MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
Frekvence a charakter chromozomových abnormalit v lidských IVF embryích Diplomová práce
Rostislav Navrátil
Vedoucí práce: Mgr. Miroslav Horňák, Ph.D.
Brno 2016
Bibliografický záznam Autor:
Název práce:
Bc. Rostislav Navrátil Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Frekvence a charakter chromozomových abnormalit v lidských IVF embryích
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Molekulární biologie a genetika
Vedoucí práce:
Mgr. Miroslav Horňák, Ph.D.
Akademický rok:
2015/2016
Počet stran:
85
Klíčová slova:
Asistovaná reprodukce; IVF; Aneuploidie; aCGH; NGS; Reciproké translokace; Robertsonské translokace; PGS; PGD
Bibliographic Entry Author:
Title of Thesis:
Bc. Rostislav Navrátil Faculty of Science, Masaryk University Department of experimental biology Frequency and nature of chromosome abnormalities in human IVF embryos
Degree programme:
Experimental biology
Field of Study:
Molecular biology and genetics
Supervisor:
Mgr. Miroslav Horňák, Ph.D.
Academic Year:
2015/2016
Number of Pages:
85
Keywords:
Assisted reproduction; IVF; Aneuploidies; aCGH; NGS; Reciprocal translocation; Robertsonian translocation; PGS; PGD
Abstrakt Chromozomové abnormality jsou hlavním důvodem zastavení vývoje embrya, selhání implantace, spontánních abortů a narození postiženého dítěte. Molekulární genetické analýzy odhalily, že nejčastěji vznikají v průběhu oogeneze, a že počet těchto chyb výrazně narůstá s věkem ženy. Asistovaná reprodukce s preimplantační genetickou diagnostikou a screeningem nabízí šanci počít zdravé dítě lidem, kteří by jinak tuto možnost nikdy mít nemuseli. V této práci se zabýváme četností, charakterem a klinickým významem chromozomových abnormalit u embryí páru, které podstupili léčbu neplodnosti v klinice asistované reprodukce Sanatorium Repromeda v Brně. Pro účely této práce jsme analyzovali výsledky vyšetření PGS a PGD u téměř 5000 embryí od více než 1000 párů. Většinový podíl (62 %) biopsií blastomer vykazoval chromozomou abnormalitu. U biopsií trofektodermu jsme pozorovali téměř poloviční množství aberantních embryí (44 %). Nejčastěji postižené chromozomy byly 15,16,21,22, X a Y. Výrazný nárůst aneuploidií u embryí byl pozorován u skupin žen nad 38 let. U PGD translokací jsme pozorovali výrazné snížení celkového zastoupení euploidních embryí a to především u skupiny biopsií blastomer (14 %). Jednotlivé segregační varianty u translokovaných chromozomů se lišily v závislosti na pohlaví přenašeče.
Abstract Chromosomal abnormalities are the main reason for developmental arrest of the embryo, implantation failure, spontaneous miscarriages and a birth of an affected child. Molecular genetic analysis revealed that chromosome abnormalities frequently arise during female meiosis and the incidence of errors increases rapidly with advanced maternal age. Assisted reproduction with preimplantation genetic diagnosis and screening helps plenty of couples suffering from infertility to conceive and give birth to a healthy child. In this thesis we discuss the frequency, nature and clinical importance of chromosomal abrnomalities in embryos of couples who underwent infertility treatment in the clinic of assisted reproduction Sanatorium Repromeda in Brno. For the purpose of this thesis we analyzed PGS and PGD results from almost 5000 embryos derived from more than 1000 couples. Majority of blastomere biopsies (60 %) was chromosomally abnormal. Concerning trophectoderm biopsies, nearly half of them (44 %) displayed chromosome nanomalies. Most frequently affected chromosomes were chromosome 15, 16, 21, 22, X and Y. Significant increase in aneuploidy rate in embryos was observed in a group of woman older than 38 years old. Most notably, only 14 % of blastomere biopsies analysed for PGD of reciprocal translocation were chromosomally normal. We have also noticed that segregation pattern of translocated chromosomes was biased by the sex of the carrier.
Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat svému školiteli Mgr. Miroslavu Horňákovi, Ph.D. za cenné rady a čas, který mi při vypracování této diplomové práce věnoval. Dále bych chtěl poděkovat ředitelce MUDr. Kateřině Veselé, Ph.D. za možnost zpracovávat diplomovou práci v Sanatoriu Repromeda. Samozřejmě nemohu opomenout skvělý kolektiv laboratoře lékařské a reprodukční genetiky Sanatoria Repromeda, zejména mého konzultanta Mgr. Davida Kubíčka, dále Mgr. Jakuba Horáka, Ph.D. a Jitku Dufkovou, jejichž rad a pomoci si velice vážím. Nakonec bych chtěl poděkovat také Mgr. Tereze Pospíšilové za konzultace embryologických metod.
Obsah Obsah ........................................................................................................................................ 7 Seznam zkratek ....................................................................................................................... 10 1. Úvod ................................................................................................................................. 12 2. Asistovaná reprodukce ..................................................................................................... 13 2.1
Indikace ...................................................................................................................... 13
2.2
Hormonální stimulace a odběr oocytů ....................................................................... 13
2.3
Umělé oplodnění oocytů a kultivace embryí ............................................................. 15
2.4
Biopsie a transfer embrya .......................................................................................... 16
3. Metody preimplantačního genetického vyšetření ............................................................. 18 3.1
Fluorescenční in situ hybridizace............................................................................... 18
3.2
Komparativní genomová hybridizace na čipu ........................................................... 19
3.3
Sekvenování nové generace ....................................................................................... 21
3.3.1
Illumina®............................................................................................................. 22
3.3.2
ThermoFisher Scientific ..................................................................................... 24
4. Chromozomové abnormality ............................................................................................ 26 4.1
Numerické chromozomové abnormality ................................................................... 26
4.1.1
Monozomie ......................................................................................................... 29
4.1.2
Trizomie ............................................................................................................. 30
4.2
Strukturní chromozomové abnormality ..................................................................... 31
4.2.1
Duplikace a delece .............................................................................................. 32
4.2.2
Translokace ......................................................................................................... 32
5. Cíle diplomové práce ........................................................................................................ 36 6. Materiál............................................................................................................................. 37 7. Metody .............................................................................................................................. 38 7.1
Celogenomová amplifikace ....................................................................................... 38 7
7.2
Gelová elektroforéza .................................................................................................. 39
7.3
aCGH ......................................................................................................................... 40
7.3.1
Značení DNA ...................................................................................................... 40
7.3.2
Hybridizace ......................................................................................................... 41
7.3.3
Vymytí nenavázané DNA ................................................................................... 42
7.3.4
Skenování čipů a analýza dat.............................................................................. 42
7.4
NGS ........................................................................................................................... 43
7.4.1
Kvantifikace produktu WGA.............................................................................. 44
7.4.2
Tagmentace produktu WGA ............................................................................... 44
7.4.3
PCR..................................................................................................................... 45
7.4.4
Přečištění knihovny ............................................................................................ 45
7.4.5
Normalizace knihovny........................................................................................ 46
7.4.6
Smíchání knihoven a vnesení vzorků do přístroje MiSeq® ................................ 47
7.4.7
Sekvenování a analýza dat .................................................................................. 47
7.5
Statistická analýza dat ................................................................................................ 49
8. Výsledky ........................................................................................................................... 50 8.1
Detekce chromozomových abnormalit ...................................................................... 50
8.2
Statistické zhodnocení výsledků PGS ........................................................................ 51
8.2.1
PGS trofektoderm ............................................................................................... 52
8.2.2
PGS blastomery .................................................................................................. 53
8.3
Porovnání frekvence a charakteru chromozomových abnormalit u embryí v závislosti
na věku ženy. ........................................................................................................................ 55 8.3.1
PGS trofektodermu ............................................................................................. 55
8.3.2
PGS blastomer .................................................................................................... 56
8.4
Srovnání frekvencí detekovaných aberací metodami aCGH 24sureTM a NGS
VeriSeq™ ............................................................................................................................. 57 8.5
Detekce a statistické vyhodnocení segregačních variant translokací u embryí. ........ 59 8
9. Diskuze ............................................................................................................................. 64 9.1
Frekvence a charakter chromozomových abnormalit ................................................ 64
9.2
Závislost věku ženy a frekvence aneuploidií u embryí .............................................. 67
9.3
Frekvence segregačních variant u embryí přenašečů reciproké translokace ............. 69
9.4
Frekvence a charakter chromozomových aberací u embryí přenašečů reciproké a
Robertsonské translokace ..................................................................................................... 71 9.5
Porovnání metod aCGH a NGS ................................................................................. 73
10. Souhrn............................................................................................................................... 74 11. Summary........................................................................................................................... 76 12. Seznam literatury .............................................................................................................. 78 12.1
Publikace ................................................................................................................ 78
12.2
Internetové zdroje ................................................................................................... 84
9
Seznam zkratek aCGH
Komparativní genomová hybridizace na čipu, Z angl. Array Comparative Genomic Hybridization
AR
Asistovaná Reprodukce
BAC
Umělý bakteriální chromozom, z angl. Bacterial Artificial Chromosome
CCD
Zařízení pro snímání obrazu, z ang. Charge Coupled Device
CGH
Komparativní genomová hybridizace, z angl. Comparative Genomic Hybridization
CNV
Varianty v počtu kopií, z angl. Copy Number Variation
dCTP
Deoxycytidin trifosfát, z angl. DeoxyCytidine TriPhospate
DNA
Deoxyribonukleová kyselina, z angl. DeoxyriboNucleotide Acid
dNTP
Deoxynukleotid trifosfát, z angl. DeoxyNucleotide TriPhoshate
DOP-PCR
PCR s degenerovanými oligonukleotidovými primery, z angl. Degenerate Oligonucleotide Primed PCR
DSB
Dvouřetězcovým zlom, z angl. Double Strand Break
ELFO
ELektroFOréza
FISH
Fluorescenční In Situ Hybridizace
FSH
FolikuloStimulační Hormon
GnRH
Gonadotropin uvolňující hormon, z angl. Gonadotropin Releasing Hormon
hCG
Lidský choriový gonadotropin, z angl. Human Chorionic Gonadotropin
ICSI
Intracytoplazmatická injekce spermie, z angl. IntraCytoplasmic Sperm Injection
IVF
In Vitro Fertilizace
LH
Luteinizační Hormon
MALBAC
z angl. Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles
MDA
Mnohočetná amplifikace s vytěsňováním řetězce, z angl. Multiple Displacement Amplification
NGS
Nová generace sekvenování, z angl. Next Generation Sequencing
OHSS
Ovariální HyperStimulační Syndrom 10
PCR
Polymerázová řetězová reakce, z angl. Polymerase Chain Reaction
PEP-PCR
Preamplifikace prodlužováním primerů, z angl. Primer Extension Preamplification PCR
PGA
Preimplantační Genetická Analýza
PGD
Preimplantační Genetická Diagnostika
PGS
Preimplantační Genetický Screening
PICSI
Fyziologická intracytoplazmatická injekce spermie, z angl. Physiological IntraCytoplasmic Sperm Injection
SNP
Jednonukleotidový polymorfismus, z angl. Single Nucleotide Polymorphism
WGA
Celogenomová amplifikace, z angl. Whole Genom Amplification
11
1. Úvod Uplynulo již více než půl století od doby, kdy byla identifikována příčina Downova syndromu a kdy tak bylo vůbec poprvé prokázáno spojení mezi vrozeným onemocněním a chromozomovou abnormalitou. Jak se brzy ukázalo, chromozomové aberace hrají důležitou roli v lidské reprodukci jakožto jedna z hlavních příčin poruch plodnosti. Právě kvůli snaze pomoci párům potýkajících se s infertilitou, se v 70. letech 19. století vytvořil nový medicínský obor zvaný asistovaná reprodukce. Brzy se v rámci tohoto převratného oboru začaly uplatňovat metody preimplantačního genetického vyšetření, které vysoce zvýšily úspěšnost asistované reprodukce a zárověn umožnily studovat chromozomové aberace v raných fázích embryonálního vývoje. Příchod moderních diagnostických metod jako jsou komparativní genomová hybridizace na čipech (aCGH) a sekvenování nové generace (NGS), nám umožnil detekovat drobné aberace u všech lidských chromozomů najednou, které s použitím starých technik ještě do nedávna zůstávaly neodhaleny. Díky tomu již víme, kolik chyb během lidské gametogeneze vzniká, a že poměrně velké množství lidských embryí je postiženo chromozomovou aberací. Jak bylo zjištěno, většina aneuploidií má původ v ženské meióze a především pak u žen pokročilejšího reprodukčního věku výrazně narůstá množství chromozomových aberací v oocytech. Tento fakt je spojen se skutečností, že na rozdíl od mužů dochází u žen k zastavení oogeneze v profázi prvního meotického dělení a k postupnému dozrávání jednotlivých oocytů dochází vždy až v době ovulace. S tímto zdržením gametogeneze, které může trvat až několik desítek let, je spojena akumulace různých vnějších faktorů, které nepříznivě ovlivňují složitý mechanismus buněčného dělení. To je se současným trendem odkládání mateřství do pozdějšího věku velký problém. Obrovský přínos představují metody preimplantačního vyšetření pro páry s genetickou zátěží v podobě reciproké či Robertsonské translokace. S přenašečstvím těchto typů aberací výrazně klesá schopnost počít zdravé dítě a v případě některých Robertsonských translokací dokonce stoupá riziko početí potomka postiženého např. Downovým syndromem. Preimplantační genetická diagnostika translokací nabízí nový pohled na chování těchto aberací v meióze a na rozdíl od klasického studia u spermií také na rozdílný vliv pohlaví přenašečů na segregační varianty u embryí.
12
2. Asistovaná reprodukce Asistovaná reprodukce (AR) je medicínský obor pracující s oocyty a spermiemi mimo tělo (in vitro), za účelem co největšího zvýšení šance na otěhotnění a početí zdravého dítěte. Jednou z hlavních metod AR je tzv. in vitro fertilizace (IVF), neboli oplodnění „ve zkumavce“. Již od svého počátku v roce 1978 nabízí v rámci asistované reprodukce řešení pro páry s poruchami plodnosti a umožňuje jim tak počít zdravé dítě. V posledních dekádách se IVF v rámci AR úspěšně kombinuje s preimplantační genetickou analýzou embryí (PGA), což podstatně rozšířilo uplatnění této metody a zvýšilo efektivitu asistované reprodukce.
2.1 Indikace Efektivita lidské reprodukce je poměrně nízká. Pravděpodobnost oplodnění v jednom ovariálním cyklu je zhruba 20%. Udává se, že pouze 90% fertilních párů otěhotní v prvním roce snahy o početí (Hull, 1990). Pro doporučení léčby neplodnosti metodami IVF a PGA je důležité zohlednit několik skutečností, např. jak dlouho se pár snaží o přirozené početí, zda se v rodinách někoho z páru nevyskytuje genetická abnormalita či porucha plodnosti, věk ženy atd. Na základě těchto informací je důležité určit, jaká je šance na otěhotnění po léčbě. Pro co největší efektivitu asistované reprodukce je nutné zvolit takový přístup, který maximalizuje pravděpodobnost otěhotnění. Indikací pro IVF je např. tubární sterilita (porucha průchodnosti vejcovodů),
andrologický
faktor
(subfertilita
muže),
endometrióza,
imunologická
infertilita, vyšší věk ženy nebo genetická zátěž.
2.2 Hormonální stimulace a odběr oocytů Brzy po zavedení asistované reprodukce do praxe se ukázalo, že pravděpodobnost otěhotnění se výrazně zvyšuje transferem více embryí současně. Výzkum hormonů řídících folikulogenezi brzy umožnil vývoj nových metod zajišťujících zisk více zralých oocytů v jednom ovariálním cyklu. Nicméně, tento přístup sebou nese rizika v podobě ovariálního hyperstimulačního syndromu (OHSS) či vícečetného těhotenství, které mohou vést k vážným komplikacím v těhotenství. To vedlo k přijetí určitého kompromisu mezi mírou 13
stimulace, počtem transferovaných embryí a pravděpodobností otěhotnění (Fishel et al., 1985; Templeton et Morris, 1998). K ovariální stimulaci se používají léky, které zvyšují hladinu folikulostimulačního hormonu (FSH) v krvi (např. FSH, menotropin, antiestrogeny). Hypofyzární pík luteinizačního hormonu (LH), který indukuje dozrávání oocytů a jejich uvolnění z folikulu, může nastat v kteroukoliv denní dobu, což není z hlediska organizace práce výhodné. Proto se používají antagonisté gonadotropin uvolňujícího hormonu (GnRH), které blokují aktivitu LH. Pro indukci ovulace se poté aplikuje lidský choriový gonadotropin (hCG), to umožňuje přesné načasování odběru zralých oocytů. Hormony jsou aplikovány injekčně pod kůži nebo do svalu (Řežábek, 2014). V průběhu podávání hormonů je folikulogeneze průběžně monitorována pomocí ultrazvuku společně s hladinou hormonů v těle. Jakmile mají folikuly požadovanou velikost, provádí se tzv. punkce folikulární tekutiny (obr. 1). Zákrok se provádí v kompletní narkóze. Nejprve je intravaginálně zavedena ultrazvuková sonda, pomocí které jsou nalezeny folikuly. Odsávací jehlou se poté pronikne skrze vaginální stěnu, vaječník a folikul. Následně se odsaje folikulární tekutina společně s oocytem. Tímto způsobem jsou odebrány všechny oocyty ze zralých folikulů vaječníku. Totéž je provedeno u druhého vaječníku.
Obrázek 1: Punkce folikulární tekutiny (převzato a upraveno podle www.womens-health-advice.com)
14
Následně embryolog pod mikroskopem vyhledá oocyty ve folikulární tekutině a očistí je od kumulárních buněk. Čisté oocyty jsou společně inkubovány při 37 °C do doby oplodnění.
2.3 Umělé oplodnění oocytů a kultivace embryí V den punkce obvykle dochází k odběru spermatu partnera a následně jsou těmito spermiemi oplodněny oocyty. Klasickým přístupem je inkubace oocytu se spermiemi a jeho oplodnění bez vnějšího zásahu. Pro potřeby IVF z důvodu špatné kvality spermií byla vyvinuta metoda intracytoplazmatické injekce spermií (ICSI) (Obr. 2) a její modifikace tzv. PICSI. Spermie vhodné pro fertilizaci jsou selektovány na základě morfologie a pohyblivosti. V Případě metody PICSI dochází k selekci na principu vazby spermie na gel z kyseliny hyaluronové, která je rovněž obsažena v obalu oocytu. Na hyaluronan se váží pouze zralé spermie a proto mají takto vybrané gamety vyšší šanci na oplodnění. Morfologicky nejkvalitnějším spermiím je pomocí mikromanipulační jehly poškozen bičík což aktivuje schopnost fertilizace. Poté je jehlou spermie vpravena do oocytu. V dnešní době je výběr spermie společně s ICSI standartním přístupem IVF, pro co nejvyšší efektivitu AR.
Obrázek 2: Intracytoplasmatická injekce spermie (www.vivaconsalud.es)
15
Takto oplozené oocyty se inkubují do dalšího dne, kdy embryolog kontroluje tvorbu prvojader a odstraňuje oocyty, u kterých nedošlo k fertilizaci. Druhý den kultivace jsou embrya rozdělena podle úrovně vývoje, fragmentace a symetrie. Jako perspektivní jsou klasifikována embrya čtyřbuněčná, symetrická a bez fragmentace. Následně jsou embrya odděleně kultivována při 37 °C do doby biopsie a to 1 den v případě biopsie blastomer nebo 2-3 dny při biopsii trofektodermu.
2.4 Biopsie a transfer embrya Pro potřeby preimplantačního genetického vyšetření je důležité z embrya odebrat jednu či více buněk, jejichž genetická výbava reprezentuje profil celého embrya. V zásadě existují tři klasické přístupy biopsií a to odběr polocytů, jedné či dvou blastomer třídenního embrya (Obr. 3) nebo několika buněk trofektodermu pěti až šestidenního embrya (Obr. 4). Prvním krokem je tzv. asistovaný hatching, kdy je třetí den kultivace pomocí mikromanipulátoru narušena zona pellucida, která obklopuje embryo. To způsobí vyhřeznutí embryonálních buněk mimo tento obal, což umožňuje samotnou biopsii. Ta se také provádí s pomocí mikromanipulátoru, kde je jednou pipetou embryo uchyceno, a druhou jsou odebrány buňky pro vyšetření. Při odběru několika buněk trofektodermu je zapotřebí buňky oddělit laserovým pulsem.
Obrázek 3: Biobsie blastomery třídenního embrya (www.ivfmd.net).
16
Obrázek 4: Biobsie trofektodermu pětidenního embrya (www.ivfmd.net).
Bioptovaný materiál je přenesen do PCR mikrozkumavek s PBS. V případě biopsie blastomer je embryo dále kultivováno do pětidenního stádia. Během této doby je provedena preimplantační diagnostika na blastomerách a 5. den kultivace je možné zdravá embrya transferovat do dělohy matky. U biopsie trofektodermu 5. – 6. den je nutné embrya před transferem tzv. vitrifikovat. Vitrifikace embrya spočívá v jeho zatavení v pouzdře s viskózním kryoprotektivem a jeho zmražení v kapalném dusíku. Tento přístup zabraňuje vzniku ledových krystalů, které mohou porušit buněčné struktury. Proces vitrifikace výrazně zvyšuje schopnost přežívání embryí po rozmražení oproti dřívějším technikám pomalého mražení (Loutradi et al., 2008). Výhodou biopsie buněk trofektodermu je především umožnění detekce chromozomových abnormalit vyskytujících se v mozaice. Transfer embrya do dělohy pacientky provádí embryolog pomocí katetru.
17
3. Metody preimplantačního genetického vyšetření V zásadě rozlišujeme dva typy preimplantačních genetických vyšetření a to preimplantační genetickou diagnostiku (PGD) a screening (PGS). Pomocí PGD se zjišťuje, zda embryo nenese konkrétní chromozomovou abnormalitu či mutaci zděděnou od rodičů, u kterých je známo, že tuto vadu přenáší. Umožňuje tedy pro transfer vybrat to embryo, které nenese hledanou genetickou zátěž. PGS je naopak plošná detekce numerických chromozomových aberací (aneuploidií) v buňkách embrya. Na rozdíl od PGD se zde nehledá konkrétní anomálie, ale hodnotí se celkový genetický profil embrya na úrovni jednotlivých chromozomů. Tímto přístupem je tedy možné vyřadit embrya s nesprávným počtem chromozomů a tím výrazně zvýšit šanci na početí. První metodou pro identifikaci numerických chromozomových abnormalit bylo karyotypování. Dělení buněk embrya je zastaveno v metafázi pomocí inhibitorů dělícího vřeténka a následně jsou chromozomy počítány pod mikroskopem. Nevýhodou tohoto přístupu je nízká úspěšnost zisku chromozomů a jejich horší kvalita pro karyotypování. Proto se hledaly nové molekulární přístupy aplikovatelné i na jedinou buňku, které by pracovaly bez nutnosti zastavení buněk v mitóze.
3.1 Fluorescenční in situ hybridizace První molekulárně-cytogenetickou metodou použitelnou na interfázní buňky byla fluorescenční in situ hybridizace. Tato technika pracuje na principu hybridizace chromozomově specifických sond označených fluorochromem. Nevýhodou je omezení počtu sond, které mohou být použity v jedné hybridizaci. Tento problém je řešen tzv. rehybridizací, kdy jsou sondy odmyty a nahrazeny sondami novými. Ovšem kvalita fluorescenčních signálů se při dalších hybridizačních kolech značně snižuje, a tudíž lze touto technikou analyzovat pouze 10-12 chromozomů. Standartní metodologií se stala mnohobarevná FISH s 5-9 sondami ve dvou sekvenčních hybridizacích. I přes pokrok v technologii PGS, který představovala tato metoda, nedocházelo k očekávanému výraznému zvýšení úspěšnosti asistované reprodukce. To bylo přičítáno nemožnosti vyšetřit všechny lidské chromozomy, a proto se vývoj technik začal soustředit 18
na analýzu všech 24 lidských chromozomů. První pokusy, které byly založeny na principu FISH, např. použití krátkých oligonukleotidových sond s několikanásobnou rehybridizací nebo 24 barevná FISH na interfázních chromozomech, nebyly u tak malého počtu buněk dostatečně efektivní (Gutiérrez-Mateo et al., 2005; Ioannou et al., 2012).
3.2 Komparativní genomová hybridizace na čipu Konvenční komparativní hybridizace byla původně vyvinuta pro karyotypování solidních nádorů. Metoda spočívá v izolaci testované a kontrolní DNA a jejich značení odlišnými barevnými fluorochromy. Takto značená DNA je společně hybridizována na metafázní chromozomy a následně jsou rozdíly v intenzitách obou barevných signálů detekovány CCD kamerou. Poprvé tak bylo možné detekovat zisky či ztráty u všech 24 chromozomů najednou (Wells et al., 1999,Voullaire et al., 1999, Wilton et al., 2001). Tento přístup je však časově velmi náročný a nedosahuje požadovaného rozlišení, které je potřeba například pro detekci strukturních abnormalit. Proto byla vytvořena nová metoda aCGH, která pracuje na stejném principu jako klasická CGH, avšak hybridizace se provádí na DNA čipech. Jelikož je množství DNA v jedné blastomeře či několika buňkách trofektodermu příliš malé, byly pro potřeby PGS a PGD navrženy metody celogenomové amplifikace (WGA). Prvními takovými metodami byly PEP-PCR a PCR s degenerovanými oligonukleotidovými primery (DOP-PCR), které fungují na principu klasické PCR. To však sebou nese určitá úskalí, především nedostatečné pokrytí celého genomu nebo nerovnoměrnou amplifikaci lokusů, což dohromady vytváří nezanedbatelný amplifikační bias (Cheung a Nelson, 1996; Telenius et al., 1992). Proto se v praxi používají spíše techniky založené na obdobných, ale propracovanějších
přístupech,
např.
WGA
v kitech
(PicoPlex, OmniPlex, Sureplex™, GenomePlex), MDA nebo poměrně nedávno vyvinutá metoda MALBAC. Metody WGA a MDA jsou v dnešní době nejvíce používané, jsou vzájemně srovnatelné a dosahují vyšší efektivity než techniky využívající standartní PCR (Barker et al., 2004). Samotné čipy pro aCGH se vyrábí několika způsoby. Jednou z nich je tzv. fotolitografie, kdy jsou pomocí světla aktivovány pozice pro připojení nukleotidu, což umožňuje syntézu sondy přímo na čipu. Další metodou je tzv. spotování, kdy je každá 19
jednotlivá předem připravená sonda mechanicky připojena na specifické místo na čipu. Podle typu sondy pak rozlišujeme tzv. BAC čipy, Oligonukleotidové čipy a SNP čipy. BAC sondy se připravují z umělých bakteriálních chromozomů a mají velikost zhruba 80-200kb. BAC aCGH dosahuje rozlišovací schopnosti od 2 do 5 MB a je vhodná především pro PGS. Oligonukleotidové čipy obsahují uměle vytvořené sondy o délce 25-85 bází. Jejich rozlišovací schopnost je řádově vyšší než v případě BAC aCGH a proto jsou vhodné zejména pro detekci menších chromozomových abnormalit (Coe et al., 2007). SNP čipy jsou také tvořeny uměle syntetizovanými
oligonukleotidy,
ovšem
umožňují
detekci
jednonukleotidových
polymorfismů (SNP). Jejich výhoda spočívá v možnosti detekce polyploidií, uniparentálních dizomií a také mutací které jsou ve vazbě s určitým SNP, jsou tedy vhodné především pro PGD (Harper and Harton, 2010). Protokol aCGH (Obr. 5) začíná hybridizací kontrolní DNA značené jedním fluorochromem a testované DNA značené jiným fluorochromem v jedné pozici čipu. Laser vybudí fluorescenci, ta je poté detektorem na jednotlivých hybridizačních pozicích čipu zachycena. Tyto signály jsou poté softwarově přepočítány a vyhodnoceny. Výsledkem je graf zobrazující ztráty a zisky na všech lidských chromozomech.
Obrázek 5: Proces komparativní http://www.cgimatba.com)
genomové
20
hybridizace
(převzato
a
upraveno
podle
Jako kontrola bývá většinou použita zdravá mužská DNA. U platformy 24SureTM firmy Illumina® jsou použity dvě kontroly, jedna mužská a jedna ženská, které jsou obě označeny vždy oběma fluorochromy. Následně jsou na jednu pozici čipu hybridizovány dvě mužské kontroly a na jinou pozici dvě kontroly opačného pohlaví. Na zbylé pozice se hybridizuje pouze různě značená DNA dvou embryí. Software porovnává intenzitu signálů obou kontrol navzájem a vyhodnotí celkový profil každého zkoumaného vzorku včetně pohlaví. Výhodou tohoto přístupu je skutečnost, že pouze 4 pozice na čipech jsou využity pro kontrolní DNA a všechny zbylé pozice mohou být zaplněny zkoumanou DNA, což umožňuje vyšetření více vzorků, než je počet kontrol.
3.3 Sekvenování nové generace Od roku 1975, kdy Frederick Sanger vyvinul převratnou metodu sekvenování, došlo na poli čtení genomu k obrovskému pokroku. První metody založené na chemickém sekvenování a gelové elektroforéze byly brzy nahrazeny rychlejším kapilárním sekvenováním s fluorescenčními terminátory. Stále větší snaha o zefektivnění čtení sekvence DNA vedla k vytvoření prvního plně automatického sekvenátoru GLS-FLX 454 firmy Roche, který na principu masivního paralelního sekvenování krátkých fragmentů DNA dokázal přečíst lidský genom s do té doby nevídanou rychlostí a za mnohem nižší cenu (Wheeler et al., 2008). Jiné firmy jako Solexa či Life Technologies brzy také představily své platformy a započaly tak novou éru, kterou dnes nazýváme „Sekvenování Nové Generace“. V dnešní době existuje několik odlišných NGS technologií, typicky však tyto metody zahrnují fragmentaci vzorku DNA na 100-200pb dlouhé fragmenty. Ty poté bývají označeny určitou specifickou sekvencí, která funguje jako jakýsi „čárový kód“ a určuje tak identitu každého jednotlivého fragmentu. To umožňuje sekvenaci většího množství vzorů v jedné sekvenační reakci. V principech, jakými jsou sekvence DNA čteny, se od sebe jednotlivé platformy liší (Handyside, 2013). Pro potřeby PGS jsou v dnešní době komerčně dostupné 2 kity a to VeriSeq™ firmy Illumina® a Ion ReproSeq™ PGS firmy ThermoFisher Scientific.
21
3.3.1 Illumina® V roce 2006 představila firma Solexa sekvenátor Genome Analyzer. Principem platformy této firmy (Obr. 6), která již od roku 2007 patří společnosti Illumina®, je tzv. sekvenování syntézou. DNA je po celogenomové amplifikaci nespecificky rozštípána na menší fragmenty, na jejichž konce jsou pomocí primerů přidány sekvence s oblastmi pro připojení k povrchu průtokové sekvenační destičky (adaptory) a tzv. indexy, které jsou specifické pro každý sekvenovaný vzorek. Směs vzorků je poté vložena do sekvenátoru, kde dochází k tzv. můstkové PCR. Fragmenty se jedním adaptorem váží na oligonukleotidy destičky a adaptory na druhém konci na sousední oligonukleotidy, to vytváří ohyb podobný mostu. V tomto stavu dochází k syntéze nových vláken. Proces se opakuje, dokud nedojde k vytvoření klastrů, neboli shluků amplikonů fragmentu v určitém místě sekvenační destičky. Poté následuje samotné sekvenování syntézou, kdy je každý jednotlivý nukleotid označen fluorescenční značkou, fungující jako terminátor syntézy DNA. Jakmile je světelný signál připojeného nukleotidu odečten, je značka odmyta a může být připojen další nukleotid. Tímto způsobem jsou přečteny sekvence všech fragmentů ve shlucích a na základě překryvu je složena genomová sekvence.
22
Obrázek
6:
Princip
sekvenování
firmy
Illumina®
(převzato
a
upraveno
podle
www.bitesizebio.com). Genom je rozdělen do tzv. binů, což jsou oblasti o velikosti zhruba 1Mb obsahující specifické sekvence dlouhé 36bp. Jakmile jsou tyto sekvence přečteny, jsou přiřazeny konkrétním binům v genomu. Na základě počtu sekvencí v binech, je určen počet kopií (CNV) dané oblasti. Teoretická rozlišovací schopnost metody VeriSeq™
je tedy 1Mb
(www.Illumina®.com,a). Data jsou vyhodnocena softwarem, který na základě informace o CNV jednotlivých binů vytvoří graf (obr. 7). Pomocí hladin, ve kterých jsou jednotlivé biny zobrazeny, lze 23
odečíst genetických profil každého chromozomu. Udávané efektivní rozlišení v softwaru BlueFuse firmy Illumina® je zhruba 20Mb (www.Illumina®.com,b).
Obrázek 7: Výsledný graf VeriSeq™ Illumina®. Trizomie chromozomu 21 identifikována v blastomeře embrya (www.prismabiotech.com.tw).
3.3.2 ThermoFisher Scientific V roce 2010 přišla na trh platforma IonTorrent™ firmy Life Technologies (od roku 2014 patřící společnosti ThermoFisher Scientific). V dnešní době firma nabízí komerční kit pro PGS s názvem Ion ReproSeq™ PGS. Technologie IonTorrent (Obrazek 8) pracuje na principu detekce vodíkových iontů uvolněných při inkorporaci nukleotidu do řetězce DNA. Samotná příprava knihovny probíhá obdobně jako u jiných platforem, tedy WGA, fragmentace a připojení adaptorů. Knihovna fragmentů s adaptory je pomocí tzv. emulzní PCR amplifikována na mikrokuličkách a poté jsou tyto kuličky aplikovány na čip, který na svém povrchu obsahuje miliony jamek. Uvnitř každé jamky je velice citlivý pH detektor. Samotná sekvenace probíhá syntézou nového vlákna na každém fragmentu kuličky. Přes čip jsou přelévány roztoky obsahující vždy jeden typ dNTP po jehož připojení je uvolněn vodíkový iont, který je detekován pH metrem. Poté se cyklus opakuje s jiným dNTP, dokud není přečtena kompletní knihovna.
24
Obrázek 8: Princip sekvenování IonTorrent. a) Jednotlivé kroky v sekvenování, b) Fragmentace a připojení adaptorů, c) Emulzní PCR, d) Detekce a zpracování signálu (převzato a upraveno podle www.genomics.cn).
Data jsou vyhodnocována softwarem Torrent Suite™ a Torrent Reporter™. Udávaná efektivní rozlišovací schopnost je 48Mb (www.thermofisher.com).
25
4. Chromozomové abnormality Odchylky od správného počtu chromozomů nebo jejich struktury nazýváme chromozomové
abnormality.
Ty
můžeme
rozdělit
do
dvou
základních
skupin: numerické, u kterých dochází ke změnám v počtu jednotlivých chromozomů nebo chromozomových sad,
a strukturní,
charakteristické změnami
uvnitř jednotlivých
chromozomů. Chromozomové abnormality jsou u lidí poměrně časté. Uvádí se, že zhruba 0,3 % narozených dětí je postiženo některou z přežitelných aneuploidií, nejčastěji trizomií chromozomu 21. V těhotenství je detekováno zhruba 4 % aneuploidních plodů (Hassold a Hunt, 2001). Okolo 65 % spontánních abortů je chromozomově abnormálních (Menasha et al., 2005).
4.1 Numerické chromozomové abnormality Tyto chyby jsou pravidla způsobeny poruchou složitého mechanismu buněčného dělení. V jádře buňky může být znásobena kompletní sada chromozomů, tomuto stavu pak říkáme polyploidie. U člověka jsou však tyto stavy většinou letální již v embryonálním vývoji. Ovšem numerické odchylky jednotlivých chromozomů, nazývané aneuploidie, jsou signifikantně častější a mnohdy dokonce umožňují kompletní vývoj embrya a porod nemocného dítěte. U této skupiny mluvíme zejména o trizomiích a monozomiích. Obecně je známo, že je vzrůstající věk matky spojen s častějším vznikem aneuploidií u oocytů a tedy i embryí. Již v roce 1933 byla pozorována korelace mezi vzrůstajícím počtem případů Downova syndromu a vyšším věkem matky a to již 25 let před objevením principu vzniku tohoto onemocnění (Penrose, 1933). Tato skutečnost je spojena s odlišným průběhem tvorby gamet u žen. Meióza, jakožto mechanizmus tvorby haploidních gamet z diploidních primordiálních buněk, je hlavním činitelem vzniku aneuploidií. Za normálních okolností se v metafázi 1. dělení vytvářejí tzv. bivalenty, což jsou struktury tvořené dvěma komplementárními chromozomy, jejichž chromatidy a centromery jsou navzájem pevně spojeny. Ve fázi leptotene se uplatňuje mechanismus, nazývaný crossingover, při němž dochází k dvouřetězcovým zlomům (DSB). Ty vytváří na celém chromozomu vysoce konzervovaná 26
endonukleáza SPO11 v průběhu leptotene meiózy 1. Tyto zlomy pak aktivují rekombinační proteiny MLH1 a MLH3 (Baudat et al., 2013). Reparační proteiny opravují DSB pomocí homologního vlákna sesterské chromatidy, vlákna jsou navzájem spojena a dochází ke vzniku tzv. chiasma. Samotná synapse je dále stabilizována komplexem synaptonemálních proteinů. Během fází zygotene a pachytene rekombinační ložiska aktivují sérii faktorů, které zajišťují crossover a non-crossover výměny. Při non-crossover výměnách dochází pouze k opravě DSB, zatímco u crossover výměn dochází k výměně ramen homologních chromatid distálně od místa crossingoveru. Zhruba 10 % reparací vede ke tvorbě crossover výměn (Baudat et al., 2013). Takto je zajištěna vyšší variabilita v genomu budoucích gamet a zároveň dochází k upevnění spojení homologních chromozomů v bivalentu. Spojení sesterských chromatid v chromozomu je zabezpečeno kohesinovým komplexem. Ten vytváří prstence kolem obou chromatid a udržuje jejich spojení po celé délce chromozomu (Page a Hawley, 2003). V následující fázi je spojení homologních chromozomů uvolněno a poté jsou rekombinantní dvouchromatidové chromozomy rozděleny k opačným pólům buňky. Sesterské chromatidy zůstávají spojeny pomocí centromerických kohesinových vazeb. Dochází k cytokinezi a tvorbě dvou haploidních buněk. Ve druhém meiotickém dělení je rozvolněno spojení sesterských chromatid a ty jsou následně separovány k opačným buněčným pólům. Nakonec vznikají celkem 4 haploidní buňky, gamety. Hlavní rozdíl mezi spermatogenezí a oogenezí, je v délce trvání kompletního dělení a v počtu zralých funkčních gamet. Zatímco u spermatogeneze dochází při dosažení pohlavní zralosti jedince k neustálému mitotickému dělení spermatogonií a jejich meiotickému dozrávání ve 4 funkční spermie, u oogeneze se mitotická fáze zastavuje ještě v intrauterinním vývoji a počet budoucích oocytů je tak jasně dán již od narození. Hlavním rozdílem u oogeneze je tzv. diktyotenní stádium, kdy se vývoj oocytů zastavuje v profázi prvního meiotického dělení a setrvává v tomto stavu až do doby pohlavní zralosti, kdy vlivem ovulace, respektive hormonů, dochází každý zhruba 28. den k dokončení prvního meiotického dělení a vzniku sekundárního oocytu a první polární buňky. Pokud je oocyt oplozen spermií, dochází k dokončení druhého meiotického dělení a ke vzniku zralého oplozeného oocytu a druhé polární buňky. Polární buňky se odlišují od oocytů pouze v množství cytoplasmy, které naprostá většina zůstává v oocytu. Oogenezí tak vzniká pouze jedna funkční gameta na rozdíl od 4 gamet vzniklých spermatogenezí. Existuje několik základních mechanizmů, které zapříčiňují vznik aneuploidních gamet (Obr. 9). Nondisjunkce, jakožto porucha segregace chromozomů v meióze I nebo chromatid 27
v meióze II, byla do nedávna považována za hlavního činitele (Hassold et al., 2007). Ovšem některé studie naznačovaly, že za vznik aneuploidních oocytů může předčasná segregace chromatid v meiózy I. Například již v roce 1991, doktorka Angellová pozorovala v karyotypu oocytů v metafázi meiózy II nadpočetné chromatidy a předpověděla tak, že předčasná segregace chromatid by mohla mít významnější vliv na vznik aneuploidních oocytů než prosazovaná teorie nondisjunkce celých chromozomů (Angell, 1991). Také studiem polárních buněk metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) byla zjištěna výrazně vyšší četnost chyb v segregaci chromatid (27,1%) oproti segregaci celých chromozomů (2,4%) v meióze I (Kuliev and Verlinsky, 2004). Průlom přišel až v letech 2011 a 2012, kdy analýzou oocytů a polárních buněk pomocí techniky aCGH bylo zjištěno, že předčasná segregace sesterských chromatid (PSSC) je výrazně častější než poruchy rozchodu celých chromozomů (Gabriel et al., 2011; Handyside et al., 2012).
28
Obrázek 9: Schématické zobrazení možných segregačních variant. Nondisjunkce celých chromozomů a předčasná segregace chromatid. Ve schématu nejsou zahrnuty reciproké varianty segregace. Červeně jsou označeny maternální chromozomy a modře chromozomy paternální. N: normální, L: ztráta chromozomu, G: zisk chromozomu, PB1: první polární buňka, PB2: druhá polární buňka (převzato a upraveno podle Handyside et al., 2012).
4.1.1 Monozomie Jestliže se v diploidní buňce nachází některý z chromozomů pouze jednou, hovoříme o monozomii (Obr. 10). Kromě monozomie chromozomu X (Turnerův syndrom) není žádný plod s monozomií životaschopný a dochází tedy ke spontánním abortům. Existuje několik mechanismů, kterými mohou tyto abnormality vznikat a to jak v prvním, tak i v druhém meiotickém dělení při tvorbě gamet (Obr. 9). Nondisjunkcí 29
homologních chromozomů v prvním dělení dochází ke ztrátě celého chromozomu. Předčasná segregace chromatid v prvním dělení vede k tvorbě jednochromatidové buňky, která ve druhém dělení dává vzniku jedné buňce monozomické. Nondisjunkce v meióze II také způsobuje vznik monozomické zygoty.
Obrázek 10: Karyotyp člověka s Turnerovým syndromem. 45, X (http://worms.zoology.wisc.edu).
4.1.2 Trizomie Vyskytuje-li se v buňce jeden chromozom nadbytečně, označujeme tento stav jako trizomie (Obr. 11). Trizomie chromozomů 21 (Downův syndrom), 18 (Edwardsův syndrom) a 13 (Patauův syndrom) jsou klasifikovány jako přežitelné, avšak pouze jedinci s trizomií 21 se dožívají dospělosti. Trizomie gonozomů XXY (Klinefelterův syndrom), XXX a XYY jsou také přežitelné a mnohdy svému nositeli nemusí způsobovat vážnější problémy a nebývají tak odhaleny, mají však negativní vliv na fertilitu. Při jiných autozomální trizomiích je velice vzácné přežití do postnatálního období. Dosud pouze několik publikací popisuje tyto případy (Brizot et al., 2001; Póvoa et al., 2008; Schinzel, 2001). Mechanizmus vzniku trizomií je obdobný jako v případě monozomií (Obr. 9), ovšem průběh je reciproký. 30
Obrázek 11: Karyotyp člověka (http://worms.zoology.wisc.edu).
s Downovým
syndromem.
47,
XX,
+21
4.2 Strukturní chromozomové abnormality Strukturní aberací nazýváme stav, kdy je určitým způsobem narušena vnitřní struktura chromozomu. Vznikají jako důsledek DSB ve vláknech DNA a následnou rekonstrukcí či nedokonalou reparací. K těmto dějům může docházet spontánně, vlivem vnějších faktorů vytvářejících DSB (např. ionizující záření), poruchou reparačních mechanizmů buňky nebo nedokonalým crossingoverem. Rozlišujeme dva základní typy chromozomových přestaveb a to balancované a nebalancované. Balancované strukturní změny nemusí pro buňku či jedince přenašeče představovat problém, protože je zachováno množství genetické informace v genomu. Ovšem představují hrozbu pro další generace z důvodu vysokého rizika tvorby nebalancovaných gamet. Jedinci nesoucí nebalancovanou aberaci mají ve svém genomu abnormální množství genetické informace, a to buď přebytečné (duplikace) či chybějící (delece). U těchto poruch většinou dochází k manifestaci ve fenotypu (Nussbaum et al., 2015). Dále můžeme tuto skupinu rozdělit podle charakteru přestavby do několika podskupin. Jsou to translokace, duplikace a delece.
31
4.2.1 Duplikace a delece Jak již bylo řečeno, delecí rozumíme absenci určité části chromozomu. Přenašeč delece je monozomický pro deletovaný úsek, takovému stavu říkáme parciální monozomie. Delece mohou vznikat prostým zlomem na ramenech chromozomu a ztrátou acentrického fragmentu při dělení, abnormální segregací balancovaných translokací (viz níže) nebo nerovnoměrným crossingoverem. Mezi nejznámější deleční syndromy patří např. syndrom kočičího křiku (del5p13), DiGeorgův syndrom (del22q11), Angelmanův a Pradel-Williho syndrom (del15q11-q13) nebo Azoospermie (mikrodelece na chromozomu Y) (Gardner et al., 2011). Duplikace, tedy zmnožení části chromozomu, vzniká společně s delecí při nerovnoměrném crossingoveru, kdy je na jednom chromozomu v bivalentu část zduplikována a na druhém chromozomu deletována. Obdobně jako delece může i duplikace vznikat abnormální segregací chromozomů z kvadrivalentu (Gardner et al., 2011; Nussbaum et al., 2015).
4.2.2 Translokace Translokace je vzájemná výměna segmentů mezi dvěma chromozomy. Rozlišujeme dva základní typy a to reciprokou a Robertsonskou translokaci. Reciproké translokace vznikají zlomy v ramenech nehomologních chromozomů a jejich vzájemnou výměnou. Nedochází tak ke změně v počtu chromozomů a množství genetického materiálu je zachováno. Většinou jsou zahrnuty pouze dva chromozomy, ale ve výjimečných případech byly pozorovány komplexní přestavby mezi více chromozomy (Hornak et al., 2014). Přibližně 1 člověk z 500 je přenašečem translokace (Jacobs et al., 1992). Mohou vznikat u jedince de novo nebo mohou být přenášeny na potomky i po mnoho generací (Koskinen et al., 1993). Při přenašečství translokace nastává problém v meióze, kdy může docházet k abnormální segregaci postižených chromozomů do gamet. V metafázi meiózy II se vytváří struktura zvaná kvadrivalent (Obr. 12). Jde o obdobu klasického bivalentu, avšak s tím 32
rozdílem, že jsou do sktruktury zahrnuty 4 chromozomy – dva normální a dva derivované (s translokací). Když meióza postupuje, 4 komponenty kvadrivalentu uvolní svá spojení s výjimkou terminálních částí chromozomů, což vytvoří prstencovou strukturu (Oliver-Bonet et al., 2005). Podle toho, jak se naváží dělící vřeténka na centromery kvadrivalentu, dochází k několika různým segregačním vzorcům. Pokud segregují vždy dva chromozomy do obou dceřiných buněk, označujeme tento typ segregace jako 2:2, dále pak odlišujeme segregační typy 3:1 a 4:0. Celkově rozlišujeme 8 základních segregačních vzorců, 3 možnosti typu 2:2, 4 možné rozchody typu 3:1 a 1 typu 4:0 (Tab. 1). Na
základě
toho,
jaké
chromozomy
z
kvadrivalentu
se
do
segregace
zapojují, rozlišujeme u segregace 2:2 tři základní typy. Prvním z nich je tzv. střídavá segregace, kdy do jedné dceřiné buňky segregují oba zdravé chromozomy a do druhé buňky chromozomy derivované. Druhým typem je tzv. segregace přilehlých segmentů typu I, kdy se rozestupuje vždy nehomologní dvojce normální/derivovaný chromozom. U segregace přilehlých segmentů typu II dochází k oddělení vždy homologních párů normální/derivovaný chromozom. V případě segregace 3:1 mohou vznikat terciální trizomie nebo monozomie a střídavá trizomie nebo monozomie. Pro lepší pochopení jsou segregační vzorce uvedeny v tabulce 1, písmena A, B, A‘ a B‘ odkazují na jednotlivé chromozomy kvadrivalentu na obrázku 12 (Gardner et al., 2011).
Obrázek 12: Kvadrivalent. Písmena A a B označují normální chromozomy a písmena A‘ a B‘ označují derivované chromozomy (Gardner et al., 2011).
33
Tabulka 1: Možné segregační vzorce chromozomů kvadrivalentu. Písmena A, B, A‘ a B‘ představují jednotlivé chromozomy z obrázku S (převzato a upraveno podle Gardner et al., 2011). První dceřiná buňka Segregace 2:2 AaB A a B‘ A a A‘ Segregace 3:1 A, B a A‘ A, B a B‘ A‘, B‘ a A A‘, B‘ a B Segregace 4:0 A, B, A‘, B‘
Druhá dceřiná buňka
Typ segregace
A‘ a B‘ B a A‘ B a B‘
Střídavá Přilehlých segmentů I Přilehlých segmentů II
B‘ A‘ B A
3:1 s terciální trizomií a monozomií 3:1 se střídavou trizomií a monozomií
---
Dvojitá trizomie a monozomie
V roce 1916 byla poprvé popsána translokace vzniklá fúzí dvou akrocentrických chromozomů. Podle svého objevitele byly tyto translokace pojmenovány Robertsonské. Existuje 5 lidských akrocentrických chromozomů: 13, 14, 15, 21 a 22 a všechny se mohou zapojovat do vzniku Robertsonských translokací. Známe tři možné mechanismy, kterými tyto translokace vznikají a to buď zlomy v centromerách, zlomem v krátkém raménku jednoho chromozomu a dlouhém raménku druhého chromozomu anebo zlomy v obou krátkých raméncích a následnou fúzí. První dvě cesty jsou spíše vzácné, většina známých Robertsonských translokací vzniká třetím mechanizmem (Guichaoua et al., 1986). Nejčastějším typem je rob(13q14q), která v populaci tvoří až 75%. Prevalence přenašečů v populaci je zhruba 1:1000 a pro rob(13q14q) je to 1:1300 (Gardner et al., 2011). Na rozdíl od translokací reciprokých existuje v tomto případě pouze 6 možných segregačních typů. Vznikají buď gamety normální, balancované, nulizomické nebo dizomické (Obr. 13).
34
Obrázek 13: Robertsonská translokace. Segregace chromozomů v meióze. (a) Trivalent v metafázi I, (b) normální gameta, (c) gameta s translokovanými chromozomy, (d) dizomická gameta, (e) nulizomická gameta (převzato a upraveno podle Gardner et al., 2011).
35
5. Cíle diplomové práce ● Detekce chromozomových abnormalit v biopsiích trofektodermu a blastomerách embryí párů, které podstoupily léčbu neplodnosti v klinice asistované reprodukce Sanatorium Repromeda Brno. ● Praktické zvládnutí metod aCGH 24Sure (Illumina®) a NGS VeriSeq™ (Illumina®). ● Statistické zhodnocení výskytu a charakteru chromozomových abnormalit v lidských IVF embryích. ● Porovnání výskytu aneuploidií u embryí rozdělených podle věku ženy do skupin do 30 let, od 30 do 38 let, a od 38 let. ● Detekce a statistické zhodnocení výskytu a charakteru nebalancovaných translokací u embryí, jejichž rodiče tuto translokaci přenáší. ● Srovnání frekvence abnormalit u biopsií trofektodermu a blastomer. ● Porovnání výhod a nevýhod metod aCGH a NGS pro PGS biopsií trofektodermu.
36
6. Materiál Pro vypracování této práce byla použita data získaná vyšetřením buněk trofektodermu blastocyst bioptovaných 5. a 6. den kultivace a dále vyšetřením blastomer bioptovaných 3. den kultivace. Buňky byly za sterilních podmínek odebrány pomocí mikromanipulátoru zkušeným embryologem. Po biopsii 3. den kultivace byla embrya nadále kultivována a 5. den transferována. Embrya po biopsii 5. a 6. den byla vitrifikována do doby transferu. Data z PGS byla sbírána v období od dubna roku 2012 do ledna roku 2016 v případě biopsií trofektodermu a od října roku 2010 do ledna roku 2016 v případě biopsií blastomer. V této době bylo celkově provedeno PGS u 4553 embryí od 958 párů podstupujících AS. Z toho bylo vyšetřeno 2791 biopsií trofektodermu a 1762 blastomer. Data z PGD reciprokých translokací byla sbírána v období od června roku 2012 do ledna 2016 v případě biopsií trofektodermu a od listopadu 2012 do ledna 2016 v případě biopsií blastomer. Počet vyšetřovaných translokací u embryí v rámci PGD byl 295 od celkem 48 párů. Z toho bylo 161 biopsií trofektodermu a 134 blastomer. V případě PGD Robertsonských translokací byla data sbírána od června roku 2012 do konce roku 2015. Celkově bylo analyzováno 151 biopsií embryí od 26 párů. Do doby amplifikace byly biopsie uchovávány při teplotě -80°C. Poté byla provedena celogenomová amplifikace metodou Sureplex™ a kontrola WGA proběhla pomocí elektroforézy na 2% agarózovém gelu. Následná vyšetření byla v rámci PGS u biopsií trofektodermu v 2348 případech provedena pomocí metody BAC aCGH 24Sure (Illumina®) a u 413 metodou NGS VeriSeq™ PGS (Illumina®). Typ použité metody u PGS blastomer a PGD translokací nemá pro účely této práce význam (viz níže).
37
7. Metody V postupu byl použit laminární box Erlab Captair Bio, termocyklér BIOER XP Cycler, centrifuga Eppendorf Centrifuge 5810 R, zařízení pro vizualizaci výsledků gelové elektroforézy UVIDOC HD5, třepačka Illumina® High-Speed Microplate Shaker, skener čipů PerkinElmer® ScanRi, fluorometr Qubit™, sekvenační platforma Illumina® MiSeq®.
7.1 Celogenomová amplifikace Prvním krokem protokolu byla WGA pomocí kitu Sureplex™ DNA Amplification System od firmy Illumina®, který byl vyvinut pro potřeby amplifikace DNA jediné buňky. Postup metody je rozdělen do 3 základních kroků, kdy se nejprve provádí lyze buněk a extrakce DNA, poté tzv. preamplifikace, při níž se pomocí částečně degenerovaných primerů přidávají specifické sekvence na konce amplikonů, a posledním krokem je PCR s univerzálními primery. Výsledné množství DNA je 2-5 μg s rovnoměrným zastoupením sekvencí celého genomu. To je nezbytné pro efektivní zhodnocení genetického profilu embrya. Celý protokol WGA byl proveden v laminárním boxu, který byl předem dekontaminován vysvícením UV lampou. Míchání reakčních směsí bylo upraveno podle počtu vyšetřovaných vzorků. V postupu jsou objemy reagencií ve směsích uvedeny pro jeden vzorek.
Postup: 1) Nejprve byla připravena směs ze 4 µl extrakčního pufru, 4,8 µl extrakčního ředícího pufru a 0,2 µl extrakčního enzymu. 9 µl takto připravené směsi bylo přidáno do mikrozkumavky obsahující 1 µl PBS s bioptovaným materiálem. Takto připravený extrakční mix byl vložen do termocykleru a poté byl spuštěn program pro extrakci (Tab. 2). Tabulka 2: Program pro extrakci DNA z buňky. Počet cyklů 1 1
Teplota (°C) 75 95
38
Čas 10 min 4 min
1
20
∞
2) Následně byl namíchán mix složený ze 4,8 µl preamplifikačního pufru a 0,2 µl preamplifikačního enzymu. 5 µl takto připravené směsi bylo přidáno ke vzorku, ten byl vložen do termocykleru a byl spuštěn program pro preamplifikaci (Tab. 3).
Tabulka 3: Program pro preamplifikaci vzorku. Počet cyklů 1
12
1
Teplota (°C) 95 95 15 25 35 65 75 4
Čas 2 min 15 s 50 s 40 s 30 s 40 s 40 s ∞
3) Posledním krokem bylo přidání 60 µl amplifikační směsi k preamplifikovanému vzorku. Tato směs obsahovala 34,2 µl vody, 25 µl amplifikačního pufru a 0,8 µl amplifikačního enzymu. Vzorek byl vložen do termocykleru a byl spuštěn program pro amplifikaci (Tab. 4).
Tabulka 4: Program pro amplifikaci. Počet cyklů 1 14
Teplota (°C) 95 95 65 75
Čas 2 min 15 s 1 min 1 min
Celý postup trval zhruba 2-3 hodiny.
7.2 Gelová elektroforéza Před analýzou vzorků byl produkt amplifikace zkontrolován pomocí elektroforézy (ELFO) na agarózovém gelu. Samotný gel byl připraven smícháním 1g agarózy s 50ml 0,5% TBE pufru a jeho zahříváním v mikrovlnné troubě do úplného rozpuštění. Do takto zahřátého 39
roztoku bylo přidáno 2,5 µl 1% ethidium bromidu, který umožňuje vizualizaci DNA na gelu pod UV světlem. Poté byl gel vylit do formy a do gelu byl vložen hřebínek pro tvorbu jamek. Takto se gel nechal zhruba půl hodiny tuhnout. Po ztuhnutí se gel ve formě přenesl do elektroforetického zařízení s TBE pufrem. Do jamek se nanesly produkty WGA společně s nanášecím pufrem a byla spuštěna elektroforéza. Po zhruba 15 minutách byl gen přenesen do zařízení pro vizualizaci elektroforetických gelů (Obr. 14). Po zkontrolování úspěšnosti amplifikace byly vzorky do doby vyšetření uloženy při -20°C.
Obrázek 14: Vizualizace produktu WGA na agarózovém gelu pomocí přístroje UVIDOC HD 5 (archiv genetické laboratoře Sanatoria Repromeda)
7.3 aCGH Pro vyšetření metodou aCGH byl využit systém 24sure Microarray (Illumina®) na přístroji ScanRI (PerkinElmer®).
7.3.1 Značení DNA Pro značení byl použit kit Fluorescent Labelling System
(Illumina®). DNA po
amplifikaci společně s kontrolní DNA je značena pomocí fluorochromů Cy3 a Cy5. Samotné vkládání značených nukleotidů do nově syntetizovaného vlákna probíhá pomocí Klenowova fragmentu nasedajícího na náhodné primery.
Postup: 1) Na ledu byl připraven PCR master mix podle tabulky 5. Objemy jsou uvedeny pro
1 vzorek. 40
Tabulka 5: Složení PCR master mixu. Reagencie Reakční pufr DTP značící mix Cy3 dCTP Cy5 dCTP Klenowův fragment
Mix Cy3 5 µl 5 µl 1 µl ---
Mix Cy5 5 µl 5 µl --1 µl
1 µl
1 µl
2) 8 µl DNA vzorků a kontrol bylo v PCR mikrozkumavkách smícháno s 5 µl
náhodných primerů. Vzorky byly denaturovány v termocykleru při 99 °C po dobu 5 minut a poté byly ihned přeneseny na led. 3) K takto denaturovaným vzorkům bylo přidáno 12 µl master mixu. Mix Cy3 pro
jednu polovinu vzorků a Cy5 pro druhou. Následně byly vzorky promíchány a centrifugovány. 4) Vzorky se nechaly inkubovat při 37 °C po dobu 2 hodin. 5) Po inkubaci byly vzorky Cy3 smíchány s Cy5 vždy do páru v 1,5 ml zkumavkách. 6) Do zkumavek bylo přidáno 25 µl lidské COT DNA (kompetitorová DNA pro
vyvázání repetitivních sekvencí). Vzorky byly zamíchány a poté byly vloženy do vakuové centrifugační odparky, kde probíhalo odpaření při 65 °C po dobu zhruba 30 minut. 7) Pelety byly resuspendovány ve 22 µl DS pufru a inkubovány při 75 °C po dobu
10 minut. Takto připravená směs byla připravena na hybridizaci.
7.3.2 Hybridizace Značená DNA resuspendovaná v DS pufru byla hybridizována na DNA čipy 24sure V3 (Illumina®).
Postup: 1) 18 µl značené DNA bylo ve formě kapičky naneseno na podložní sklo, které bylo poté překryto čipem. 2) Čipy byly umístěny do zvlhčených hybridizačních komůrek, které byly uzavřeny. 3) Komůrky s čipy byly přes noc inkubovány při teplotě 47 °C. 41
7.3.3 Vymytí nenavázané DNA Tento krok slouží k odmytí nenavázané nebo nespecificky navázané DNA z čipu. Využívá se 3 různě koncentrovaných roztoků SSC s Tweenem.
Postup: 1) Nejprve byly připraveny 3 vymývací roztoky. Roztok A byl 2x koncentrovaný SSC s 0,05% Tweenem, který byl rozdělen do dvou Wheatonových kyvet. Roztok B obsahoval 1x koncentrovaný SSC. Roztok C obsahoval 0,1x koncentrovaný SSC a byl rozdělen do dvou kyvet, z nichž jedna byla temperována na 60 °C. 2) Čip byl vložen do roztoku A, kde byly odstraněny krycí skla. 3) Poté byl čip přemístěn do druhé kyvety s roztokem A a zde byl vymýván po dobu 10 minut za stálého míchání. 4) Následovalo přemístění čipu do kyvety s roztokem B a opětovné míchání po dobu 10 minut. 5) Poté byl čip přesunut do roztoku C, který byl vytemperován na 60 °C a zde byl vymýván po dobu 5 minut. 6) Nakonec byl čip vymyt v roztoku C pokojové teploty a vysušen pomocí centrifugy.
7.3.4 Skenování čipů a analýza dat Skenování čipů bylo provedeno na skeneru ScanRI (PerkinElmer®) pomocí softwaru ScanRI. Hrubá data byla vyhodnocena pomocí softwaru BluFuse Multi (Illumina®) (Obr. 15, 16). Genetický profil embrya byl zhodnocen na základě log2 poměru fluorescence jednotlivých BAC klonů na čipu a hodnoty X-separace. Ta je určena na základě srovnání hladiny X chromozomu s mužskou a ženskou kontrolou.
42
Obrázek 15: Genetický profil euploidního embrya. Pohlaví embrya je XX. Výsledný graf vytvořený programem BlueFuse (archiv genetické laboratoře Sanatoria Repromeda)
Obrázek 16: Genetický profil embrya s trizomií chromozomů 11 a 12 a monozomií chromozomů 15 a 21. Pohlaví embrya je XY. Výsledný graf vytvořený programem BlueFuse (archiv genetické laboratoře Sanatoria Repromeda)
7.4 NGS Pro vyšetření metodou NGS byl použit kit VeriSeq™ PGS (Illumina®) obsahující oddělené kity VeriSeq™ PGS Library Preparation Kit, VeriSeq™ Index Kit – PGS a MiSeq® reagent Kit v3 – PGS. Sekvenování bylo provedeno na platformě MiSeq® (Illumina®). V jednom sekvenačním běhu bylo vyšetřeno celkem 24 vzorků. 43
7.4.1 Kvantifikace produktu WGA Ke kvantifikaci byl použit systém Qubit™ dsDNA HS Assay Kit a fluorometr Qubit™. Vstupní množství DNA do přípravy knihovny musí být rovnocenně 1 ng u každého vzorku.
Postup: 1) Nejprve byl fluorometr kalibrován pomocí dvou standardů, které jsou obsaženy v kitu. 10 µl každého standartu bylo přidáno k 190 µl pracovního roztoku a poté byly tyto směsi změřeny ve fluorometru. 2) Následně se přidalo 10 µl každého vzorku do 190 µl pracovního roztoku a jejich koncentrace byla změřena na fluorometru. 3) Na základě zjištěné koncentrace byla DNA vzorků naředěna na požadovanou koncentraci 0,2 ng/µl.
7.4.2 Tagmentace produktu WGA V tomto kroku je DNA fragmentována pomocí transpozomů. Ty souvisle fragmentují amplikony a na jejich konce přidávají adaptérové sekvence, které umožňují následnou PCR.
Postup: 1) Do PCR destičky bylo přidáno 10 µl TD tagmentačního DNA pufru pro každý vzorek. 2) K pufru bylo přidáno 5 µl ATM tagmentačního mixu. 3) Následně se do jamek s mixem přidalo 5 µl vzorku o koncentraci 0,2 ng/µl. 4) Směs byla homogenizována vortexem a poté byla PCR destička vložena do termocykleru. 5) V termocykleru probíhala tagmentace 5 min při 55 °C a poté byla destička vychlazena na 10 °C. 6) Dalším krokem bylo zastavení tagmentace přidáním 5 µl neutralizačního NT pufru do každé jamky se vzorkem a několikerým nasátím pipety byla směs promíchána. 44
7.4.3 PCR V tomto kroku je tagmentovaná DNA amplifikována pomocí primerů, které na konce amplikonů přidávají indexy 1 (i7) a 2 (i5) a sekvence nutné pro navázání na povrch sekvenační destičky. Kombinace indexů je unikátní pro každý vyšetřovaný vzorek.
Postup: 1) K jednotlivým vzorkům na PCR destičce byla přidána specifická kombinace dvou indexů i7 a i5 vždy po 5 µl. 2) Poté bylo do těchto pozic přidáno 15 µl PCR mixu (NPM). 3) Celá destička byla vortexována a centrifugována. 4) Poté byla destička umístěna do termocykleru a byl zapnut program index PCR (Tab. 6). Tabulka 6: Program pro PCR. Počet cyklů 1 1 12 1 1
Teplota (°C) 72 95 95 55 72 72 4
Čas 3 min 30 s 10 s 30 s 30 s 5 min ∞
7.4.4 Přečištění knihovny V tomto kroku jsou použity magnetické mikro kuličky AMPure XP, které umožňují selekci fragmentů požadované délky a odstraňují nevyužité primery po PCR.
Postup: 1) Nejprve byl roztok s kuličkami homogenizován vortexováním. 2) Poté bylo přidáno 45 µl roztoku AMPure XP ke každému vzorku na PCR destičce a směs byla promíchána několikerým nasátím pipetou. 3) Následně byla destička inkubována 5 minut při pokojové teplotě. 45
4) Poté byla přenesena na magnetický stojánek, kde zůstala umístěna zhruba 2 minuty, dokud nebyl supernatant čirý. 5) V dalším kroku byl supernatant odsát a do každé bylo přidáno 200 µl čerstvě připraveného 80% etanolu. 6) PCR destička byla inkubována na magnetickém stojánku zhruba 30 vteřin a následně byl supernatant odebrán. 7) Následovalo druhé vymytí pomocí 200 µl etanolu a inkubace 30 vteřin. 8) Poté byl veškerý etanol odstraněn a jamky s kuličkami se nechaly vysušit při pokojové teplotě. 9) V dalším kroku byla PCR destička odebrána z magnetického stojánku a do každé jamky bylo přidáno 50 µl pufru pro resuspenzi (RSB), směs byla promíchána několikerým nasátím pipetou a destička byla centrifugována. 10) Nakonec se PCR destička umístila na magnetický stojánek a zhruba po 2 minutách bylo 45 µl supernatantu přesunuto do čisté PCR destičky.
7.4.5 Normalizace knihovny Normalizace se provádí za účelem rovnoměrného zastoupení knihoven v sekvenační reakci. K tomu byly použity normalizační mikrokuličky LNB1.
Postup: 1) Nejprve byla namíchána směs 1,1 ml normalizačního aditiva LNA1 a 200 µl normalizačních mikrokuliček LNB1 do 15 ml zkumavky a poté byla promíchána pipetou. 2) Následně byl tento mix pomocí automatické pipety přenesen do jamek normalizační destičky. 3) Do jamek destičky se směsí bylo přidáno 20 µl přečištěného PCR produktu a destička byla vortexována 30 minut při 1800 rpm. 4) Poté byla destička umístěna na magnetický stojánek na dobu zhruba 2 minuty, dokud se supernatant nevyčeřil. 5) Po vyčeření byl supernatant odstraněn a do jamek destičky bylo přidáno 45 µl normalizačního vymývacího roztoku LNW1. 6) Destička byla vortexována 5 minut při 1800 rmp a centrifugována. 46
7) Poté byla destička opět umístěna na magnetický stojánek a krok 4 – 6 byl zopakován. 8) Dále byl odsát supernatant a do jamek destičky bylo přidáno 30 µl 0,1 N NaOH. 9) Destička byla vortexována 5 minut při 1800 rpm a centrifugována. 10) Následně byla destička umístěna na magnetický stojánek a zde byla inkubována 2 minuty při pokojové teplotě. 11) Mezi tím bylo do čisté PCR destičky přidáno 25 µl pufru LNS1, do kterého byl přesunut čirý supernatant z destičky na magnetickém stojánku. 12) PCR destička byla nakonec zvortexována a centrifugována.
7.4.6 Smíchání knihoven a vnesení vzorků do přístroje MiSeq® Postup: 1) 5 µl každého jednotlivého vzorku z destičky bylo smícháno v jedné zkumavce. 2) Ze vzniklé směsi bylo odebráno 10 - 15 µl a přeneseno do čisté PCR zkumavky. 3) Následně bylo k této směsi přidáno 85 – 90 µl (celkový objem 100 µl) hybridizačního pufru HT1. 4) Směs byla zvortexována a centrifugována a následně byla umístěna do termocykleru, kde byl zapnut program 96 °C 3 min a 4 °C 5 minut. 5) Veškerý obsah PCR zkumavky byl poté přenesen do zkumavky obsahující 600 µl HT1. 6) Nakonec byla směs promíchána a nanesena do příslušné pozice sekvenační kazety, která byla umístěna do přístroje MiSeq® společně se sekvenační průtokovou destičkou.
7.4.7 Sekvenování a analýza dat Sekvenování probíhalo v přístroji MiSeq® (Illumina®). Hrubá data byla vyhodnocena pomocí softwaru BlueFuse Multi (Illumina®). Genetický profil embrya (Obr. 17 a 18) byl zhodnocen na základě počtu kopií jednotlivých binů a jejich vzájemným porovnáním. V případě nulizomie je počet čtení specifických sekvencí binu nulové a příslušný bin tedy není detekován. U monozomie je počet čtení sekvencí binu poloviční oproti oblastem genomu 47
vyskytujících se ve dvou kopiích (poměr 1:2). V případě trizomie je pak počet čtení sekvencí binu zhruba o třetinu vyšší (poměr 3:2).
Obrázek 17: Genetický profil euploidního embrya. Pohlaví embrya je XX. Výsledný graf vytvořený programem BlueFuse (archiv genetické laboratoře Sanatoria Repromeda)
Obrázek 18: Genetický profil embrya s nebalancovaným rozchodem translokace t(5;7) a monozomií chromozomu 16. Chromozomy 5 a 7 mají navzájem translokované koncové části p ramena (bílé šipky). U tohoto embrya se nachází koncová část chromozomu 5 3x (2x normální a 1x translokovaná na chromozomu 7) a chromozomu 7 pouze 1x. Pohlaví embrya je XY (archiv genetické laboratoře Sanatoria Repromeda).
48
7.5 Statistická analýza dat Pro výpočet jednotlivých statistických ukazatelů byl použit program Microsoft ExcelTM. Jednotlivá embrya byla rozdělena do tabulek podle typu biopsie (trofektoderm, blastomery) a typu vyšetření (PGS, PGD). V případě PGS analýz bylo u každého embrya uvedeno rodné číslo ženy, věk ženy v době odběru oocytu, úspěšnost celogenomové amplifikace, pohlaví embrya, typ genetických abnormalit, změny na konkrétních chromozomech a typ vyšetřovací metody. V případě PGD reciprokých translokací bylo u embryí uvedeno rodné číslo ženy, věk ženy v době odběru oocytu, úspěšnost celogenomové amplifikace, informaci zda translokaci v páru přenášel muž či žena, typ rozchodu z kvadrivalentu do oocytu a jiné chromozomové abnormality. U PGD Robertsonských translokací bylo uvedeno rodné číslo ženy, věk ženy v době odběru oocytu, úspěšnost celogenomové amplifikace, informaci zda translokaci v páru přenášel muž či žena a charakter chromozomových abnormalit. Ke statistickému zhodnocení významnosti rozdílů mezi daty byl použit Fisherův exaktní testu a t-test, při hodnotě P<0,05 byl rozdíl dvou hodnot vyhodnocen jako statisticky významný.
49
8. Výsledky 8.1 Detekce chromozomových abnormalit V rámci PGS prováděným vyšetřením biopsií trofektodermu bylo vyšetřeno 2791 biopsií od celkem 627 párů (průměrný věk ženy 33 let) podstupující léčbu neplodnosti. WGA proběhla úspěšně v 2761 případech (99 %). Jako euploidní bylo klasifikováno 56,4 % (1556) embryí a u 43,6 % (1205) embryí byla nalezena chromozomová aberace. Dále bylo vyšetřeno 1762 biopsií blastomer od celkově 331 párů (průměrný věk ženy 34 let). WGA proběhla úspěšně u 1710 biopsií (97 %) z celkově 1762. Chromozomová aberace byla detekována v 62 % případů (1060). V rámci PGD reciprokých translokací bylo vyšetřeno 160 biopsií trofektodermu od 27 párů. WGA proběhla úspěšně u všech biopsií. Chromozomová aberace (nebalancované rozchody, aneuploidie všech chromozomů) byla nalezena v 80 % případů (129). Dále bylo v rámci PGD reciprokých translokací vyšetřeno 133 blastomer od celkově 21 párů. WGA byla úspěšná ve 122 případech (92 %) z celkově 133. Chromozomová aberace byla nalezena v 86 % případů (105). V rámci PGD Robertsonských translokací bylo celkově vyšetřeno 151 biopsií od 26 párů. WGA proběhla úspěšně u 145 biopsií (39 %). Chromozomová aberace byla nalezena u 82 biopsií (57 %). Procentuální zastoupení aberací v biopsiích embryí shrnuje graf 1.
50
Graf 1: Procentuální zastoupení chromozomově normálních a abnormálních embryí v rámci PGS u trofektodermu a blastomer, PGD reciprokých translokací u trofektodermu a blastomer a PGD Robertsonských translokací.
Frekvence aberací u embryí v rámci PGS a PGD 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% PGS trofektoderm (n=2762)
PGS blastomery (n=1710)
PGD reciprokých PGD reciprokých PGD Robertsonských translokací translokací translokací (n=145) trofektoderm (=160) blastomery (n=122)
Normální
Abnormální
8.2 Statistické zhodnocení výsledků PGS Jednotlivá embrya byla rozdělena do několika skupin podle typu a počtu analyzovaných chr. abnormalit a) 1 monozomie, b) 1 trizomie, c) kombinace 2 aneuploidií, d) 3 a více aneuploidií (dále označovány jako komplexní), e) segmentální aneuploidie a aneuploidie vyskytující se v mozaice (dále označovány jako jiné). Abnormality jednotlivých chromozomů, tedy jejich zapojení do aneuploidií, byly v rámci PGS statisticky vyhodnoceny u embryí obsahujících aberaci 1 – 2 chromozomů (skupiny a, b, c). Komplexní změny (3 a více) v počtu chromozomů nebyly do statistiky zahrnuty. Do statistiky nebyly zahrnuty také aberace vyskytujícíc se v mozaice a aberace segmentální. Tato skupina chyb byla ve statistickém vyhodnocení označena jako „jiné“. Toto číslo odráží pouze samostatně se vyskytující aberace tohoto typu, pokud se vyskytovaly v kombinaci s jinou aneuploidií, byly ignorovány.
51
8.2.1 PGS trofektoderm Během PGS prováděným vyšetřením biopsií trofektodermu bylo identifikováno 1205 (43,6%) aneuploidních embryí. Z toho 333 (12,1% z celku) embryí bylo postiženo jednou monozomií, 238 (8,6%) embryí jednou trizomií, 119 (4,3%) embryí přenášelo kombinaci dvou aneuploidií, 100 (3,6%) embryí bylo postiženo komplexními změnami a zbylých 415 embryí neslo jinou změnu (chyby v mozaice, segmentální aneuploidie) (Graf 2). Graf 2: Frekvence a charakter chromozomových abnormalit v biopsiích trofektodermu.
Zastoupení a charakter aberací - PGS trofektoderm Jiné 15%
Komplexní 4% 2 aneuploidie 4% Trizomie 9%
Euploidní 56%
Monozomie 12%
Monozomie i trizomie se nejčastěji vyskytovaly u chromozomů 15, 16, 21, 22 a X/Y. U jednotlivých gonozomů byly detekovány pouze zisky, ztráty byly uvedeny společně pro oba chromozomy. Celkové zastoupení početních změn u jednotlivých chromozomů je zobrazeno v grafu 3.
52
Graf 3: Procentuální zastoupení ztrát a zisků jednotlivých chromozomů v biopsiích trofektodermu.
Zapojení jednotlivých chromozomů v aberacích - PGS trofektoderm 70 60 50 40 30 20 10 0 X/Y X
Y
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
zisk
ztráta
8.2.2 PGS blastomery Během PGS prováděným vyšetřením biopsií blastomer bylo identifikováno 1060 (62%) aneuploidních embryí. Z toho u 177 (10% z celku) embryí byla detekována jedna monozomie, u 120 (7%) embryí jedna trizomie, 121 (7%) embryí přenášelo kombinaci dvou aneuploidií, 463 (27%) embryí bylo postiženo komplexními změnami a zbylých 179 embryí neslo jinou změnu (aneuploidie v mozaice, segmentální aneuploidie) (Graf 4)
53
Graf 4: Frekvence a charakter chromozomových abnormalit v biopsiích blastomer.
Zastoupení a charakter aberací - PGS blastomery Jiné 11%
Euploidní 38% Komplexní 27%
2 aneuploidie 7%
Trizomie 7%
Monozomie 10%
Výrazně častěji se vyskytovaly monozomie a to především chromozomů 16 a 21. Nejčastěji byly zapojeny chromozomy 14, 15, 16, 22 a pohlavní chromozomy. Celkové zastoupení početních změn jednotlivých chromozomů je zobrazeno v grafu 5. Graf 5: Zastoupení ztrát a zisků jednotlivých chromozomů v biopsiích blastomer.
Zapojení jednotlivých chromozomů v aberacích - PGS blastomery 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 X/Y X
Y
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
zisk
54
ztráta
8.3 Porovnání frekvence a charakteru chromozomových abnormalit u embryí v závislosti na věku ženy. V rámci analýzy vlivu věku ženy na frekvenci aberací u embryí byly jednotlivé biopsie rozděleny do 3 skupin podle věku ženy a to do 30, od 30 do 38 a od 38 let. Do této statistiky byly zahrnuty monozomie, trizomie, 2 aneuploidie a komplexní změny. Průměrný věk ženy na embryo byl u biopsií trofektodermu 33 let a u biopsií blastomer 34 let.
8.3.1 PGS trofektodermu Ve skupině do 30 let bylo celkem detekováno 72 (11 %) monozomií, 37 (5 %) trizomií, 16 (2 %) případů se dvěma aneuploidiemi a 14 (2 %) komplexních změn z celkového počtu 683 biopsií. Ve skupině od 30 do 38 let bylo detekováno 209 (12 %) monozomií, 157 (9 %) trizomií, 72 (4 %) případů se dvěma aneuploidiemi a 54 (3 %) komplexních změn z celkového počtu 1730 biopsií. Ve třetí skupině od 38 let bylo detekováno 52 (15 %) monozomií, 44 (13 %) trizomií, 31 (9 %) případů se dvěma aneuploidiemi a 32 (9 %) komplexních aberací z celkem 348 biopsií. Procentuální zastoupení jednotlivých typů aberací a celkové množství chyb meiotického původu u všech skupin je shrnuto v grafu 6.
55
Graf 6: Frekvence chromozomových aberací u biopsií trofektodermu v závislosti na věku ženy (* p<0,05; ** p<0,001).
Závislost věku matky a frekvence aneuploidií u embryí - PGS trofektoderm 50 45 40 35
%
30
do 30 let
25 20
30-38 let
15
od 38 let
10 5 0 Trizomie
Monozomie
2 aneuploidie
Komplexní
Aneuploidní celkem
8.3.2 PGS blastomer Ve skupině do 30 let bylo celkem detekováno 30 (8 %) monozomií, 14 (4 %) trizomií, 12 (3 %) případů se dvěma aneuploidiemi a 99 (28 %) komplexních změn z celkového počtu 360 biopsií. Ve skupině od 30 do 38 let bylo detekováno 120 (11 %) monozomií, 77 (7 %) trizomií, 72 (7 %) případů se dvěma aneuploidiemi a 258 (25 %) komplexních změn z celkového počtu 1044 biopsií. Ve třetí skupině od 38 let bylo detekováno 27 (9 %) monozomií, 29 (9 %) trizomií, 37 (12 %) případů se dvěma aneuploidiemi a 106 (35 %) komplexních aberací z celkem 306 biopsií. Procentuální zastoupení jednotlivých typů aberací a celkové zastoupení chyb meiotického původu u všech skupin je shrnuto v grafu 7.
56
Graf 7: Frekvence chromozomových aberací u biopsií blastomer v závislosti na věku ženy. (* p<0,05; ** p<0,001).
Závislost věku matky a frekvence aneuploidií u embryí - PGS blastomery 70 60 50 40
%
do 30 let
30
30-38 let
20
od 38 let
10 0 Trizomie
Monozomie
2 aneuploidie
Komplexní
Aneuploidní celkem
8.4 Srovnání frekvencí detekovaných aberací metodami aCGH 24sureTM a NGS VeriSeq™ Celkově bylo metodou aCGH 24sure (Illumina®) vyšetřeno 2348 biopsií trofektodermu a metodou NGS VeriSeq™ (Illumina®) 413 biopsií trofektodermu. Množství detekovaných aberací a aberací v mozaice u biopsií trofektodermu se lišilo v závislosti na použité metodě. Metodou NGS bylo detekováno přibližně 44 % euploidních embryí a metodou aCGH přibližně 49 % (Graf 8).
57
Graf 8: Množství detekovaných aberací a aberací v mozaice metodami NGS a aCGH u biopsií trofektodermu.
Srovnání frekvence detekovaných aberací u použitých metod
NGS
aCGH
0%
10%
20%
30%
40%
Euploidní
50% Mozaicistní
60%
70%
80%
90%
100%
Aneuploidní
Celkový počet detekovaných chromozomových abnormalit v mozaice byl u metody NGS přibližně 2x vyšší než při použití metody aCGH (Graf 9). Graf 9: Výskyt mozaicistních embryí v závislosti na použité technologii. (** P<0,001).
Podíl embryí s aberací v mozaice Mozaicistní embrya
30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% NGS
aCGH
Metoda
Časová náročnost obou metod je přibližně 12 hodin od počátku amplifikace do získání výsledků analýzy. Počet vzorků, které lze vyšetřit v jednom běhu je u NGS VeriSeq™ 24 a u aCGH 24Sure™ je to 28 + 4 kontrolní vzorky v jednom kitu. Metoda aCGH ovšem není kapacitně nijak omezená a tudíž je možné použít různé množství čipů. 58
8.5 Detekce a statistické vyhodnocení segregačních variant translokací u embryí. Celkově bylo v rámci PGD reciprokých translokací vyšetřeno 282 biopsií embryí. Z toho 160 bylo biopsií trofektodermu a 122 biopsií blastomer. U každé biopsie byl analyzován typ rozchodu kvadrivalentu. Celkem byla u 95 (34 %) biopsií detekována segregace přilehlých segmentů typu I, u 39 (14 %) biopsií segregace přilehlých segmentů typu II a u 12 (4 %) biopsií některá z možných segregací typu 3:1. Segregační typ 4:0 nebyl detekován ani v jednom případě. Zbylá embrya (136, 48 %) nesla chromozomy normální nebo s balancovanou translokací (segregace střídavá). (Graf. 10). Graf 10: Celkové zastoupení segregačních variant chromozomů z kvadrivalentu u embryí.
Celkové zastoupení segregačních variant - PGD reciprokých translokací
2:2 přilehlých segmentů I 34% Střídavá 48%
2:2 přilehlých segmentů II 14%
3:1 4%
Následně byla data rozdělena do dvou podskupin podle toho, zda translokaci přenášel muž či žena. Pokud byl přenašečem translokace muž, bylo detekováno 91 (54 %) zdravých či balancovaných embryí, 53 (32 %) embryí s nebalancovanou formou segregační varianty 2:2 přilehlých segmentů typu I, 20 (12 %) s variantou 2:2 přilehlých segmentů typu II a 1 (1 %) embryo s variantou 3:1. Pokud byla přenašečem žena, zdravých a balancovaných forem bylo 44 (38 %), 2:2 typu I bylo 42 (37 %), 2:2 typu II 19 (17 %) a s variantou 3:1 11 (10 %). 59
Metodami aCGH a NGS nelze odhalit balancované přestavby, jelikož není změněno absolutní množství DNA v buňce. Procentuální zastoupení jednotlivých typů rozchodů u embryí je zobrazeno v grafu 11.
Graf 11: Procentuální zastoupení typů segregace kvadrivalentu v závislosti na pohlaví přenašeče translokace (* p<0,05; ** p<0,001).
Podíl segregačních variant kvadrivalentu v závislosti na pohlaví přenašeče 60 50
%
40 30 20 10 0 2:2 přilehlých segmentů I 2:2 přilehlých segmentů II muži
3:1
Střídavá
ženy
Dále byla embrya rozdělena do 4 skupin podle toho, jaký typ segregace kvadrivalentu přenášela a zda přenášela jinou aberaci chromozomů, které nebyly zapojeny do translokace. Tyto skupiny jsou balancované euploidní, nebalancované euploidní, balancované aneuploidní a
nebalancované
aneuploidní.
Termíny
euploidní/aneuploidní
se
vztahují
pouze
k netranslokovaným chromozomům. Procentuální zastoupení jednotlivých skupin u obou typů biopsií je zobrazeno v grafech 12 a 13.
60
Graf 12: PGD reciprokých translokací: zastoupení a charakter aberací u biopsií trofektodermu.
Frekvence a charakter aberací - PGD reciprokých translokací trofektoderm Nebalancované aneuploidní 21%
Balancované euploidní 19%
Balancované aneuploidní 22%
Nebalancované euploidní 38%
Graf 13: PGD reciprokých translokací: zastoupení a charakter aberací u biopsií blastomer.
Frekvence a charakter aberací - PGD reciprokých translokací blastomery Balancované euploidní 14%
Nebalancované aneuploidní 24%
Balancované aneuploidní 42%
Nebalancované euploidní 20%
Dále bylo vyšetřeno 145 biopsií embryí v rámci PGD Robertsonských translokací. 63 (43%) biopsií bylo klasifikováno jako euploidní, 27 (19%) neslo aneuploidii způsobenou nebalancovaným rozchodem chromozomů z trivalentu a zbylých 55 (38%) biopsií neslo jinou aberaci bez vztahu k translokovanými chromozomům (Graf 14). 61
Graf 14: PGD Robertsonských translokací: zastoupení a charakter aberací u embryí.
Frekvence a charakter aberací - PGD Robertsonských translokací Nebalancované 19%
Euploidní 43%
Aneuploidie bez vztahu k translokaci 38%
Translokace rob(13q14q) byly zastoupeny nejčastěji a to v počtu 97 (67 %) ostatní typy Robertsonských translokací byly zastoupeny v počtu 48 (33 %). Embrya byla dále rozdělena podle toho, zda translokaci v páru přenášel muž či žena. V souboru bylo 84 embryí mužů přenašečů a z toho 11 (13 %) embryí neslo nebalancovaný rozchod. Párům, kde přenašečem byla žena, patřilo 61 embryí a z toho 16 (26 %) neslo nebalancovanou formu rozchodu (Graf 15).
62
Graf 15: Frekvence nebalancovaných rozchodů z trivalentu v závislosti na pohlaví přenašeče Robertsonské translokace. (* P<0,05)
Frekvence nebalancovaných rozchodů v závislosti na pohlaví přenašeče 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% muži
ženy
63
9. Diskuze 9.1 Frekvence a charakter chromozomových abnormalit U PGS prováděného vyšetřením biopsie trofektodermu činila celková frekvence aneuploidií 44 %, 15 % embryí bylo postiženo segmentálními aneuploidiemi nebo aneuploidiemi v mozaice, 12 % jednou monozomií, 9 % jednou trizomií, 4 % kombinací dvou aneuploidií a 4 % komplexními změnami. Průměrný věk ženy vztažený na jednotlivá embrya byl 33 let. U biopsií blastomer byla frekvence aneuploidních embryí 62 %, 11 % byly segmentální aneuploidie a aberace v mozaice, 10 % byly monozomie, 7 % trizomie, 7 % kombinace dvou aneuploidií a 27 % byly komplexní změny. Průměrný věk činil 34 let. Adlerová a spol. analyzovali 936 biopsií blastomer metodou aCGH (průměrným věk ženy 38 let) a detekovali 69 % aneuploidních embryí. Dále analyzovali 667 biopsií trofektodermu průměrného věku 39 let a chromozomovou aberaci detekovali u 53 % (Adler et al., 2014). Gutiérrez-Mateo a kol. ve své studii dospěli k 63 % aneuploidních blastomer (metodou aCGH) při průměrném věku 37 let (Gutiérrez-Mateo et al., 2011). Fragouli a Wells analyzovali data několika studií a u celkově 1290 biopsií trofektodermu detekovali 56 % aneuploidních embryí (průměrný věk ženy byl 38 let) (Fragouli and Wells, 2011). Srovnáme-li naše výsledky PGS u biopsií blastomer, procentuální zastoupení detekovaných aneuploidií zcela odpovídá citovaným studiím, vezmeme-li v úvahu vyšší věkové průměry v jednotlivých studiích. Avšak porovnáme-li naše výsledky PGS u biopsií trofektodermu se studiemi Adlerové a Fragouliho s Wellsem, pozorujeme výrazně nižší frekvenci výskytu aneuploidií (44 % oproti 53 % a 56 %). To je zřejmě způsobeno v našem případě významně nižším průměrným věkem žen (33 let oproti 39 respektive 38 let). V této práci a i v pracích citovaných výše pozorujeme signifikantní rozdíl ve frekvenci detekovaných aneuploidií u biopsií blastomer a trofektodermu (P<0.001). Zajímavým aspektem tohoto srovnání je charakter aneuploidií u obou supin. Zatímco u trofektodermu jsme v rámci skupin s trizomií, monozomií a dvěmi aneuploidie detekovali zhruba srovnatelné množství monozomií a trizomií (53 % a 47 %), u blastomer registrujeme výrazně vyšší frekvenci monozomií (60 %) oproti trizomiím (40 %) (P<0,001). Tato skutečnost je ve shodě s jinými analýzami, kdy bylo detekováno více monozomií než trizomií v raných fázích embryonálního vývoje (Márquez et al., 2000; Munné et al., 2004) a srovnatelné množství u 64
trofektodermu (Fragouli and Wells, 2011; Handyside et al., 2012). Dále jsme u biopsií blastomer detekovali výrazně vyšší frekvenci výskytu komplexních změn (27 %) oproti biopsiím 5. den kultivace (4 %) (P<0,001). Toto zjištění je taktéž v souladu s výsledky jiných studií (McCoy et al., 2015). Z dat je zřejmé, že při kultivaci in vitro dochází k určité selekci proti aneuploidním embryí v raných fázích vývoje. Vzhledem k významným rozdílům mezi množstvím monozomií u obou skupin biopsií se dá usuzovat, že embrya postižena tímto typem aberace prochází výraznější selekcí a zastavují svůj vývoj velmi záhy v porovnání s embryi trizomickými. To vede k vyvážení zastoupení obou typů aberací v embryích pokročilejšího stádia vývoje. Stejným selekčním mechanizmem by se dalo vysvětlit výrazné snížení embryí s komplexními aneuploidiemi u biopsií 5. den kultivace. Dalším neméně významným procesem způsobujícím snížení frekvence aneuploidií při prodloužené kultivaci je negativní selekce aneuploidních buněk u mozaicistních embryí (Magli et al., 2000; Northrop et al., 2010). Některé studie uvádějí, že až 73 % embryí v raných fázích vývoje je mozaicistních (van Echten-Arends et al., 2011). Otázkou zůstává, jakým mechanismem nejčastěji dochází k missegregaci chromozomů či chromatid v meióze. Jak již bylo řečeno, existuje několik typů segregačních modelů vedoucích ke vzniku aneuploidního embrya. Metoda aCGH pomohla odhalit, že zhruba 97 % aneuploidií je způsobeno předčasnou segregací sesterských chromatid (PSSC) v meióze 1 a pouze zhruba 3 % nondisjunkcí chromozomů (Gabriel et al., 2011; Handyside et al., 2012). Nedávná studie kombinující vyšetření obou polárních buněk, oocytů a embryí pomocí metody karyomapping odhalila, že ve většině případů, kdy byl v PB1 detekován normální počet chromatid, byly tyto chromatidy nesesterské. 77 % těchto případů vedlo k normálnímu rozdělení v meióze 2 a vzniku euploidního oocytu, ale 23 % vedlo k chybné segregaci a vzniku dizomického či nulizomického oocytu. Tento mechanizmus je označován jako reverzní segregace. Dále bylo zjištěno, že při selhání vícenásobného crossingoveru v meióze 1 zahrnující všechny chromatidy homologních chromozomů, docházelo v případě rozchodu chromatid v meióze 2 k neočekávané preferenci distribuce nerekombinantní chromatidy do PB2. Reverzní segregace byla pozorována zhruba 100 x častěji, než je teoretická pravděpodobnost současného vzniku dvou nezávislých PSSC. Metodou aCGH nebylo dříve možné odhalit tento nový segregační model a odlišit jej od PSSC (Ottolini et al., 2015). Podíváme-li se na míru zapojení jednotlivých chromozomů v aneuploidiích, u obou typů biopsií pozorujeme nekonzistentní rozložení. Obecně převažují změny u chromozomů 65
15, 16, 21, 22 a pohlavních chromozomů, což je ve shodě s jinými studiemi (Fragouli a Wells, 2011; Handyside et al., 2012; Kuliev et al., 2011). Tento jev by se dal teoreticky vysvětlit na základě znalostí meiózy a pravidel segregace chromozomů a chromatid. Existuje několik popsaných mechanizmů, které mají majoritní vliv na tvorbu aneuploidií. Jedním z nich je například porucha tvorby chiasmat mezi homologními chromozomy v bivalentu, které mají dvě základní funkce a to rekombinaci, a udržení homologních chromozomů v bivalentu. Druhým je odbourávání kohesinové vazby držící pohromadě sesterské chromatidy. Oba typy struktur jsou důležité pro tvorbu tenze při navázání dělících vřetének opačných pólů na kinetochory, což vede ke správné segregaci chromozomů či chromatid (Page a Hawley, 2003). Některé studie ukazují, že až u 30 % maternálně způsobených trizomií chromozomu 21 došlo k poruše tvorby crossingoveru. Jak bylo zjištěno, poloha crossingoveru na chromozomu může mít vliv na jeho citlivost k missegregacím. Výrazně častěji byly detekovány trizomie chromozomu 21, u kterých proběhl jediný crossingover v blízkosti telomery, a také v případě, kdy proběhl pericentromericky (Oliver et al., 2012, 2008). V případě telomerických crossingoverů zřejmě dochází k jejich ztrátám a tím oslabení spojení homologních chromozomů. Pericentromerické synapse by mohly určitým způsobem oslabovat centromerické kohesinové vazby a tím zvyšovat náchylnost chromatid k missegregaci. Tato teorie odpovídá skutečnosti, že pericentromerické crossingovery jsou častější u aneuploidních oocytů žen vyššího věku (Oliver et al., 2012). Jestliže je poloha překřížení na chromozomu klíčová pro správnou funkci synapsí, můžeme předpokládat, že čím menší je chromozom, tím větší je pravděpodobnost vzniku crossingoveru v blízkosti telomery či centromery a tím častěji bude docházet chybné segregaci těchto chromozomů. Dalším mechanizmem, který může mít vliv na častější vznik aneuploidií u menších chromozomů je porušení kohesinových vazeb. Ty jsou s rostoucím věkem matky odbourávány, což způsobuje věkově závislý vznik aneuploidií u oocytů. Podrobněji se touto souvislostí zabývám v následující podkapitole. Obecně bychom však mohli říct, že jestliže je se s věkem snižuje množství a kvalita kohesinů, jako první budou postiženy právě malé chromozomy. Jinou zajímavou otázkou je vliv hormonální stimulace na frekvenci aneuploidií u žen podstupující léčbu neplodnosti. Studie na myších oocytech odhalila, že zvýšená hormonální stimulace pomocí FSH zrychluje dozrávání oocytů a zvyšuje frekvenci vzniku aneuploidií (Roberts et al., 2005). Jiná studie prokázala, že u žen s nižší přirozenou ovariální rezervou,
66
které v rámci hormonální stimulace přijímaly vyšší dávky FSH, je výskyt aneuploidií výrazně častější, než u žen s vyšší ovariální rezervou (Katz-Jaffe et al., 2013).
9.2 Závislost věku ženy a frekvence aneuploidií u embryí Jak již bylo řečeno výše, vliv vyššího věku ženy na častější vznik aneuploidií je jev, který je pozorován již dlouhou řadu let. Náš soubor 2791 biopsií trofektodermu a 1762 biopsií blastomer jsme rozdělili podle věku ženy do 3 skupin. U biopsií trofektodermu pozorujeme u jednotlivých skupin nárůst ve všech sledovaných typech aberací (viz graf P). Největší mezi skupinový nárůst pozorujeme u trizomií, kdy jsme jich u skupiny do 30 let detekovali pouze 5 %, u skupiny od 30 do 38 let 9 % (P<0,05) a od 38 let výše to bylo téměř 13 % (P<0,05). U vícečetných aneuploidií (2 aneuploidie a komplexní) sledujeme mírný nárůst mezi prvními dvěma skupinami (P<0,05), ale skokový nárůst ve skupině od 38 let (P<0,001). Obecně lze tedy říci, že v naší skupině biopsií trofektodermu detekujeme jasnou závislost zvyšujícího se věku žen na frekvenci aneuploidií u embryí ve všech sledovaných typech aberací a především pak pozorujeme skokový nárůst vícečetných aneuploidií ve skupině od 38 let. Celkové množství aneuploidií bylo v případě první skupiny 20 %, u druhé skupiny 28,5 % (P<0,001) a u skupiny nad 38 let téměř 46 % (P<0,001). V případě biopsií blastomer dochází mezi skupinami k mírnému nárůstu četností trizomií (4, 8, 10 %), četnost monozomií je mezi skupinami srovnatelná. Signifikantní rozdíl pozorujeme v případě kombinace dvou aneuploidií, kdy frekvence mezi skupinami stoupá vždy dvojnásobně (3; 6,5; 12 %) (P<0,05). Komplexní aneuploidie jsou v případě biopsií blastomer významně častější, do 30 let a od 30 do 38 let srovnatelně 25 % a 28 % a u skupiny od 38 dosahuje frekvence komplexních změn hodnoty 35 % (P<0,001). Podobně jako v případě biopsií trofektodermu pozorujeme zvýšenou frekvenci výskytu komplexních aneuploidií ve skupině od 38 let. Celkové množství chyb meiotického původu bylo v případě první skupiny 43 %, u druhé skupiny téměř 51 % (P<0,05) a u skupiny nad 38 let 65% (P<0,001). Handyside a kol. v roce 2012 publikovali výsledky zkoumání frekvence aneuploidií u žen různého věku. Ve skupině žen od 33 do 36 let byl podíl vícečetně aneuploidních (≥ 2) ze souboru všech aberantních embryí 20 %, ve skupině od 37 do 39 to bylo 33 %, od 40 do 42 let 57 % a ve skupině od 43 do 45 let vzrostla frekvence komplexních aneuploidií u embryí 67
na 87 %. Výsledky korelují s naším pozorováním, kdy jak u biopsií trofektodermu tak u biopsií blastomer výrazně vzrůstá počet komplexních aneuploidií u skupiny nad 38 let (Handyside et al., 2012). Studiem oocytů bylo zjištěno, že v případě skupiny žen od 40 do 45 let vykazovaly oocyty abnormální rozložení tubulinu, které vedlo k poruše dělení v 79 % případů a ve skupině od 20 do 25 let pouze v 17 % případů (Battaglia et al., 1996). Harton a spol. analyzovali 451 biopsií blastomer a 462 biopsií trofektodermu. Jednotlivé biopsie rozdělili podle věku ženy na skupiny do 35 let, 35 – 37 let, 38 - 40 let, 41 – 42 let, a od 42 let. V případě biopsií blastomer bylo v první skupině detekováno 53 % aneuploidních embryí, ve druhé 68 %, ve třetí 74 %, ve čtvrté 86 % a v poslední skupině to bylo 93 %. V případě biopsií trofektodermu bylo v první skupině detekováno 32 % aneuploidních embryí, ve druhé 44 %, ve třetí 43 %, ve čtvrté 76 % a v poslední skupině to bylo 85 % (Harton et al., 2013). V těchto studiích můžeme pozorovat celkové navýšení frekvence aneuploidií u jednotlivých skupin oproti našemu pozorování. To je pravděpodobně způsobeno zahrnutím embryí se segmentálními aberacemi a aberacemi v mozaice do statistické analýzy. V našem případě činí množství těchto typů změn u biopsií trofektodermu průměrně 15 % a u biopsií blastomer 11 % u všech sledovaných skupin. Dalším aspektem, který může mít vliv na rozdílnou frekvenci výskytu aneuploidí především u skupin nad 40 let, je menší soubor pacientek vysokého věku. Naše skupina od 38 let spíše procentuálně odpovídá vyšetřovaným skupinám od 38 – 40 let studie Hartona a spol. vlivem převahy biopsií nacházejících se v tomto věkovém rozmezí. Závislost frekvence aneuploidií a věku matky má původ v oogenezi. Klíčovou složkou účastnící se mašinérie oogeneze, která má zřejmě hlavní vliv na tvorbu aneuploidií u starších žen, je kohesinový komplex. Kohese sesterských chromatid je vytvořena již v prenatálním vývoji. Samotný komplex je tvořen 4 podjednotkami (heterodimer SMC, kleisin, SA), které dohromady vytvářejí prstenec obklopující obě sesterské chromatidy. Imunofluorescenčním detekcí u oocytů bylo zjištěno, že hladina kohesinových proteinů REC8 a SMC1β se snižuje s dobou, kterou byl oocyt zdržen v dyktyotenním stádiu (Tsutsumi et al., 2014). V souladu s objevy u myších oocytů se zdá, že určitá prahová hodnota kohesinu a proteinů účastnících se tvorby kohesinového komplexu je esenciální pro prevenci missegregace chromozomů (Chiang et al., 2010; Tsutsumi et al., 2014). Přesný mechanizmus, kterým je v průběhu let kohesinový komplex odbouráván není znám. Zajímavým zjištěním bylo, že když byl preimplantačně u 68
myší knock-outován gen pro SMC1β, vedlo to k infertilitě způsobené poruchami segregace. Naopak, když byl tento gen cíleně vyřazen krátce po narození, fertilita myší zůstala po celý život normální a nedocházelo ke zvýšení vzniku aneuploidií (Hodges et al., 2005; Revenkova et al., 2010, 2004). Tento překvapující objev nasvědčuje tomu, že kohesin není v průběhu života obměňován, což by mohlo vysvětlovat věkovou závislost na vznik aneuploidií způsobenou oxidativním stresem a jinými vnějšími faktory působícími na proteiny kohesinového komplexu. Věkem ovlivněné oslabení kohesinových vazeb a tím způsobená missegregace sesterských chromatid je v souladu s objevem, že předčasná segregace chromatid a reverzní segregace jsou nejvýznamnějšími mechanizmy způsobujícími vznik aneuploidních embryí (Gabriel et al., 2011; Handyside et al., 2012; Ottolini et al., 2015). Teoreticky se tedy dá předpokládat, že jestliže jsou s věkem oslabeny kohesinové vazby, daleko častěji bude docházet právě k poruše segregace sesterských chromatid.
9.3 Frekvence segregačních variant u embryí přenašečů reciproké translokace V rámci PGD reciprokých translokací jsme vyšetřili celkem 282 biopsií. U 34 % biopsií byla detekována segregace přilehlých segmentů typu I, u 14 % biopsií segregace přilehlých segmentů typu II a u 4 % biopsií některá z možných segregací typu 3:1. Segregační typ 4:0 nebyl detekován ani v jednom případě. Zbylá embrya nesla chromozomy normální nebo s balancovanou translokací. Pokud byl přenašečem translokace muž, zastoupení normálních či balancovaných embryí bylo 54 %, embryí s nebalancovanou formou segregační varianty 2:2 přilehlých segmentů typu I 32 %, 2:2 přilehlých segmentů typu II 12 % a 3:1 pouze 1 %. Pokud byla přenašečem žena, normálních a balancovaných forem bylo 38 %, 2:2 typu I bylo 37 %, 2:2 typu II 17 % a 3:1 10 %. Ogilvie a kol. (2002) vyšetřovali 149 embryí od celkem 18 párů. 48 % embryí neslo zdravé či balancované chromozomy, 25 % přenášelo variantu 2:2 typu I, 10 % variantu 2:2 typu II, 15 % variantu 3:1 a 2 % 4:0. Dále byly tyto výsledky rozděleny do skupin podle toho, zda translokaci přenášel muž či žena. Střídavá segregace a segregace 2:2 typu I byla zastoupena u obou pohlaví srovnatelně, segregace 2:2 typu II se vyskytovala s převahou u
69
mužů (21 % oproti 6 %) a naopak segregace 3:1 převažovala u žen (20 % oproti 5 %) (Mackie Ogilvie a Scriven, 2002). Jiná studie provedená u 1294 embryí přenašečů translokace odhalila 22 % balancovaných či zdravých, segregace 2:2 byla nalezena u 23 % v případě typu I a u 11 % v případě typu II, segregace 3:1 byla detekována u 25 % embryí a 4:0 u 3 % embryí, zbytek tvořily chaotické rozchody. Bylo zjištěno, že rozchod 2:2 typu I byl častější u mužských přenašečů (28 % oproti 20 %) a rozchody typu 3:1 naopak u ženských přenašečů (28 % oproti 21 %), ostatní typy segregací byly u obou pohlaví zastoupeny s podobnou četností (Ko et al., 2010). S těmito výsledky se shoduje Ye a kol. (2012), kteří detekovali rovnoměrné zastoupení segregačních variant 2:2 typu II u obou pohlaví, avšak vyšší frekvenci varianty 2:2 typu I u mužů přenašečů (33 % oproti 20%) a taktéž vyšší frekvenci výskytu variant 3:1 u ženských přenašečů (38 % oproti 30 %) (Ye et al., 2012). Naopak výrazný rozdíl v zastoupení segregační varianty 2:2 přilehlých segmentů typu II u mužů a žen byl detekován ve studii Scrivena a kol. (2013), kdy zhruba 2x častěji se tento typ segregace nacházel v gametách mužů (Scriven et al., 2013). Porovnáme-li výsledky této práce a výsledky výše zmíněných studií, pozorujeme ve všech případech zcela nekonzistentní celkové zastoupení jednotlivých typů segregací. Obecně bychom však mohli říct, že nejčastějším typem rozchodu je střídavý a poté 2:2 segregace přilehlých segmentů typu I. U ostatních typů rozchodů sledujeme odchylky mezi jednotlivými studiemi, především v případě segregace 3:1, jejíž frekvence kolísá mezi 4 – 33 %. Avšak zaměříme-li se na poměr výskytu segregačních variant u embryí v závislosti na pohlaví přenašeče, v případě rozchodů typu 3:1 pozorujeme ve všech studiích převažující výskyt u ženských přenašečů a naopak u mužů pozorujeme vyšší výskyt rozchodů typu 2:2 (segregace střídavá, přilehlých segmentů typu I a II). Tento nepoměr je zřejmě dán rozdílnou frekvencí a distribucí crossingoverů mezi pohlavími. Bylo zjištěno, že větší množství chiasmat na chromozomech v kvadrivalentu více proximálně způsobí změnu konformace a častější nerovnoměrné rozchody. Naopak chiasmata vzniklá více distálně umožňují symetričtější konformaci kvadrivalentu vedoucí k rovnoměrným segregacím (Rickards, 1983).
Větší počet crossingoverů umístěných na chromozomech více proximálně je
pozorován u ženské meiózy na rozdíl od té mužské, a je tedy pravděpodobné, že právě u
70
přenašeček reciproké translokace budou mít segregace 3:1 výraznější zastoupení (Barlow a Hultén, 1998; Broman et al., 1998). Některé práce se zabývaly vlivem velikosti translokovaných oblastí, pozicí zlomů na chromozomech a velikostí chromozomů zapojených v translokaci na frekvenci jednotlivých segregačních variant. Bylo zjištěno, že zlomy, které jsou dále od centromery a tedy i menší úseky translokovaných oblastí, jsou spojeny se složitějším udržením struktury kvadrivalentu, což častěji vede k nebalancovaným typům rozchodů. Naopak zlomy blíže centromeře, způsobující translokaci větších částí chromozomů, umožňují stabilnější udržení struktury kvadrivalentu, vedoucí k rovnoměrnému rozestupu chromozomů. Podobně je tomu v případě
zapojení
malých
či
akrocentrických
chromozomů.
Obecně
lze
tedy
říci, že u stabilnější symetrických kvadrivalentů dochází spíše k rovnoměrnému rozchodu chromozomů typu 2:2 a naopak u kvadrivalentů nestabilních asymetrických dochází častěji k nerovnoměrné segregaci (Pinton et al., 2005; Yakut et al., 2006; Ye et al., 2012; Zhang et al., 2014). Rozdíly ve výsledcích studií jsou tedy zřejmě dány obrovskou diverzitou způsobenou kombinacemi různých faktorů ovlivňujících charakter segregací a jejich nerovnoměrné zastoupení mezi těmito studiemi.
9.4 Frekvence a charakter chromozomových aberací u embryí přenašečů reciproké a Robertsonské translokace Z 282 embryí přenašečů reciproké translokace bylo celkem vyšetřeno 160 biopsií trofektodermu a 122 biopsií blastomer. Při vyšetření trofektodermu bylo detekováno 19 % embryí bez genetické zátěže, 38 % s nebalancovaným rozchodem bez jiné aberace, 22 % embryí aneuploidních s balancovaným rozchodem a 21 % s nebalancovaným rozchodem společně s jinou aneuploidií. U biopsií blastomer to bylo 14 % euploidních, 20 % nebalancovaných bez jiné aberace, 42 % aneuploidních bez nebalancovaného rozchodu a 24 % bylo nebalancovaných s jinou aberací. Alfarawati a kol. (2011) vyšetřili 121 embryí přenašečů reciproké translokace, u kterých pozorovali, že 22 % embryí neslo nebalancovaný rozchod bez jiné aberace, 27 % bylo nebalancovaných společně s jinou aneuploidií, 29 % embryí bylo balancovaných s jinou aneuploidií a 22 % bylo euploidních (Alfarawati et al., 2011).
71
Jiná studie z roku 2012 provedená na 402 embryích odhalila 23 % nebalancovaných, 31 % nebalancovaných společně s jinou aneuploidií, 26 % balancovaných aneuploidních embryí a 20 % zdravých (Colls et al., 2012). Obě studie provedly analýzy na biopsiích trofektodermu i blastomer a výsledky uvádějí pro všechny typy biopsií společně. To by mohlo skutečná data zkreslit, zejména pak u skupin s aneuploidiemi (balancované aneuploidní, nebalancované aneuploidní), které u biopsií blastomer vyskytují s mnohem vyšší četností. Srovnáme-li výsledky analýzy této práce s těmito studiemi, pozorujeme zhruba obdobné zastoupení téměř všech skupin, s výjimkou biopsií trofektodermu pouze s nebalacovaným rozchodem (38 % oproti 22 % a 23 %) a biopsií blastomer s balancovaným rozchodem a jinou aberací (42 % oproti 29 % a 26 %). Provedeme-li však sjednocení dat obou typů biopsií, výrazně se přiblížíme frekvencím uvedeným v těchto pracích. Rozdíly mezi studiemi mohou být dány chybou malých čísel, zastoupením jednotlivých typů biopsií v souboru, ale také charakterem jednotlivých translokací a pohlavím přenašečů, což může mít u tak malého souboru významný vliv na výsledná data (viz. kapitola 9.3.). Srovnáme-li celkové zastoupení aneuploidií u obou typů biopsií v rámci PGD reciprokých translokací, frekvence (43 % u trofektodermu, 66 % u blastomer) zcela odpovídá výsledkům PGS uvedených v této práci V rámci PGD Robertsonských translokací jsme vyšetřili 145 embryí, z nichž 43 % bylo euploidních a 19 % neslo nebalancovaný rozchod. U embryí mužských přenašečů bylo detekováno 13 % nebalancovaných rozchodů a u embryí ženských přenašečů to bylo 26 % (P<0,05). Roux a kol. (2005) analyzovali data 18 studií provedených na spermiích přenašečů Robertsonských translokací a zjistili, že frekvence nebalancovaných spermií je průměrně 15 % (Roux et al., 2005). Tyto výsledky odpovídají datům uvedených v této práci, ovšem porovnáme-li zastoupení nebalancovaných rozchodů v závislosti na tom, zda aberaci přenášela žena či muž, vidíme dvojnásobný nárůst u žen oproti mužům (26 % oproti 13%). To je v souladu s výsledky jiné studie provedené na blastomerách, která ukázala, že u embryí ženských přenašečů byla prevalence nebalancovaných rozchodů 31 %, kdežto u mužkých pouze 16 % (Bint et al., 2011). Tento rozdíl je zřejmě způsoben vysokou selekcí spermií s nebalancovaným rozchodem, což vede k umělému navýšení počtu balancovaných spermií u mužských přenašečů. Tento fakt také koreluje se zjištěním, že častěji dochází ke spontánním 72
abortům z důvodu přítomnosti nebalancovaného rozchodu u embryí ženských přenašečů Robertsonovské translokace než mužských (Harris et al., 1979).
9.5 Porovnání metod aCGH a NGS Významný rozdíl mezi použitými metodami, je v množství detekovaných aberací vyskytujících se v mozaice u biopsií trofektodermu. V případě metody aCGH to bylo 13 % a u NGS přesně dvojnásobně více (P<0,001). U metody NGS odpadá nutnost hybridizace a detekce fluorescenčních signálů a jejich přepočítávání, což díky přímé analýze počtu kopií daných sekvencí výrazně zvyšuje rozsah detekce zisku a ztrát jednotlivých chromozomů. Když se podíváme na zastoupení aberací u biopsií v závislosti na typu použité metody, pozorujeme snížení množství euploidních embryí u metody NGS oproti aCGH právě z důvodu vyššího množství detekovaných mozaiek. Jinak řečeno, dříve nebylo možné metodou aCGH odhalit některá mozaicistní embrya, která tak byla vyhodnocena jako euploidní, což teoreticky mohlo vést ke snížení úspěšnosti implantace. Použitím metody NGS pro PGS je tedy možné zvýšit úspěšnost asistované reprodukce. Oficiální časová náročnost obou metod je srovnatelná, ovšem z důvodu lepší organizace práce v laboratoři neprobíhá hybridizace klasické 4 hodiny, ale celou noc, tím se celkový čas metody aCGH prodlouží. Nevýhodou obou metod je neschopnost odhalit přenašečství balancovaných aberací.
73
10. Souhrn Hlavním cílem této práce bylo analyzovat výsledky vyšetření PGS a PGD Robertsonských a reciprokých translokací a porovnat výsledky u biopsií trofektodermu a blastomer. Data byla získána metodami aCGH a NGS v období od října roku 2010 do ledna roku 2016. Celkově bylo analyzováno 4999 embryí od celkem 1032 párů podstupujících léčbu neplodnosti pomocí asistované reprodukce v Sanatoriu Repromeda v Brně. Pro
PGS
bylo
odebráno
2791
biopsií
trofektodermu
a
1762
biopsií
blastomer, amplifikace proběhla úspešně u 2761 (99 %) biopsií trofektodemů a 1710 biopsií blastomer (97 %). V rámci PGS prováděném na u trofektodermu bylo detekováno 1205 (44 %) aberantních embryí, z nichž 12 % tvořily případy s jednou monozomií, 9 % s jednou trizomií, 4 % přenášela kombinaci dvou aneuploidií, 4 % komplexní aneuploidie a zbytek tvořily změny strukturní a aneuploidie v mozaice (15 %). Nejčastěji aberantní chromozomy byly 15, 16, 21, 22, X a Y. V rámci PGS prováděném u blastomer bylo detekováno 1060 (62 %) aneuploidních embryí. Jedna monozomie byla detekována v 10 % případů, jedna trizomie v 7 %, 2 aneuploidie v 7 %, komplexní změny v 27 % a strukturní aberace se vyskytovaly u 11 % embryí. Nejčastěji aberantní chromozomy byly 15, 16, 21, 22, X a Y. Pro PGD reciprokých translokací bylo odebráno 160 biopsií trofektodermu a 133 biopsií blastomer, amplifikace proběhla úspěšně u 160 biopsií trofektodermu a 122 biopsií blastomer (92 %). V rámci PGD reciprokých translokací u trofektodermu bylo detekováno 129 (80 %) embryí s aberací, z nichž 61 (38 %) neslo nebalancovaný rozchod bez jiné aberace, 22 (35 %) bylo aneuploidních a balancovaných, 31 (19 %) bylo euploidních a 33 (21 %) neslo nebalancovaný rozchod společně s jinou aberací. V rámci PGD reciprokých translokací u blastomer bylo detekováno 105 (86 %) embryí s aberací, z nichž 52 (43 %) bylo balancovaných s jinou aneuploidií, 29 (24 %) bylo nebalancovaných s aneuploidií, 24 (20 %) bylo nebelancovaných bez jiné aneuploidie a 17 (14 %) bylo euploidních. Segregační varianta střídavá byla zastoupena u 136 biopsií (48 %), varianta 2:2 přilehlých segmentů typu I u 95 biopsií (34 %), 2:2 typu II u 39 (14 %) a 3:1 u 12 (4 %) biopsií. Segregaci 4:0 nebyla pozorována ani v jednom případě. Jiným cílem práce bylo sledovat vliv rostoucího věku ženy na frekvenci aneuploidií u embryií. U biopsií trofektodermu jsme pozorovali nárůst četnosti aneuploidí u všech 74
sledovaných typů aberací, celkem bylo u skupin do 30 let detekováno 20 % aberantních embryí, u skupiny od 30 do 38 let 28 % a od 38 let bylo detekováno 46 % aneuploidních embryí. U biopsií blastomer byl meziskupinový nárůst pozorován u všech typů aberací kromě samostatných monozomií. Celkové zastoupení aberantních embryí bylo u skupiny do 30 let 43 %, od 30 do 38 let 50 % a od 38 let 65 %. Dalším cílem práce bylo sledovat vliv pohlaví přenašeče reciproké translokace na typ segregace chromozomů z kvadrivalentu u gametogeneze. Střídavá segregace byla s větší četností zastoupena u embryí mužských přenašečů (54 % oproti 38 %), ostatní typy se častěji nacházely u embryí ženských přenašečů, 2:2 typu I v 37 % oproti 32 %, 2:2 typu II u 17 % oproti 12 %, a varianta 3:1 byla zastoupena výrazně častěji (10 % oproti 1 %). Dále byly v rámci této práce vyhodnoceny výsledky PGD Robertsonských translokací. Celkem bylo odebráno 151 biopsií, z nichž bylo úspěšně vyšetřeno 145 (39 %). 19 % neslo aberaci vzniklou nebalancovaným rozchodem z trivalentu, 38 % neslo jinou aberaci a 43 % embryí bylo euploidních. Frekvence nebalancovaných rozchodů u embryí se lišila v závislosti na pohlaví přenašeče v páru, u embryí mužských přenašečů byl nebalancovaný rozchod detekován u 13 % a u embryí ženských přenašečů to bylo 26 %. Posledním cílem práce bylo porovnat výhody a nevýhody metod aCGH a NGS pro PGS. Výhoda metody NGS spočívá v citlivější detekci aberací vyskytujících se v mozaice, proto byla do této analýzy zahrnuta pouze data z PGS prováděném u biopsií trofektodermu. U 2348 biopsií trofektodermu byla použita metoda aCGH a u 413 metoda NGS. Celkem bylo metodou NGS detekováno 49 % euploidních, 21 % pouze mozaicistních a 30 % aneuploidních embryí. U metody aCGH to bylo 58 % euploidních, 10 % pouze mozaicistních a 32 % aneuploidních. Celkový podíl embryí, která nesla aberaci v mozaice, bylo v případě NGS 26 % a u aCGH 13 %.
75
11. Summary The main objective of this thesis was to analyse results of PGS and PGD of Robertsonian and reciprocal translocations and to compare results from blatomere and trophectoderm biopsies. PGS and PGD was performed by aCGH and NGS in the period from october 2010 to january 2016. The analysis is based on data obtained from 4999 embryos derived from 1032 couples who underwent infertility treatment in Sanatorium Repromeda in Brno. In PGS, 2791 trophectoderm and 1762 blastomere biopsies were collected, amplification was successfull in 2761 (99 %) trophectoderm and 1710 (97 %) blastomere biopsies. When analysing trophectoderm biopsies, we have detected 1205 (44 %) aneuploid embryos, of which 12 % were monosomic, 9 % trisomic, 4 % carried combination of two aneuploidies, 4 % were complex aneuploid and the rest carried structural and mosaic aneuploidies (15 %). Most frequently aneuploid chromosomes were chromosome 15, 16, 21, 22, X and Y. When analysing blastomere biopsies, we have detected 1060 (62 %), aneuploid embryos. Monosomies were detected in 10 % of biopsies, trisomies in 7 %, combination of two aneuploidies in 7 %, complex aneuploidies in 27 % and structural aneuploidies were detected in 15 % of embryos. Most frequently aneuploid chromosomes were chromosome 15, 16, 21, 22, X and Y. In PGD for reciprocal translocations, 160 trophectoderm and 133 blastomere biopsies were collected, amplification was successfull in 160 trophectoderm and 122 blastomere biopsies (92 %). When analysing trophectoderm biopsies for reciprocal translocations, 129 (80 %) aberant embryos were detected of which 61 (38 %) were unbalanced without another aberration, 22 (35 %) were balanced with another aberration, 31 (19 %) were euploid and 33 (21 %) were unbalanced with another aberration. When analysing blastomere biopsies for reciprocal translocations, 105 (86 %) aberant embryos were detected of which 52 (43 %) were balanced with another aberration, 29 (24 %) were unbalanced with another aberration, 24 (20 %) were unbalanced without another aberration and 17 (14 %) were euploid. 136 (48 %) embryos showed alternate segregation pattern, 95 (34 %) adjacent-1, 39 (14 %) adjacent-2 and 12 (4 %) embryos showed 3:1 pattern. 4:0 pattern wasn’t detected. 76
Another objective of this thesis was to describe the effect of maternal age on the aneuploidy frequency in embryos. In trophectoderm biopsies, we observed increased frequency of all types of chromosomal abnormalities in positive correlation with advanced maternal age. In the group of women younger than 30 years old, we have detected 20 % aneuploid embryos, in the 30 to 38 age group, we have detected 28 % aneuploid ones and in the group of women older than 38 we have detected 46 % aneuploid embryos. Increased incidence of aneuploid embryos positively correlating with advancing age was detected also when blastomere biopsy was performed. Overall representation of aneuploid embryos in the groupe of women younger than 30 years old was 43 %, in the 30 to 38 age group 50 % and in the group older than 38 65 %. Another objective of this thesis was to analyse the influence of sex of the reciprocal translocation carrier on segregation pattern. Alternate pattern was observed in male carriers more frequently than in females (54 % vs. 38 %), other segregation patterns were observed in female carriers more often than in males, adjacent I in 37 % vs. 32 %, adjacent II in 17 % vs. 12 % and 3:1 in 10 % vs. 1 %. Furthermore, we analysed the results of PGD for Robertsonian translocations. 151 biopsies were collected, amplification was succesfull in 145 (96 %) biopsies. 19 % of embryos carried unbalanced segregation pattern, 38 % were aneuploid and 43 % were chromosomally normal. We observed that segregation pattern producing unbalanced chromosome configuration was biased by the sex of the carrier. Male carriers produced 13 % of unbalanced embryos compared to female carriers, who produced 26 % of unbalanced embryos. Last objective of this thesis was to compare pros and cons of aCGH and NGS methods. NGS method is more sensitive for detection of mosaicism than aCGH. 2348 trophectoderm biopsies were analysed by aCGH and 413 biopsies by NGS. Using NGS we detected 49 % euploid embryos, 21 % embryos with mosaicism and 30 % aneuploid embryos. Using aCGH we detected 58 % euploid embryos, 10 % mosaic embryos and 32 % aneuploid embryos. Overall, using NGS we detected mosaicism in 26 % of embryos and using aCGH in 13 % of them.
77
12. Seznam literatury 12.1 Publikace 1. Adler, A., Lee, H.-L., McCulloh, D.H., Ampeloquio, E., Clarke-Williams, M., Wertz, B.H., Grifo, J., 2014. Blastocyst culture selects for euploid embryos: comparison of blastomere and trophectoderm biopsies. Reprod. Biomed. Online 28, 485–491. 2. Alfarawati, S., Fragouli, E., Colls, P., Wells, D., 2011. First births after preimplantation genetic diagnosis of structural chromosome abnormalities using comparative genomic hybridization and microarray analysis. Hum. Reprod. 26, 1560–1574. 3. Angell, R.R., 1991. Predivision in human oocytes at meiosis: I: a mechanism for trisomy formation in man. Hum. Genet. 86, 383–387. 4. Barker, D.L., Hansen, M.S.T., Faruqi, A.F., Giannola, D., Irsula, O.R., Lasken, R.S., Latterich, M., Makarov, V., Oliphant, A., Pinter, J.H., Shen, R., Sleptsova, I., Ziehler, W., Lai, E., 2004. Two methods of whole-genome amplification enable accurate genotyping across a 2320-SNP linkage panel. Genome Res. 14, 901–907. 5. Barlow, A.L., Hultén, M.A., 1998. Combined immunocytogenetic and molecular cytogenetic analysis of meiosis I oocytes from normal human females. Zygote Camb. Engl. 6, 27–38. 6. Battaglia, D.E., Goodwin, P., Klein, N.A., Soules, M.R., 1996. Fertilization and early embryology: Influence of maternal age on meiotic spindle assembly oocytes from naturally cycling women. Hum. Reprod. 11, 2217–2222. 7. Baudat, F., Imai, Y., de Massy, B., 2013. Meiotic recombination in mammals: localization and regulation. Nat. Rev. Genet. 14, 794–806. 8. Bint, S.M., Ogilvie, C.M., Flinter, F.A., Khalaf, Y., Scriven, P.N., 2011. Meiotic segregation of Robertsonian translocations ascertained in cleavage-stage embryos-implications for preimplantation genetic diagnosis. Hum. Reprod. Oxf. Engl. 26, 1575– 1584. 9. Brizot, M.L., Schultz, R., Patroni, L.T., Lopes, L.M., Armbruster-Moraes, E., Zugaib, M., 2001. Trisomy 10: ultrasound features and natural history after first trimester diagnosis. Prenat. Diagn. 21, 672–675.
78
10. Broman, K.W., Murray, J.C., Sheffield, V.C., White, R.L., Weber, J.L., 1998. Comprehensive Human Genetic Maps: Individual and Sex-Specific Variation in Recombination. Am. J. Hum. Genet. 63, 861–869. 11. Cheung, V.G., Nelson, S.F., 1996. Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 14676–14679. 12. Chiang, T., Duncan, F.E., Schindler, K., Schultz, R.M., Lampson, M.A., 2010. Evidence that Weakened Centromere Cohesion Is a Leading Cause of Age-Related Aneuploidy in Oocytes. Curr. Biol. 20, 1522–1528. 13. Coe, B.P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G.A., MacAulay, C., Lam, W.L., 2007. Resolving the resolution of array CGH. Genomics 89, 647–653. 14. Colls, P., Escudero, T., Fischer, J., Cekleniak, N.A., Ben-Ozer, S., Meyer, B., Damien, M., Grifo, J.A., Hershlag, A., Munné, S., 2012. Validation of array comparative genome hybridization for diagnosis of translocations in preimplantation human embryos. Reprod. Biomed. Online 24, 621–629. 15. Fishel, S.B., Edwards, R.G., Purdy, J.M., Steptoe, P.C., Webster, J., Walters, E., Cohen, J., Fehilly, C., Hewitt, J., Rowland, G., 1985. Implantation, abortion, and birth after in vitro fertilization using the natural menstrual cycle or follicular stimulation with clomiphene citrate and human menopausal gonadotropin. J. Vitro Fertil. Embryo Transf. IVF 2, 123–131. 16. Fragouli, E., Wells, D., 2011. Aneuploidy in the human blastocyst. Cytogenet. Genome Res. 133, 149–159. 17. Gabriel, A.S., Thornhill, A.R., Ottolini, C.S., Gordon, A., Brown, A.P.C., Taylor, J., Bennett, K., Handyside, A., Griffin, D.K., 2011. Array comparative genomic hybridisation on first polar bodies suggests that non-disjunction is not the predominant mechanism leading to aneuploidy in humans. J. Med. Genet. 48, 433–437. 18. Gardner, R.J.Mk., Sutherland, G.R., Shaffer, L.G., 2011. Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling. Oxford University Press, USA. 19. Guichaoua, M.R., Devictor, M., Hartung, M., Luciani, J.M., Stahl, A., 1986. Random acrocentric bivalent associations in human pachytene spermatocytes. Molecular implications in the occurrence of Robertsonian translocations. Cytogenet. Cell Genet. 42, 191–197.
79
20. Gutiérrez-Mateo, C., Benet, J., Starke, H., Oliver-Bonet, M., Munné, S., Liehr, T., Navarro, J., 2005. Karyotyping of human oocytes by cenM-FISH, a new 24-colour centromere-specific technique. Hum. Reprod. Oxf. Engl. 20, 3395–3401. 21. Handyside, A.H., 2013. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertil. Steril. 100, 595–602. 22. Handyside, A.H., Montag, M., Magli, M.C., Repping, S., Harper, J., Schmutzler, A., Vesela, K., Gianaroli, L., Geraedts, J., 2012. Multiple meiotic errors caused by predivision of chromatids in women of advanced maternal age undergoing in vitro fertilisation. Eur. J. Hum. Genet. EJHG 20, 742–747. 23. Harper, J.C., Harton, G., 2010. The use of arrays in preimplantation genetic diagnosis and screening. Fertil. Steril. 94, 1173–1177. 24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P., 2007. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum. Mol. Genet. 16, R203–R208. 25. Hassold, T., Hunt, P., 2001. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat. Rev. Genet. 2, 280–291. 26. Harton, G.L., Munné, S., Surrey, M., Grifo, J., Kaplan, B., McCulloh, D.H., Griffin, D.K., Wells, D., Group, P.P., 2013. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertil. Steril. 100, 1695–1703. 27. Harris, D.J., Hankins, L., Begleiter, M.L., 1979. Reproductive risk of t(13q14q) carriers: case report and review. Am. J. Med. Genet. 3, 175–181. 28. Henderson, S.A., Edwards, R.G., 1968. Chiasma frequency and maternal age in mammals. 29. Hodges, C.A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T.J., Hunt, P.A., 2005. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat. Genet. 37, 1351–1355. 30. Hornak, M., Vozdova, M., Musilova, P., Prinosilova, P., Oracova, E., Linkova, V., Vesela, K., Rubes, J., 2014. Comprehensive meiotic segregation analysis of a 4breakpoint t(1;3;6) complex chromosome rearrangement using single sperm array comparative genomic hybridization and FISH. Reprod. Biomed. Online 29, 499–508. 31. Hull, M.G.R., 1990. Indications for assisted conception. Br. Med. Bull. 46, 580–595. 32. Ioannou, D., Fonseka, K.G.L., Meershoek, E.J., Thornhill, A.R., Abogrein, A., Ellis, M., Griffin, D.K., 2012. Twenty-four chromosome FISH in human IVF embryos reveals 80
patterns of post-zygotic chromosome segregation and nuclear organisation. Chromosome Res. Int. J. Mol. Supramol. Evol. Asp. Chromosome Biol. 20, 447–460. 33. Jacobs, P.A., Browne, C., Gregson, N., Joyce, C., White, H., 1992. Estimates of the frequency of chromosome abnormalities detectable in unselected newborns using moderate levels of banding. J. Med. Genet. 29, 103–108. 34. Katz-Jaffe, M.G., Surrey, E.S., Minjarez, D.A., Gustofson, R.L., Stevens, J.M., Schoolcraft, W.B., 2013. Association of abnormal ovarian reserve parameters with a higher incidence of aneuploid blastocysts. Obstet. Gynecol. 121, 71–77. 35. Ko, D.S., Cho, J.W., Park, S.Y., Kim, J.Y., Koong, M.K., Song, I.O., Kang, I.S., Lim, C.K., 2010. Clinical outcomes of preimplantation genetic diagnosis (PGD) and analysis of meiotic segregation modes in reciprocal translocation carriers. Am. J. Med. Genet. A. 152A, 1428–1433. 36. Koskinen, S., Onnelainen, T., de la Chapelle, A., Kere, J., 1993. A rare reciprocal translocation (12; 21) segregating for nine generations. Hum. Genet. 92, 509–512. 37. Kuliev, A., Verlinsky, Y., 2004. Meiotic and mitotic nondisjunction: lessons from preimplantation genetic diagnosis. Hum. Reprod. Update 10, 401–407. 38. Kuliev, A., Zlatopolsky, Z., Kirillova, I., Spivakova, J., Cieslak Janzen, J., 2011. Meiosis errors in over 20,000 oocytes studied in the practice of preimplantation aneuploidy testing. Reprod. Biomed. Online 22, 2–8. 39. Loutradi, K.E., Kolibianakis, E.M., Venetis, C.A., Papanikolaou, E.G., Pados, G., Bontis, I., Tarlatzis, B.C., 2008. Cryopreservation of human embryos by vitrification or slow freezing: a systematic review and meta-analysis. Fertil. Steril. 90, 186–193. 40. Mackie Ogilvie, C., Scriven, P.N., 2002. Meiotic outcomes in reciprocal translocation carriers ascertained in 3-day human embryos. Eur. J. Hum. Genet. EJHG 10, 801–806. 41. Magli, M.C., Jones, G.M., Gras, L., Gianaroli, L., Korman, I., Trounson, A.O., 2000. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid embryos that develop to morphologically normal blastocysts in vitro. Hum. Reprod. Oxf. Engl. 15, 1781–1786. 42. Márquez, C., Sandalinas, M., Bahçe, M., Alikani, M., Munné, S., 2000. Chromosome abnormalities in 1255 cleavage-stage human embryos. Reprod. Biomed. Online 1, 17– 26. 43. McCoy, R.C., Demko, Z.P., Ryan, A., Banjevic, M., Hill, M., Sigurjonsson, S., Rabinowitz, M., Petrov, D.A., 2015. Evidence of Selection against Complex MitoticOrigin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLOS Genet 11, e1005601. 81
44. Menasha, J., Levy, B., Hirschhorn, K., Kardon, N.B., 2005. Incidence and spectrum of chromosome abnormalities in spontaneous abortions: new insights from a 12-year study. Genet. Med. Off. J. Am. Coll. Med. Genet. 7, 251–263. 45. Munné, S., Bahçe, M., Sandalinas, M., Escudero, T., Márquez, C., Velilla, E., Colls, P., Oter, M., Alikani, M., Cohen, J., 2004. Differences in chromosome susceptibility to aneuploidy and survival to first trimester. Reprod. Biomed. Online 8, 81–90. 46. Northrop, L.E., Treff, N.R., Levy, B., Scott, R.T., 2010. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Mol. Hum. Reprod. 16, 590–600. 47. Nussbaum, R.L., McInnes, R.R., Willard, H.F., 2015. Thompson & Thompson genetics in medicine. Elsevier Health Sciences. 48. Oliver-Bonet, M., Benet, J., Sun, F., Navarro, J., Abad, C., Liehr, T., Starke, H., Greene, C., Ko, E., Martin, R.H., 2005. Meiotic studies in two human reciprocal translocations and their association with spermatogenic failure. Hum. Reprod. Oxf. Engl. 20, 683–688. 49. Oliver, T.R., Feingold, E., Yu, K., Cheung, V., Tinker, S., Yadav-Shah, M., Masse, N., Sherman, S.L., 2008. New insights into human nondisjunction of chromosome 21 in oocytes. PLoS Genet. 4, e1000033. 50. Oliver, T.R., Tinker, S.W., Allen, E.G., Hollis, N., Locke, A.E., Bean, L.J.H., Chowdhury, R., Begum, F., Marazita, M., Cheung, V., Feingold, E., Sherman, S.L., 2012. Altered patterns of multiple recombinant events are associated with nondisjunction of chromosome 21. Hum. Genet. 131, 1039–1046. 51. Ottolini, C.S., Newnham, L.J., Capalbo, A., Natesan, S.A., Joshi, H.A., Cimadomo, D., Griffin, D.K., Sage, K., Summers, M.C., Thornhill, A.R., Housworth, E., Herbert, A.D., Rienzi, L., Ubaldi, F.M., Handyside, A.H., Hoffmann, E.R., 2015. Genome-wide maps of recombination and chromosome segregation in human oocytes and embryos show selection for maternal recombination rates. Nat. Genet. 47, 727–735. 52. Page, S.L., Hawley, R.S., 2003. Chromosome choreography: the meiotic ballet. Science 301, 785–789. 53. Penrose, L.S., 1933. The relative effects of paternal and maternal age in mongolism. J. Genet. 27, 219–224. 54. Pinton, A., Faraut, T., Yerle, M., Gruand, J., Pellestor, F., Ducos, A., 2005. Comparison of male and female meiotic segregation patterns in translocation heterozygotes: a case 82
study in an animal model (Sus scrofa domestica L.). Hum. Reprod. Oxf. Engl. 20, 2476– 2482. 55. Póvoa, A., Ramalho, C., Torgal, A., Brandão, O., Matias, A., J. V. Oliveira, M., Montenegro, N., Castedo, S., 2008. Positive biochemical screening for trisomy 18: on the path of trisomy 9. Prenat. Diagn. 28, 162–164. 56. Revenkova, E., Eijpe, M., Heyting, C., Hodges, C.A., Hunt, P.A., Liebe, B., Scherthan, H., Jessberger, R., 2004. Cohesin SMC1 beta is required for meiotic chromosome dynamics, sister chromatid cohesion and DNA recombination. Nat. Cell Biol. 6, 555– 562. 57. Revenkova, E., Herrmann, K., Adelfalk, C., Jessberger, R., 2010. Cohesin expression restricted to the pre-dictyate stages of oocyte development provides full fertility and prevents aneuploidy. Curr. Biol. CB 20, 1529–1533. 58. Řežábek, K., n.d. Asistovaná reprodukce. 2. vydání. Praha: Maxdorf, 2008. ISBN 97880-7345-154-7. 59. Rickards, G.K., 1983. Orientation Behavior of Chromosome Multiples of Interchange (Reciprocal Translocation) Heterozygotes. Annu. Rev. Genet. 17, 443–498. 60. Roberts, R., Iatropoulou, A., Ciantar, D., Stark, J., Becker, D.L., Franks, S., Hardy, K., 2005. Follicle-stimulating hormone affects metaphase I chromosome alignment and increases aneuploidy in mouse oocytes matured in vitro. Biol. Reprod. 72, 107–118. 61. Roux, C., Tripogney, C., Morel, F., Joanne, C., Fellmann, F., Clavequin, M.C., Bresson, J.L., 2005. Segregation of chromosomes in sperm of Robertsonian translocation carriers. Cytogenet. Genome Res. 111, 291–296. 62. Rowsey, R., Gruhn, J., Broman, K.W., Hunt, P.A., Hassold, T., 2014. Examining variation in recombination levels in the human female: a test of the production-line hypothesis. Am. J. Hum. Genet. 95, 108–112 63. Schinzel, A., 2001. Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man. Walter de Gruyter. 64. Telenius, H., Carter, N.P., Bebb, C.E., Nordenskjöld, M., Ponder, B.A., Tunnacliffe, A., 1992. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics 13, 718–725. 65. Templeton, A., Morris, J.K., 1998. Reducing the Risk of Multiple Births by Transfer of Two Embryos after in Vitro Fertilization. N. Engl. J. Med. 339, 573–577.
83
66. Tsutsumi, M., Fujiwara, R., Nishizawa, H., Ito, M., Kogo, H., Inagaki, H., Ohye, T., Kato, T., Fujii, T., Kurahashi, H., 2014. Age-Related Decrease of Meiotic Cohesins in Human Oocytes. PLOS ONE 9, e96710. 67. van Echten-Arends, J., Mastenbroek, S., Sikkema-Raddatz, B., Korevaar, J.C., Heineman, M.J., van der Veen, F., Repping, S., 2011. Chromosomal mosaicism in human preimplantation embryos: a systematic review. Hum. Reprod. Update 17, 620– 627. 68. Voullaire, L., Wilton, L., Slater, H., Williamson, R., 1999. Detection of aneuploidy in single cells using comparative genomic hybridization. Prenat. Diagn. 19, 846–851. 69. Wells, D., Sherlock, J.K., Delhanty, J.D.A., Handyside, A.H., 1999. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification and comparative genomic hybridisation. Nucleic Acids Res. 27, 1214– 1218. 70. Wheeler, D.A., Srinivasan, M., Egholm, M., Shen, Y., Chen, L., McGuire, A., He, W., Chen, Y.-J., Makhijani, V., Roth, G.T., others, 2008. The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing. nature 452, 872–876. 71. Yakut, T., Ercelen, N., Acar, H., Kimya, Y., Egeli, U., 2006. Meiotic segregation analysis of reciprocal translocations both in sperms and blastomeres. Am. J. Med. Genet. A. 140A, 1074–1082. 72. Ye, Y., Qian, Y., Xu, C., Jin, F., 2012. Meiotic segregation analysis of embryos from reciprocal translocation carriers in PGD cycles. Reprod. Biomed. Online 24, 83–90. 73. Zhang, Y., Zhu, S., Wu, J., Liu, S., Sun, X., 2014. Quadrivalent asymmetry in reciprocal translocation carriers predicts meiotic segregation patterns in cleavage stage embryos. Reprod. Biomed. Online 29, 490–498.
12.2 Internetové zdroje 1. Array CGH technology. Array-CGH Methodology (online) (cit. 2016-02-27). Dostupné z http://cgimatba.com/array-cgh-technology/ 2. BitesizeBio. Technology
Sequencing-by-Synthesis: (online)
(cit.
Explaining
the
2016-02-28).
84
Illumina®
Sequencing
Dostupné
z
http://bitesizebio.com/13546/sequencing-by-synthesis-explaining-the-Illumina®sequencing-technology/ 3. Fertility tratments. Biopsie blastomery a trofektodermu (online) (cit. 2016-02-14). Dostupné z http://ivfmd.net/fertility-treatments/pgs/ 4. Genomics. NGS platform/Ion Torrent (online) (cit. 2016-02-28). Dostupné z http://www.genomics.cn/en/navigation/show_navigation?nid=2640 5. Human karyotype. Human karyotype for teaching (45, X, Monosomy X) (online) (cit. 2016-02-25). Dostupné z http://worms.zoology.wisc.edu/zooweb/Phelps/45x.html 6. Human karyotype. Human karyotype for teaching (47, XY,+21, Trisomy 21) (online) (cit.
Dostupné
2016-02-25).
z
http://worms.zoology.wisc.edu/zooweb/Phelps/47XY_21.html 7. ICSI. Intracytoplasmatická injekce spermie (online) (cit. 2016-02-10). Dostupné z http://www.vivaconsalud.es/wp-content/uploads/2013/08/icsi-que-es-y-en-queconsiste.jpg 8. Illumina
a.
VeriSeq™
PGS
kit
(online)
(cit.
2016-02-16).
Dostupné
zhttps://www.Illumina®.com/content/dam/Illumina®marketing/documents/products/product_information_sheets/product-info-VeriSeq™ .pdf 9. Illumina b. Software BlueFuse multi (online) (cit. 2016-02-16). Dostupné z https://support.Illumina®.com/content/dam/Illumina®support/documents/documentation/software_documentation/bluefuse-multisoftware/bluefuse-multi-v4-3-software-guide-15053620-01.pdf 10. Ion Torrent. Ion ReproSeq PGS kit (online) (cit. 2016-02-14). Dostupné z https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/lifesciences/sequencing/pdfs/ion-reproseq-pgs-kit-flyer.pdf 11. Punkce. Egg retrieval (online) (cit. 2016-02-10). Dostupné z http://www.womenshealth-advice.com/assets/images/egg-retrieval2.jpg 12. VeriSeq.
BlueFuse
chart
(online)
(cit.
2016-02-09).
Dostupné
http://prismabiotech.com.tw/prisma_attachments/VeriSeq™ %20datasheet.pdf
85
z
