Fluorescenční vyšetření rostlinných surovin
10. cvičení
Cíl cvičení • práce s fluorescenčním mikroskopem • detekce vybraných rostlinných surovin • Princip nepřímé dvojstupňové IHC s použitím fluorochromu
Fluorescenční mikroskopie • umožňuje zobrazit určité látky obsažené v buňkách často v minimálním množství • je založena na skutečnosti, že některé chemické látky (fluorochromy) po dopadu světla o kratší vlnové délce září světlem o delší vlnové délce - tedy světlem jiné barvy - fluorescence. • je projevem intramolekulové energetické změny vzbuzené v látce absorbovaným zářením.
Princip fluorescenční mikroskopie • Princip - vazba fluorochromu na určitou buněčnou složku (polysacharid, protein), která pak např. v modrém budícím světle září světlem žlutým. • Aby modré světlo budící fluorescenci nevadilo při pozorování, musí být odstraněno bariérovým filtrem. • Ten pohltí modré světlo vycházející z preparátu do objektivu a do okuláru propustí jen světlo žluté. • Výsledkem je tedy obraz žlutě zářících struktur v temném poli.
Princip konstrukce fluorescenčního mikroskopu
Fluorescenční mikroskopie v odraženém světle (epifluorescence) • Dichroické zrcadlo odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem ke vzorku, propouští ostatní vlnové délky a také odráží osamocené paprsky excitačního světla zpět ve směru zdroje. • Bariérový filtr zachytí zbytky excitačního světla, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu.
Pracovní postup fluorescenčního vyšetření • • • • • • •
zapněte fluorescenční mikroskop zapněte zdroj světla umístěte preparát na posuvný stolek na mikroskopu nastavte filtr na pozici 2 zvolte zvětšení zaostřete sledovanou strukturu sledovaná struktura fluoreskuje na černém pozadí
Preparáty ke studiu • • • • • • •
Majoránka Cibule Kmín Bramborový škrob Mouka hladká Mouka polohrubá Sójová bílkovina
Majoránka Mikroskopické znaky • pokožka - na líci listu ploché buňky, na rubu průduchy a je tvořena laločnatými tabulovými buňkami • trojí chlupy - kuželovité štíhlé chlupy dvoubuněčné až čtyřbuněčné, paličkovité chlupy s jednobuněčnou nebo dvoubuněčnou paličkou a žláznaté chlupy s jednobuněčnou stopkou a paličkou složenou z více sekrečních buněk, nad nimi je sekreční měchýřek se silicí. • charakteristická je pokožka semeníku s tlustostěnnými buňkami se zvrásněným povrchem.
Majoránka- zvětšeno 100x
Cibule Mikroskopické znaky • pokožka na šupinách ze silně protáhlých buněk • pod pokožkou je hypoderm ze šestibokých buněk, v řadách a kolmo k protáhlým buňkám pokožky • téměř každá buňka obsahuje na konci krystalek šťavelanu vápenatého • v náhodném řezu se buňky parenchymu podobají tukové tkáni • cévní svazky jsou v řadě a jsou obklopeny buňkami, které obsahují olej
Cibule- zvětšeno 100x
Kmín Mikroskopické znaky : • pokožka • parenchym s velkými cévními svazky • endosperm - tenkostěnné buňky s obsahem tuku a aleuronových zrn
Kmín- zvětšeno 50x
Bramborový škrob Mikroskopické znaky • největší zrna ze všech domácích škrobů (70 100 µm) • vejčitá nebo eliptická s jádrem excentricky uloženým v užším konci a se zřejmým mimostředným vrstvením • někdy se vyskytují zrna podvojná a potrojná
Bramborový škrob-zvětšeno 400x
Pšeničná mouka Pšeničný škrob- mikroskopické znaky • zrna jsou dvojí - velká a malá • zrna čočkovitého tvaru • velká zrna mají velikost 12 - 41 µm, uprostředje slabě zřetelné jádro a téměř nepatrné centrické vrstvení • malá zrna jsou velká 2 - 8 µm
Mouka hladká-zvětšeno 200x
Mouka polohrubá-zvětšeno 200x
Sójová bílkovina Mikroskopické znaky • nemá strukturu, ale má formu • tvar - houbovité, popř. srpovité až kruhovité částice
Sójová bílkovin-zvětšeno 200x
Další vzorky ke studiu: • • • • •
Karagenan Zázvor-škrob Skořice Vláknina Kukuřičný škrob
• Další příklady využití fluorescenční mikroskopie
Fluorescence listů huseníčku • Fluorescence poskytuje užitečné informace o stavu fotosyntetického aparátu uvnitř buněk. Biologové svítí na rostlinu přesně definovaným způsobem a měří fluorescenci. Ze získaných dat pak mohou posoudit, nakolik je rostlina poškozena stresem. • Stresy podstatně snižují výnos zemědělských plodin. Proto jsou hledány způsoby, jak zlepšit odolnost rostlin vůči nim: například zvýšením obsahu přirozených ochranných látek (antioxidantů) nebo změnami hladin hormonů.
Fluorescence listů huseníčku •
Na fotografii vidíte listy huseníčku. Pokusné rostliny byly na pět dnů vystaveny teplotě 5 °C. Potom byla kamerou snímána fluorescence listů. Barvy ukazují její intenzitu. Oblasti nejvíce poškozené chladem jsou modré, nejméně postižené jsou červené.
• Princip IHC s použitím fluorochromu
Imunohistochemické metody • Základním cílem imunohistochemických metod je detekce specifických antigenních determinant (molekul či jejich částí) s využitím imunologické vazby, t.j. na principu vazby antigenu a protilátky. • Tuto vazbu si můžeme obrazně představit jako vztah specifického klíče (protilátky, která je zpravidla volná) k zámku (tkáňovému antigenu, který je zpravidla pevně fixován na určitou strukturu, např. na povrch buňky.
Nepřímá dvojstupňová IHC • Nepřímé IHC metody jsou ve srovnání s přímými sice komplikovanější, ale výhodou je, že mohou být mnohem citlivější.
• Na tkáňové řezy se nejprve aplikuje neoznačená protilátka (imunoglobulin) nebo sérum, které jsou specifické proti prokazovanému antigenu a nazýváme je primární protilátkou. • Ve druhé vrstvě nanášíme protilátku proti Fc-fragmentu imunoglobulinu zvířete, které bylo dárcem primární protilátky. Druhá (sekundární) protilátka je značená fluorochromem nebo enzymem a imunologickou vazbou se váže na protilátku primární.
Nepřímá dvojstupňová IHC Postup: • • • • • • • •
rostlinný či živočišný materiál nakrájet napínání řezu fixace v acetonu blokace pozadí (nespecifické vazby) vazba primární protilátky vazba sekundární protilátky barvení preparátů-fluorochrom montování preparátů
Pšeničný protein v masném výrobku • •
Zvětšeno 200x Barveno: Texas red
Děkuji za pozornost
