján prediktált logP értékeket is tartalmaz. A CLOGP szoftver segítségével számolt logP egy ún. kalkulált partíciós koefficiens. A számítógépes program által használt módszer a Hansch-Leo fragmens alapú számítás, ahol az alapmolekula és a hozzá kapcsolódó fragmensek, szubsztituensek száma, pozíciója határozza meg a kalkulált logP értéket. A mért és számolt értékek viszonylag jól korrelálnak egymással. Az öttagú gyűrűs és hattagú gyűrűs dimetilamino-származék esetén azonban viszonylag nagy az eltérés a két adat között, a mért logP értékek jóval magasabbak (4,50, illetve 4,91) mint a számolt logP értékek (3,76, illetve 4,32). A többi esetben a differencia kisebb, mint 0,45. Míg a 2 sorozat tagjainak kísérleti úton meghatározott logP értéke minden esetben

37

nagyobb a nyílt láncú (1) analógokétól, addig a számolt értékek között gyakorlatilag nincs különbség. A szubsztituens minőségének vizsgálatakor megfigyelhető, hogy a parahelyzetben szubsztituált származékok esetén a lipofilitás a következők szerint változik: OH < CN < NO2 < H < F < OCH3 < CH3 < Cl < N(CH3)2 ≈ Br

Vegyület

logPTLC

Vegyület

logPTLC

Vegyület

logPTLC

1H

3,42 ± 0,05*

2 o-Cl

4,28 ± 0,09

3 m-NO2

3,99 ± 0,02

1 p-N(CH3)2

4,23 ± 0,01*

2 m-Br

5,15 ± 0,04

3 o-NO2

4,06 ± 0,07

1 p-OCH3

3,67 ± 0,05*

2 o-Br

4,36 ± 0,08

3 p-CN

3,48 ± 0,12*

1 m-OCH3

3,80 ± 0,04*

2 o-NO2

4,32 ± 0,05

1 o-OCH3

3,99 ± 0,05*

2 p-CN

3,13 ± 0,07*

4H

4,48 ± 0,05*

1 p-CH3

4,12 ± 0,04

4 p-N(CH3)2

5,26 ± 0,04*

1 p-F

3,65 ± 0,02

3H

4,14 ± 0,04*

4 p-OCH3

4,72 ± 0,05*

1 p-Cl

4,11 ± 0,01

3 p-N(CH3)2

4,91 ± 0,03*

4 m-OCH3

4,79 ± 0,09*

1 p-Br

4,23 ± 0,03

3 p-OH

2,96 ± 0,06*

4 o-OCH3

4,69 ± 0,09*

1 p-CN

2,93 ± 0,04*

3 p-OCH3

4,32 ± 0,07*

4 p-CH3

5,10 ± 0,09*

3 m-OCH3

4,42 ± 0,04*

4 m-CH3

4,98 ± 0,01*

2H

3,63 ± 0,06*

3 o-OCH3

4,43 ± 0,04*

4 o-CH3

4,92 ± 0,11*

2 p-N(CH3)2

4,50 ± 0,07*

3 p-CH3

4,76 ± 0,09

4 p-F

4,45 ± 0,04*

2 p-OH

2,53 ± 0,06*

3 m-CH3

4,70 ± 0,07

4 m-F

4,60 ± 0,02*

2 p-OCH3

3,91 ± 0,04*

3 o-CH3

4,56 ± 0,07

4 o-F

4,55 ± 0,06*

2 m-OCH3

3,97 ± 0,09*

3 p-F

4,14 ± 0,04

4 p-Cl

5,10 ± 0,10*

2 o-OCH3

4,01 ± 0,05*

3 m-F

4,35 ± 0,05

4 m-Cl

5,22 ± 0,02*

2 p-CH3

4,30 ± 0,02

3 o-F

4,42 ± 0,05

4 o-Cl

5,04 ± 0,04*

2 m-CH3

4,34 ± 0,05

3 p-Cl

4,58 ± 0,03

4 p-Br

5,22 ± 0,02*

2 o-CH3

4,12 ± 0,02

3 m-Cl

4,82 ± 0,04

4 m-Br

5,35 ± 0,12*

2 p-F

3,75 ± 0,04

3 o-Cl

4,60 ± 0,08

4 o-Br

5,04 ± 0,02*

2 m-F

4,82 ± 0,03

3 p-Br

4,68 ± 0,04

4 p-NO2

4,15 ± 0,08*

2 o-F

3,90 ± 0,08

3 m-Br

4,88 ± 0,06

4 m-NO2

4,32 ± 0,02*

2 m-Cl

4,38 ± 0,04

3 o-Br

4,61 ± 0,08

4 o-NO2

4,07 ± 0,07*

4 p-CN

3,72 ± 0,03*

5. táblázat Az 1-4 sorozat tagjainak kísérleti úton meghatározott logPTLC értékei. Az eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. A *-al jelölt értékek korábbi, nem saját mérések eredményei. (80)

38

logPTLC(logPCLOGP)

p-X 1

2

3

4*

H

3,42 (3,62)

3,63 (3,60)

4,14 (4,16)

4,48 (4,72)

N(CH3)2

4,23 (3,79)

4,50 (3,76)

4,91 (4,32)

5,26 (4,88)

OCH3

3,67 (3,54)

3,91 (3,52)

4,32 (4,08)

4,72 (4,64)

CH3

4,12 (4,12)

4,30 (4,10)

4,76 (4,66)

5,10 (5,22)

F

3,65 (3,77)

3,75 (3,74)

4,14 (4,30)

4,45 (4,86)

Cl

4,11 (4,34)

N.A. (4,31)

4,58 (4,87)

5,10 (5,43)

Br

4,23 (4,49)

N.A. (4,46)

4,68 (5,02)

5,22 (5,58)

CN

2,93 (3,06)

3,13 (3,03)

3,48 (3,59)

3,72 (4,15)

6. táblázat Az 1-4 sorozat para-helyzetben szubsztituált származékainak kísérletes úton meghatározott (logPTLC), valamint prediktált (logPCLOGP) logP értékeinek összehasonlítása. A logPCLOGP értékek számolása Chem3D Ultra 9.0.1. szoftver csomag CLOGP alkalmazásával történt. A *-al jelölt sorozat logP értékeinek meghatározása korábban történt. (80) (N.A. = nincs adat) A szubsztituenseknek nemcsak a minősége, hanem a helyzete is befolyásolja a logP értékeket. (7. táblázat) A 7-tagú gyűrűs benzoszuberon származékok (4) esetén megállapítható, hogy adott szubsztituenst orto-, meta-, illetve para-helyzetben taralmazó vegyületek logP értéke a következők szerint változik: logPTLC(orto) ≤ logPTLC(para) ≤ logPTLC(meta). A 2 és 3 sorozat tagjainál azonban a különböző helyzetben szubsztituált analógok logPTLC értékeiben nem figyelhető meg hasonló szabályszerűség. Ez a megfigyelés szintén arra utal, hogy a tér- és elektronszerkezet, amit a szubsztituensek minősége és helyzete is nagyban befolyásol, jelentős hatással van a molekulák lipofilitására. (80; 101; 67; 68) A

kidolgozott

módszer

lehetőséget

teremt

a

nagy

lipofilitással

bíró

kalkonanalógok logP értékeinek pontos meghatározására. A kísérleti eredmények, a várakozásoknak megfelelően, igazolták a vegyületek lipofilitásának változását a gyűrű tagszámának, valamint a szubsztituensek minőségének és helyzetének függvényében. Mindezek segítséget nyújthatnak a kalkon-molekulaelemmel rendelkező, esetleges gyógyszerjelölt molekula optimális fizikai-kémiai tulajdonságainak megtervezésében.

39

logPTLC

Vegyület orto

meta

para

2 OCH3 2 CH3 2F 2 Cl 2 Br

4,01 4,12 3,90 4,28 4,36

3,97 4,34 4,82 4,38 5,15

3,91 4,30 3,75 N.A. N.A.

3 OCH3 3 CH3 3F 3 Cl 3 Br 3 NO2

4,43 4,56 4,42 4,60 4,61 4,06

4,42 4,70 4,35 4,82 4,88 3,99

4,32 4,76 4,14 4,58 4,68 N.A.

4 OCH3 4 CH3 4F 4 Cl 4 Br 4 NO2

4,69 4,92 4,55 5,04 5,04 4,07

4,79 4,98 4,60 5,22 5,35 4,32

4,72 5,10 4,45 5,10 5,22 4,15

7. táblázat A szubsztituensek helyzetének hatása a 2-4 sorozat vegyületeinek kísérletes úton meghatározott logP értékeire. A 4 sorozat tagjainak logP meghatározása korábban történt. (80) (N.A. = nincs adat)

40

V.2. Gyűrűs kalkonszármazékok hatás-vizsgálatának eredményei A korábbi in vitro toxicitásvizsgálatok során kiemelkedő hatást mutató 7-tagú gyűrűs (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-benzoszuberont

(4a)

és

kevéssé

toxikus

4-

metilszubsztituált analógját (4b) (12. ábra) választottuk a tervezett vizsgálatok elvégzéséhez, a gyűrűs kalkonszármazékok citotoxikus és daganatellenes hatásának kialakulásában szerepet játszó mechanizmusok alaposabb megismerése céljából.

V.2.1. Az (E)-2-(4-metoxibenzilidén)-1-benzoszuberon és 4-metilanalógjának sejtproliferációra és sejtciklusra gyakorolt hatása V.2.1.1. A kalkonanalógok apoptózist indukálnak Jurkat T sejtekben Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a humán Jurkat T sejtek érzékenyebbek egy új α,β-telítetlen ketonra, mint más tumorsejtvonalak, így munkánkhoz Jurkat T sejteket használtunk. (102) A kalkonszármazékok Jurkat T sejtek sejtproliferációjára gyakorolt hatásának megismeréséhez elsőként a teljes sejtszám, valamint az élő sejtek arányának az alakulását vizsgáltuk a vegyületekkel történő kezelést követően. A 4a és 4b vegyületekkel – a Jurkat T sejtekkel szemben korábban meghatározott IC80 koncentrációértékek (4a: 5,6 μM; 4b: 23,3 μM) (64) mellett – történő 8, 24 illetve 48 órás kezelést követően a teljes sejtszámot (8. táblázat), illetve ebből az élő sejtek arányát (13. ábra) a sejtek tripánkékkel történő festését követően, hemocitométerrel határoztuk meg. (82) A tripánkék festék csak az elpusztult sejtek citoplazmájába képes behatolni és citoplazmás fehérjékhez kötődni, mivel az élő sejtek membránja nem ereszti át a festéket, így megkülönböztethetők egymástól az élő és elpusztult sejtek. A 8. táblázatból kiolvasható, hogy a kezeletlen sejtek, valamint az 1% DMSO-t tartalmazó inkubátumban levő sejtek száma 24 óra alatt megkétszereződik, ami megfelel a Jurkat T sejtek duplikációs idejének. (103) (A következő 24 óra alatt már térbeli korlátok miatt nem tud újra osztódni.) A kalkonok oldószereként használt DMSO tehát ekkora mennyiségben (1%), önmagában nem befolyásolja a sejtszámot. A két

41

vizsgált vegyület egymáshoz hasonló módon csökkenti a sejtek számát a 8, 24 és 48 órás időpontokban, gátló hatásuk a sejtek proliferációjára kifejezett.

Teljes sejtszám (x 105) 8 óra

24 óra

48 óra

Kontroll

5,45 ± 0,66

11,26 ± 1,67

11,07 ± 1,01

DMSO 1%

5,01 ± 0,74

10,53 ± 1,72

11,85 ± 2,44

4a (5,6 μM)

4,88 ± 0,68

8,68 ± 0,98

5,33 ± 0,83

4b (23,3 μM)

4,69 ± 0,52

7,91 ± 0,78

7,00 ± 0,76

8. táblázat 4a és 4b vegyületekkel történő sejtkezeléseket követően a teljes sejtszám alakulása. A meghatározás tripánkékkel történő festéssel történt. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. Az életképes sejtek aránya a kontroll sejtekhez képest mindkét kalkonanalóg esetén hasonlóan alakul. (13. ábra) 8 órás inkubációs időt követően az élő sejtek mennyisége még közel annyi, mint a kezeletlen sejtek esetében, de 24 órás, illetve 48 órás inkubációs idő után már csaknem felére csökken a számuk. Nagy valószínűség szerint már a 8 órás kezelési időtartam alatt is lejátszódnak olyan folyamatok, amelyek hatással lesznek a sejtproliferáció további alakulására.

13. ábra A 4a és 4b vegyületek hatása a Jurkat T sejtek életképességére. Az élő sejtek arányának meghatározása a kezelést követően tripánkékkel történő festési eljárással történt. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók.

42

A 4a és 4b vegyületek citotoxikus hatásának további vizsgálata céljából meghatároztuk a vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás kezelési időtartamokat követően az inkubátumokban levő élő, korai apototikus fázisban levő, és apoptózis (és/vagy nekrózis) során elpusztult sejtek mennyiségét. A sejteken minden időpontban kettős jelölést hajtottunk végre, fluoreszceinizotiocianáttal (FITC)-kötött annexin V-t és propídium-jodidot használva, majd áramlási citometriai módszerrel mértük a két festék fluoreszcencia-intenzitását. Az élő, ép sejtek nem jelölődnek. Az apoptózis korai szakaszában azonban megszűnik a sejtmembrán foszfolipid-aszimmetriája, azáltal, hogy a belső foszfolipid rétegből a külsőbe kerül a negatív töltésű foszfatidilszerin, amihez nagy affinitással kötődik az annexin V. Ebben a stádiumban a sejtmembrán még átjárhatatlan PI számára. Ugyanakkor az elpusztult vagy sérült sejtek membránján keresztül a PI már bejut a sejtekbe, és a kettős szálú DNS-hez kötődik. Így ez a két anyag együttesen alkalmas az apoptózis korai, illetve késői fázisában levő sejtek elkülönítésére. (84; 85) Az áramlási citometriai mérés során a kezeletlen kontroll sejtek esetén beállított kvadráns

statisztikai

paramétereket

használtuk

a

kalkonokkal

kezelt

sejtek

vizsgálatához. (14. ábra)

14. ábra A kontroll, valamint 4a és 4b vegyületekkel kezelt (8 órás kezelés) sejtek áramlási citometriai vizsgálata a sejtek kettős jelölését (annexin V(FITC) + PI) követően. Az FL-1/FL-2 csatornákon mérhető fluoreszcencia intenzitás alapján megkülönböztethetünk élő sejteket (annexin V-negatív + PI-negatív), korai apoptotikus fázisban levő sejteket (annexin V-pozitív + PI-negatív) és apototikus (vagy nekrotikus, azaz elpusztult) sejteket (annexin V-pozitív + PI-pozitív).

43

A citotoxicitás vizsgálat eredményeit a 9. táblázat tartalmazza. 8 órás kezelés alatt sem a 4a, sem a 4b vegyület nem mutat kifejezett toxikus hatást. 24 órás kezelési időtartam után azonban az élő sejtek száma sokkal kisebb a metoxiszármazék (4a) esetén (57,7%), mint a 4b vegyülettel történő kezelést követően (71,7%). A sejtek jelentős része korai apoptotikus fázisban (4a: 22,8%; 4b: 7,8%), illetve késői apoptotikus/nekrotikus fázisban van (4a: 16,8%; 4b: 17,1%).

Élő sejtek (%)

Korai apoptotikus sejtek (%)

Elpusztult sejtek (%)

Kontroll

90,33 ± 3,50

2,15 ± 1,07

3,98 ± 1,53

DMSO 1%

89,53 ± 5,60

2,67 ± 0,17

6,16 ± 2,68

4a (5,6 μM)

84,31 ± 4,24

3,15 ± 0,45

8,66 ± 2,15

4b (23,3 μM)

84,15 ± 0,52

2,81 ± 0,09

8,09 ± 0,11

Kontroll

89,37 ± 4,08

4,40 ± 3,07

4,24 ± 0,71

DMSO 1%

88,43 ± 5,72

3,17 ± 2,32

5,71 ± 2,49

4a (5,6 μM)

57,65 ± 5,52

22,80 ± 1,55

16,82 ± 3,39

4b (23,3 μM)

72,71 ± 6,59

7,81 ± 0,98

17,11 ± 6,35

Kontroll

90,27 ± 0,37

N.A.

9,70 ± 0,35

DMSO 1%

85,56 ± 1,26

N.A.

14,43 ± 1,24

4a (5,6 μM)

40,15 ± 1,39

N.A.

59,79 ± 1,39

4b (23,3 μM)

48,53 ± 3,18

N.A.

51,44 ± 3,18

8 óra

24 óra

48 óra

9. táblázat 4a és 4b vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás sejtkezeléseket, és annexinV(-FITC)/propídium jodiddal történő kettős jelölést követő áramlási citometriai módszer eredményei: az élő, korai apoptotikus fázisban levő, valamint elpusztult sejtek mennyisége %-ban kifejezve. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. (N.A.=nincs adat, 48 órás kezelést követően csak propídium-jodiddal történt jelölés) 48 órás kezelést követően csak propídium-jodidot használtunk az élő (PI-negatív) és a késői apoptotikus/nekrotikus fázisban levő (PI-pozitív) sejtek mennyiségének meghatározására. Ebben az időpontban az élő sejtek száma jelentősen lecsökken, a 4a vegyület esetén 40,2%-ra, a 4b analóg esetén pedig 48,5%-ra. (9. táblázat)

44

Az eredményekből kiolvasható, hogy a vizsgált kalkonszármazékok, ezen koncentrációértékek mellett, gátolják a sejtszaporodást, és apoptózist indukálnak. (104) A fenti módszerekkel kapott 48 órás citotoxicitás vizsgálat eredményei valamelyest különböznek a 4a és 4b vegyületekkel történt, nigrozin festés mellett értékelt korábbi vizsgálatok eredményétől. (64) A két különböző festési módszerrel kapott eltérő eredmény a tripánkék-festés relatív érzéketlenségének lehet a következménye, ami a festék makromolekuláris szerkezetéből adódik. (105) Másrészt, az áramlási citometriai módszerrel történt citotoxicitás vizsgálat eltérő eredménye a két különböző eljárás és értékelési módszer következménye lehet. (106) A 48 órás eredményeket illetően, az alkalmazott eljárásoktól függetlenül látszódik az, hogy a két koncentrációérték (4a: 5,6 μM 4b: 23,3 μM) közel ekvitoxikus dózist képvisel.

V.2.1.2. A vizsgált származékok eltérő módon befolyásolják a sejtciklust A kísérletekbe bevont kalkonanalógok Jurkat T sejtek sejtciklusára gyakorolt hatásának vizsgálata a vegyületekkel történt kezeléseket (IV.2.2) követően, a DNS mennyiségi analízise által valósult meg. A Jurkat T sejtek kezelése során különböző: 8, 24 és 48 órás időpontokban vizsgáltuk a sejteket, hogy időben is láthassuk a kalkonok sejtciklusra gyakorolt hatását. A DNS mennyiségi analíziséhez a sejtek jelölése minden időpontban propídiumjodiddal (PI) történt. A PI a sejtekben a kettősszálú DNS-hez kötődik, ezért a megkötött PI mennyisége, így az áramlási citometriai eljárás során látható fluoreszcens jel erőssége is arányos a sejtek DNS-mennyiségével. (A kísérletben használt RNAse enzim a kettős szálú RNS-t bontja, így a PI ahhoz nem tud kötődni, és nem torzítja el az eredményt.) A sejtciklus egyes fázisaiban levő sejtek egymástól való megkülönböztetetése a kezeletlen kontroll sejtek esetén felvett ábra alapján történt, az ott meghatározott „sávok” kerültek meghatározásra minden vizsgált vegyület és időpont esetén. (107) (15. ábra) A 4a és 4b vegyületek sejtciklusra gyakorolt hatásában eltérések mutatkoznak, különösen drasztikus a változás a metoxiszubsztituált (4a) származék esetén. A sejtciklus vizsgálat eredményeit, az egyes fázisokban levő sejtek mennyiségét, %-ban kifejezve az 10. táblázat, valamint a 16. ábra foglalja össze.

45

15. ábra Áramlási citometriai sejtciklus-analízis a kezeletlen kontroll sejteken (8 óra), valamint a 4a és 4b vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás kezelést követően. A sejtciklus egyes szakaszainak kijelölése a kontroll sejtek ábráján történt. A 4a vegyület korai hatása (8 óra) abban nyilvánul meg, hogy megnöveli a G2/M fázisban levő sejtek arányát (36,9%), ami együtt jár a G0/G1 fázisban levő sejtek mennyiségének csökkenésével (18,6%). A metilszármazék esetén (4b) a sejtek legnagyobb hányada, a kontroll sejtekhez hasonlóan, a G0/G1 fázisban található (36,8%).

46

Sub-G0 fázis (%)

G0 / G1 fázis (%)

Kontroll

3,3 ± 0,7

42,6 ± 0,9

DMSO 1%

3,1 ± 0,3

4a (5,6 μM) 4b (23,3 μM)

S fázis (%)

G2 / M fázis (%)

Poliploid sejtek (%)

21,2 ± 3,9

27,2 ± 0,9

5,6 ± 1,0

40,8 ± 1,4

20,7 ± 3,0

26,6 ± 1,7

7,6 ± 1,3

6,4 ± 0,9

18,6 ± 2,2

24,7 ± 1,0

36,9 ± 0,9

9,9 ± 2,7

3,8 ± 0,4

36,8 ± 2,3

22,8 ± 3,3

25,1 ± 3,2

8,4 ± 1,1

Kontroll

5,0 ± 1,5

44,7 ± 3,2

25,8 ± 0,5

22,7 ± 1,8

3,6 ± 0,9

DMSO 1%

5,5 ± 2,2

43,6 ± 2,6

21,1 ± 2,1

20,3 ± 1,1

4,9 ± 0,7

4a (5,6 μM)

22,4 ± 1,1

7,3 ± 0,4

9,6 ± 1,2

44,8 ± 4,9

16,2 ± 2,7

4b (23,3 μM)

14,5 ± 2,5

31,7 ± 2,5

17,3 ± 2,8

27,1 ± 2,2

8,5 ± 1,5

Kontroll

6,4 ± 1,9

49,6 ± 2,7

21,0 ± 1,1

17,3 ± 1,5

5,2 ± 2,0

DMSO 1%

8,4 ± 1,8

51,5 ± 2,3

17,2 ± 2,0

19,0 ± 0,7

7,1 ± 2,6

4a (5,6 μM)

40,8 ± 2,2

8,5 ± 0,8

5,9 ± 2,3

8,3 ± 1,5

34,3 ± 6,5

4b (23,3 μM)

36,5 ± 2,4

24,4 ± 1,2

13,0 ± 2,4

13,9 ± 1,3

12,4 ± 2,9

8 óra

24 óra

48 óra

10. táblázat Az áramlási citometriai módszerrel történt sejtciklus-analízis eredményei, a 4a és 4b vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás kezelést és propídium-jodidos jelölést követően. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. Hosszabb, 24 órás inkubációs időt követően a 4a vegyület hatására tovább csökken a G0/G1 fázisban levő sejtek mennyisége (7,3%), és nő a G2/M fázisban (44,8%), valamint a Sub-G0 (apoptotikus/nekrotikus sejtek) fázisban (22,4%) levő sejtek aránya. Ebben az időpontban (24 óra), a 4b származékkal kezelt sejtek esetén mérsékelt csökkenés következik be a G0/G1 fázisban levő sejtek mennyiségében (31,7%), ami együtt jár a G2/M fázisban (27,1%), illetve a Sub-G0 fázisban (14,5%) levő sejtek arányának kismértékű növekedésével. A 4a és 4b vegyületek eltérő hatása a (G2/M)/(G0/G1) aránnyal is kifejezhető, ami 0,51 a kontroll, 6,1 a metoxi- (4a), és 0,85 a metilszármazék (4b) esetén. 48 órás kezelést követően mindkét kalkonanalóg esetén további növekedés tapasztalható a Sub-G0 fázisban, vagyis jelentősen megnő az apoptotikus/nekrotikus sejtek aránya (4a: 40,8%; 4b: 36,5%), valamint ún. poliploid sejtek kialakulása figyelhető meg.

47

16. ábra A kontroll, az 1%-ban DMSO-t tartalmazó, valamint a 4a és 4b vegyületekkel történő 8, 24 és 48 órás kezelést és propídium-jodidos jelölést követő sejtciklus-analízis eredményei - a sejtciklus egyes fázisaiban levő sejtek százalékos mennyisége szerint ábrázolva. Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók.

48

A sejtciklus-vizsgálat eredményeit összefoglalva elmondható, hogy a kalkonok oldószereként használt DMSO, az alkalmazott 1%-ban nem befolyásolja a sejtciklust, a két vizsgált vegyület hatása jelentős, de egymástól eltérő. (104) Míg a metilszármazék (4b) esetén, a 8 órás kezelést követően a sejtek legnagyobb hányada – a kontroll sejtekhez hasonlóan – a G0/G1 fázisban található, addig a metoxiszubsztituált analóg (4a) esetén a G2/M fázisban. Ez együtt jár a G0/G1 fázisban levő sejtek mennyiségének csökkenésével, ugyanakkor a Sub-G0 fázisban levő apoptotikus/nekrotikus sejtek arányának növekedésével is. (84; 85) Mivel a 8 órás időtartam körülbelül harmada egy sejtciklus időtartamának Jurkat T sejtekben (103), a kísérleti eredmény arra utal, hogy a 4a vegyület esetén nem működik megfelelően a G1 ellenőrző pont, aminek egyébként meghatározó szerepe van genetikai problémák kiküszöbölésében. (108) A G1 ellenőrzőpont által „visszatartott” sejtek ugyanis részben, apoptózis vagy nekrózis során elpusztulnak, aminek fontos szerepe van a genom integritásának biztosításában. (109) A vegyület tulajdonképpen felfüggeszti a G1 ellenőrzőpont „munkáját”. A 4a vegyület G2/M fázisú blokkot is okoz. A sejtciklusban bekövetkező ilyen jellegű zavar, mint egyes flavonoidok és kalkonok lehetséges hatásmechanizmusa, az irodalomban is dokumentált. (110; 111; 112; 113) Az észlelt változások arra utalnak, hogy a metoxiszármazék (4a) viszonylag gyorsan DNS károsodást okozhat, aminek gyakori velejárója a G2/M fázisú blokk. (114; 115) A metilvegyület (4b) ekvitoxikus dózisával történő sejtkezelés estén nem figyelhető meg hasonlóan jelentős változás a G1 ellenőrzőpontot illetően, és a G2/M blokk sem kifejezett. A 4a származékkal történő hosszútávú (24 és 48 órás) expozíciót követően mind a G0/G1, az S, valamint a G2/M fázisban levő sejtek mennyisége drasztikusan csökken. Egyidejűleg nagymértékben megnő a Sub-G0 fázisban levő (apoptotikus/nekrotikus) sejtek, valamint a poliploid sejtek mennyisége, ami a G2 ellenőrzőpont működési zavarára utal. Az ilyen jellegű késleltetett sejthalál, amit „mitotikus halál”-nak is neveznek, jellegzetessége a p53 mutáns tumoroknak. (116) A poliploid populáció proliferációs potenciálja egyelőre vitatott. Vannak, akik azt állítják, hogy a poliploid sejtek alacsony proliferatív potenciállal rendelkeznek, mások szerint azonban – bár késleltetett a metafázis – proliferációra képesek. (116) A vizsgált kalkonszármazékok csökkentik az élő sejtek számát, apoptózist indukálnak, ami minden bizonnyal összefüggésbe hozható azzal a kísérleti eredménnyel, hogy jelentős mértékben befolyásolják a sejtciklust, különösen a 4a

49

vegyület. Az apotózis számos anti-apoptotikus, valamint pro-apototikus modulátor által irányított folyamat. Későbbi kutatások igazolták, hogy a 4a származék csökkenti a Bcl-2 fehérje – az anti-apoptotikus proteinek egy típusának – expresszióját, ugyanakkor megnöveli az apotózist elősegítő Bax protein szintézisét. (117) A Bax/Bcl-2 arány növekedése nagyban hozzájárulhat az apoptózis indukciójához.

V.2.2. A kalkonszármazékok in vitro antioxidáns hatással bírnak A 7-tagú gyűrűs 4-metoxi- (4a) és 4-metilszubsztituált (4b) kalkonanalógok in vitro antioxidáns (hidroxilgyök scavanger), esetleges prooxidáns hatását, illetve annak időfüggését, a Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs tesztet alkalmazva vizsgáltuk. (86; 87) A hidroxilgyök scavanger hatás in vitro jellemzésére számos módszer ismert az irodalomban. Ezek egyike a Halliwell és mtsai által kidolgozott módszer, melynek lényege, hogy a vas(II)-ionok és H2O2 reakciójában keletkező hidroxilgyökök a 2dezoxi-D-ribózt eloxidálják. A láncszakadással járó oxidáció eredményeképpen savas közegben tiobarbitursavval 532 nm körüli abszorpciós maximummal rendelkező karbonilvegyületek keletkeznek. (87) (17. ábra) Ha a vizsgálatot hidroxilgyökscavanger tulajdonságú vegyület jelenlétében végezzük, akkor kompetitív reakció eredményeként az 532 nm körüli abszorpciós maximummal rendelkező fragmens vegyületek mennyisége csökken. (87)

17. ábra A Fenton-reakció, illetve a dezoxiribóz degradációs teszt lényege Kísérleteink során Winterbourn vizsgálatai alapján optimalizált dezoxiribóz teszt összetételt alkalmaztuk. (118) Bár a reakció pontos mechanizmusa és a reakció során keletkező vegyületek kémiai szerkezete teljességében nem ismert, az érzékeny és könnyen kivitelezhető módszer széles körben alkalmazott a hidroxilgyök scavanger tulajdonságú vegyületek in vitro antioxidáns hatásának vizsgálatára. A módszer, az alkalmazott kísérleti körülmények között alkalmas az azonnali, illetve hosszútávú

50

antioxidáns, sőt pro-oxidáns aktivitás meghatározására. (119) A hosszútávú (240 perc) vizsgálat során ugyanis a hidroxilgyökök hatására esetlegesen keletkező redox-aktív metabolitok további redox-reakciókat indíthatnak el (ami a vas(III)-ionok vas(II)ionokká

történő

redukcióját

is

magába

foglalja),

és

„újra” hidroxilgyökök

képződhetnek. (53) A vizsgálatokat etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA) jelenlétében és EDTA hozzáadása

nélkül

is

elvégeztük.

EDTA

hozzáadása

vas(II)-EDTA-komplex

kialakulását eredményezi (120), aminek Fenton-reakcióban való részvétele az EDTA degradációjához vezethet. (121) EDTA hiányában a vas(II)-ionok egy része a dezoxiribózzal képez komplexet. (122) Az ún. „hely-specifikus” Fenton-reakcióban a hidroxilgyökök képződésük helyén azonnal elreagálnak. Tehát azok a vegyületek, amelyek ligandként szerepelhetnek (jelen esetben az EDTA), versengenek a dezoxiribózzal a vas(II)-ionokért, ezáltal csökken a vas(II)-ion katalizálta reakcióban keletkező hidroxilgyök okozta degradáció. A dezoxiribóz degradációs teszt eredményeit a 18.-19. ábra foglalja össze. A kontroll inkubátumok esetén a keletkező TBA-reaktív anyagok mennyisége (a mért abszorbancia) időben viszonylag állandónak mondható. Ahogy az a 18. ábraról leolvasható, az EDTA-t nem tartalmazó rendszerben mindkét vizsgált kalkonszármazék folyamatos antioxidáns, vagyis hidroxilgyök scavanger aktivitást mutat a 240 perces kísérleti ídőtartam alatt. Bár a 4a vegyület antioxidáns kapacitása az inkubációs idő 120-adik perce körül minimumot mutat, az inkubációt folytatva a két vegyület hasonló mértékben csökkentette a dezoxiribóz oxidációja során keletkező TBA-reaktív termékek mennyiségét. A 19. ábran láthatók az EDTA (36 μM) jelenlétében elvégzett kísérletek eredményei. EDTA jelenlétében a reakció során keletkező TBA-reaktív termékek mennyisége jelentősen kisebb (alacsonyabb a mért abszorbancia), mint EDTA nélkül. A 4a vegyület esetén a TBA-reaktív anyagok mennyisége megnő a 80-120 percig tartó periódius alatt, majd jelentős csökkenésnek indul. Az észlelt prooxidáns hatás könnyebb értelmezésének céljából a 120. percben vett inkubátum etilacetátos kivonatát GC-MS mérésnek vetettük alá. A GC-MS analízis során azonban nem sikerült a 4a vegyület valamely, az inkubáció során keletkező metabolitjának jelenlétét igazolni. Az észlelt hatás hátterének megismeréséhez további vizsgálatok szükségesek. A metilszármazék (4b) ezen kísérleti körülmények között is mindvégig antioxidáns aktivitást mutatott.

51

18. ábra A Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs teszt időbeli függésének eredményei a kontroll inkubátumban, valamint 4a (200 μM) és 4b (200 μM) jelenlétében, EDTA hozzáadása nélkül. Az abszorbancia mérése 532 nm-en történt. Az eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók.

19. ábra A Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs teszt időbeli függésének eredményei a kontroll inkubátumban, valamint 4a (200 μM) és 4b (200 μM) jelenlétében, 36 μM EDTA hozzáadása mellett. Az abszorbancia mérése 532 nm-en történt. Az eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. A rákos sejtek folyamatosan, viszonylag nagy mennyiségben termelnek hidrogénperoxidot (H2O2). (123) A hidrogén-peroxid és vas-, illetve réz-ionok reakciója során (általánosságban a Fenton-reakció során (124)) folyamatosan hidroxilgyökök is termelődnek. Az aromás vegyületek reakcióba léphetnek a keletkező gyökökkel,

52

miközben

hidroxilszubsztituált

származékok

keletkezhetnek.

(52)

A

fenolos

metabolitok további oxidációja során reaktív oxigéngyökök keletkezhetnek, és az eredetileg

antioxidáns

hatású

aromás

vegyületek

–

számos,

spontán

vagy

enzimkatalizált reakció eredményeként – akár oxidatív stresszt is okozhatnak. (53; 125) Ezek ismeretében vizsgáltuk a két kalkonszármazék in vitro antioxidáns, illetve esetleges prooxidáns hatását. A Fenton-reakció inicializálta dezoxiribóz degradációs teszt eredményeként azt láthatjuk, hogy a vizsgált vegyületek rövidtávon antioxidáns aktivitást mutatnak, de hosszútávú inkubációjuk során kapott eredmények függnek az alkalmazott kísérleti körölményektől. A metilszármazék (4b) mindkét vizsgálati protokoll (EDTA nélkül és EDTA mellett) szerint in vitro antioxidáns hatással bír. A metoxiszubsztituált analóg (4a) az EDTA jelenlétében elvégzett kísérletben átmeneti prooxidáns aktivitást mutatott, ami arra utal, hogy a vizsgált aktivitás függ a jelen levő kelátkomplexképző anyagtól, ami befolyásolhatja a vasionok mikrospeciációját és reaktivitását. (104; 126)

V.2.3. A kalkonszármazékok hatással vannak a Jurkat T sejtek redox státuszára V.2.3.1. A vegyületek befolyásolják a ROS-aktivitást A vizsgált kalkonanalógok reaktív oxigéngyök (ROS) termelésre gyakorolt hatását, a vegyületekkel történő 1 és 4 órás sejtkezelést követően, 2’,7’-diklórfluoreszcindiacetátot (DCFH-DA) használva vizsgáltuk. (88; 89) A DCFH-DA egy nemfluoreszkáló molekula, amely képes a sejtek membránján áthatolni, és az intracelluláris térbe kerülni. A jelen levő észteráz enzimek lehasítják a molekuláról az acetilcsoportokat és 2’,7’-diklórfluoreszcin (DCFH) keletkezik, amely még nem fluoreszkál.

Reaktív

oxigénszármazékok

(főként

H2O2)

jelenlétében

azonban

fluoreszcens 2’,7’-diklórfluoreszceinné (DCF) oxidálódik. A fluoreszcens jel intenzitása – többek között – áramlási citométerrel detektálható. Az FL-1 csatornán mért jelintenziás tehát végső soron az intracelluláris ROS-koncentrációval arányos. Az áramlási citometriai analízis alkalmazásával láthatóvá vált, hogy a metilanalóg (4b) jelentősen csökkenti a kezelt sejtekben a ROS termelést, ugyanakkor a metoxiszármazék (4a) a kontroll sejtek analízisével hasonló képet mutat, vagyis nem befolyásolja ezen kísérleti körülmények között a ROS produkciót. (20. ábra)

53

20. ábra A kalkonszármazékok celluláris ROS termelésre gyakorolt hatása. Áramlási citometriai (FACScan) analízis a Jurkat T sejtek 4a és 4b vegyületekkel történő 4 órás inkubációját, és DCFH-DA-val (10 μM) történő 20 perces jelölését követően. A 21. ábra foglalja össze a ROS-mérés eredményeit, a kezeletlen kontroll sejtekhez viszonyított relatív fluoreszcencia intezitás (%) értékek láthatók.

21. ábra A kalkonszármazékok celluláris ROS termelésre gyakorolt hatása. A kezelt sejtek (DMSO 1%, 4a és 4b) fluoreszcencia intenzitását a kezeletlen kontroll sejtek esetén mért fluoreszcenzia intenzitáshoz viszonyítjuk (%). Az eredmények négy párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. A kezeletlen kontroll sejtekhez képest szignifikáns különbség (Student-t teszt, p < 0,05) *-al jelölve.

54

A 4b vegyület szignifikánsan csökkentette a DCF jelének intenzitását, mind az 1 órás, mind a 4 órás kezelést követően (80,20 ± 10,35% és 71,35 ± 16,51% a kontrollhoz viszonyítva). A 4a származék esetén nem figyelhető meg szignifikáns változás. A korábbiakban láthattuk, hogy a vizsgált kalkonszármazékok apoptózist indukálnak. Az apoptózis olyan szigorúan szabályozott morfológiai változások sora, amelyek a sejtek halálához vezetnek, de az apotózist nemcsak természetes, hanem mesterséges stimulusok is indukálhatják. Egyre nagyobb az egyetértés arra vonatkozólag, hogy az oxidatív stressz és a redox-státuszt befolyásoló tényezők döntő szerepet játszanak az apoptózis irányításában és lefolyásában. (127) Néhány kalkonszármazék citotoxikus hatásának hátterében az állhat, hogy oxidatív stresszt okoznak (128), ugyanakkor mások a kalkonok antioxidáns hatásáról számolnak be (35; 37), de azt is feltételezik, hogy a kalkonok toxikus hatása a prooxidáns tulajdonságnak tudható be (35; 51). A 4a és 4b vegyületek ROS termelésre gyakorolt hatását azért vizsgáltuk, hogy vajon oxidatív stresszt is okozva indukálnak apoptózist. A vizsgálati eredmények arra utalnak (21. ábra), hogy a vegyületek nem növelik meg az intracelluláris ROS aktivitást, sőt a metilszubsztituált analóg (4b) szignifikánsan csökkenti a ROS-szintet és antioxidáns aktivitást mutat. Ez utóbbi eredmény összhangban áll az in vitro antioxidáns hatást vizsgáló dezoxiribóz teszt eredményével (V.2.2), ami szerint a vegyületek in vitro hidroxilgyök-scavanger aktivitással rendelkeznek. (104; 126)

V.2.3.2. A kalkonszármazékok hatással vannak a mitokondriális funkciókra A sejtek mitokondriális működése alapvetően három folyamatot határoz meg: az oxidatív foszforiláció, reaktív oxigénszármazékok képződése, valamint a fiziológiás sejthalál (apoptózis) iniciációja a legfontosabb mitokondriális funkciók. (129) Következésképpen,

ha

egy

xenobiotikum

befolyásolja

a

mitokondriális

tevékenységeket, az hozzájárulhat a vegyület citotoxikus vagy antineoplasztikus hatásához. Néhány kalkonszármazék és izolált patkány máj mitokondriális külső membrán interakciójának fluoreszcencia polarizációs módszerrel történő vizsgálatakor a 4a vegyület más származékoktól eltérő módon viselkedett. A 4a analóg esetén, mitokondrium jelenlétében, folyamatosan növekedő fluoreszcencia polarizációs jelet lehetett detektálni. (130) Ez következménye lehet annak, hogy a lipofil kalkonanalóg

55

fokozatosan beépül a mitokondriális membránba, ami csökkenti a molekula konformációs mobilitását, ez pedig szintén hozzájárulhat a vegyület kiemelkedő citotoxikus hatásához. (130) A kalkonanalógok mitokondriális funkcióra gyakorolt hatásának vizsgálatát a kassai P. J. Šafarik Egyetem Orvosi Kémiai és Biokémiai Intézetével kooperációban végeztük. A mitokondriális respirációra, ATPáz enzim aktivitásra, ezáltal a mitokondriális redox státuszra gyakorolt hatás vizsgálatok izolált patkánymáj mitokondriumokon történtek. (131) Az izolált mitokondriumok oxigénfogyasztás sebességének meghatározása 25 °Con, polarográfiás módszerrel, oxigénelektróddal történt. Az ún. respirációs médumhoz adtuk a kalkonanalógokat, ADP-t, respirációs szubsztrátként nátrium-szukcinátot, valamint a mitokondriumot. Az oxigénfogyasztás nmol O2 x min-1 x fehérje mg-1 formában került kifejezésre, ADP hozzáadásakor (3-as állapot; state 3), illetve ADP hozzáadása előtt (4-es állapot; state 4). A vizsgált kalkonszármazékok nem befolyásolják az oxigénfogyasztást a 3-as állapotban, de szignifikánsan megnövelik azt a 4-es állapotban (a 4a vegyület 50,7 %-al), vagyis ADP-mentes körülmények között. (11. táblázat) O2 fogyasztás a 4-es állapotban

O2 fogyasztás a 3-as állapotban

(nmol O2 x min-1 x mg-1)

(nmol O2 x min-1 x mg-1)

ATPáz RCR

(nmol x min-1 x mg-1)

Kontroll

11,87 ± 0,83

34,57 ± 0,79

2,91 ± 0,14

0,403 ± 0,017

4a

17,89 ± 0,83*

38,44 ± 0,96

2,14 ± 0,10*

0,544 ± 0,021*

4b

15,94 ± 0,66*

40,92 ± 2,78

2,57 ± 0,21

0,457 ± 0,019

11. táblázat A 4a és 4b vegyületek mitokondriális respirációs funkciókra gyakorolt hatása. RCR = respiratory control ratio, az „oxigénfogyasztás a 3-as állapotban” és az „oxigénfogyasztás a 4-es állaptban” hányadosa. Az eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. A kontrollhoz képest szignifikáns különbség (Student-t teszt, p < 0,05) *-al jelölve látható (131) A 4a vegyület szignifikánsan csökkenti az RCR-értéket (RCR = respiratory control ratio, az „oxigénfogyasztás a 3-as állapotban” és az „oxigénfogyasztás a 4-es állapotban” hányadosa). Mivel a vegyületek autooxidációja nem lehet felelős a megnövekedett oxigénfogyasztásért, az „elfogyasztott” oxigén a mitokondriális

56

elektron-transzfer reakciók szubsztrátja lehet (132), ami a mitokondriális redox-státusz megváltozásával járhat. Annak tisztázása érdekében, hogy az oxigénfogyasztás összefüggésben áll-e az ATP szintézis esetleges megváltozásával, az ATP szintáz (ATPáz) aktivitását vizsgáltuk, a Meissner-féle módszer (93) szerint. A kísérlet eredménye szerint a metoxiszármazék (4a) szignifikánsan megnöveli a mitokondriális ATPáz aktivitást, anélkül, hogy hatással lenne az oxigénfogyasztásra a 3-as állapotban. (11. táblázat) Az észlelt szétkapcsoló hatás főként egyes lipofil, gyengén savas karakterű kismolekulára jellemző, amikor a megnövekedett O2-fogyasztás ellenére nem történik ATP szintézis. (133) Miután a vizsgált vegyületek lipofil molekulák, de nem bírnak gyenge savi karakterrel, további vizsgálatok szükségesek a szétkapcsoló hatás mechanizmusának kiderítésére.

V.2.3.3. A kalkonanalógok befolyásolják a celluláris SH-szintet Az α,β-telítetlen karbonilvegyületek citotoxikus hatását elsősorban az élő szervezetek esszenciális, tiolcsoportot tartalmazó molekuláival szemben mutatott reaktivitásuknak tulajdonítják. (35; 37) Az esetlegesen lejátszódó reakciók befolyásolják az intracelluláris redox-státuszt, és ezáltal számos más folyamatot is. (45) A 4a és 4b vegyületek celluláris tiol-csoportokkal kialakuló lehetséges kölcsönhatását első lépésben a vegyületek celluláris SH-szintre gyakorolt hatása révén vizsgáltuk, tápanyagmentes és tápanyagokat tartalmazó környezetben. Az 1 (PBS-pufferben), 4 illetve 8 óráig (RPMI tápoldatban) tartó kezeléseket követően, Ellmann-reagenssel történő meghatározások (94) eredményeit a sejtek fehérjemennyiségére vonatkoztattuk. Az eredményeket a 12. táblázat foglalja össze. A 4a vegyülettel történő 1 órás, tápanyagokat nem tartalmazó PBS-pufferben történt kezelés alatt a celluláris SH-szint szignifikánsan csökkent az 1% DMSO-val kezelt kontroll sejtekhez képest. 4b vegyület nem okozott ilyen jellegű változást. A hosszabb ideig (4, illetve 8 óra) tartó, RPMI-tápoldatban történő inkubáció már lehetőséget teremt a sejteknek, hogy reagáljanak a GSH-szintet érintő esetleges változtatásokra. (134) A metoxivegyület (4a) ezen körülmények között is szignifikánsan csökkentette az SH-szintet, ugyanakkor 4b vegyület nem változtatta meg szignifikáns mértékben az SH-szintet.

57

Teljes celluláris tiol (SH-csoport) mennyiség (nmol/mg fehérje) 1 óra (PBS)

4 óra (RPMI)

8 óra (RPMI)

Kontroll (DMSO 1%)

33,08 ± 0,35

124,42 ± 3,21

122,01 ± 3,89

4a (5,6 μM)

24,01 ± 0,53*

107,92 ± 2,30*

108,03 ± 2,05*

4b (23,3 μM)

31,84 ± 0,63

129,19 ± 1,52

114,08 ± 1,07

12. táblázat Celluláris SH-szint Jurkat T sejtekben a 4a és 4b vegyületekkel történő sejtkezeléseket követően. A PBS-pufferben történt meghatározás tápanyagmentes környezetet, az RPMI-tápoldatban történt mérés tápanyagokat tartalmazó környezetet jelent. Az eredmények három párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. Az 1% DMSO-val kezelt kontroll sejtekhez képest szignifikáns különbség (Student-t teszt, p < 0,05) *-al jelölve látható Sejtes körülmények között a gyűrűs kalkonszármazékok egyrészt enzim-katalizált konjugációs reakciók révén és/vagy a redukált SH-csoportok diszulfiddá történő oxidációja révén képesek a tiol-státuszt befolyásolni. (56; 135) A kísérlet eredményei arra utalnak, hogy a 4a vegyület, glutation-S-transzferáz enzim katalízise mellett, nagyobb reaktivitást mutat SH-csoportokkal, mint 4b vegyület. (135)

V.2.3.4. A kalkonszármazékok hatása a Jurkat sejtek glutation státuszára A kalkonanalógok SH-reaktivitásának vizsgálatát tovább folytatva, a Jurkat T sejtek 4a és 4b vegyületekkel történő kezelését követően, a redukált glutation-szintet (GSH) és az oxidált glutation-szintet (GSSG) orto-ftálaldehiddel történő derivatizálást követően, nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerrel határoztuk meg. (96) A mintaelőkészítés során a sejtlízist három, egymást követő „freeze-and-thaw ciklus” révén valósítottuk meg (136), nem az egyébként használatos ultrahangos szonikálás révén, ugyanis az megnövelheti a sejtek GSSG-tartalmát. (137) Az önmagában nem fluoreszkáló orto-flálaldehid, mint bifunkcionális reagens egyszerre reagál a GSH molekula tiol- és primer aminocsoportjával, fluoreszkáló izoindolszármazékot képezve. A keletkező termék 348 nm gerjesztési hullámhossz, valamint 450 nm emissziós hullámhossz mellett detektálható. (138) A reakció pHfüggő, a redukált glutation OPA-val lejátszódó reakciójának optimális pH-értéke 8,0. Ezen a pH-értéken az OPA nem reagál oxidált glutationnal, vagyis a GSH szelektíven

58

mérhető. Magas pH-érték mellett (≈ pH 12) azonban a GSSG is reakcióba lép OPA-val. (133) Így pH 12 mellett a GSSG-tartalom is meghatározható. (138; 139; 140) Annak érdekében, hogy az oxidált glutationmennyiség is szelektíven mérhető legyen, a GSSG mérésekor a mintákban levő redukált glutationt N-etilmaleimiddel (NEM) reagáltatjuk, amely a GSH tiolcsoportjához kapcsolódik. Ezáltal a GSH nem tud reakcióba lépni OPÁ-val, illetve a konjugáció megvédi az oxidációtól is. (141) Ezt alátámasztja az a vizsgálat is, amikor csak GSH-t tartalmazó standard oldathoz NEM-et adtunk, majd azt a GSSG-szint meghatározásához használt módszer (IV.2.6.4) szerint derivatizáltuk és vizsgáltuk. A kromatogramon nem láttunk csúcsot, igazolva a GSH teljes „eliminálását” a mintából. A kezeletlen és kalkonokkal kezelt sejtes minták glutation-koncentrációjának meghatározása az OPA-val történő derivatizálást követően, a kísérleti részben leírt fordított fázisú HPLC kromatográfiás kondíciók mellett történt. (IV.2.6.4) A koncentráció meghatározása a GSH-t és GSSG-t tartalmazó standard sorozat mintáinak mérése során felvett kalibrációs egyenesek segítségével történt. A meghatározott redukált és oxidált glutation-szinteket a minták fehérjemennyiségére vonatkoztattuk. Az eredmények (nmol/mg fehérje) a 22. ábra láthatók.

22. ábra A kalkonszármazékok celluláris glutation-szintre gyakorolt hatása Jurkat T sejtekben a 4a és 4b vegyületekkel történő 4 órás kezelést követően. A kezeletlen és kezelt sejtek (DMSO 1%, 4a és 4b) redukált glutation, valamint oxidált glutation mennyiségének (nmol/mg fehérje) meghatározása OPA-val történő derivatizálást követően HPLC-módszerrel történt. Az eredmények öt párhuzamos mérésből képezett átlag ± szórás formában láthatók. A kezeletlen kontroll sejtekhez képest szignifikáns különbség (Student-t teszt, p < 0,05) *-al jelölve.

59

A kísérleti eredmények alapján a metoxi- (4a), és a metilszubsztituált (4b) kalkonszármazék eltérő módon befolyásolja a Jurkat sejtekben a glutation-szintet 4 órás kezelést követően. A 4a vegyület nem befolyásolja jelentősen a szabad glutation-szintet (GSH), de szignifikáns mértékben megnöveli az oxidált glutation (GSSG) mennyiségét (0,67 ± 0,26 nmol/mg fehérje a kontroll sejtek esetén, 1,15 ± 0,33 nmol/mg fehérje 4a esetén). A 4b származék azonban a redukált glutation mennyiségét növeli meg kis mértékben (35,3 ± 6,6 nmol/mg fehérje mennyiségről 42,4 ± 7,2 nmol/mg fehérje-re), de nem befolyásolja jelentősen a GSSG szintet a kezeletlen kontroll, illetve 1% DMSOval inkubált sejtekhez viszonyítva. (22. ábra) A glutation-rendszer az egyik legfontosabb celluláris védekező mechanizmus az élő sejtben. A glutation önmagában ROS scavengerként működik, de az intracelluláris redox-homeosztázis szabályozásában is kiemelt szereppel bír. (127; 139) A sejt azon képessége, hogy milyen mértékben képes glutationt termelni (akár a GSSG redukciója révén, vagy de novo GSH szintézis révén) alapvetően meghatározza a sejt hatékonyságát az oxidatív stressz kezelésében. A 4 órás kezelési időtartam elég hosszú ahhoz, hogy a sejt reagáljon a glutationszintet érintő változtatásokra. (134) A metilszármazék (4b) az ismert kondíciók mellett képes a GSH szintet kis mértékben megnövelni. Korábban is beszámoltak már arról, hogy néhány elektrofil tulajdonsággal rendelkező Mannich bázis megnövelte a celluláris tiol-szintet Jurkat T sejtekben (134), illetve HeLa sejtvonalakban (142). A megnövekedett GSH szint nagy valószínűséggel az azt befolyásoló tényezők hatására fellépő feedback mechanizmus következtében, de novo szintézis eredményeként képződött GSH-nak tudható be. (134) A GSH-szint növekedése mögött az is állhat, hogy a kalkon, mint α,β-telítetlen keton, a Keap1 fehérjék inaktiválása révén, aktiválja az Nrf2 protein által irányított expressziós folyamatokat, többek között a γ-glutamilcisztein-szintetáz (γ-GCS), glutation-szintetáz, glutation-reduktáz és glükóz-6-foszfátdehidrogenáz enzimek fokozott kifejeződése révén megnöveli a GSH szintézist. (59) Ezzel ellentétben a metoxianalóg (4a) a sejt oxidált GSSG-tartalmát növelte meg szignifikáns mértékben, ami utalhat arra, hogy a vegyület valamilyen módon oxidatív stresszt idéz elő. A GSSG-szint fiziológiás indikátora a ROS elleni intracelluláris védekező mechanizmus aktivitásának, így alkalmas az oxidatív stressz in vivo monitorozására is. (143; 144) A GSSG-szint emelkedésével párhuzamosan a GSH-szint csökkenése nem volt megfigyelhető. Ez adódhat abból, hogy a kettő mennyisége között nagyságrendbeli különbség van, és a GSH mennyiségben esetlegesen bekövetkező

60

változás nem érzékelhető ilyen módon. Ugyanakkor szerepe lehet annak is, hogy megnő a glutation-reduktáz enzim aktivitása és/vagy megnő a γ-GCS aktivitása, annak érdekében, hogy a sejt próbálja fenntartani a megfelelő glutation szintet. (128)

V.2.4. A kalkon-glutation konjugációs reakció vizsgálata V.2.4.1. A vizsgált kalkonszármazékok intrinsic aktivitást mutatnak glutationnal A celluláris glutation-státusz megváltoztatásának a redox reakción kívül egy másik lehetséges, a gyűrűs kalkonanalógok kémiai szerkezete alapján feltételezhető mechanizmusa a vegyületek redukált glutationnal lejátszódó spontán és/vagy glutationS-transzferáz enzim által katalizált konjugációs reakciója. Első lépésben a spontán lejátszódó reakciót vizsgáltuk sejtmentes körülmények között. Ehhez a kalkonanalógokat és redukált glutationt ekvimoláris mennyiségben tartalmazó, különböző pH-jú (pH = 5,5; 7,4; 9,0) oldatokat inkubáltunk 37 °C-on, illetve 50°C-on, 1 és 3 órán keresztül. Az inkubátumok összetételét vékonyrétegkromatográfiás módszerrel, a kísérleti részben (IV.2.7.1) leírtak szerint vizsgáltuk. A pH 7,4-es, illetve a pH 9,0-es oldatok esetén az 50 °C-os inkubátum, valamint a pH 9,0es, 37 °C-os inkubátum analízise során, a kettős előhívást követően, a kalkon, valamint a GSH foltján kívül egy harmadik folt is láthatóvá vált. Ez a folt egy addukt jelenlétét feltételezi, hiszen mind a két előhívási forma szerint látható volt, vagyis az aromás vegyületekre jellemző UV-aktivitást is mutatja és a peptid (GSH) jelenlétére utaló színreakciót is adja. A GSH UV-fénnyel történő előhívás során nem ad jelet, azonban ninhidrinnel ibolyáskék színreakciót ad, ugyanis a GSH három aminosavból álló tripeptid és az αaminosavak zöme semleges közegben ninhidrinnel igen érzékeny, kvantitatív célra is alkalmas színreakciót nyújt. A kalkonszármazékok csak UV fényben történő előhívás után adnak jelet. Mivel a konjugátumok GSH-t és a kiindulási kalkon vegyületet is tartalmazzák, ezért ezek UV fényben, valamint ninhidrinnel történő előhívás során is pozitív reakciót adnak. (104) Mindkét vizsgált származék (4a és 4b) esetén hasonlóak voltak a tapasztalatok.

61

Gyengén savas körülmények között (pH = 5,5), ami egyébként jellemző kémhatás tumoros sejtek környezetében, a vizsgált származékok nem mutatnak intrinsic aktivitást glutationnal. A kalkonszármazékok és GSH között lejátszódó nem enzim-katalizált reakció további

vizsgálata

céljából

egy

fordított-fázisú

nagyhatékonyságú-

folyadékromatográfiás módszer (RP-HPLC) kifejlesztése is megtörtént. (145) A reakcióelegyben a GSH végső koncentrációja 5 x 10-2 M, a kalkon koncentrációja 5 x 10-3 M volt. A reakcióelegy pH értékének beállítása pH 8-ra történt, amely pH értéken a GSH kb. 6%-a a sokkal erősebb nukleofil tiolát-anion formában található. (A GSH tiolcsoportjának pKa értéke 9,2.) (146) Az inkubációs idő lejárta után (150, illetve 330 perc) a komponensek elválasztása fordított fázisú C-18 oszlopon történt UV-detektálás mellett (λ = 260 nm). (145) Ezen inkubálási körülmények és kromatográfiás paraméterek mellett a kromatogramon a kalkonanalógok (4a, illetve 4b) jele mellett, további két csúcs jelent meg, feltételezhetően a kalkon-glutation konjugátum diasztereomer párjának jele. (145) A vékonyréteg-kromatográfiás eljárás, illetve az RP-HPLC vizsgálat (145) eredményei arra utalnak, hogy a vizsgált vegyületek (4a és 4b) és redukált glutation között spontán konjugációs reakció játszódik le, aminek során két egymással diasztereomer viszonyban álló termékek keletkeznek. (23. ábra)

23. ábra A kalkonszármazékok redukált glutationnal (GSH) lejátszódó Michael-típusú konjugációs reakciója Az irodalomban is találhatók arra vonatkozó adatok, hogy α,β-telítetlen karbonilvegyületek és glutation konjugációs reakciójában diasztereomer adduktumok

62

keletkeznek, például a nyílt láncú analóg, (E)-4-fenil-3-butén-2-on és GSH reakciójában. (147) Hasonlóképpen, néhány ciklikus kalkonszármazék ((E)-2benzilidén-1-tetralon és -1-benzoszuberon) és ditiokarbaminsav (szintén kén-nukleofil reagens) savkatalizálta reakciója során szintén két diasztereomer konjugátum keletkezett, amit 1H-NMR vizsgálatokkal is alátámasztottak. (148) A folyadékkromatográfiás vizsgálatok megerősítése céljából, illetve a feltételezett GSH-adduktok

szerkezetének

igazolása

céljából

MALDI-TOF-MS,

illetve

elektronspray ionizáció segítségével HPLC-ESI-MS vizsgálatok is történtek. A mérések megerősítették a DAD-HPLC vizsgálatok eredményeit, miszerint az inkubátumokban 4a-GSH, illetve 4b-GSH adduktok (a protonált molekulatömegek 586,18 és 570,23) keletkeznek spontán reakció révén. (145)

V.2.4.2. A kalkonanalógok és glutation konjugációs reakciójának vizsgálata Jurkat T sejtekben A 4a és 4b vegyületek sejtmentes körülmények között aktivitást mutatnak redukált glutationnal szemben. A kifejlesztett RP-HPLC és csatolt ESI-MS eljárással (IV.2.7.2) azt kívántuk vizsgálni, hogy a konjugációs reakció a Jurkat T sejtekben is lejátszódik-e, hozzájárulva a vegyületek toxikus hatásának kialakításához. A protokoll szerint (IV.2.2) kezelt sejteket lizáltuk, majd külön vizsgáltuk a centrifugálás során kapott felülúszót és üledéket is. A megfelelő fehérjementesítés és előkészítési eljárást követően felvett HPLC kromatogramokat (24. ábra), valamint ESI tömegspektrumokat (25. ábra) összehasonlítottuk a kalkonanalógokat és glutationt tartalmazó inkubátumok vizsgálatakor (145) kapott kromatogramokkal, illetve spektrumokkal. A vizsgálatok arra utalnak, hogy a 4a származék (279,2 Da protonált molekulatömeggel) a sejtkezeléseket követően megtalálható mind a sejt felülúszóban, mind a sejtes üledékben. A vegyület tehát a sejtkezelés során a Jurkat sejtek membránján átjut és hatását intracellulárisan fejti ki. A 4a származékot és GSH-t tartalmazó inkubátumban igazoltan keletkező 4a-GSH diasztereomerpár adduktok (145) jelenléte azonban sem a sejt felülúszóból sem az üledékből nem bizonyítható. A 4b vegyülettel kapott eredmények teljesen azonosak a 4a vegyület analízisekor kapott eredményekkel. A 4b analóg jelenléte (m/z = 263,2) igazolható a felülúszóból, és az üledékből is, de 4b-GSH konjugátumok ebben az esetben sem mutathatók ki.

63

Az előzetes, sejtmentes körülmények között elvégzett mérések eredményi arra engedtek következtetni, hogy a vizsgált ciklikus kalkonanalógok citotoxikus hatásában a redukált glutationnal lejátszódó konjugációs reakció is szerepet kap. A HPLC-ESI-MS mérések azonban arra utalnak, hogy a feltételezett in vivo GST-katalizált reaktivitás 4a illetve 4b vegyületek és GSH között nem járul hozzá a vegyületek apoptózist indukáló hatásához.

24. ábra A Jurkat T sejtek 4a (5,6 μM) vegyülettel történő kezelése (4 óra), és centrifugálása után kapott sejtfelülúszó és sejtes üledék vizsgálata során kapott szelektált ion-kromatogramok (m/z = 279,2), valamint a 4a vegyületet (5 x 10-3M) és GSH-t (5 x 10-2M) tartalmazó inkubátum (pH = 8,0; 50 °C) analízisekor kapott (145) egymásra helyezett ion-kromatogramok (m/z = 279,2 és m/z = 586,2)

64

25. ábra A Jurkat T sejtek 4a (5,6 μM)(279,2 Da) vegyülettel történő kezelése (4 óra), és centrifugálása után kapott sejtfelülúszó és sejtes üledék vizsgálata során kapott ESI tömegspektrumok, valamint a 4a vegyületet (5 x 10-3M) és GSH-t (5 x 10-2M) tartalmazó inkubátum (pH = 8,0; 50 °C) analízisekor kapott ESI tömegspektrumok (4a vegyület (279,2 Da), valamint 4a-GSH addukt (586,2 Da)). (m/z = 50 – 2.000) Ugyanakkor az MS mérések eredményei szerint nem keletkeznek olyan molekulatömegű adduktumok sem, amelyek a vegyületek ciszteinil-glicin-, ciszteinvagy esetleg N-acetil-cisztein-konjugátumai lennének, illetve a már előzetesen

65

esetlegesen metabolizálódott vegyület (pl. demetilált-, vagy hidroxilált-származék) glutationnal képezett adduktumai. Az eredmények mögött állhat a glutation-S-transzferáz enzim esetleges gátlása is. Az

irodalomban

több

esetben

is

beszámoltak

róla,

hogy

α,β-telítetlen

karbonilvegyületek, közöttük kalkonok is, gátolják a GST enzim aktivitását. (149; 150; 151; 152) A GST enzim gátlása Jurkat T sejtekben sejtciklus gátlást és apoptózist indukál. (153) A glutation-S-transzferáz enzim az egyik legfontosabb képviselője a detoxikációs folyamatokban kulcsfontosságú szerepet játszó fázis 2 enzimeknek, ugyanakkor számos humán daganatos sejtben túlexpresszálódik, és hozzájárul a tumorsejtek kemoterápiás szerekkel szembeni rezisztenciájának kialakulásához. (154) Az enzim gátlása révén gyógyszer-rezisztens tumorok újra érzékennyé tehetők a terápia iránt. (149) A vizsgált kalkonszármazékok GST enzimaktivitásra gyakorolt hatása még további vizsgálatokat igényel.

66

VI. Új eredmények összefoglalása, megbeszélés Az előtanulmányok során összegyűjtött kísérleti tapasztalatok, valamint irodalmi adatok alapján a kalkonok (1), valamint gyűrűs analógjaik (2-4) ígéretes kísérleti anyagok lehetnek egy új szerkezeti típushoz tartozó, antineoplasztikus (citotoxikus és/vagy citoprotektív) hatással rendelkező anyagok kutatására. A természetben előforduló kalkonok és szintetikus analógjaik jól dokumentált antibakteriális, antifungális, antiprotozoális, kemopreventív és citotoxikus aktivitással rendelkeznek. A vizsgált anyagok és a kapcsolódó publikációk nagy száma ellenére az irodalomban kevés olyan adat található, amelyek a megfigyelt biológiai hatások molekuláris hátterének, a hatás szempontjából releváns molekuláris kölcsönhatások szerkezet-hatás összefüggéseinek vizsgálatával foglalkoznak. A téma kidolgozásának előzményeként mintegy száz, különbözőképpen szubsztituált kalkon és ciklikus kalkonszármazék in vitro sejtproliferációt gátló hatásának (IC50) meghatározása történt egér és humán daganatos sejtvonalakkal szemben. A vegyületek biológiai hatását nagymértékben befolyásolja azok tér- és elektronszerkezét meghatározó gyűrűtagszám és a kalkon molekulrész B-gyűrűjén lévő szubsztituens elektronküldő, illetve elektronvonzó tulajdonsága. A vizsgált vegyületek szerkezet-hatás összefüggése alapján a leghatékonyabbnak a héttagú gyűrűs (E)-2-(4’metoxibenzilidén)-1-benzoszuberon

és

az

(E)-2-(4’-(dimetilaminobenzilidén)-1-

benzoszuberon származékok bizonyultak. (64) Az e téren folytatandó további kutatómunka fő célkitűzése a gyűrűs kalkonszármazékok

fizikai-kémiai

tulajdonságainak,

valamint

citotoxikus

és

citoprotektív hatása molekuláris mechanizmusának alaposabb megismerése volt. A gyűrűs származékok lipofilitásának jellemzésére számos, a 2-4 sorozatba tartozó vegyületet vizsgáltunk, a hatásmechanizmus-vizsgálatokhoz a 7-tagú gyűrűs 4-metoxi(4a), valamint a 4-metilszubsztituált (4b) analógokat választottuk. (12. ábra) Munkánk során kapott új eredmények: 1.

Fordított fázisú vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel számos, különböző módon szubsztituált, öt-, illetve hattagú gyűrűs kalkonanalóg logP értékét határoztuk meg, kiegészítve a korábban vizsgált 7-tagú gyűrűs vegyületek vizsgálata során kapott eredményeket. Összefüggéseket kerestünk a vegyületek gyűrűtagszáma, a szubsztituensek minősége és helyzete, valamint a molekulák lipofilitása között.

67

2.

In vitro kísérletek során áramlásos citometriai módszerrel vizsgáltuk a vegyületek sejtszaporodást gátló, valamint sejtciklusra gyakorolt hatását Jurkat T sejtekkel szemben. A Jurkat T sejteknek a vegyületek közel ekvitoxikus dózisával történő 8 órás kezelést követően a metilszármazék (4b) esetén a sejtek legnagyobb hányada – a kontroll sejtekhez hasonlóan – a sejtciklus G0/G1 fázisában, míg a metoxivegyülettel (4a) történt kezelés esetén a G2/M fázisban volt található. A metoxivegyülettel (4a) történt 24 órás kezelést követően a sejtek közel fele a G2/M fázisban volt található, míg a metilszármazékkal (4b) kezelt sejtek csak kisebb hányada volt ebben a fázisban. Hosszabb inkubálás (48 óra) során, mindkét kezelés estén, jelentősen megnő az apoptotikus sejtek aránya, ugyanakkor poliploid sejtek képződése is megfigyelhető. A poliploid sejtek aránya a metoxivegyület (4a) esetében közel háromszor olyan magas volt, mint a metilszármazék esetén. Ezek alapján megállapíthattuk, hogy az in vitro citotoxicitás azon alapszik, hogy a vegyületek erős apoptózist indukáló szerek, a hatékonyabb vegyület (4a) esetén megfigyelhető a G2/M fázisú sejtciklus gátlás, és jellemző a poliploid sejtek képződése. A vegyületek sejtciklusra gyakorolt hatása alapján feltételezhető, hogy azok kölcsönhatást alakítanak ki celluláris makromolekulákkal (tubulinnal, DNS-sel), valamint redukált glutationnal, és befolyást gyakorolnak a sejtek redox-státuszára.

3.

A vizsgálandó vegyületek in vitro antioxidáns hatását úgy jellemeztük, hogy vizsgáltuk, a vegyületek mennyire képesek gátolni a hidroxilgyök – a biológiai rendszerekben képződő legreaktívabb oxigénszármazék – toxicitását. Vizsgáltuk a vegyületek lehetséges pooxidáns aktivitását is, a dezoxiribóz degradációra gyakorolt hatásuk révén. A 4b vegyület az alkalmazott tesztrendszerben mindvégig antioxidáns aktivitást mutatott, a 4a vegyület a rövid távú antioxidáns hatás után (főként az EDTA-t is tartalmazó környezetben) növelte a dezoxiribóz degradációját, és átmenetileg prooxidáns aktivitást mutatott.

4.

A vegyületek celluláris redox-státuszra gyakorolt hatásának vizsgálatakor megállapítottuk, hogy a vegyületek nem növelik meg az intracelluláris ROS aktivitást, sőt a metilszubsztituált analóg (4b) szignifikánsan csökkenti a ROSszintet és antioxidáns aktivitást mutat. Ez utóbbi eredmény összhangban áll az in

68

vitro antioxidáns hatást vizsgáló dezoxiribóz teszt eredményével, ami szerint a vegyület in vitro hidroxilgyök-scavanger aktivitással rendelkezik. A vegyületek apoptózist okozó hatásában az oxidatív stressz indukciója nagy valószínűséggel nem játszik szerepet. 5.

A vegyületek izolált patkánymáj mitokondriumok funkcióira gyakorolt hatásának vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy a 4a vegyület megnöveli a mitokondriális oxigénfogyasztást és emeli az ATPáz aktivitást. A mitokondriális funkciók megváltozása szerepet játszhat a vegyület citotoxikus hatásának kialakításában.

6.

A celluláris redox-homeosztázist alapvetően befolyásolja a celluláris tiol-szint, illetve a glutation-státusz. A gyűrűs kalkonanalógok celluláris tiolokkal, ezen belül a sejtekben nagy mennyiségben jelen levő redukált glutationnal szemben mutatott esetleges kölcsönhatását vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy míg a 4a vegyület az oxidált glutation mennyiségét növelte meg, és a redukált glutation-szintet nem befolyásolta, addig a 4b származék a redukált glutation szintet (és a totál SH-szintet is) növelte. A redukált glutationszint növelése magyarázatot adhat a korábbi vizsgálatok során tapasztalt antioxidáns aktivitás (ROS csökkentés) hátterére. A 4a vegyület GSSG-szintet növelő hatása szerepet játszhat az apoptózisindukcióban.

7.

A vegyületek glutationnal történő konjugációs reakciójának vizsgálatakor megállapítottuk, hogy a vegyületek közel semleges és gyengén lúgos kémhatás mellett, magasabb hőmérsékleten intrinsic aktivitást mutatnak redukált glutationnal szemben. A reakció során keletkező kalkon-GSH adduktok jelenlétének igazolása vékonyréteg-kromatográfiás, illetve RP-HPLC eljárásokkal, szerkezetük igazolása HPLC-MS technika segítségével történt. A kifejleszett módszerek lehetőséget nyújtottak a konjugációs reakció sejtes körülmények közötti vizsgálatára is. A Jurkat T sejtekben a kalkonokkal való kezeléseket követően, azonban csak a vizsgált származékot sikerült kimutatni, konjugátumok jelenlétét nem. Az eredmény arra enged következtetni, hogy a citotoxicitásban minden bizonnyal szerepet játszó, GSH-szintet befolyásoló hatás nem a konjugációs-reakció következménye.

69

Összességében azt láthattuk, hogy bár a két vizsgált kalkonszármazék szerkezetét tekintve csak egy oxigénatomban tér el egymástól, hatásmechanizmusuk igen különböző. A kevésbé toxikus 4-metilanalóg (4b) apoptózist indukál Jurkat T sejtekben, de hatása elmarad a 4a vegyület sejtciklust befolyásoló hatásától. Mind az in vitro tesztben, mind sejtes körülmények között antioxidáns aktivitást mutat, ami összefüggésben állhat a redukált glutation-szintet emelő hatásával. A kiemelkedő citotoxicitást mutató 4-metoxiszármazék (4a) drasztikusan befolyásolja a sejtciklust, apoptózist indukál, poliploid sejtek képződését váltja ki. Nem rendelkezik kifejezett antioxidáns hatással, sőt citotoxikus hatásának hátterében a vegyület prooxidáns hatása is valószínűsíthető. Befolyásolja a mitokondriális funkciókat, a celluláris SH-szintet, megnöveli a sejtek oxidált glutation tartalmát, ezáltal befolyásolja a redox homeosztázist. A sejtciklus G2/M fázisú, a vegyületek általi gátlásának egyik biokémiai háttere a tubulin polimerizációs-depolimerizációs folyamatára gyakorolt hatás lehet. A citotoxikus hatás, a fent említett hatások mellett, részben a vegyületek celluláris makromolekulákkal

(tubulin,

DNS)

történő

nem-kovalens

kölcsönhatásának

eredményeképpen alakulhat ki. A kutatási programunk eredményeképpen tovább bővültek ismereteink a gyűrűs kalkonszármazékok kettős – citotoxikus és citoprotektív (kemopreventív) – hatásának mechanizmusát illetően. A kísérletek eredményei alapjául szolgálnak a további munkának: a természetes és/vagy szintetikus kalkonszármazékok daganatellenes hatás szempontjából történő komplex vizsgálatának.

70

VII. Irodalomjegyzék 1.

Döbrössy, L.: A daganatos betegségek helyzete és várható alakulása. Kopper L., Jeney A. (Eds.): Onkológia - a géntől a betegágyig. Medicina Kiadó, Budapest. 2003.

2.

Szeberényi, J.: Molekuláris sejtbiológia. Dialóg-Campus Kiadó, Budapest-Pécs. 1999

3.

Ember, I.: Népegészségügyi orvostan. Dialog-Campus Kiadó, Budapest-Pécs. 2007.

4.

Hoensch, H.P., Kirch, W., 2005. Potential role of flavonoids in the prevention of intestinal neoplasia. International Journal of Gastrointestinal Cancer 35, 187-196.

5.

Cutler, G.J., Nettleton, J.A., Ross, J.A., Harnack, L.J., Jacobs, D.R., Scrafford, C.G., Barraj, L.M., Mink, P.J., Robien, K., 2008. Dietary flavonoid intake and risk of cancer in postmenopausal women: The Iowa Women's Health Study. International Journal of Cancer 123, 664-671.

6.

Petri, G.: Gyógynövény és drogismeret. Medicina, Budapest. 1991.

7.

Carlo, G.D., Mascolo, N., Izzo, A.A., Capasso, F., 1999. Flavonoids: Old and new aspects of a class of natural therapeutic drugs. Life Sciences 65, 337-353.

8.

Crozier, A., Burns, J., Aziz, A.A., Stewart, A.J., Rabiasz, H.S., Jenkins, G.I., Edwards, C.A., Lean, M.E., 2000. Antioxidant flavonols from fruits, vegetables and beverages: measurments and bioavailability. Biological Research 33, 79-88.

9.

Havsteen, B.H., 2002. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology and Therapeutics 96, 67-202.

10. Moon, Y.J., Wang, X., és Morris, M.E., 2006. Dietary flavonoids: Effects on xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicology in Vitro 20, 187-210. 11. Cushnie, T.P.T. és Lamb, A.J., 2005. Antimicrobal activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents 26, 343-356. 12. Garg, A., Garg, S., Zaneveld, L.J.D., Singla, A.K., 2001. Chemistry and pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin. Phytotherapy Research 15, 655-669. 13. Jacobs, B.P., Dennehy, C., Ramirez, G., Sapp, J., Lawrence, V.A., 2002. Milk thistle for the treatment of liver disease: a systematic review and meta-analysis. The American Journal of Medicine 113, 506-515.

71

14. Ratheesh, M., Shyni, G.L., Sindhu, G., Helen, A., 2011. Inhibitory effect of Ruta graveolens L. on oxidative damage, inflammation and aortic pathology in hypercholesteremic rats. Experimental and Toxicologic Pathology 63, 285-290. 15. Seigler, D.S.: Plant secondary metabolism. Kluwer Academic Publishers, 1998. 16. Dixon, R.A., Steele, C.L., 1999. Flavonoids and isoflavonoids - a gold mine for metabolic engineering. Trend in plant science (reviews) 4, 394-400. 17. Winkel-Shirley, B., 2001. Flavnoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology and biotechnology. Plant Physiology 126, 485-493. 18. Rozmer, Zs. és Perjési, P. Naturally occuring chalcones and their biological activity. Phytochemistry Reviews Közlésre beküldve. 19. Fenwick, G.R., Lutomski, J., Nieman, C., 1990. Liquorice, Glycyrrhiza glabra Composition, usues and analysis. Food Chemistry 38, 119-143. 20. Kang, D.G., Lee, A.S., Mun, Y.J., Woo, W.H., Kim, J.C., Sohn, E.J., Moon, M.K., Lee, H.S., 2004. Butein ameliorates renal concentrating ability in cisplatin-induced acutes renal failure in rats. Biological and Pharmaceutical Bulletin 27, 366-370. 21. Lee, J.C., Lee, K.Y., Kim, J., Na, C.S., Jung, N.C., Chung, G.H., Jang, Y.S., 2004. Extract from Rhus verniciflua Stokes is capable of inhibiting the growth of human lymphoma cells. Food Chemistry and Toxicology 42, 1383-1388. 22. Nowakowska, Z., 2007. A review of anti-infective and anti-inflammatory chalcones. European Journal of Medicinal Chemistry 42, 125-137. 23. ElSohly, H.N., Joshi, A.S., Nimrod, A.C., Walker, L.A., Clark, A.M., 2001. Antifungal chalcones from Maclura tinctoria. Planta Medica 67, 87-89. 24. Buckwold, V.E., Wilson, R.J.H., Nalca, A., Beer, B.B., Voss, T.G., Turpin, J.A., Buckheit, R.W., Wei, J., Wenzel-Mathers, M., Walton, E.M., Smith, R.J., Pallansh, M., Ward, P., Wells, J., Chuvala, L., Sloane, S., Paulman, R., Russell, J., Hartman, T., Ptak, R., 2004. Antiviral activity of hop constituents against a series of DNA and RNA viruses. Antiviral Research 61, 57-62. 25. Sen, R., Chatterjee, M., 2011. Plant derived therapeutics for the treatment of Leishmaniasis. Phytomedicine 18, 1056-1069. 26. Zhang, X., Yeung, E.D., Wang, J., Panzhinskiy, E.E., Tong, C., Li, W., Li, J., 2010. Isoliquiritigenin, a natural anti-oxidant, selectively inhibits the proliferation of prostate cancer cells. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 37, 841-847.

72

27. Szliszka, E., Czuba, Z.P., Mazur, B., Sedek, L., Paradysz, A., Krol, W., 2010. Chalcones enhance TRAIL-induced apoptosis in prostate cancer cells. International Journal of Molecular Sciences 11, 1-13. 28. Haraguchi, H., Ishikawa, H., Mizutani, K., Tamura, Y., Kinoshita, T., 1998. Antioxidative and superoxide scavenging activities of retrochalcones in Glycyrrhiza inflata. Bioorganic and Medicinal Chemistry 6, 339-347. 29. An, W., Yang, Y., Ao, Y., 2006. Metallothionein mediates cardioprotection of isoliquiritigenin against ischemia-reperfusion through JAK2/STAT3 activation. Acta Pharmacologica Sinica 27, 1431-1437. 30. Enoki, T., Ohnogi, H., Nagamine, K., Kudo, Y., Sugiyama, K., Tanabe, M., Kobayashi, E., Sagawa, H., Kato, I., 2007. Antidiabetic activities of chalcones isolated from a Japanese herb, Angelica keiskei. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 6013-6017. 31. Dong, F., Jian, C., Zhenghao, F., Kai, G., Zuliang, L., 2008. Synthesis of chalcones via Claisen-Schmidt condensation reaction catalyzed by acyclic acidic ionic liquids. Catalysis Communications 9, 1924-1927. 32. Fan, X.S., Zhang, Y.M., 2002. A simple access to chalcones via modified Mukaiyama aldol condensation promoted by SmI3/TMSCl. Chinese Journal of Chemistry 20, 198-201. 33. Eddarir, S., Cotelle, N., Bakkour, Y., Rolando, C., 2003. An efficient synthesis of chalcones based on the Suzuki reaction. Tetrahedron Letters 44, 5359-5363. 34. Briot, A., Baehr, C., Brouillard, R., Wagner, A., Mioskowski, C., 2004. Concise synthesis of dihydrochalcones via palladium-catalyzed coupling of aryl halides and 1-aryl-2-propen-1-ols. Journal of Organic Chemistry 69, 1374-1377. 35. Dimmock, J.R., Elias, D.W., Beazely, M.A., Kandepu, N.M., 1999. Bioactivities of chalcones. Current Medicinal Chemistry 6, 1125-1149. 36. Ni, L., Meng, C.Q., Sikorski, J.A., 2004. Recent advances in therapeutic chalcones. Expert Oponion on Therapeutic Patents 14, 1669-1691. 37. Go, M.L., Wu, X., Liu, X.L., 2005. Chalcones: an update on cytotoxic and chemoprotective properties. Current medicinal chemistry 12, 483-499. 38. Dimmock, J.R., Raghavan, S.K., Logan, B.M., Bigam, G.E., 1983. Antileukemic evaluation of some Mannich bases derived from 2-arylidene-1,3-deiketones. European Journal of Medicinal Chemistry 18, 248-254.

73

39. Benvenuto, J.A., Connor, T.H., Monteith, D.K., Laidlaw, J.L., Adams, S.C., Matney, T.S., Theiss, J.C., 1993. Degradation and inactivation of antitumor drugs. Journal of Pharmaceutical Science 82, 988-991. 40. Ádám, V.: Orvosi biokémia. Medicina Könykiadó, Budapest, 2001. 41. Sen, C.K., 1997. Nutritional biochemistry of cellular glutathione. (Review). Nutritional Biochemistry 8, 660-672. 42. Dimmock, J.R., Kandepu, N.M., Hetherington, M., Quail, J.W., Pugazhenthi, U., Sudom, A.M., Chamankhah, M., Rose, P., Pass, E., Allen, T.M., Halleran, S., Szydlowski, J., Mutus, B., Tannous, M., Manavathu, E.K., Myers, T.G., De Clercq, E., Balzarini, J., 1998. Cytotoxic activities of Mannich bases of chalcones and related compounds. Journal of Medicinal Chemistry 41, 1014-1026. 43. Sabzevari, O., Galati, G., Moridani, M.Y., Siraki, A., O'Brien, P.J., 2004. Molecular cytotoxic mechanisms of anticancer hydroxychalcones. ChemicoBiological Interactions 148, 57-67. 44. Esterbauer, H., Zollner, H., Scholz, N., 1975. Reaction of glutathione with conjugated carbonyls. Zeitschrift für Naturforschung C 30, 466-473. 45. Powis, G., Gasdaska, J.R., Baker, J.R.: Redox signaling and the controll of cell growth and death. In: Sies, H. (Ed.), Antioxidants in Disease Mechanism and Therapy. In:Advances in Pharmacology, vol. 38. Academic Press, San Diego, pp 329-359. 1997. 46. Nam, N.H., Kim, Y., You, Y.J., Hong, D.H., Kim, H.M., Ahn, B.Z., 2003. Cytotoxic 2',5'-dihydroxychalcones with unexpected antiangiogenic activity. European Journal of Medicinal Chemistry 38, 179-187. 47. Navarini, A.L.F., Chiaradia, L.D., Mascarello, A., Fritzen, M., Nunes, R.J., Yunes, R.A., Creczynski-Pasa, T.B., 2009. Hydroxychalcones induce apopotosis in B16F10 melanoma cells via GSH and ATP depletion. European Journal of Medicinal Chemsitry 44, 1630-1637. 48. Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.S., Lin, C.C., 2006. Chalcone inhibits the proliferation of human breast cancer cell by blocking cell cycle progression and inducing apoptosis. Food and Chemical Toxicology 44, 704-713. 49. Rao, Y.K., Fang, S.H., Tzeng, Y.M., 2004. Differential effects of synthesized 2'oxygenated chalcone derivatves: modulation of human cell cycle phase distribution. Bioorganic and Medicinal Chemistry 12, 2679-2686.

74

50. Satomi, Y., 1993. Inhibitory effects of 3'-methyl-3-hydroxy-chalcone on proliferation of human malignant tumor cells and on skin carcinogenesis. International Journal of Cancer 55, 506-517. 51. Middleton, E., Kandaswami , C., Theoharides, T.C., 2000. The effect of plant flavonoids on mammalian cells: Implications for inflammation, heart disease and cancer. Pharmacological Reviews 52, 673-751. 52. Gutteridge, J.M.C., 1987. Ferrous-salt-promoted damage to deoxyribose and benzoate. The increased effectiveness of hydroxyl-radical scavengers in the presence of EDTA. Biochemical Journal 243, 709-714. 53. Gregus, Z., Klaasen, C.D.: Mechanism of toxicity. In: Klaasen, C.D. (Ed.), Casarett and Dull's Toxicology. The Basic Science of Poisons. Sixth ed. McGraw-Hill, New York, (Chapter 3.) pp. 35-81. 2001. 54. Prochaska, H.J., Fernandes, C.L., 1993. Elevation of serum Phase II enzymes ba anticarcinogenic

enzym

inducers:

markers

for

a

chemoprotrcted

state?

Carcinogenesis 14, 2441-2449. 55. Dinkova-Kostova, A.T., Abeygunawardana, C., Talalay, P., 1998. Chemoprotective properties of phenylpropenoids, bis(benzylidene)cycloalkanones, and related Michael reaction acceptors: correlation of potencies as Phase 2 enzyme inducers and radical scavengers. Journal of Medicinal Chemistry 41, 5287-5296. 56. Dinkova-Kostova, A.T., Massiah, M.A., Bozak, R.E., Hicks, R.J., Talalay, P., 2001. Potency of Michael reaction acceptors as inducers of enzymes that protect against carcinogenesis depends on their reactivity with sulfhydryl groups. Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 3404-3409. 57. Dinkova-Kostova, A.T., Holtzclaw, W.D., Kensler, T.W., 2005. The role of Keap1 in cellular protective responses. Chemical Research in Toxicology 18, 1779-1791. 58. Dinkova-Kostova, A.T., Holtzclaw, W.D., Wakabayashi, N., 2005. Keap1, the sensor for electrophiles and oxidants that regulates the Phase 2 response, is a zinc metalloprotein. Biochemistry 44, 6889-6899. 59. Motohashi, H., Yamamoto, M., 2004. Nrf2-Keap1 defines a physiologically important stress response mechanism. Trends in Molecular Medicine 10, 549-557. 60. Izumi, Y., Matsumura, A., Wakita, S., Akagi, K., Fukuda, H., Kume, T., Irie, K., Takada-Takatori, Y., Sugimoto, H., Hashimoto, T., Akaike, A. 2012. Isolation, identification and biological evaluation of Nfr2-ARE activator from the leaves of

75

green perilla (Perilla frutescens var. crispa f. viridis). Free Radical Biology and Medicine 53, 669-679. 61. Hashimoto, Y., Kagechika, H., Kawachi, E., Shudo, K., 1987. New-type inducers of differentation of HL-60 leukemia cells suppress c-myc expression. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 35, 3190-3194. 62. Forejtníková, H., Lunerová, K., Kubinová, R., Jankovská, D., Marek, R., Kares, R., Suchy, V., Vondrácek, J., Machala, M., 2005. Chemoprotective and toxic potentials of synthetic and naural chalcones and dihydrochalcones in vitro. Toxicology 208, 81-93. 63. Iwata, S., Nishino, T., Inoue, H., Nagata, N., Satomi, Y., Nishino, H., Shibata, S., 1997. Antitumorigenic activities of chalcones. (II) Photo-isomerization of chalcones and the correlation with their biological activities. Biological and Pharmaceutical Bulletin 20, 1266-1270. 64. Dimmock, J.R., Kandepu, N.M., Nazarali, A.J., Kowalchuk, T.P., Motaganahalli, N., Quail, J.W., Mykiytiuk, P.A., Audette, G.F., Prasad, L., Perjési, P., Allen, T.M., Santos, C.L., Szydlowski, J., De Clercq, E., Balzarini, J., 1999. Conformational and quantitative

structure-activity

relationship

study

of

cytotoxic

2-

arylidenebenzocycloalkanones. Journal of Medicinal Chemistry 42, 1358-1366. 65. Perjési, P., Nusser, T., Tarczay, Gy., Sohár, P., 1999. E-2-Bezylidenebenzocycloalkanones. Stereostructure and NMR spectroscopic investigations. Journal of Molecular Structure 479, 13-19. 66. Tarczay, Gy., Vékey, K., Ludányi, K., Perjési, P., Sohár, P., 2000. E-2benzylidenebenzocyclanones. II. IR and mass spectrometric investigations. Journal of Molecular Structure 520, 97-102. 67. Perjési, P., Perjéssy, A., Kolehmainen, E., Ősz, E., Samalikova, M., Linnato, J., Virtanen, E.,

2004.

E-2-Benzylidenebenzocycloalkanones

III.

Studies

on

transmission of substituent effects on IR carbonyl stretching frequencies and 13C NMR chemical shifts of E-2-(X-benzylidene)-1-indanones. Comparison with the IR data of E-2-(X-benzylidene)-1-indanones. Journal of Molecular Structure 697, 4147. 68. Perjési, P., Linnanto, J., Kolehmainen, E., Ősz, E., Virtanen, E., 2005. E-2Benzylidenebenzocycloalkanones IV. Studies on transmission of substituent effects on

13C

NMR

chemical

shifts

of

76

E-2-(X-benzylidene)-1-tetralones

and

benzosuberones. Comparison with the 13C NMR data of chalcones and E-2-(Xbenzylidene)-1-indanones. Journal of Molecular Structure 740, 81-89. 69. Dimmock, J.R., Zello, G.A., Oloo, E.O., Quail, J.W., Kraatz, H.B., Perjési, P., Aradi, F., Takács-Novák, K., Allen, T.M., Santos, C.L., Balzarini, J., De Clercq, E., Stables, J.P., 2002. Correlations between citotoxicity and topography of some 2arylidenebenzocycloalkanones determined by X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry 45, 3103-3111. 70. Miyata, M., Furukawa, M., Takahashi, K., Gonzalez, F.J., Yamazoe, Y., 2001. Mechanism of 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene-induced immunotoxicity: Role of metabolic activation at the target organ. Japanese Journal of Pharmacology 86, 302-309. 71. Perjési, P., Bayer, Z., Ember, I., 2000. Effect of E-2-(4'-methoxybenzylidene)-1benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz[alpha]anthracene-induced onco/supressor gene action in vivo.I: A 24-hour experiment. Anticancer Research 20, 475-481. 72. Perjési, P., Gyöngyi, Z., Bayer, Z., 2000. Effect of E-2-(4'-methoxybenzylidene)-1benzosuberone on the 7,12-dimethylbenz[alpha]anthracene-induced onco/supressor gene action in vivo II: A 48-hour experiment. Anticancer Research 20, 1839-1848. 73. Pitot, H.C., Dragon, Y.P.: Chemical carcinogenesis. In: Klaassen, C.D. (Ed.), Casarett and Dull's Toxicology. McGraw-Hill, New York, pp. 241-320. 2001. 74. Larsen, M.C., Angus, W.G.R., Brake, P.B., Eltom, S.E., Sukow, K.A., Jefcoate, C.R., 1998. Characterization of CYP1B1 and CYP1A1 expression in human mammary epithelial cells: Role of the aryl hydrocarbon receptor in polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism. Cancer Research 58, 2366-2374. 75. Michejda, C.J., Kroeger Koepke, M.B., 1994. Carcinogen activation by sulfate conjugate formation. Advances in Pharmacology 27, 331-363. 76. Surh, Y.J., Miller, J.A., 1994. Roles of electrophilic sulfuric acid ester metabolites in mutagenesis and carcinogenesis by some polynuclear aromatic hydrocarbons. Chemico-Biological Interactions 92, 351-362. 77. Monostory, K., Tamási, V., Vereczkey, L., Perjési, P., 2003. A study on CYP1A inhibitory action of E-2-(4'-methoxybenzylidene)-1-benzosuberone and some related chalcones and cyclic chalcone analogues. Toxicology 184, 203-210. 78. Tute, M.S.: Lipophilicity: A History. In: Mannhold, R., Kubinyi, H. and Timmerman, H. (Eds), Methods and principles in medicinal chemistry, Vol. 4,

77

Lipophilicity in Drug Action and Toxicology (Pliska, V., Testa, B. and van de Waterbeemd, H., Eds.) VHC, Weinheim, FRG. Chap. 2., pp. 7-26. 1996. 79. Takács-Novák, K., 1997. A megoszlási hányados GLP szerinti meghatározásának praktikus szempontjai. Acta Pharmaceutica Hungarica 67, 179-191. 80. Takács-Novák, K., Perjési, P., Vámos, J., 2001. Determination of logP for biologically active chalcones and cyclic chalcone analogs by RPTLC. Journal of Planar Chromatogrphy 14, 42-46. 81. Almási, J., Takács-Novák, K., Kökösi, J., Vámos, J., 1999. Characterization of potential NMDA and cholecystokinin antagonists: II. Lipophilicity studies on 2methyl-4-oxo-3H-quinazoline-3-alkyl-carboxylic acid derivatives. International Journal of Pharmaceutics 180, 13-22. 82. Tennant, J.R., 1964. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation 12, 685-694. 83. Givan, A.L.: Flow Cytometry: First Principles. New York, NY-Wiley-Liss., 1992. 84. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelinsperger, C., 1995. A novel assay for apoptosis. Flow-cytometric detection of phosphatidylserin expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. Journal of Immunological Methods 184, 39-51. 85. Del Bino, G., Darzynkiewicz, Z., Degraef, C., Mosselmans, R., Fokan, D., Galand, P., 1999. Comparison of methods based on annexin V binding, DNA content or TUNEL for evaluating cell death in HL-60 and adherent MCF-7 cells. Cell Proliferation 32, 27-37. 86. Cheng, Z., Li, Y., Chang, W., 2003. Kinetic deoxyribose degradation assay and its application in asessing the antioxidant activities of phenolic compounds in a Fenton-type system. Analytica Chimica Acta 478, 129-137. 87. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., Auroma, O.I., 1987. The deoxyribose method: A simple "test-tube" assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals. Analytical Biochemistry 165, 215-219. 88. Aronis, A., Melendez, J.A., Golan, O., Shilo, S., Dicter, N., Tirosh, O., 2003. Potentiation of FAS-mediated apoptosis by attenuated production of mitochondriaderived reactive oxygen species. Cell Death and Differentiation 10, 335-344. 89. Frei, G.M., Lebenthal, I., Albeck, M., Albeck, A., Sredni, B., 2007. Neutral and positively charged thiols synergize the effect on the immunomodulator AS101 as a

78

growth inhibitor of Jurkat cells, by increasing its uptake. Biochemical Pharmacology 74, 712-722. 90. Johnson, D., Lardy, H., 1967. Isolation of liver or kidney mitochondria. Methods in Enzymology 10, 94-96. 91. Hartree, R.F., 1972. Determination of protein: A modification of Lowry method that gives a linear photometric response. Analytical Biochemistry 48, 422-427. 92. Estabrook, R.E., 1967. Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurment of ADP/O ratios. Methods in Enzymology 10, 41-47. 93. Meissner, G., 1974. Isolation of sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle. Methods in Enzymology 31, 238-246. 94. Ellmann, G.L., 1958. A colorimetring method for determining low concentrations of mercaptans. Archives of Biochemistry and Biophysics 74, 443-450. 95. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., Klenk, D.C., 1985. Measurment of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry 150, 7685. 96. Kand'ár, R., Záková, P., Lotková, H., Kucera, O., Cervinková, Z., 2007. Determination of reduced and oxidized glutathione in biological samples using liquid chromatography with fluorimetric detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 43, 1382-1387. 97. Testa, B., Crivori, P., Reist, M., Carrupt, P.A., 2000. The influence of lipophilicity on the pharmacokinetic behavior of drugs: concepts and examples. Perspectives in Drug Discovery and Design 19, 179-211. 98. Zhou, L., Wang, J., 2009. Physico-chemical characterization in drug discovery. Trends in bio/pharmaceutical industry. Preclinical formulation 2009, 12-18. 99. Takács-Novák, K., Völgyi, G., 2005. A fizikai-kémiai jellemzés helye és módszerei a gyógyszerkutatásban. Magyar Kémiai Folyóirat 111, 169-176. 100.Lambert, W.J., 1993. Modeling oil-water partitioning and membrane permeation using reversed-phase chromatography. Journal of Chromatography A 656, 469484. 101.Rozmer, Zs., Perjési, P., Takács-Novák, K., 2006. Use of RP-TLC for determination of logP of isomeric chalcones and cyclic chalcone analogues. Journal of Planar Chromatography 19, 124-128.

79

102.Vashishtha, S.C., Nazarali, A.J., Dimmock, J.R., 1998. Application of fluorescence microscopy to measure apoptosis in Jurkat T cells after treatment with new investigational anticancer agent. Cellular and Molecular Neurobiology 18, 437445. 103.Schoene, N.W., Kamara, K.S., 1999. Population doubling time, phosphatase activity, and hydrogen peroxide generation in Jurkat cells. Free Radical Biology and Medicine 27, 364-369. 104.Rozmer, Zs., Berki, T., Perjési, P., 2006. Different effects of two cyclic chalcone analogues on cell cycle of Jurkat T cells. Toxicology in Vitro 20, 1354-1362. 105.Cook, J.A., Mitchell, J.B., 1989. Viability measurments of mammalian cell systems. Analytical Biochemistry 179, 1-7. 106.Mesner, P.W., Kaufman, S.H.: Methods utilized in the study of apoptosis. In: Kaufman S.H. (ed.), Apoptosis. Pharmacological Implications and Therapeutic Oppurtunities. In: Advances in Pharmacology, Vol. 41. Academic Press, San Diego, pp. 57-87. 107.Dean, P.N.: Data analysis in cell kinetics research. In: Gray, J.W., Darzynkiewicz, Z.( Eds.) Techniques In Cell Cycle Research. Humana Press, Clifton, New Jersey, pp. 207-253. 1987. 108.Murray, A., 1994. Cell cycle checkpoints. Current Opinion in Cell Biology 6, 872876. 109.Diffey, J.F.X., Evan, G., 2000. Oncogenes and cell proliferation. Cell cycle, genome integrity and cancer - a millennial view. Current Opinion in Genetics and Development 10, 13-16. 110.Lepley, D.M., Li, B., Birt, D.F., Pelling, J.C., 1996. The chemopreventive flavonoid apigenin induces G2/M arrest in keratinocytes. Carcinogenesis 17, 23672375. 111.Rao, Y.K., Fang, S.H., Tzeng, Y.M., 2004. Differential effects of synthesized 2'oxygenated chalcone derivatives: modulation of human cell cycle phase distribution. Bioorganic and Medicinal Chemistry 12, 2679-2686. 112.Rao, Y.K., Fang, S.H., Tzeng, Y.M., 2005. Synthesis, growth inhibition, and cell cycle evaluations of novel flavonoid derivatives. Bioorganic and Medicinal Chemistry 13, 6850-6855.

80

113.Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.S., Lin, C.C., 2006. Chalcone inhibits the proliferation of human breast cancer cell by blocking cell cycle progression and inducing apoptosis. Food and Chemical Toxicology 44, 704-713. 114.Kimler, B.F., Schneiderman, M.H., Leeper, D.B., 1978. Induction of concentrationdependent blockade in the G2 phase of the cell cycle by cancer chemotherapeutic agents. Cancer Research 38, 809-814. 115.Konopa, J., 1988. G2 block induced by DNA crosslinking agents and its possible consequences. Biochemical Pharamcology 37, 2303-2309. 116.Erenpreisa, J., Cragg, M.S., 2001. Mitotic death: a mechanism of survival? A review. Cancer Cell International 1, 1-7. 117.Pilatova, M., Varinska, L., Perjési, P., Sarissky, M., Mirossay, L., Solar, P., Ostro, A., Mojzis, J., 2010. In vitro antiproliferative and antiangiogenic effects of synthetic chalcone analogues. Toxicology in Vitro 24, 1347-1355. 118.Winterbourn, C.C., 1991. Factors that influence the deoxyribose oxidation assay for Fenton reaction products. Free Radical Biology and Medicine 11, 353-360. 119.Rozmer, Zs., Perjési, P., 2005. Néhány nem-szteroid gyulladáscsökkentő hatásának vizsgálata a 2-deoxi-D-ribóz Fenton-reakció inicializálta degradációjára. Acta Pharmaceutica Hungarica 75, 69-75. 120.Galey, J.B.: Antioxidants in Disease Mechanism and Therapy. Sies H. (Ed.) Academic Press, San Diego, pp. 167-203. 1997. 121.Halliwell, B.: Antioxidants in Disease Mechanism and Therapy. Sies H. (Ed.) Academic Press, San Diego, pp. 3-20. 1997. 122.Chobot, V., 2010. Simultaneous detection of pro- and antioxidative effects in the variants of the deoxyribose degradation assay. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58, 2088-94. 123.Loo, G., 2003. Redox-sensitive mechanism of phytochemical-mediated inhibition of cancer cell proliferation. Journal of Nutritional Biochemistry 14, 64-73. 124.Croft, S., Gilbert, B.C., Lidsay Smith, J.R., Whithwood, A.C., 1992. An ESR investigation of the reactive intermediate generated in the reaction between iron and hydrogen peroxide in aqueous solution. Direct evidence for formation of the hydroxyl radicals. Free Radical Research Communication 17, 21-39. 125.Prokai, L., Prokai-Tátrai, K., Perjési, P., Zharikova, A.D., Perez, E.J., Liu, R.; Simpkins, J.W., 2003. Quinol-based cyclic antioxidant mechanism in estrogen

81

neuroprotection. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, 1174111746. 126.Perjési, P., Rozmer, Zs., 2011. Kinetic analysis of some chalcones and synthetic chalcone analogues on the Fenton-reaction initiated deoxyribose degradation assay. The Open Medicinal Chemistry Journa. 5, 61-67. 127.Curtin, J.F., Donovan, M., Cotter, T.G., 2002. Regulation and measurment of oxidative stress in apoptosis. Journal of Immunological Methods 265, 49-72. 128.Winter, E., Chiaradia, L.D., Cordova, C.A.S., Nunes, R.J., Yunes, R.A.; Creczynski-Pasa, T.B., 2010. Naphthylchalcones induce apoptosis and caspase activation in a leukemia cell line: The relationship between mitochondrial damage, oxidative stress, and cell death. Bioorganic and Medicinal Chemistry 18, 80268034. 129.Wallace, D.C., 1999. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283, 11481482. 130.Tomeckova, V., Perjési, P., Guzy, J., Kusnir, J., Chovakova, Z., Chavkova, Z., Marekova, M., 2004. Comparison of effect of selected synthetic chalcone analogues on mitochondrial outer membrane determined by fluorescence spectroscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 61, 135-141. 131.Perjési , P., Kubalkova, J., Chovanova, Z., Marekova, M., Rozmer, Zs., Fodor, K., Chavkova, Z., Tomeckova, V., Guzy, J., 2008. Comparison of effects of some cyclic chalcone analogues on selected mitochondrial functions. Pharmazie 63, 899903. 132.Hodnick, W.F., Milosavljevic, E.B., Nelson, J.H., Pardini, R.S., 1988. Electrochemistry of flavonoids. Relationships between redox potentials, inhibition of mitochondrial respiration and production of oxygen radicals of flavonoids. Biochemical Pharmacology 37, 2601-2611. 133.Trumbeckaite, S., Bernatoniene, J., Majiene, D., Jakstas, V., Savickas, A., Toleikis, A., 2006. The effects of flavonoids on rat heart mitochondrial function. Biomedicine and Pharmacotherapy 60, 245-248. 134.Gul, M., Gul, H.I., Hanninen, O., 2002. Effects of Mannich bases on cellular glutathione and related enzymes on Jurkat cells in culture conditions. Toxicology in Vitro 16, 107-112.

82

135.Galati, G., Sabzevari, O., Wilson, J.X., O'Brien, P.J., 2002. Prooxidant activity and cellular effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenolics. Toxicology 177, 91-104. 136.Michaelsen, J.T., Dehnert, S., Giustarini, D., Beckmann, B., Tsikas, D., 2009. HPLC analysis of human erythrocytic glutathione forms using OPA and N-acetylcysteine ethyl ester: Evidence for nitrite-induced GSH oxidation to GSSG. Journal of Chromatography B. 877, 3405-3417. 137.Ridnour, L.A., Winters, R.A., Ercal, N., Spitz, D.R., 1999. Measurement of glutathione, glutathione disulfide, and other thiols in mammalian cell and tissue homogenates using high-performance liquid chromatography separation of N-(1pyrenyl)maleimide derivatives. Methods in Enzymology. 299, 258-264. 138.Hissin, P.J., Hilf, R., 1976. A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues. Analytical Biochemistry. 74, 214-226. 139.Camera, E., Picardo, M., 2002. Analytical methods to investigate glutathione and related compounds in biological and pathological processes. Journal of Chromatography B 781, 181-206. 140.Lenton, K.J., Therriault, H., Wagner, J.R., 1999. Analysis of glutathione and glutathione disulfide in whole cells and mitochondria by postcolumn derivatization high-performance liquid chromatography with ortho-phthalaldehyde. Analytical Biochemistry. 274, 125-130. 141.Pastore, A.; Federici, G.; Bertini, E.; Piemonte, F., 2003. Analysis of glutathione: implication in redox and detoxification. Clinica Chimica Acta. 333, 19-33. 142.Lóránd, T., Kocsis, B., Sohár, P., Nagy, G., Kispál, G., Krane, H.G., Schmitt, H., Weckert, E., 2001. Synthesis and antibacterial study of unsaturated Mannich ketones. European Journal of Medicinal Chemistry 36, 705-717. 143.Gitler, C., Mogyoros, M., Kalef, E., 1994. Labeling of protein vicinal dithiols: Role of protein-S2 to protein-(SH)2 conversion in metabolic regulation and oxidative stress. Methods in Enzymology 233, 403-415. 144.Hughes, H., Taeschke, H., Mitchell, J.R., 1990. Measurment of oxidant stress in vivo. Methods in Enzymology 186, 681-685. 145.Perjési, P., Maász, G., Reisch, R., Benkő, A., 2012. (E)-2-Benzylidenebenzocyclanones: Part VII. Investigation of the conjugation reaction of two cytotoxic cyclic chalcone analogues with glutathione: an HPLC-MS study. Monatshefte für Chemie 143, 1107-1114.

83

146.Tang, S.S., Chang, G.G., 1996. Kinetic characterization of the endogenous glutathione transferase activity of Octopus lens S-Crystallin. The Journal of Biochemistry 119, 1182-1188. 147.Kubo, Y., Armstrong, R.N., 1989. Observation of a substituent effect on the stereoselectivity of glutathione S-transferase toward para-substituted 4-phenyl-3buten-2-ones. Chemical Research in Toxicology 2, 144-145. 148.Perjési, P., Batta, G., Földesi, A., 1994. Reaction of benzylidenebenzocyclanones with dithiocarbamic acid and thiourea. Monatshefte für Chemie 125, 433-439. 149.Wang, J., Wang, S., Song, D., Zhao, D., Sha, Y., Jiang, Y., Jing, Y., Cheng, M., 2009. Chalcone derivatives inhibit glutathione S-transferase P1-1 activity: Insights into the interaction mode of α,β-unsaturated carbonyal compounds. Chemical Biology and Drug Design 73, 511-514. 150.Miyamoto, T, Silva, M., Hammock, B.D., 1987. Inhibition of epoxide hydrolases and glutathione S-transferases by 2-, 3-, and 4-substituted derivatives of 4'phenylchalcone and its oxide. Archives of Biochemistry and Biophysics 254, 203213. 151.Huang, H., Niu, J., Zhao, L., Lu, Y., 2011. Reversal effect of 2',4'-dihydroxy-6'methoxy-3',5'-dimethylchalcone on multi-drug resistance in resistant human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402/5-FU. Phytomedicine 18, 1086-1092. 152.Zhang, K., Das, N.P., 1994. Inhibitory effects of plant polyphenols on rat liver glutathione S-transferase. Biochemical Pharmacology 47, 2063-2068. 153.Mccaughan, F.M., Brown, A.L., Harrison, D.J., 1994. The effect of inhibition of glutathione S-transferase P on the growth of the Jurkat human T cell line. Journal of Pathology 172, 357-362. 154.Townsend, D.M., Tew, K.D., 2003. The role of glutathione S-transferase in anticancer drug resistance. Oncogene 22, 7369-7375.

84

VIII.

Saját publikációk

A tézis alapját képező közlemények 1.

Zs. Rozmer, T. Berki, G. Maász, P. Perjési: Different effects of two cyclic chalcone analogues on redox status of Jurkat cells. Toxicology in Vitro. Közlésre elfogadva.

2.

Zs. Rozmer, P. Perjési: Naturally occurring chalcones and their biological activity. Review. Phytochemistry Reviews. Közlésre beküldve.

3.

P. Perjési, Zs. Rozmer: Kinetic analysis of some chalcones and synthetic chalcone analogues on the Fenton-reaction initiated deoxyribose degradation assay. Open Med. Chem. J. (2011) 142, 463-468 IF: - (2010)

4.

P. Perjesi, J. Kubalkova, Z. Chovanova, M. Marekova, Zs. Rozmer, K. Fodor, Z. Chavkova, V. Tomecková, J. Guzy: Comparison of effects of some cyclic chalcone analogues on selected mitochondrial functions. Pharmazie (2008) 63, 899-903 IF: 0.858 (2008)

5.

Zs. Rozmer, P. Perjési, K. Takács-Novák: Use of RP-TLC for Determination of logP of Isomeric Chalcones and Cyclic Chalcone Analogues. J. Planar Chrom. – Modern TLC (2006) 19, 124-128. IF: 1,153 (2006)

6.

Zs. Rozmer, T. Berki, P. Perjési: Different effects of two cyclic chalcone analogues on cell cycle of Jurkat T cells. Toxicol. in Vitro (2006) 20, 1354-1362. IF: 2,045 (2006)

Egyéb közlemények 1.

Rozmer Zs., Perjési P.: (E)-2-benzylidenebenzocyclanones: Part X. Determination of logP of (E)-3-benzylidene-2,3-dihydro-1-benzopyran-4-ones by RP-TLC. Effect on logP of incorporation of oxygen atom into carbocyclic chalcone analogues. J. Planar Chrom. - Modern TLC (2013) 26, 284-288. IF: 0,955

85

2.

P. Perjési, K. Takács-Novák, Zs. Rozmer, P. Sohár, R. E. Bozak, T. M. Allen: Comparison of structure, logP and P388 cytotoxicity of some phenyl and ferrocenyl cyclic chalcone analogues. Application of RP-TLC for logP determination of the ferrocenyl analogues. Cent. Eur. J. Chem. (2012) 10, 1500-1505. IF: 1,073 (2011)

3.

J. Guzy, J. Vasková-Kubálková, Zs. Rozmer, K. Fodor, M. Marekova, M. Poskrobová, P. Perjési: Activation of oxidative stress response by hydroxyl substituted

chalcones

and

cyclic

chalcone

analogues

in

mitochondria.

FEBS Lett. (2010) 584, 567-70. IF: 3.601 (2010) 4.

P. Perjési, U. Das, E. De Clerq, J. Balzarini, M. Kawase, H. Sakagami, J. P. Stables, T. Loránd, Zs. Rozmer, J. R. Dimmock: Design, synthesis and antiproliferative activity of some 3-benzylidene-2,3-dihydro-1-benzopyran-4-ones which display selective toxicity for malignant cells Eur. J. Med. Chem. (2008) 43, 839-845IF: 2,882 (2008)

5.

P. Perjési, I. Ember, R. E. Bozak, E. Nádasi, Zs. Rozmer, T. Varjas, R. J. Hicks: Effect of the Chalcone Analogue E,E-bis(2-Hydroxybenzylidene)acetone on the 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene-Induced Ha-ras Gene Action in Vivo. In Vivo (2006) 20, 141-146. IF: 1,273 (2006)

6.

Rozmer Zs., Perjési P.: Néhány nem-szteroid gyulladáscsökkentő hatásának vizsgálata a 2-deoxi-D-ribóz Fenton-reakció iniciálta degradációjára Acta Pharm. Hung. (2005) 75, 87-93. IF: - (2005)

Idézhető absztraktok 1.

Rozmer Zs., Marton E., Perjési P.: Gyűrűs kalkonanalógok celluláris makromolekulákkal kialakuló kölcsönhatásának vizsgálata spektroszkópiai és kromatográfiás módszerekkel. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XV., Budapest, 2014. Gyógyszerészet Suppl. 2014/14. P-18

86

2.

Rozmer Zs., Berki T., Maász G., Perjési P.: Gyűrűs kalkonszármazékok celluláris redox státuszra gyakorolt hatásának vizsgálata Jurkat T sejtekben. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XV., Budapest, 2014. Gyógyszerészet Suppl. 2014/14. P-94

3.

P. Perjési, M. Kuzma, K. Fodor, Zs. Rozmer: Application of crocin bleaching and deoxyribose degradation tests to assess antioxidant capacity of capsaicinoids and some selected flavonoids. 2nd BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Tartu, 2007. Eur. J. Pharm. Sci. 32 (S1), 39, 2007.

4.

Csékei J., Szitter I., Rozmer Zs., Perjési P.: Flavonoid tartalmú teakeverékek flavonoidtartalmának meghatározása és hidroxilgyök scavenger hatásának in vitro jellemzése a dezoxiribóz degradációs teszt alkalmazásával. Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság III. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2006. Magyar Epidemiológia 3 (S), S33, 2006.

5.

Rozmer

Zs.,

Perjési

P.:

Kalkonszármazékok

és

fenolos

nem-szteroid

gyulladáscsökkentők hidroxilgyök scavenger hatásának in vitro jellemzése a dezoxi-ribóz degradációs teszt alkalmazásával. Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság II. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2005. Magyar Epidemiológia 2 (S), S76. 2005. 6.

Nádasi E., Rozmer Zs., Bozak R. E., Hicks R. J., Perjési P.: A synthetic curcumin analogue: chemopreventive or genotoxic effect? Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság II. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2005. Magyar Epidemiológia 2 (S), S63. 2005.

Poszterek 1.

Rozmer Zs., Berki T., Maász G., Perjési P.: Different effects of two cyclic chalcone analogues on redox status of Jurkat T cells. 2nd International Doctoral Workshop on Natural Sciences, Pécs, 2013.

87

2.

Perjési P., Kuzma M., Fodor K., Rozmer Zs.: Studies on in vitro antioxidant effect of salicylic acid and its hydroxylated metabolites. 9th International Symposium on Instrumental Analysis, Pécs, 2008.

3.

Kuzma M., Fodor K., Rozmer Zs., Perjési P.: Néhány kapszaicinoid és flavonoid antioxidáns hatásának vizsgálata krocin oxidációs teszt és deoxiribóz degradációs teszt alkalmazásával. Magyar Szabadgyök Kutató Társaság IV. Kongresszusa, Pécs, 2007.

4.

Rozmer Zs., Berki T., Perjési P.: Gyűrűs kalkonanalógok citotoxicitásának vizsgálata. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIII, Budapest, 2006.

5.

J. Guzy, M. Mareková, Z. Chavková, J. Kubálková, V. Tomečková, Zs. Rozmer, P. Perjési: Comparison of effect of some cyclic chalcone analogues on selected mitochondrial functions. 8th Symposium on Instrumental Analysis, Graz, 2005.

6.

Rozmer Zs., T. Novák K., Perjési P.: Kalkonok és gyűrűs kalkonszármazékok logP értékeinek meghatározása fordított fázisú vékonyréteg kromatográfiás módszerrel. Az MGYT Gyógyszerkutatási Szakosztály tudományos ülése, Pécs, 2005.

7.

Zs. Rozmer, P. Perjési: Application of deoxyribose degradation to assess hydroxyl radical scavanger activity of chalcones and cyclic chalcone analogues. 8th Symposium on Instrumental Analysis, Graz, 2005.

8.

Zs. Rozmer, T. Berki, P. Perjési: Cytotoxic effect of chalcone analogues in human T-cell leukemia. 1st BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Siófok, 2005.

Előadások 1.

Rozmer

Zs.,

Perjési

P.:

Flavonoidok

sejtciklusra

gyakorolt

hatása,

Magyar Biológiai Társaság Pécsi Csoportja szakülése, Pécs, 2006 2.

Rozmer Zs., Berki T., Perjési P.: Gyűrűs kalkonanalógok daganatsejt-toxikus hatásának

vizsgálata,

MTA

Gyógyszerésztudományi

Osztályközi

Komplex

Bizottságának ülése, Pécs, 2005 3.

Rozmer Zs.: Gyűrűs kalkonanalógok citotoxicitásának és citoprotektív hatásának vizsgálata. VII. Clauder Otto Emlékverseny, Visegrád, 2004

88

IX. Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném köszönetemet kifejezni mindazoknak, akik az elmúlt évek során segítették a munkámat. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Perjési Pál Professzor Úrnak, hogy szakmai tevékenységemet mindvégig figyelemmel kísérte, kutató munkámat irányította és segítette. Köszönöm Dr. Gregus Zoltán Professzor Úrnak szakmai tanácsait, disszertációm gondos átolvasását, és hogy kutatómunkámat az általa vezetett Ph.D. program keretein belül végezhettem. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Berki Tímea Professzor Asszonynak, hogy lehetőséget biztosított a sejtkezelések és áramlásos citometriai kísérletek elvégzésére az Immunológiai és Biotechnológiai Intézetben, valamint köszönöm segítségét a kísérletek megtervezésében és elvégzésében, szakmai és személyes tanácsait. Az intézetben dolgozó asszisztenseknek külön köszönöm a sejtek előkészítésében nyújtott segítségüket. Köszönöm Dr. Maász Gábornak a tömegspektrometriás mérésekben nyújtott segítségét. Köszönöm Takácsné Dr. Novák Krisztina Professzor Asszonynak a logP meghatározás módszerének elsajátításában nyújtott segítségét, valamint személyes példamutatását. A kooperációban végzett munkáért köszönetemet szeretném kifejezni a a kassai P. J. Šafarik Egyetem Orvosi Kémiai és Biokémiai Intézet munkatársainak. Köszönettel tartozom kollégáimnak szakmai tanácsaikért, valamint baráti támogatásukért. Köszönöm a Gyógyszerészi Kémiai Intézet minden munkatársának az évek során nyújtott segítségét. Végül köszönöm barátaim biztatását, családom támogatását, megértő türelmét és mindazt a szeretetet, amit tőlük kaptam.

89