Flachner Beáta. Enzimek a cellulóz biológiai hasznosulásában: b-glükozidáz és a 3-foszfoglicerát kináz. Doktori értekezés. Okl

Enzimek a cellulóz biológiai hasznosulásában: β -glükozidáz és a 3-foszfoglicerát kináz Doktori értekezés

Flachner Beáta Okl. Biológusmérnök

Dr. Réczey Istvánné egyetemi docens BME Mezogazdasági Kémiai Technológia Tanszék

Kazinczyné Dr. Vas Mária tudományos tanácsadó MTA SzBK Enzimológiai Intézet

2003

Tartalomjegyzék 1

Bevezetés ...........................................................................................1

2

Irodalmi áttekintés ............................................................................2

2.1

β-glükozidáz ............................................................................................................... 2

2.1.1

β-glükozidáz szerepe az élovilágban ........................................................................ 3

2.1.2 A β-glükozidáz hasznosítási lehetoségei az iparban és a mezogazdaságban ........ 4 2.1.2.1 β-glükozidáz szerepe a bor aroma kialakulásában .......................................................4 2.1.2.2 Lignocellulózok lebontása – cellulóz alapú alkohol eloállítás .....................................5 2.1.2.2.1 A celluláz enzimrendszer..........................................................................................7 2.1.2.2.2 Cellulázok eloállítása ................................................................................................7 2.1.3 2.1.3.1 2.1.3.2 2.2

β-glükozidáz eloállítása ............................................................................................. 8 Aspergillus törzsek enzim termelése ............................................................................9 Pelletekben rögzített enzim...........................................................................................9 3-Foszfoglicerát kináz (PGK) ................................................................................. 12

2.2.1

A PGK szerepe az élo szervezetben........................................................................ 12

2.2.2

A PGK molekula térszerkezete............................................................................... 13

2.2.3 2.2.3.1 2.2.3.2

A szubsztrát kötohelyek szerkezeti leírása............................................................ 14 3-PG kötohely .............................................................................................................14 Nukleotid kötohely .....................................................................................................15

2.2.4

A doménzáródás mechanizmusa............................................................................ 17

2.2.5 2.2.5.1 2.2.5.2 2.2.5.3

A PGK funkcionális tulajdonságai......................................................................... 18 A fémion szerepe ........................................................................................................18 A szubsztrát kötodés sztöchiometriája és disszociációs állandói ...............................18 A PGK különleges enzimkinetikai viselkedése..........................................................19

3

Célkituzések ....................................................................................20

4

Alkalmazott módszerek ................................................................... 21

4.1

Az enzimek eloállítása ............................................................................................. 21

4.1.1

β-glükozidáz ............................................................................................................. 21

4.1.2

PGK........................................................................................................................... 21

4.2

Enzim vizsgálati módszerek.................................................................................... 21

4.2.1 4.2.1.1 4.2.1.2

Enzimaktivitás meghatározása............................................................................... 21 β-glükozidáz aktivitásának mérése .............................................................................21 PGK aktivitás mérése .................................................................................................22

4.2.2 4.2.2.1 4.2.2.2

Enzimkinetikai vizsgálatok ..................................................................................... 22 β-glükozidáz kinetikai vizsgálata ...............................................................................22 Gátlási kísérletek PGK-val.........................................................................................22

4.2.3 4.2.3.1

Egyensúlyi ligandkötodési vizsgálatok................................................................... 23 Egyensúlyi dialízis ......................................................................................................23

4.2.3.2 4.2.3.3 4.2.3.4

Kompetitív fluorimetriás titrálás.................................................................................23 Tiol-csoportok módosítása 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoát)-tal (DTNB) .......................23 Tiol-csoportok alkilálása jódecetamiddal ...................................................................24

4.3

Stabilitási vizsgálatok ..............................................................................................24

4.4

Kísérlettervezés........................................................................................................24

5

Eredmények és tárgyalásuk .............................................................26

5.1

β-glükozidáz..............................................................................................................26

5.1.1 5.1.1.1 5.1.1.2

Oldott β-glükozidáz..................................................................................................26 β-glükozidáz eloállítása ..............................................................................................26 A fermentlé felülúszók kinetikai tulajdonságainak összehasonlítása .........................27

5.1.2 5.1.2.1 5.1.2.2 5.1.2.3

Pelletekben rögzített β-glükozidáz vizsgálata........................................................29 Stabilizálási lehetoségek.............................................................................................30 Glutáraldehides rögzítés optimalizálása......................................................................31 Optimális kezelési körülmény vizsgálata hidrolízis kísérlettel...................................32

5.2

Foszfoglicerát kináz .................................................................................................33

5.2.1

Szubsztrát antagonizmus és a domének közötti kommunikáció .........................33

5.2.2 5.2.2.1 5.2.2.2 5.2.2.3 5.2.2.4 5.2.2.5 5.2.2.6

A nukleotid kötodés hatása a doménzáródásra.....................................................36 MgAMP-PCP*3-PG*PGK terner komplex kristályszerkezete ..................................36 ATP analógok enzimmel való kölcsönhatása .............................................................37 Nukleotidok tiol-reaktivitásra gyakorolt hatása és a hélix fexibilitás.........................38 Az ATP-t ill. a MgATP –t köto biner enzim komplexek kristály szerkezete .............40 A Mg2+ szerepe a PGK által katalizált foszfo-transzferben........................................41 A nukleotid foszfátok alternatív kötohelye és a doménzáródás kapcsolata................43

6

Összefoglalás -tézisek.......................................................................44

7

Közlemények Jegyzéke ....................................................................45

8

Irodalmi hivatkozások .....................................................................47

RÖVIDITÉSEK ABE

Aceton-butanol-etanol

FPA:

szuropapír bontó aktivitás

pNPG:

p-nitrophenil-β-D-glükopiranozid

PGK

3-foszfoglicerát kináz

1,3-BPG:

1,3-biszfoszfo-glicerát

3-PG:

3-foszfo-glicerát

α13:

13. számú α hélix A többi α hélixet is hasonlóképpen jelölöm.

βL:

L jelu β redo. A többi β redot is hasonlóképpen jelölöm.

G-3-P:

glicerol-3-foszfát

AMP-PNP:

β,γ-imido-adenozin-5’-trifoszfát

AMP-PCP:

β,γ-metilén-adenozin-5’-trifoszfát

DTNB:

5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoát)

DTT:

ditiotreitol

TNP-ATP:

2’3’-O-(2,4,6-trinitrofenil)ATP

Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki témavezetoimnek Dr. Réczey Istvánnénak és Kazinczyné Dr. Vas Máriának a munkám során nyújtott sokrétu és önzetlen segítségéért és útmutatásáért. Hálás vagyok Dr. Sevella Bélának a BME Mezogazdasági Kémiai Technológia Tanszék tanszékvezetojének és Dr. Friedrich Péter akadémikusnak az MTA Enzimológiai Intézetének igazgatójának, hogy biztosították számomra a lehetoséget, hogy kutató munkámat az intézetükben végezzem. Külön köszönöm Dr. Angelo Merlinek a Pármai Egyetem professzorának és Kováry Zoltánnak, az ELTE Elméleti Kémiai Tanszék munkatársának az együttmuködést a kristályos enzimmel végzett munkában. Köszönöm az összes kollegám barátságát és segítségét mind a BME Mezogazdasági Kémiai Technológia Tanszékén, mind a MTA Enzimológiai Intézetében. Köszönöm a Varga József alapítványnak ösztöndíjam kiegészítését, a Soros alapítványnak és az OMFB-nek, hogy lehetové tették nemzetközi konferencián való részvételemet és az OTKAnak, hogy kutatásaim anyagi forrásait biztosította. Külön köszönöm szüleim állhatatos segítségét, férjemnek Dr. Pollner Lászlónak és gyerekeimnek Nórának és Barnabásnak irántam tanúsított szeretetüket és türelmüket.

Bevezetés

1

1 BEVEZETÉS Az enzimek használata jelentosen megnott az elmúlt évtizedekben, számos helyen találkozhatunk velük az élet minden területén. Az iparban majdnem minden területen alkalmaznak enzimeket, fontos szerephez jutnak finom vegyszerek, gyógyszerek eloállításában, az élelmiszeriparban (mint a sütoipar, sör, bor, tejtermék eloállítás), a textil- és papíriparban, de egyre nagyobb szerepet kapnak a diagnosztika és a környezetvédelem területén is. Ennek következtében az utóbbi évtizedekben elotérbe került az enzimek kutatása, fejlesztése. Fontos megismernünk az enzimek tulajdonságait, optimalizálnunk eloállítási körülményeiket, felhasználhatóságukat, vizsgálni stabilitásukat, pH és homérséklet optimumukat, hogy megtalálhassuk az „ideálisan” katalizáló enzimet az ipari felhasználáshoz. Fontos a számunkra azonban a muködési mechanizmusuk tanulmányozása is, mely egészen más módszereket és mélységet kíván, mint az ipari kutatás. Ezen alapveto enzimológiai tudás ismeretében hatékonyabb muködésu, stabilabb, új tulajdonságokkal pl. módosított sztereospecificitásal rendelkezo enzimeket fejleszthetünk ki a genetikai módosítás és modern enzimvizsgálati módszerek segítségével. Doktori munkám során a cellulóz hasznosítási folyamatát vizsgálva mind az ipari enzim fejlesztésben, mind az enzim alapkutatásban részt vettem. A cellulóz a Földön a legnagyobb mennyiségben eloforduló szerves anyag, ß-1-4glükozidos kötésekkel D-glükóz molekulákból felépülo lineáris polimer, a fás növényi részek fo alkotóeleme. Miután fotoszintézis következtében újratermelodik, jelentosége az utóbbi években a fenntartható fejlodés megteremtésének, a megújuló nyersanyagok és energiaforrások felhasználásának elotérbe kerülésével felértékelodött. Hasznosítása sokrétu, az építoipar, bútoripar az eredeti szerkezetében ligninnel és hemicellulózzal együtt használja fel, a textilipar, papíripar ugyancsak polimer formában, de részben, vagy egészben a kíséro polimerektol elválasztva hasznosítja. A cellulóz építoköveire történo bontása utáni hasznosításának egyre növekvo jelentosége van napjainkban, hiszen a glükóz számos fermentációs folyamat szénforrása lehet. A cellulóz enzimes lebontásában számos enzim tevékenykedik, ezek közül doktori dolgozatomban két enzimmel foglalkozom, a β-glükozidázzal és a glükóz tovább alakításának egyik kulcs enzimével a foszfoglicerát kinázzal (PGK). Miután kísérleti munkámat két különbözo kutatóhelyen, a Budapesti Muszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Mezogazdasági Kémiai Technológia Tanszékén és az MTA SzBK Enzimológiai Intézetében végeztem, a kutatóhelyek eltéro jellegébol és adottságaiból eredoen lehetoségem volt mind az enzimes alapkutatás, mind az alkalmazott kutatás kérdéskörével és sajátos módszereivel megismerkedni. A ß-glükozidáz esetében, mely a cellulóz lebontás utolsó enzime, kísérleteim célja az ipari alkalmazás megteremtésének elosegítése. Az enzim eloállításának, rögzítésének lehetoségeit vizsgálom, különös tekintettel a muködés közbeni stabilitás javításának lehetoségéire. A PGK enzimmel kapcsolatos méréseim az enzim szerkezeti felderítéséhez kapcsolódnak, ahol a szubsztrát kötés vizsgálata és a két szerkezeti doménból álló enzim domén mozgásának tanulmányozása segíthet az enzimmuködés szerkezeti mechanizmusának megértéséhez.

2

2. Fejezet

2 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 β-glükozidáz A β-glükozidázok széles körben megtalálhatóak az élovilágban mind a pro- mind az eukarióta szervezetekben. Elofordulnak mikroorganizmusok (baktériumok, élesztok és gombák) körében, növényekben és emlosök sejtjeiben, ahol a di- és oligoszaharidok és más aryl- vagy alkil-β glükozidok β-glükozidos kötését hasítják (1. egyenlet). A lebontási folyamat mellett a glükozidázok képesek a glükozil csoportok direkt összekapcsolására (transzglikolízis). Ez vagy a hidrolitikus folyamat fordítottjaként, vagy egy glükozil csoport átvitelével történik egy aktivált donorról egy akceptorra.

cellobióz

β-D-glükóz

1. egyenlet: A β-glükozidáz által katalizált reakció

Számos biológiai folyamatban kulcsszerepet játszanak a β-glükozidázok. Ilyen a cellulóz tartalmú biomassza lebontása vagy a glikolipidek hidrolízise. Másodlagos metabolitok módosításával növényi aroma eloállításban vesznek rész. Fontos szerepet töltenek be a növények saját védelmében, ahol illékony mérgezo anyagokat állítanak elo növényi glükozidok bontásával.

1. ábra: β-glükozidáz (β/α)8 hordó alalú térszerkezete Bacillus polymyxa enzim, glükonátot tartalmazó alegységének kristály szerkezete (1)

Irodalmi áttekintés

3

A β-glükozidázok aminosav szekvenciai homológia alapján a glikozid hidrolázok 1. és 3. családjába tartoznak (2). Az 1. típusú családba tartozó, foként bakteriális eredetu enzim háromdimenziós szerkezete (β/α)8 hordó alakú (1. ábra). Asszimetrikus homodimer (3, 4) ill. ezek összekapcsolódásával létrejövo oktamer alegység szerkezetu (1). A hidrolízisben kémiailag résztvevo proton donor és a nukleofil glutaminsav oldalláncok a fehérjelánc 4. ill. 7. szálán TFNEP ill. ITENG konzervált motívumokban találhatók. A cukor szubsztrát kötodését számos oldallánc kontaktus stabilizálja, az egyes oldalláncok alkalmasak mind glükóz, mind galaktóz kötésére is, mellyel jól magyarázható az enzim család egyideju glükozidáz és galaktozidáz aktivitása. A szubsztrát hosszúságát az aktív centrum körüli hurkok hossza és elhelyezkedése határozza meg, így ez enzim cellobiózon kívül kettonél nagyobb tagszámú cellulo-oligozokat is képes bontani. A glikozid hidrolázok 3. családjába tartozó gomba eredetu enzimek szerkezete még nem ismert.

2.1.1 β-glükozidáz szerepe az élovilágban A földünkön legnagyobb mennyiségben eloforduló szerves anyag, a cellulóz lebontásában fontos szerepet játszanak a β-glükozidázt szintetizáló mikroorganizmusok. Az enzim a talaj mikroflórájában éppúgy megtalálható, mint a pillangósvirágúak gyökérgümoiben és a kérodzok gyomrából izolált gombákban. A legismertebb β-glükozidáz termelo baktérium törzsek az anaerob Clostridium thermocellum, az Acetivibrio cellulolyticus, a bendo baktérium Bacteroides succinogenes. A legismertebb gombatörzsek a fekete Aspergillus-ok, a Trichoderma reesei, a Thermoascus aurantiacus és az éleszto Sacharomices cerevisiae (5). Ezek közül számos törzzsel részletesen a késobbiekben foglalkozom. A mikroorganizmusok β-glükozidázának szerepe lehet az adott organizmus többi cellulázának indukálásában is, azáltal, hogy a természetben igen ritkán eloforduló indukáló disszaharidokat mint pl. a szoforózt transzglikolízissel állítják elo (6). Több szerzo szerint a szoforóz a celluláz termelo Trichoderma reesei fontos induktora (6, 7) A növényvilágban a β-glükozidáz szerepe a fiziológiailag fontos anyagok β-D-glükozidos formában való tárolásán és ezek megfelelo idoben történo felszabadításán alapul. Részt vesz a virágok pigmentációjában (5, 8), ahol flavonok és antocianidok szabadulnak fel és fontos a növényi hormonok aktiválásában is (9, 10). Szerepet játszik az aroma kialakulásában, amit pl. az eper esetében Orruno és mtsai. kimutattak, ahol az érés folyamán a β-glükozidáz és az eper aromát tartalmazó glükozid mennyisége egyaránt megnott (11). A növényekben a mikrobák, rovarok és parazita növények elleni védekezo mechanizmus kulcsenzime (12-14). Mivel a növények nem tudnak elmenekülni, elbújni a veszély elol ezért egy biokémiai védekezo mechanizmust fejlesztettek ki. Keseru vagy mérgezo anyagok (pl. tiocianidok, nitrilek, terpénalkaloidok, szaponiok, benzaldehid és HCN) nem mérgezo glükozidos formában tárolódnak a növény szövetében, melyekbol az aktív anyagot megfelelo idoben kulcsenzim a β-glükozidáz szabadítja fel. A búzában, a kukoricában és a rizsben a legnagyobb mennyiségben eloforduló másodlagos metabolitok a ciklikus hydroxamin savak fontos szerepet játszanak a növény védelmében. Csírázás során ezek glükozidjai és a β-glükozidáz szintje egyidejuleg megno, így a felszabaduló ciklikus hydroxamin savak már a növekedés elejétol fogva betöltik védelmi szerepüket (15). A növény a hernyó, atka vagy egyéb támadásra egy bonyolult kaszkád rendszeren keresztül válaszol. Ennek eredményeként a glükozidos formában tárolt illékony méreg hasítás révén felszabadul és elriasztja vagy megmérgezi a támadót. Bonyolultabb esetben, amikor a kártevo már védett a növényi méreggel szemben, az illékony anyag oda vonzza a növényevo ragadozóját (pók, húsevo rovar vagy darázs), így az megeszi a növényevot, megszabadítva a növényt károkozójától (16-18).

4

2. Fejezet

Ez a növényi védelem azonban sajnálatos módon az állatokra és az emberre is veszélyt jelenthet. Toxikus aglikont tartalmaz pl. a mannioka gyökér, a limabab, a lenmag és a keseru mandula. A cianogén β-glükozid (linamarin) tartalmú manioka fontos táplálék Afrika Ázsia és Dél-Amerika trópusi részein, mely nyersen fogyasztva cianid mérgezést okoz, azonban megfozve, azaz a β-glükozidázt tönkretéve, ez a veszély megszunik. Ehhez hasonló a keseru mandula is, mely pörkölés nélkül fogyasztva mérgezo. A keresztes virágú zöldségek (káposzta, kelkáposzta brokkoli, mustár, torma) jellemzoen keseru, csípos aromát tartalmaznak, mely ugyancsak a fent leírt növényi védelem hozadéka. Az emlos sejtekben a lizoszómális β-glükozidáz az endoplazmatikus retikulumban a glükozil ceramidok lebontásában játszik szerepet. Született enzimhiány esetén (Gaucher betegség) a lépben, a májban, a tüdoben, a csontveloben felhalmozódik a lebontatlan glükozil ceramid és a szervek megnagyobbodását okozza (19). A betegség ritkábban az idegrendszert támadja meg, ahol kiterjedt és eroteljes idegrendszeri károsodást okoz (20). Legtöbb esetben megfelelo β-glükozidázos kezeléssel gyógyítható ez a veleszületett betegség (21, 22).

2.1.2 A β-glükozidáz mezogazdaságban

hasznosítási

lehetoségei

az

iparban

és

a

A β-glükozidáznak számos alkalmazási lehetosége kínálkozik. Alkalmazható az élelmiszeriparban (bortermelés, gyümölcslé eloállítás) természetes aroma-, illatanyag eloállítására, mivel a természetben igen sok növény aromaanyaga glükozidos formában található meg, amelyek bontása β-glükozidázzal az aroma felszabadulását eredményezi. Használható a kellemetlen ipari mellékhatásoktól való mentesítésre is, pl. a narancslé pasztörizálás alatti megbarnulása megakadályozható β-glükozidázos elokezeléssel, amikor is az enzimes kezelés hatására könnyen eltávolítható, oldhatatlan aglikon keletkezik (23). Az illatszer ipar érdeklodése is várható a β-glükozidáz felhasználása iránt, ahol a természetes illatanyagok, pl. a parfüm eloállításban használhatják fel az enzimet. A β-glükozidáz fontos szerepet játszik a növények növekedésében. Ez lehetoséget teremt arra, hogy a nagyobb terméshozam elérése érdekében, a növények növekedését és fejlodését az enzim megfelelo módosításával elosegíthessük ill. szabályozhassuk (24). A β-glükozidáznak nagy jelentosége van a növényvédelemben is, így elképzelheto, hogy genetikai módosítással növelheto a növények természetes védelme, csökkentve a költséges és környezetszennyezo növényvédoszerek alkalmazását (24). Manapság az enzim legfontosabb alkalmazási területe azonban a cellulóz enzimes lebontása, mely során a keletkezo glükóz bioetanol vagy egysejtfehérje eloállítására használható. A felsorolt lehetoségek közül a β-glükozidáznak, az iparilag jelentos bortermelésben és bioetanol eloállításában elfoglalt szerepét ismertetem részletesen az alábbiakban.

2.1.2.1 β-glükozidáz szerepe a bor aroma kialakulásában A β-glükozidáz a bortermelés egyik fontos enzime, mely segítségével a monoterpentilglükozidokból hasítás révén a fontos aromaanyagok alakulnak ki. Ezek a terpentolok részint szabad formában, részint 6-O-α-L-arabinofuranosil-β-D-glükopiranoz és 6-O-α-Lrhamnopiranozil-β-D-glükopiranozid formában vannak jelen, melyek aglikon részei foként

Irodalmi áttekintés

5

galaniol, neol, citronellol, linalool és α-terpineol (25). Az aroma teljes kialakulásához, mely igen lassú folyamat, más glikozidáz enzimek, így a α-L-arabinofuranozidáz ill. α-Lrhamnopiranozidáz jelenléte is szükséges (26). Az elso lépésben az elobb említett enzimek bontják az aroma tartalmú cukrokat, majd ezt kövezoen a β-glükozidáz szabadítja fel az aroma anyagot (2. ábra). A szolo eredetileg is tartalmaz β-glükozidázt, de ennek stabilitása az erjedés savas pH tartományában nem megfelelo. Az erjesztés mikroorganizmusa a S. cerevisiae alacsony βgükozidáz aktivitású, ami ráadásul könnyen gátlódik a bor erjedési körülményei között (27, 28). A megfelelo aroma kialakulásához tehát széles aglikon specificitású β-glükozidáz enzimkészítmény adagolása szükséges. Az enzim kiválasztásánál a 0,5M glükóz és a 10-15% alkohol tolerancia is elengedhetetlen feltétel, mivel ezen körülmények az erjedési folyamat velejárói. Erre a célra törzs szelektálási és fejlesztési kísérlek során Martino és mtsi (29) egy A. niger, Spanga és mtsi pedig egy Pichia anomala (30) és egy S. cerevisiae (31) törzset találtak megfelelonek. Az eloállított és tisztított enzimet rögzített formában alkalmazták mindhárom esetben.

2. ábra: A β-glükozidáz szerepe a bor aroma felszabadulásában

Az enzim rögzítése azért elonyös, mivel ezáltal könnyen elválasztható a termelt bortól és ez lehetové teszi az enzim újra felhasználását. Ezenkívül a rögzítés növeli az enzim stabilitását csökkentve a felhasználandó enzim mennyiségét és emellett lehetové teszi a folyamatos technológia használatát is. Rögzített β-glükozidáz alkalmazása a borászatban a rögzítés általános elonyein kívül különösen kívánatos, mivel az Európai Uniós szabályok nem teszik lehetové oldott enzim alkalmazását. Az enzim rögzítését citozán gélbe (32), amin agaróz gélbe zárással (33) ill. hidroxi-apaptit gyöngyökhöz kötéssel (34) oldották meg a kutatók.

2.1.2.2 Lignocellulózok lebontása – cellulóz alapú alkohol eloállítás Az intenzív fejlodés következtében, a világ koolaj készlete egyre növekvo ütemben csökken, ezért egyre növekszik az érdeklodés az alternatív, nem koolaj alapú, megújuló

6

2. Fejezet

energiaforrások iránt. Mivel a közlekedésre fordított energia 97% koolajból származik, ezért a kutatók az utóbbi 20 évben világszerte nagy erofeszítéseket tettek újfajta üzemanyagok kifejlesztésére. Egy jó lehetoség az etilalkohol alkalmazása benzin helyett, amit ma még foként kukoricakeményítobol származó glükóz fermentációjával állítanak elo. Egyre erosödik azonban az a tendencia, hogy ne csak élelmiszeripari növénybol állítsunk elo etilalkoholt, hanem mezogazdasági melléktermékbol és hulladékból is, mint pl. kukoricaszár, cukornád hulladék, búza vagy rizs szalma, fa- és papíripari hulladék vagy a kommunális hulladék cellulóz része (35). Ezen melléktermékek és hulladékok nagy százalékban cellulózt tartalmaznak melynek hasznosítását az alábbiakban mutatom be. A cellulóz a Földünkön a legnagyobb mennyiségben eloforduló megújuló nyersanyag, melybol évenként 4*1014 tonnát termelnek a fotoszintetizáló növények (36). A természetben nem fordul elo tisztán, hanem a ligninnel és a hemicellulózzal együtt a lignocellulózokat alkotja. A keményfa 40-55% cellulózt, 24-40% hemicellulózt és 18-25% lignint tartalmaz, de a különbözo lignocellulózokban a komponensek részaránya tág határok között változhat (37). A cellulóz a növényi sejtfal fo alkotórésze, lineáris láncú homopolimer, melyet β-1,4-glükozidos kötéssel kapcsolódó D-glükóz molekulák alkotnak. Ez egy nagyon stabil H-híd kötésekkel és hidrofil kölcsönhatásokkal stabilizált szerkezet, melyet hemicellulóz és lignin vesz körül. A hemicellulóz rövidebb szétágazó polimer lánc kb. 200-as polimerizációs fokkal. A legtöbb hemicellulóz viszonylag könnyen hidrolízálható az ezeket alkotó glükózra, galaktózra, mannózra, xylózra, arabinózra vagy más monoszaharidokra ill. ezek uronsavaira. A lignin a harmadik fo komponense a növényi részeknek. Fenolos heteropolimer, mely három prekurzorból származik melyek p-hidroxi-fahéjalkohol, 4-hidroxi-3-metoxi-fahéjalkohol és a 3,5dimetoxi-4-hidroxi-fahéjalkohol. Ezen három alkohol szabad gyökös kopolimerizációja révén heterogén, optikailag inaktív, keresztkötött anyag jön létre, mely rendkívül ellenálló a kémiai és enzimes lebontással szemben, bár néhány gombák, foként a Basidomicetes törzsek képesek a lebontására. A fában és más lignocellulózokban a cellulóz kristályos és amorf formában egyaránt megtalálható. A hemicellulóz összetétele éppúgy mint a lignin koncentrációja és szerkezete igen különbözo lehet, pl. szignifikánsan eltér a kemény és puhafa esetén. Mivel a különbözo lignocellulózok igen eltéroek, feldolgozásuk különbözo eljárások kidolgozását igényli, így hasznosításuk is nagyon bonyolult (38). A cellulóz és hemicellulóz frakció alkalmasan választott elokezelés (39), majd enzimes hidrolízis után (37), megfelelo szénforrás lehet egy sor fermentációs technológiai folyamatban. Eloállíthatunk különbözo oldószereket (ABE ill. etanol fermentáció), egysejtfehérjét, hidrogént vagy antibiotikumokat. A lignint számos gomba és baktérium képes lebontani, de a lebontás sebessége egyenlore nem tesz lehetové ipari alkalmazást. Hasznosítására különbözo kémiai anyagok, foként adszorbensek gyártásával is próbálkoznak (40), de a nagy égéshoje miatt ma még elégetését tervezik. Egyelore csak elgondolások léteznek olyan gyár tervezésére, mely a lignint, mint tüzelot alkalmazná a technológia hoigényének fedezésére. A hemicellulóz az elokezelés alatt vízoldható pentózzá bomlik le, ami már felhasználható etanol eloállítására, bár az erre a célra általában használt S. cerevisiae csak a glükózt hasznosítja szénforrásként, ezért pentóz frakció hasznosítására rekombináns éleszto ill. baktérium törzsek felhasználását tervezik (35). A cellulózból nagy mennyiségu glükóz eloállítása savas vagy enzimes hidrolízissel történhet. A savas hidrolízis magas homérsékleten és alacsony pH-n történik, mely erosen korrodálja a berendezéseket. Problémát jelent emellett a melléktermékek keletkezése is mint pl. a

Irodalmi áttekintés

7

tipikusnak mondható 5-hidroximetil-furfurol, amelyek inhibitorai az etanol termelo élesztoknek. Ezzel ellentétben a cellulóz enzimes hidrolízise szelektíven, nagy glükóz kitermeléssel megy végbe inhibitorok keletkezése nélkül. A végso lépés, az etanol eloállítás élesztok segítségével történik. A cellulóz hidrolízise glükózzá, majd a glükóz fermentációja etilalkohollá történhet két különálló lépésben, különkülön reaktorban, de végrehajtható egyszerre egy helyen is. Ez utóbbit szimultán lebontás és fermentációnak (simultaneous saccharification and fermentation, SSF) nevezik (35, 41, 42).

2.1.2.2.1A celluláz enzimrendszer A cellulóz enzimes hidrolízisét a celluláz enzimredszer hajtja végre, melynek fo komponensei az endoglükanázok (1,4-β-D-glükán-4-glükanohidroláz, EC 3.2.1.4), melyek véletlenszeruen támadják a cellulóz amorf részeit, szabad lánc végeket hozva létre; az exoglükazázok (1,4-β-D-glükán-cellobiohidroláz, EC 3.2.1.91), melyek a cellulóz molekula redukáló ill. nem redukáló végérol cellobiózt hasítanak le. A rendszer harmadik tagja, a β-glükozidáz (1,4-β-glükozidáz, EC 3.2.1.21), egyes szerzok szerint nem valódi celluláz (24), de miután muködése elengedhetetlen a hatékony cellulóz bontás eléréséhez, ezért a cellulázokhoz sorolható. Az oldhatatlan natív cellulózt az exo- és endoglükanázok szinergikus támadása bontja le oldható cellodextrinek és cellobióz keletkezésével, amit a β-glükozidáz tovább hasít, a termék glükózzá. E három fo komponensen kívül a hemicellulóz lebontását még glükuronidáz, acetilészteráz, xilanáz, β-xilozidáz, galaktomannáz és glükomannáz enzimek is segítik.

2.1.2.2.2 Cellulázok eloállítása Számos gomba és baktérium képes cellulózt hasznosítani, azonban csak nagyon kevés termeli a teljes celluláz enzimrendszer minden, a kristályos cellulóz lebontásához szükséges tagját. Az ipar érdeklodését is felkelto cellulóz bontó gombák a Trichoderma, Aspergillus és Penicillium fajok speciális törzsei valamint Phanerochaete chrysosporium és a Sclerotium folfsii (37, 39, 43, 44). A baktériumok közül a Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Bacteriodes és Streptomyces fajok termelnek celluláz enzimeket, melyek közül foként a Cellulomonas fimi, a Thermomonospora fusca, az anaerob Clostridium thermocellum és Bacteriodes cellulosolvens törzseket vizsgálták (39). A legjobban vizsgált gomba a Trichoderma reesei. A Trichoderma reesei mutánsait a T. reesei QM6a törzsbol fejlesztették ki. A mutáció célja a celluláz enzim termelés növelése volt, mivel a bioetanol eloállításának ez a legköltségesebb része (45). Eloállították tehát a hiper celluláz termelo T. reesei QM9414 és RUT C30 törzset, melyek 17- ill. 25-ször nagyobb szuropapír bontó aktivitással (Filter Paper Activity, FPA) rendelkeznek mint az eredeti QM6a törzs (46). Az így kifejlesztett a törzseknek azonban a βglükozidáz enzim termelése elégtelen a cellulóz hidrolíziséhez, ami cellobióz felhalmozódáshoz vezet, mely két okból is kedvezotlen. Egyrészt a cellobióz gátolja az endo- és exoglükanázokat ezzel csökkentve a cellulóz lebontás hatékonyságát (47, 48), másrészt a cellobióz az alkohol eloállítására használt Saccharomyses cerevisiae számára nem fermentálható cukor, mely az etanol hozam csökkenését okozza (5). Mindebbol látszik milyen fontos a megfelelo mennyiségu β-glükozidáz jelenléte a cellulóz enzimes hidrolízise folyamán. Ennek biztosítási lehetoségei a következok: a jó celluláz termelo T.

8

2. Fejezet

reesei törzsek továbbfejlesztése genetikai módosítással (49), a T. reesei törzsek fermentálási körülményeinek átalakítása, annak érdekében, hogy β-glükozidáz termelést emeljük (50, 51), avagy, jó celluláz termelo törzsek felkutatása, melyek magas β-glükozidáz aktivitással rendelkeznek (52, 53). Természetesen arra is van lehetoség, hogy β-glükozidázt szükség szerint pótoljuk a hidrolízis során (54). Dolgozatomban a β-glükozidázzal végzett munkám során az utóbbi megvalósítását tuztem ki célul, ezért az enzim irodalmi bemutatásának hátralevo részében ezzel foglalkozom.

2.1.3 β-glükozidáz eloállítása Ahhoz, hogy az enzimes hidrolízis katalizáló Trichoderma enzimkoplexet β-glükozidázzal kiegészíthessük, az enzimet nagy mennyiségben és jó aktivitással kell eloállítanunk. Stenberg és munkatársai (55) már 1976-ban több mint 200 féle gomba és 15 féle baktérium törzs β-glükozidáz termelését vizsgálták, melyek közül a fekete Aspergillus törzsek enzim termelését kiemelkedonek találták. Az irodalomban is foként ezen törzseket tanulmányozzák behatóbban, mindamellett más törzsek használata is felmerült, bár ezek enzim termelése néhány kivételtol eltekintve elmaradt az Aspergillus törzsekétol. Vizsgálták anaerob Neocallimastix frontalis bendogombát (56), melynek β-gükozidáz termelése 0,87 U/ml vagy a Piromices ill. Orpinomyces törzseket (57) melyek ennél is alacsonyabb enzimtermelést (0,1 U/ml) mutattak. A boreloállításban fontos a megfelelo specificitású β-glükozidáz, ezért Spanga és munkatársai mustból élesztoket izoláltak és vizsgálták az enzim termelésüket. A legmegfelelobbnek a Pichia anomala törzset találták (31). Mások a Candida wickerhamii törzset aerob és anaerob körülmények között vizsgálták, ahol 1,8 ill. 3,2 U/ml enzimaktivitást mértek (58). A legnagyobb, meglepoen magas 22,2 U/ml aktivitást a Schizopyllum commuene törzs esetében mértek a kutatók (59). A elozoekben bemutatott nem Aspergillus törzsekbol származó enzimek homérséklet optimuma viszonylag alacsony, 30 °C-körül található. Gomes és mtsi (60) kiváló eredményeket értek el a termostabil Thermoascus aurantiacus-val melynek β-glükozidáz termelése jó (6,2 U/ml ), homérséklet optimuma 70 °C és az enzim féléletideje 23,5 óra ezen a hofokon. Több kutató vizsgálta annak lehetoségét, hogy jó celluláz termelo törzseket kevert kultúrájú fermentációban együtt fermentáljon olyan törzsekkel, melyek jó β-glükozidáz termelok. Foként T. reseei és Aspergillus törzsek használatosak együtt az ilyen típusú fermentációhoz (61-63). Kevert kultúra alkalmazása esetén a kutatók minden esetben magasabb a β-glükozidáz termelést tapasztaltak, mint a külön fermentált Trichoderma esetében, azonban az Aspergillus törzseknél alacsonyabbat. A fermentáció vezetés optimumának meghatározása is igen fontos, mivel a különbözo törzsek optimális növekedési homérséklete ill. pH-ja igen különbözo lehet. Ez azért is szükséges, hogy a fermentáció folyamán egyik kultúra se erosödjön meg a másik rovására, így a termelt enzim mennyisége és összetétele megfelelo legyen. Más termelo törzsek esetében is alkalmaztak kevert kultúrájú fermentációt β-glükozidáz termelésére, pl. Garsia és mtsi egy Pennicillium és egy Aspergillus terrus törzset fermentáltak együtt (64). A celluláz és β-glükozidáz enzim eloállítása jelenleg foként szubmerz (süllyesztett) fermentációval történik, ennek dacára érdemes említést tenni a szilárd fázisú fermentáció, mely kihasználja a cellulóz lebontásában résztvevo fonalas gombák azon természetes tulajdonságát, hogy képesek a lebontandó anyag felületén növekedni. Így a fermentáció is a fermentálandó anyag felületén, szilárd fázisban történik. Ma az iparban foként még szubmerz fermentációt alkalmaznak, mivel a technikai paramétereik könnyebben szabályozhatóak, mint szilárd fázisú fermentáció esetén. Fontos lehet azonban ez a fermentációs technika, mivel a celluláz és így a

Irodalmi áttekintés

9

β-glükozidáz fermentációjára gyakran olcsó hulladék anyagokat használunk fel, melyek szilárdan állnak rendelkezésünkre. Pl. a búzaszalma (51, 65) és a kukoricaszár (66) jól felhasználható ilyen fermentációra. Ezenkívül a fonalas gombák szilárd fázisú kultúrában termelt enzimjeinek mennyisége nagyobb és gyakran meghaladja a szubmerz kultúrában termelt enzimét (67). Ennek oka az, hogy a két fázis közötti különbözo tenyésztési feltételek különbözo gének expresszióját eredményezhetik, így különbséget kaphatunk a fenotípusban, a növekedésben, a fejlettségben éppúgy, mint az enzimtermelésben. Az így megtermelt fehérje egy specifikus gén expressziós rendszer segítségével kijut az extracelluláris térbe, míg szubmerz kultúrák estén gyakran a sejtfalhoz kötött marad. Grajek (68) termofil gombák szilárdfázisú és szubmerz fermentációját hasonlította össze és a szilárd fázisban jóval magasabb β-glükozidáz enzim termelést tapasztalt. A szilárd fázisú fermentáció elonye a rendkívül alacsony energia igény is, hisz nincs szükség keverésre és a levegoztetés is megoldható egyszeru ventillációval. Mind a kevert kultúrájú, mind a szilárd fázisú fermentáció jó lehetoség. Az elobbiben a két törzs fermentációja által eloállított enzimkomplex nagyobb arányban tartalmaz ugyan βglükozidázt, azonban ez alacsonyabb aktivitású mint a külön eloállított enzim. Az utóbbi bár magas aktivitású enzimet eredményez számos technikai nehézséget tartogat. Dolgozatomban a celluláz enzim komplex kiegészítésére hagyományos szubmerz fermentációban alkalmazott Aspergillus törzsek β-glükozidáz termelését vizsgáltam, ezért a továbbiakban ezt tárgyalom részletesen.

2.1.3.1 Aspergillus törzsek enzim termelése Az Aspergillus törzsek β-glükozidáz termelését széles körben tanulmányozták, vannak kutatók, akik különbözo törzsek enzim termelését vizsgálták azonos körülmények között (69), mások azonos törzset alkalmaztak különbözo szénforráson (70) ill. megint mások különbözo fermentációs technikák hatását tanulmányozták az enzimtermelésre (71). Mivel ezek összehasonlítása igen nehéz, ezért az 1. táblázatba foglalom az általam fellelt fermentációs eredményeket. A fenti adatok alapján a legjobban hasznosítható szénforrásnak a glükóz bizonyult, ami nem meglepo, mivel ez egyszerubben hasznosítható a gombák számára mint a mezogazdasági hulladékok. Olcsó enzim eloállításhoz azonban fontos, hogy az olcsó alapanyagok is jól hasznosíthatóak legyenek a gombák számára, ami az elokezelés és a fermentációs technika optimalizálásával érheto el. Például A. fumigatus esetén a magas, 9,69 U/ml enzimtermelés az optimalizálás eredménye (72). Különbözo fermentációs technikák vizsgálata során Kim és mtsi (71) az air-lift fermentort találták a legalkalmasabbnak β-glükozidáz eloállítására. Az enzim eloállítás természetesen a fermentációs ido függvénye is, mivel a β-glükozidáz csak a szénforrás hasznosulása után mérheto a fermentlében. Az irodalom alapján a legjobb β-glükozidáz termelo törzs az A. fumigátus és az A. niger.

2.1.3.2 Pelletekben rögzített enzim A fonalas gombák, amilyenek az Aspergillus törzsek is, növekedése a szabadon eloszló, változatos és bonyolult alakzatú, gyakran elágazó hifáktól a pelletes növekedésig igen különbözo lehet (73). A pellet a hifák összekuszálódott suru szövedéke, melynek átméroje néhány száz µmtol, néhány mm-es nagyságig terjedhet. Egy a suru hifa szövedéku magból és az ezt körülvevo lazábban szövodött gyurubol vagy „bolyhos” régióból áll. Belsejében az oxigén- és más anyagtranszportot a diffúzió korlátozza, melynek elégtelensége esetén közepe autolizál és belül

10

2. Fejezet

technika

ido(h)

C-forrás

β-glükozidáz aktivitás U/ml

rázatott lombik

144

gozrob. fuzfa

2,9

(69)

rázatott lombik

72

narancshéj

0,9

(23)

kevert reaktor

192

2% rizs szalma

4,0

(71)

fed-batch

192

2% rizs szalma

3,6

(71)

fed-batch szak. rátáplálásal

72

2% glükóz

9,2

(74)

air-lift fermentor

192

2% rizs szalma

4,0

(71)

buborék oszlop

192

2% rizs szalma

3,8

(71)

rázatott lombik

240

glükóz

2,85

(70)

rázatott lombik

240

cellobióz

1,6

(70)

rázatott lombik

240

maláta extrakt

3,4

(70)

rázatott lombik

144

2%búzaszalma

9,69

(72)

rázatott lombik

168

4%búzaszalma

5,88

(75)

rázatott lombik

168

1%búzaszalma

1,02

(76)

rázatott lomb ik

168

1%cukornád

0,83

(76)

A. phoenicis

rázatott lombik

144

gozrob. fuzfa

4,6

(69)

A. foetidus

rázatott lombik

144

gozrob. fuzfa

2,02

(69)

Fermentálási körülmények Mikroorganizmus A. niger

A. wentii

A. fumigátus

A. terreus

Ref

1. táblázat: Aspergillus törzsek β-glükozidáz eloállítása

lyukas pelletek keletkeznek. A pelletek belsejében a limitált anyag transzport miatt magasabb enzimtermelés tapasztalható (A. niger estén pl. hatszoros az enzimtermelés pelletek létrejöttével (77)). Tehát az Aspergillus törzseknél gyakori pelletes növekedés jó lehetoséget ad rögzített enzim készítmény eloállítására, amennyiben az enzim a pelleten belül marad és nem választódik ki a fermentlébe. Réczey és munkatársai (78) az Aspergillus phoenicis QM 329 törzs pelletes növekedését tapasztalták, mind rázatott lombikos, mind „air-lift” típusú fermentáció során. A pelletek átlag 2mm átmérojuek és jó β-glükozidáz aktivitásúak (33,4 U/ml pellet) voltak. 48 órás cellobióz hidrolízis alatt az aktivitásuk 75%-a megmaradt, így egy jó aktivitású rögzített készítményt kaptak. A késobbiekben (79) fluid ágyas reaktorban vizsgálták ennek a készítménynek a muködési stabilitását. Folyamatos cellobióz hidrolízis mellett 50°C-on és 4,8-as pH-n a pelletekben lévo β-glükozidáznak 700 óra volt a féléletideje. Ipari alkalmazáshoz szükséges a pelletek szárítása a sterilezhetoség, a könnyebb és olcsóbb szállíthatóság miatt. A BME Mezogazdasági Kémiai Technológia Tanszéken Szabó Ildikó szárított pelletekkel végzett cellobióz hidrolízist, mely során 30h félélet idot tapasztalt (80). Felmerült a kérdés, hogy mi okozza ez a drasztikus féléletido csökkenést és ez hogyan küszöbölheto ki. Vajon az enzim stabilizálása megoldja-e ezt a problémát? Az irodalomban egyedül Linden foglalkozott mikrobiális pelletek stabilizálásával (81), ahol α-galaktozidáz tartalmú pelleteket stabilizált glutáraldehides keresztkötések segítségével. A pelletek muködését folyamatos hidrolízissel vizsgálta. 1 %-os glutáraldehid alkalmazásával nagymértéku muködési stabilitás növekedést ért el. A kezelt pelletekben az α-galaktozdáz féléletideje 19 nap, míg a kezeletlenekében 11 nap volt.

Irodalmi áttekintés

11

Az elobbiekben bemutatott a pelletben lévo enzim önmagában rögzített készítményként alkalmazható. Ez elonyös, mivel biztosítja a folyamatos muködtethetoséget és könnyu elválaszthatósága miatt az enzim újra felhasználását. Az enzimek rögzítése emellett gyakran növeli az enzim stabilitását, ezzel csökkentve a felhasználandó enzim mennyiségét. Ezért az enzimek rögzített formában történo alkalmazása számos technológiai folyamatban kívánatos. Az esetek többségében azonban szükséges az enzim fizikai vagy kémiai rögzítése, amely számos enzimrögzítési technika segítségével történhet. Az alábbiakban a β-glükozidáz esetében alkalmazottakat mutatom be. Az egyik leggyakrabban használt technika a Ca-, ill. Al-alginát gélbe zárás (82, 83), melynek során az enzim oldatot Na-alginát oldattal keverik össze, majd Ca2+ ill. Al3+ ion tartalmú oldatba csöpögtetik. Ekkor az enzimet magába záró golyócskák alakulnak ki. Az alkalmazott pórusméret optimalizálása igen fontos, a kismolekulájú anyagok áramlásának biztosítására, úgy hogy közben az enzim a hordozóban maradjon. Az enzim rögzítésére poliakrilamid gélbe zárást (83) ill. az olcsó, kémiailag közömbös nylonhordozóhoz kötést (84). A β-glükozidáz enzim minden esetben stabilabbnak bizonyult, mint a szabad enzim.

12

2. Fejezet

2.2 3-Foszfoglicerát kináz (PGK) A PGK alapveto enzim minden élo sejt számára: univerzális energiatároló, az ATP termelésében vesz részt az aerob szervezetek glikolízise illetve az anaerob szervezetek fermentációja során, továbbá nélkülözhetelen a növények fotoszintéziséhez is. A PGK az 1,3biszfoszfo-glicerát (1,3-BPG) savanhidrid kötésben lévo foszfo-csoportjának ADP-re történo átvitelét katalizálja, melynek során 3-foszfo-glicerát (3-PG) képzodése mellett ATP-t termel, kétszeres töltésu fémion (általában Mg2+) jelenlétében (2.egyenlet). Ez a folyamat fordítva is lejátszódik a glükogenezis során, in vitro általában a fordított folyamatot tanulmányozzuk mivel az 1,3-BPG igen bomlékony szubsztrát lenne. Az enzimnek az összes élolény számára alapveto szerepét már évtizedek óta ismerjük. A PGK sejten belüli további szerepérol azonban újabb és újabb eredmények születnek.

(3-PG)

(1,3-BPG)

2. egyenlet: A PGK által katalizált reakció egyenlete

2.2.1 A PGK szerepe az élo szervezetben A PGK enzim alapveto szerepén, azaz a citoplazmában folyó glikolízisen túlmenoen valószínuleg igen sokrétu feladatot lát el a sejt különbözo kompartmentjeiben. A kation transzportban jelentos szerepe van a Na+ transzportnál (85) valamint a Ca2+pumpa muködése során, ahol a PGK más glikolítikus enzimekkel együtt kapcsolatban áll a szarkoplazmatikus retikulummal és ATP-t szolgáltat a pumpa muködéséhez (86). A PGK funkcionális károsodása (pl. bizonyos természetes mutációk következtében) összefüggésbe hozható az emberi hemolitikus anémiával (87, 88). Ez az X kromoszómán öröklodo mutáció, mely ATP hiányt okoz, kihat a K-Na pumpa muködésére. Maga után vonja azt, hogy akár a sejtmembrán két oldala közötti Na és K gradiens is eltunhet és ezt követoen bizonyos növekedési határt átlépve a vörösvérsejt kipukkad. Más kutatások szerint a PGK a sejtmagban is megtalálható, ahol valószínuleg szerepet kap a DNS szintézisénél, transzkripciójánál illetve javításánál (89, 90). Szerepe a DNS replikáció elso lépésénél jelentkezik, amikor az α-DNS-polimeráz kb. 5-60 nukleotid hosszúságú RNS-láncot szintetizál a templát DNS-szál irányításával, amihez PRP (Primer Recognition Proteins) jelenléte szükséges. A PRP komponenseként azonosították az annexin II mellett a PGK-t is, valamint azt is megállapították, hogy mindketto igen szoros kölcsönhatásban áll a sejtmag mátrixával. Feltételezik, hogy az LDH (tejsav dehidrogenáz) mellett a PGK az a fehérje, melynek „átkapcsoló” szerep jut a DNS replikációs és a javító mechanizmusa között. Az utóbbi idoben új eredményeket közöltek az emberi eredetu PGK tumor angiogenezist gátló szerepérol (91, 92). Eddigi ismereteink szerint a glikolitikus enzimek – közöttük a PGK is – tumort tápláló hatásúak. Új megfigyelések szerint viszont a daganatsejtben az angiogenezis során a PGK diszulfid reduktázként muködve részt vesz a plazmin redukciójában, s ezáltal angiosztatint

Irodalmi áttekintés

13

termel, amely gátolja az angiogenezis folyamatát (93, 94). A közölt adatok látszólag bizonyítják a PGK diszulfid-reduktáz aktivitását és tumorellenes hatását, azonban ezen eredményt mindaddig fenntartással kell kezelnünk, amíg nem születik ésszeru magyarázat a PGK tiol-reduktáz aktivitás mechanizmusáról. A legújabb adatok szerint ugyanis az aktív centrum közelében található két, szekvenciálisan szomszédos reaktív tiol-csoport ezen aktivitásban egyáltalán nem vesz részt, bár ez várható volna. Tehát paradox módon a plazmin redukciója független a PGK tiol csoportjaitól, amit a legújabb hipotézis szerint a doménzáródás okozta konformáció-változásokkal próbálják összefüggésbe hozni (92). Fontos szerepet játszik a PGK a tumor és vírus ellenes terápiában, mivel HIV, a Hepatitis B és a rák gyógyítására használható új ígéretes L-dezoxi nukleotid analógokat foszforilálja és így farmakológiailag aktív metabolítot állíja elo (95).

2.2.2 A PGK molekula térszerkezete A PGK monomer, 44,5 kDa molekulatömegu, két, kb. azonos méretu szerkezeti C- ill. Nterminális doménbol felépülo enzim. Mindkét domén hasonló felépítésu, egy központi 6 elemu βredobol képzodött hidrofób magból és a körülötte lévo α-hélixekbol áll (96) (3. ábra). A fehérje harmadlagos szerkezete konzervatív, annak ellenére, hogy különbözo fajokban a aminosav szekvenciákban akár 50%-os eltérés is lehetséges, bár az emlos eredetu szekvenciák között már kb. 96-98%-os az azonosság (97-99)

. 3. ábra A PGK térszerkezete MnAMP-PNP*3PG terner komplex tartalmú nyitott kristály szerkezet(100).

Az elso röntgenkrisztallográfiás szerkezet a ló izomból izolált PGK-ból 1979-ben született, mely bemutatta a fehérje szerkezetét és leírta a nukleotid C-doménhez való kötödését, de még a szerkezeti részletek tisztázása nélkül (96). A késobbiekben több nagyfelbontású röntgen szerkezetet is meghatároztak (2. táblázat), amelyek a nukleotid szubsztrát, MgADP (101-105) ill. az ATP-analóg MgAMP-PNP (100, 105) C terminális doménen való kötodését mutatják. A nukleotid szubsztrát MgATP kötodésérol azonban mindezidáig nem sikerült krisztallográfiás

14

2. Fejezet

képet nyerni. A másik szubsztrát, a 3-PG kötohelyérol már régen feltételezték, hogy az N-domén Arg-ben gazdag bázikus foltjához kötodik, mivel a C-doménen az ATP közelében nem találtak kötésre alkalmas csoportokat (96). Ez a feltételezés a késobbiekben beigazolódott, sot sikerült a 3-PG N-doménen való kötodésének részleteit is az meghatározni (106).

PGK eredete

Ligandok

Konformáció

Felbontás

Irodalmi hivatkozás

Ló izom

λ

Nyitott

2,5 Å

(96)

Sertés izom

3-PG

Nyitott

2,0 Å

(106)

Bacillus stearothermophilus (Bst)

MgADP

Nyitott

1,65 Å

(102)

Sertés izom

MnAMP-PNP*3-PG

Nyitott

2,0 Å

(100)

Trypanosoma brucei (Tb)

MgADP*3-PG

Zárt

2,8 Å

(104)

Thermotoga maritima (Tm)

MgAMP-PNP*3-PG

Zárt

2,0 Å

(105)

Sertés izom

MgADP*3-PG

Nyitott

1,8 Å

(103)

2. táblázat: A PGK-ra közölt krisztallográfiás szerkezetek

Az ún. nyitott konformációjú szerkezetben, amelyet a 3. ábra mutat be, a két külön doménen kötodo két szubsztrát egymástól viszonylag távol van, kb. 10 Å távolság becsülheto az ATP γ-foszfátja és a 3–PG karboxil csoportja között. Funkcionális vizsgálatok alapján nagyon valószínunek látszik, hogy PGK esetén a reakció közvetlen foszfotranszferrel játszódik le (107). A 10Å távolság tehát azt jelenti, hogy reakció itt nem jöhet létre, azaz ez a krisztallográfiás szerkezet az enzimnek egy inaktív konformációját mutatja. Ennek alapján született meg az ún. „hinge bending” hipotézis, mely feltételezi, hogy a szubsztrátok reaktív csoportjai a fehérje doménjeinek összezáródása által kerülnek a reakció szempontjából optimális közelségbe. A doménzáródás hipotézisével összhangban vannak az oldott enzimmel végzett kis szögu röntgen szórási kísérletek is, amelyekben a mindkét szubsztrátot köto (terner) komplex kialakulása során a girációs sugár csökkenését észlelték (108, 109). Késobb zárt szerkezetu terner komplex PGK kristályok röntgendifrakciós vizsgálata valóban egyértelmu bizonyítékot szolgáltatott a doménzáródás bekövetkezésére (104, 105). A PGK molekulára jelenleg rendelkezésre álló nagyfelbontású kristályszerkezetek ( 2. táblázat) alapján nem csak a szubsztrátok kötodésének részleteirol, hanem a doménzáródás mikéntjérol is elképzelésünk lehet.

2.2.3 A szubsztrát kötohelyek szerkezeti leírása 2.2.3.1 3-PG kötohely A 3-PG az N-terminális domén belso felületén elhelyezkedo bázikus oldallánchoz kötodik (106). A negatív töltésu foszfátcsoport a konzervatív Arg 170∗ , Arg 122 és Arg 65 oldalláncokhoz hidrogén híddal és ionos kölcsönhatással kötodik (4. ábra). A His 62 a foszfát észteres oxigénatomját, míg a Asn 25 és az Asp 23 a szubsztrát hidroxil csoportját köti H-híddal. Fontos megjegyezni, hogy e két utóbbi csoport felelos a D-sztereospecificitásért. Az ábrán feltüntetett oldalláncok konzervatívak és minden egyes kristályszerkezetben a 3-PG kötéséért ∗

Az értekezésben a sertésizom PGK aminósavszekvencia számozását használom

Irodalmi áttekintés

15

felelosek. Egyes oldalláncok pozíciója a 3-PG ill. nukleotid kötés hatására megváltozik, amit a szubsztrátmentes, és a különbözo enzim szubsztrát komplexek szerkezeteinek összehasonlítása során figyelhetünk meg. A biner komplexben pl. az Arg 65 a 3-PG kötohelyhez közelebb kerül

4. ábra: PGK 3-PG kötohelyének térszerkezete a terner komplexben (106)

és megfordulva hidrogén-hidat létesít a foszfát csoporttal. A nukleotidot ( az ATP analóg AMPPNP-t) is köto terner komplexben a felsoroltak mellett az Arg 38 is sókötést alakít ki a 3-PG karboxil csoportjával, továbbá ugyanez az oldallánc H-hidas kapcsolatot teremt a két domén között is a Thr 393 és az Asn 25 kötésével (100). A 3-PG kötodésére nem csak az egyes oldalláncok pozíciói és kötései, hanem egyes másodlagos szerkezeti elemek rendezettsége is megváltozik. Az α13 hélix rendezodik a biner szerkezetben, bár a 3-PG kötohelytol messzebb található (3. ábra). Ez jól egybeesik a tiol reaktivitási vizsgálatokkal, ahol a 3-PG hatására csökken a α13-ban található két reaktív Cys kémiai reagensekkel való módosíthatósága (110). Mivel az α13 hélix közvetlen szerepet játszik a nukleotid kötésben (amint azt késobbiekben bemutatom) ezért valószínuleg az α13-as hélixnek fontos szerepe lehet az enzim muködésében. Lokális konformáció változás jön létre az Arg 170-t hordozó α5 hélixben is, amely közelebb mozdul a 3PG kötohelyhez (106). H+-NMR mérések bemutatták az α1, α5 és az α14 hélixek egymáshoz viszonyított elmozdulását (111). 3-PG kötodése következtében a doménok kismértéku relatív elfordulása tapasztalható, ahol a két domén 7,7-8° közeledik egymáshoz (106). Ez az elfordulás feltehetoen az α7-es hélix N terminális szakaszában jön létre (103, 104).

2.2.3.2 Nukleotid kötohely A nukleotid kötohely a C-domén belso hidrofób felszínén található. A kristályszerkezetekben foként ADP ill. az ATP analóg AMP-PNP (β,γ-imino-adenozin-5’trifoszfát) fém komplexét vizsgálták. Erre a helyettesítésre stabil, nem muködo terner komplex elérése céljából volt szükség. Az analógban a β- és γ-foszfocsoportot összeköto oxigént egy NHcsoport helyettesíti. A helyettesítés izosztérikus, azaz nincs jelentos különbség sem a kötésszögben, sem a nukleotid más fontos tulajdonságában (112)

16

2. Fejezet

A

B

5. ábra: PGK nukleotid kötohelyének térszerkezete A MgADP (102) B MnAMP-PNP kötodése (100)

A nukleotidok adenozin és cukor gyuruje szinte teljes egybeesést mutat az ismert kristályszerkezeteket összehasonlítva. Az adenozin rész a βH, a βG és a βJ lemezek folytatása által alkotott mély, szuk hidrofób zsebben kötodik. A ribóz gyuru egy sekély mélyedésben helyezkedik el a Pro 338 fölött, C2’ endo vagy O4’ endo konformációjú, mely két konformáció közötti energia különbség igen csekély. A Glu 343 a cukor 2’,3’ hidroxil csoportjaival van kölcsönhatásban (5. ábra). A nukleotidok foszfát láncai di- és trifoszfát estén más-más kontaktusokban vannak mind a fehérje lánccal, mind a fémionnal: MgADP α foszfátja Lys 219 εNH4 csoportjával ion pár kölcsönhatásban van, míg a β foszfátot az Asn 336, Thr 375 és az α13 hélix dipolja stabilizálja (102). Érdemes megjegyezni, hogy a hélix N terminálisa a hélix dipól hatása következtében pozitívan töltött és gyakori kötohelye a szubsztrát negatívan töltött foszfát csoportjainak (113, 114). A Mg2+ ionos kölcsönhatásban van mind az α- és a β-foszfát 1-1 negatívan töltött oxigénjével, mind pedig az α13 hélixben található Asp 374 karboxil csoportjával. Ezek a kötések mind a nyitott (B. stearothermophilus) (102), mind a zárt (T. brucei) (104) szerkezetben azonosak. Az Asn 336 és a Lys 219 konzervatív oldalláncokkal létesített H-híd nélkülözhetetlenségét irányított mutációs kísérletek is alátámasztják, mely során Asn→Asp ill. Lys→Ala aminosavak cseréjét hajtották végre (95). MgAMP-PNP α és β foszfátja az ADP-vel azonos módon kötodik a fehérjéhez. A fémion viszont mindhárom foszfáthoz (α, β, γ) kötodik és ellentétben az ADP-s szerkezettel, a fehérjével nincs kapcsolata. (100, 105). A doménzáródás a kötések erosödését eredményezi és a γ-foszfát oxigénjével H-híd is kötést létesít a Lys 219 (105). Fontos megjegyezni, hogy a zárt szerkezetben a Lys 215 és Asn 336 közel kerül a nukleotid γ foszfátjához, amelyeknek szerepük lehet a doménzáródásban (103). A röntgenkrisztallográfiás vizsgálatokon kívül, az oldatban elvégezheto NMR-es vizsgálatok is alátámasztják a nukleotidok fent leírt elhelyezkedését a fehérje lánchoz képest (111, 115) és a fontos oldalláncok szerepét a nukleotid kötésben (116). A fémion koordináció,

Irodalmi áttekintés

17

ami ADP esetén az α- és a β-foszfát, az ATP esetén pedig mind a három (α-, β- és γ-) foszfát koordinációját jelenti, szintén jó egyezést mutat a meghatározott kristályszerkezetekkel (117). A két nukleotid szubsztrát konformációját illetoen viszont eltéréseket tapasztaltak a kristályban megfigyeltekhez képest (118, 119). A krisztallográfiás és az oldatban elvégezheto NMR-es mérés során meghatározott fehérjeszerkezetek részletei gyakran eltérnek. Ezeket a különbségeket fenntartással kell kezelni, mivel az oldat és a kristály a fehérje két különbözo fizikai állapotát képviseli. A kristályosítás során a fehérje a kristályrácsokat kialakító fehérje-fehérje kölcsönhatások révén stabilizálódhat. Ezek a kölcsönhatások bizonyos molekulakonformerek között energetikailag elonyösebben alakulnak ki. Ennek eredményeként az oldatban fennálló konformációs egyensúlyi állapot megbomlik és a kristályban az optimális kontaktust kialakító konformerek jelennek meg (120). Természetesen ezt nagyban befolyásolja az oldószer is, ami gyakran igen magas só koncentráció jelenlétet jelent ( 2-2.5 M). Ez a különbség problémát okozhat az oldatkísérletek és a kristályban fellelheto szerkezet összevetésében, és ezért fontos, hogy a krisztallográfiásan meghatározott szerkezeteket az enzimmel oldatban elvégzett funkcionális vizsgálatok figyelembevételével magyarázzuk.

2.2.4 A doménzáródás mechanizmusa Amint fentebb tárgyaltam, zárt kristályszerkezetet csak mindkét szubsztrátot (analógot) köto terner komplex esetén határoztak meg, tehát feltételezheto, hogy a doménzáródáshoz mind a két szubsztrát jelenléte szükséges. Ennek látszólag ellentmond, hogy a sertésizom PGK kristályszerkezete mindkét szubsztrát jelenléte mellett is nyitott, ez azonban a különbözo fajspecifikus kristálykontaktusok kialakulásának tulajdonítható (121). Zárt és nyitott szerkezetu kristályok összehasonlításából a doménzáródás folyamán bekövetkezo változások mikéntjére, azaz a doménzáródás mechanizmusára néhány alapveto következtetést vontak le (103). Ha a szerkezetek az N- ill. a C-domén β alaplemezeit másoljuk össze a domének konformációja a fajspecifikus fehérje láncon belüli eltérések ellenére lényegében azonos, de a relatív pozícióik igen eltéroek. Tehát a domének rigid testként fordulnak el egymáshoz képest. A doménzáródásnál néhány fontos csukló-régió (hinge) játszik szerepet, amelyeket sikerült azonosítani. A 3-PG kötodése, amint azt már bemutattam a két domént összeköto α7-hélix N terminális régiójában kb. 8° elfordulást okoz (106). Ugyanezen hélix C terminális régiójában a zárt és a nyitott szerkezetek közötti átlagos négyzetes eltérés (RMS) nagy, amelyrol Bernstein és munkatársai bizonyították, hogy a két domén egymáshoz képesti kb. 32° elfordulását mutatja (104). Laboratóriumunkban mutatták ki, hogy az α13- és az α14-hélixeket összeköto βL-redo a molekula legfontosabb csukló régiója (103). Az α13-hélix a C-domén integrált részét alkotja, míg az α14-hélix az N-doménét. A doménzáródás folyamán a két hélix elmozdulása egymáshoz képest ugyanakkora, mint a domének elmozdulása, azonban az α13-hélix a C-doménhoz ill. az α14-hélix az N doménhoz képest csak kisebb mértékben mozdul el. A βL-redonek tehát nagyfokú konformációs változáson kell átesnie, amit a átlagos négyzetes eltérési adatok is alátámasztanak. Modellezéssel bemutatták, hogy a βL-redo és az α13-hélix egy része a két domént közelebb pozícionálja egymáshoz. Ehhez szükséges az α7-hélixbeni csuklórégiók

18

2. Fejezet

elmozdulása is, mivel enélkül a fehérje lánc széttörne. Ez utóbbi azonban csak másodlagos, a szubsztrátok valószínuleg közvetlenül a βL-csukló muködését irányítják. Egy másik szerkezeti elemrol, az α8-hélixrol szintén ugyanezen szerzok (103) azt találták, hogy a doménzáródás folyamán nagymértékben elmozdul a C-doménhoz képest, bár annak szerves részét képezi. Az α7- és az α8-hélixek összeköto βG-lemez C terminálisa és az α8-hélix N terminálisa közötti hurokban szintén található egy csukló régió, mely ezért az elmozdulásért felelos lehet. Az α8-hélix N terminális része, mely közel esik a nukleotid kötohelyhez, konformációs változáson is keresztül esik. Megnyúlik és elmozdul úgy, hogy az α14-hélixxel párhuzamos legyen, ezzel zárva a két domén közötti csatornát. Mindezt a csukló régióban történo változás okozza, mely más és más fordulatot ad zárt ill. nyitott konformáció esetén. Annak ellenére, hogy a doménzáródás mechanizmusának fent tárgyalt molekuláris részleteire fény derült, számos részlet vár tisztázásra, pl. hogy az egyes szubsztrátoknak mi a konkrét szerkezeti szerepe a domén mozgások eloidézésében és hogy miért szükséges mind a két szubsztrát egyideju kötodése a doménzáródáshoz.

2.2.5 A PGK funkcionális tulajdonságai 2.2.5.1 A fémion szerepe A PGK-nak mint a többi kináznak is csak a nukleotid fém komplexe a szubsztrátja. Fiziológiásan ez a fém foként a Mg2+, mely közvetlenül komplex kötésben van a foszfát oxigénekkel. Az enzim azonban muködik a nukleotid Mn2+, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+ komplexeivel is, bár eltéro hatásfokkal (122). A fém lehetséges szerepei a következok: elektrosztatikus kölcsönhatása révén a foszfát csoport negatív töltéseit árnyékolja és ezáltal megkönnyíti a 3PG karboxil csoportjának nukleofil támadását a részlegesen pozitívan töltött P-atomon, továbbá segíti a távozó csoport negatív töltésének kialakítását, stabilizálja az átmeneti állapotot és/vagy a reagáló csoportokat is orientálja. A PGK esetén a fémion szerepe még nem tisztázott. Nem eldöntött kérdés, hogy csupán a nukleotid foszfátjainak orientációjában vesz-e részt, vagy szerepe van a két szubsztrát összekapcsolásában, amint arra NMR adatok utalnak (123). A domén záródással és a katalitikus ciklussal hozható kapcsolatba a fémion elmozdulása ami a MgADP-t és a Mg/Mn-AMP-PNP-t köto biner és terner szerkezetek összehasonlításából jól látható (103). Nem tisztázott azonban, hogy a két nukleotid szubsztrát, MgADP és MgATP foszfát láncát másképpen orientálja-e a Mg2+ ion, hiszen MgATP részletes kötodési módja krisztallográfiásan még nincs meghatározva. Mindenesetre, a különbözoségük mellett szól, hogy a MgADP sokkal jobban meggátolja a α13 hélixben levo 2 reaktív SH-csoport kémiai reagens számára való hozzáférhetoséget, mint a MgATP (110).

2.2.5.2 A szubsztrát kötodés sztöchiometriája és disszociációs állandói A PGK katalízis random mechanizmus alapján muködik, ami azt jelenti, hogy a szubsztrátok kötodése egymástól független (124, 125). Korábbi kinetikai cikkek szerint a szubsztrátok kötodése gyors (rapid equilibrum mechanizmus) (126), de különleges kinetikai viselkedése (ld. 2.2.5.3 fejezet), a szubsztrátok negatív kooperativitása miatt egyes közlemények szerint a steady-state mechanizmus sem zárható ki (101, 127, 128 ).

Irodalmi áttekintés

19

A szubsztrátok Km értékei az enzim forrásától függetlenül nagyon hasonlóak (127-129), viszont a kötodési állandókban még azonos eredet esetén is nagy különbség mutatkozik (127, 128, 130, 131). Oldatkísérletek felvetették egy másodlagos szubsztrát kötohely létezését (98, 127, 130, 132), amit egyes NMR-es kísérletekkel is alátámasztanak (133, 134). Azonban más fluorimetriás kötodési (128, 135, 136) és egyensúlyi dialízissel végzett oldatkísérletek (137) ennek ellentmondanak. A röntgen krisztallográfiás szerkezetben is minden esetben 1-1 kötohely mutatható ki. A Mg2+ különbözoképpen hat a két nukleotid szubsztrát kötodésére (137). Míg az ADP kötodésére a Mg2+ egyértelmu erosíto hatással van, addig a ATP kötodésére nincs befolyással. Megfigyelték, hogy a 3-PG kötodése jelentosen gyengíti mind a MgADP mind a MgATP kötodését (135), mely fordítva is lejátszódik (128). Ezt a jelenséget szubsztrát antagonizmusnak nevezzük. Munkám megkezdésekor még nem volt arról elképzelésünk, hogy az antagonizmusnak mi lehet a szerkezeti háttere.

2.2.5.3 A PGK különleges enzimkinetikai viselkedése Az irodalomban leírtak szerint a PGK a szokványostól eltéro, anomális kinetikai viselkedést mutat. A szubsztráttelítési görbék a szokásos kettos reciprok (Lineweaver-Burk) ábrázolásban nem egyenest adnak a szubsztrát felesleg aktiválás miatt, bár a kapott görbe két különbözo meredekségu egyenessel közelítheto (124, 127, 129). Ezt a jelenséget már kb. 30 évvel ezelott megállapították, de a fehérjeszerkezet ismerete nélkül reális magyarázat nem születhetett. Két aktív centrum feltételezése magyarázhatta volna ugyanis a jelenséget, azonban ma már tudjuk, hogy a fehérjének egyetlen aktív centruma és mindkét szubsztrátnak csak egyetlen kötohelye van. A többértéku anionok alacsony koncentrációban szintén aktiválják az enzimet (127, 138). Például ilyen hatást fejt ki a fiziológiásan eloforduló foszfát, sot saját megfigyeléseink szerint a citrát és a pirofoszfát is (139) valamint a Mg2+ mentes ATP is (138). Az enzimszerkezet ismeretében laboratóriumunkban hipotézist állítottak fel az anionaktiválás mechanizmusára, ami a kétféle aktiválási jelenséget összekapcsolja, mivel a szubsztrátok is anionos jelleguek (138). Feltételezik, hogy a szubsztrátok vagy más anionok egy közös, aktív centrumon kívüli aktiváló helyre kötodnek, mely a nyitott konformációjú enzimben csak elemeiben létezik és csupán az enzim doménzáródása során alakul ki teljesen. Kialakításában valószínuleg mind az N-, mind a C-domén belso felszínén található bázikus aminosavak részt vesznek. A hipotézis szerint az aktiváló anionok valószínuleg közvetlenül a termék 1,3-biszfoszfo-glicerát kötésének gyengítésével, közvetve pedig a doménzáródás energiagátjának csökkentésével fejtik ki hatásukat. A hipotézis alapján mindenesetre kvantitatív módon le lehetett írni a PGK mindkét fajta anomális kinetikai viselkedését: a szubsztrátfelesleg és az anionok általi aktiválást. A többértéku anionok magasabb koncentrációjánál viszont az enzimmuködés gátlása lép elotérbe, ami természetes következménye a szintén anionos jellegu szubsztrátok aktív centrumból való kiszorításának. A doménzáródással egyidejuleg kialakuló és szabályozószerepet betölto anion kötohely létezése, amely egy második szubsztrát molekulát is megköthet, igen vonzó hipotézis, azonban mindeddig nem sikerült rá közvetlen bizonyítékot szerezni. Ennek oka az lehet, hogy a reguláló anionkötohely egyrészt nem állandóan létezik, csak idoszakosan a doménzáródással egyidejuleg alakul ki. Másrészt pedig a katalitikus szubsztrátkötohelyhez képest gyenge kötohely, amit a ligandkötés szokásos módszereivel nehéz kimutatni

20

3. Fejezet

3 CÉLKITUZÉSEK Miután lehetoségem nyílt arra, hogy doktori tevékenységemet két különbözo szemléletu és eltéro adottságú kutatóhelyen végezzem, célom a doktori dolgozatomban e kétféle szemléletnek az ötvözése. Arra sajnos nem volt módom, hogy ugyanazt az enzimet vizsgáljam, a Budapesti Muszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Mezogazdasági Kémiai Technológia Tanszékén valamint az MTA Enzimológiai Intézetében. Arra viszont lehetoségem adódott, hogy két olyan enzimet vizsgáljak, melyek egyaránt a szénhidrát lebontásában ill. metabolizmusában játszanak szerepet. A BME Mezogazdasági Kémiai Technológia Tanszékén, ahol több évtizede sikeresen foglalkoznak a lignocellulózok hasznosításával és az ehhez kapcsolódó enzim eloállításával és jellemzésével, a cellulóz lebontás utolsó enzimével a β-glükozidázzal foglalkoztam. Célom βglükozidáz eloállítása cellulóz enzimes hidrolízisének kiegészítésére, oldott ill. rögzített enzimkészítményként. Ezekben a kísérleteimben fermentlé felülúszót ill. mikrobiológiai pelleteket alkalmaztam. Nem voltam tekintettel az egyéb jellegu enzimekre vagy más szennyezésekre, mivel kísérleteimmel az alkalmazott enzimológia, az ipari alkalmazás számára kívántam adatokat, eredményeket szolgáltatni. Ennek megvalósítása érdekében a következoket terveztem: o

A β-glükozidáz eloállítása és vizsgálata, különös tekintettel a pelletes növekedésu Aspergillus phoenicis QM 329 enzimreaktorban való alkalmazhatóságának és stabilitásának vizsgálatára

o

A szárított pelletek nem kielégíto muködési stabilitásának javítása glutáraldehides kezeléssel

o

Az optimális kezelési paraméterek meghatározása kísérlettervezés alkalmazásával

Az MTA Enzimológiai Intézetében szintén hosszabb ideje tanulmányozták a glükóz hasznosításában kulcsszerepet játszó 3-foszfoglicerát kináz enzim katalitikus muködését és annak fehérjeszerkezeti alapjait. Kutatásommal a kinázok muködésével kapcsolatosan általános érdeklodésre számot tartó problémáknak, mint a doménzáródás mechanizmusának, a nukleotid szubsztrátok kötodési módjának és a fémion szerepének tanulmányozásába kapcsolódtam be. Jelenleg még nem tisztázott pl., hogy miért szükséges mindkét szubsztrát egyideju kötodése a katalitikus zárt domén konformáció kialakulásához, továbbá nem értheto a fémion alapveto szerepe a katalízisben, hiszen az irodalom alapján a Mg2+ ion a PGK ATP kötésére egyáltalán nincs hatással és az ATP-analóg AMP-PNP-hez kötött fémion sem alakít ki semmiféle kölcsönhatást az enzimmel. Ezért célul tuztem ki a következo problémák vizsgálatát: o

A szubsztrát antagonizmus, azaz a szubsztátok egymás kötodését gyengíto hatásának, molekuláris szerkezeti háttere és kapcsolata a doménzáródással

o

A nukleotid szubsztrátok, MgATP és MgADP enzimmel való különbözo kölcsönhatása, szerkezeti hátterének vizsgálata.

o

A Mg2+ ion szerepe a nukleotid-enzim specifikus kölcsönhatás kialakításában

Alkalmazott módszerek

21

4 ALKALMAZOTT MÓDSZEREK 4.1 Az enzimek eloállítása 4.1.1 β-glükozidáz A β-glükozidáz eloállítására használt törzsek a BME Mezogazdasági Kémia Technológia tanszékérol származtak (táblázat). Az alkalmazott táptalaj 10 g/l glükózt vagy 10 g/l részlegesen hidrolízált papírvattát és Vogel’s (140) ill. Mandels (141) sókat tartalmazott. A fermentációt rázatott kultúrában, Erlenmeyer lombikban (I., II. közlemény) vagy air–lift fermentorban (II. közlemény) hajtottam végre.

Törzs

Táptalaj

Fermentációs technika

Közlemény

Glükóz+Vogel’s

Air-lift fermentor vagy rázatott lombik

II.

Hidr. papírvatta+Mandels

Rázatott lombik

I.

Aspergillus niger BKM F-1305

Hidr. papírvatta+Mandels

Rázatott lombik

I.

Aspergillus foetidus Biogal 39

Hidr. papírvatta+Mandels

Rázatott lombik

I.

Aspergillus phoenicus ATCC-1315B

Hidr. papírvatta+Mandels

Rázatott lombik

I.

Trichoderma reesei RUT C-30

Hidr. papírvatta+Mandels

Rázatott lombik

I.

Aspergillus phoenicis QM 329

3. táblázat: β-glükozidáz eloállítására használt gomba törzsek

Rázatott lombikban a fermentáció 30 °C-on, naponta a kiindulási pH-ra visszaállítva a pH-t ill. anélkül 7-10 napon át folytatódott (I. közlemény).

4.1.2 PGK A PGK-t sertésizomból Harlos és mti. módszere alapján (106) izoláltam és tisztítottam (III. közlemény). Kristályosítottam 3.75M ammónium-szulfát, valamint 2mM DTT jelenlétében és az így kapott mikrokristályos szuszpenzióban tároltam. A kísérletek elott a szulfát eltávolítás céljából a megfelelo pH-jú 50mM Tris pufferben dializáltam.

4.2 Enzim vizsgálati módszerek 4.2.1 Enzimaktivitás meghatározása 4.2.1.1 β -glükozidáz aktivitásának mérése β-glükozidáz aktivitását a mesterséges 5mM p-nitrophenil-β-D-glükopiranozid (pNPG) (I., II. közlemény) és a természetes 5mM cellobióz (I. közlemény) bontási sebességét mérve határoztam meg. 1,0 ml szubsztrát és 0,1 ml megfeleloen hígított enzim oldatot 50 °C-on inkubáltam, majd a reakció leállítása után mértem a para-nitofenol ill. glükóz tartalmát. Rögzített

22

4. Fejezet

enzim esetén az enzim oldat helyett, megfelelo mennyiségu nedves ill. szárított pellet alkalmaztam a mérés során.

4.2.1.2 PGK aktivitás mérése A PGK aktvitását ATP és 3-PG szubsztrátokból kiindulva D-glicerinaldehid-3-foszfátdehidrogenáz (GAPDH) segédenzim segítségével a NADH oxidációjának spektrofotometriás követésével (340 nm) határoztam meg (137). A tisztított enzim specifikus aktivitása a 20-25000 M/M*perc tartományba esett.

4.2.2 Enzimkinetikai vizsgálatok Enzim kinetikai vizsgálatok során az enzimre jellemzo paraméterek, a Km , Vmax, Kd értékek meghatározását végeztem. Mértem a különbözo ligandumok gátló hatását is, melyre a KI értékek a jellemzoek.

4.2.2.1 β-glükozidáz kinetikai vizsgálata β-glükozidáz tartalmú fermentlé kinetikai jellemzésére szubsztrátként a cellobiózt és pNPG-t használtam fel. A 6-6 párhuzamos fermentációból származó fermentlé felülúszókat betöményítettem, majd külön-külön kb. 1 U/ml β-glükozidáz aktivitásura hígítva egyenként szubsztrát telítési görbét vettem fel és a kinetikai paramétereket nem lineáris regresszióval, SigmaPlot 5.0 program segítségével határoztam meg.

4.2.2.2 Gátlási kísérletek PGK-val Különbözo MgATP analógok gátló hatását vizsgáltam a PGK által katalizált reakcióra. A gátlószerek különbözo konstans koncentrációja mellett felvettem a MgATP telítési görbéket, azaz meghatároztam az enzim aktivitását növekvo MgATP koncentrációk jelenlétében. A görbék analízisére a következo egyenletet (138) alkalmaztam:

v = vS ⋅

[S ]

K S ( kat) + [S ]

+ v S ⋅ (a − 1) ⋅

[S ]

⋅

[S ]

K S ( kat) + [S ] K S ( akt ) + [S ]

3. egyenlet

Az elso tag írja le a katalitikus hely telítodését a szubsztráttal. Katalitikus hely telítésekor mérheto hipotetikus aktivitást v S jelöli. Az egyenlet második tagja írja le az aktiváló hely telítodésébol adódó aktivitás-növekedést. K S ( kat) és K S ( akt) rendre a katalitikus és az aktiváló helynek megfelelo disszociációs állandók, míg a az aktiválási faktort jelöli. Ha a szubsztrát mind a katalitikus, mind az aktiváló helyet telíti, akkor az aktivitás a ⋅ v S lesz. Ezzel az egyenlettel illesztve a szubsztrát (S ) koncentrációjának függvényében mért kísérleti aktivitás ( v ) értékeket, meghatározhatjuk az adott szubsztrátra jellemzo K S ( kat) és K S ( akt) paramétereket és az aktiválási faktor ( a ) értékét. Az inhibíciós konstans KI meghatározható K S ( kat) és az inhibítor jelen ill. távollétében mérheto látszólagos disszociáció állandó, K app S( kat ) segítségével a 4. egyenlet alapján

Alkalmazott módszerek

KI =

K s(kat ) [I] ) K S(app − K S( kat ) (kat )

23

4. egyenlet

4.2.3 Egyensúlyi ligandkötodési vizsgálatok Az kötodési vizsgálatok során célom az enzimhez különbözo ligandumok (szubsztrátok ill. analógok) kötésének vizsgálata a közvetlen egyensúlyi dialízis és a közvetett fluorimetriás titrálás ill. az enzim tiol csoportjainak módosítása segítségével.

4.2.3.1 Egyensúlyi dialízis Az egyensúlyi dialízis kísérleteket Micro D200 cellában Dianorm (MSE) készüléken végeztem. A 0,4 ml térfogatú cellát egy féligátereszto membrán osztja ketté, melynek egyik oldalára az enzimet tartalmazó oldatot ( 0,6-1,0 mM PGK enzimet ), míg másik oldalára a vizsgálandó ligandumot helyeztem, a cellasorozatban variálva a ligandum koncentrációját celláról cellára. A két cella fél között a szabad, az enzim által nem kötött, ligandum koncentrációja egyensúlyba kerül. Az egyensúly beállta után a cellákban lévo ligandum és fehérje koncentrációját meghatároztam és kötodési állandót számoltam (137).

4.2.3.2 Kompetitív fluorimetriás titrálás A fluoreszcens TNP-ATP szubsztrátot titráltam PGK enzimmel, a vizsgálandó nukleotid ligandum távollétében ill. különbözo koncentrációja mellett. A fluorimetriás intenzitás változást Jasco FP-777 spektrofluoriméterrel követtem. A besugárzási hullámhossz 408 nm, az elnyelési hullámhossz 535 nm volt. A módszer elve, hogy a TNP-ATP kompetitíven kötodik az enzim nukleotid kötohelyéhez, így a nukleotid jelenlétében TNP-ATP szabadul fel befolyásolva az intenzitás változást. A disszociációs állandót (135) alapján számoltam.

4.2.3.3 Tiol-csoportok módosítása 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoát)-tal (DTNB) A módszer felhasználja azt a tényt, hogy a PGK-hoz kötodo ligandumok nagymértékben csökkentik az enzim gyorsan reagáló tioljainak reakciókészségét, így az SH-módosítás sebességének a ligandum koncentráció függésébol, az illeto ligandum kötodési állandója meghatározható (110). A reakció lejátszódása során a szabadon hozzáférheto tiol oldalláncok (mólonként 2) gyorsan elreagálnak és az eltemetett tiol oldalláncok (mólonként 5) reakciója elhanyagolható (142). Különbözo ligandum koncentráció mellett meghatározott sebességi állandókat, a ligandum koncentráció függvényében ábrázoltam és a 5. egyenlettel görbéket illesztve, meghatároztam a ligandum kötodés-disszociációs állandóját.

Y = kmax −

(k max − k min ) ⋅ [L] K d + [L]

5. egyenlet,

ahol az Y a ligandummal való relatív telítettség foka, [L] a szabad ligandum koncentrációja, k max ligandum távollétében, illetve k min az enzim ligandummal való telítésekor mérheto tiol módosítás sebességi állandója. Az egyenlet alkalmazásának a feltétele az, hogy a kötött ligandum koncentráció a kísérlet során elhanyagolható legyen a szabad ligandum koncentrációhoz képest.

24

4. Fejezet

4.2.3.4 Tiol-csoportok alkilálása jódecetamiddal PGK-t jódecetamiddal alkilálva módosítottam a két reaktív tiol csoportot, melyet az enzim aktivitás vesztése kísér (143). Az alkiláció kinetikáját a PGK maradék aktivitásának követésével mértem, ami a reakcióelegybol megfelelo idoközönként kihígított minta aktivitásának mérését jelenti. A különféle ligandumok befolyásolják az alkiláció sebességét, így azok kötodési állandója meghatározható a DTNB-s módosításnál ismertetett elv alapján.

4.3 Stabilitási vizsgálatok Egymást követo cellobióz hidrolízis kísérlettel vizsgáltam a nedves, szárított és stabilizált β-glükozidáz tartalmú pelletek muködési stabilitását. 0,001g szárított ill. 0,1-0,3g nedves pelletet adtam 15 ml 25 g/l cellobióz szubsztráthoz (4,8 pH-jú 0,05 M citrát pufferben) és 50 °C-on légfürdos rázógépben 110 rpm fordulattal rázattam. A kezdeti hidrolízis sebesség kiszámításához 0., 20., 40., 60., 80. és 100. percben mintát véve meghatároztam a minta glükóz tartalmát és lineáris regresszióval számoltam a kezdeti sebességet. Új hidrolízis kezdése elott a pelleteket citrát pufferben cukor mentességig mostam. A PGK-val pedig konformációs stabilitási vizsgálatokat végeztem differenciális pásztázó mikrokaloriméter (DSC) készülék segítségével (V. közlemény). Ily módon határoztam meg a nukleotid-szubsztátok enzimkonformációra gyakorolt hatását.

4.4 Kísérlettervezés Kísérleteim optimalizálására.

során

32

tervet

alkalmaztam

a

glutáraldehides

kezelés

kísérletes

Az egyszerre egy faktor hatását vizsgáló kísérletekkel ellentétben a kísérlettervezésnél meghatározhatóak azok a változók és kölcsönhatásaik, amelyek befolyással vannak az eredményre. Ezután a leheto legkedvezobb eredményhez vezeto legfontosabb faktorok(hatások) értéke optimalizálással határozható meg (144, 145).

Faktor

Kísérleti beállítás

A

B

1

+

+

2

+

–

3

+

0

4

–

+

5

–

–

6

–

0

7

0

+

8

0

–

9

0

0

4. táblázat: 32 kísérleti terv faktor beállítási terve (+maximimum, –minimu m , 0 közbülso faktor szint)

Alkalmazott módszerek

25

Háromszintes, 3p kísérleti tervet alkalmazunk, ha a válaszfüggvény másodrendu. Elokísérleteim során azt tapasztaltam, hogy a glutáraldehides rögzítés során ez áll fent ezért, 32 kísérleti tervben két faktort, a glutáraldehid koncentrációt és a kezelési idot, 3-3 szinten variáltam. Egy 32 kísérleti tervet mutat be a 4. táblázat. A kísérleti tervet Statgraf program segítségével értékeltem ki. A kísérlettervezés eredményeinek értékeléséhez variencia analízist végeztem és ennek segítségével meghatároztam az eredményfelületet leíró egyenletet. Ezután grafikus analízis segítségével határoztam meg az optimumot, ill. az irányt mely az optimum eléréséhez vezet.

26

5. Fejezet

5 EREDMÉNYEK ÉS TÁRGYALÁSUK 5.1 β-glükozidáz A cellulóz enzimes hidrolízisét katalizáló celluláz enzim komplex akkor eredményez megfelelo konverziót ill. megfelelo hidrolízis sebességet, ha a β-glükozidáz és a cellulázok aktivitásának jellemzésére használt szuropapír bontó aktivitás (FPA) aránya megfelelo azaz, 1,5:1 vagy 1:1 (61). A kereskedelemben kapható Trichoderma eredetu enzimkoplexekben pld. a Celluclast 1,5L (Novozymes) ez az arány csak 0,3-0,5 közötti. A megfelelo konverzió ill. hidrolízis sebesség biztosítása érdekében külso β-glükozidáz adagolása szükséges. Munkám során ennek két lehetoségét vizsgálom, az egyik az oldott β-glükozidáz, a másik a rögzített βglükozidáz alkalmazása.

5.1.1 Oldott β -glükozidáz Annak eldöntésére, hogy a rendelkezésemre álló Aspergillus törzsek közül melyik termel a Trichoderma enzim kiegészítése alkalmas enzimet, egyrészt a törzsek szaporítását és az enzimtermelést kellett megvizsgálnom, másrészt a kapott fermentlé felülúszók kinetikai tulajdonságainak jellemzését kellett elvégeznem.

5.1.1.1 β-glükozidáz eloállítása Különbözo Aspergillus törzsek, A. phoenicus, A. niger, A. foetidus, A. phoenicis és a Trichoderma reesei RUT C-30 β-glükozidáz eloállítását vizsgáltam rázatott lombikos kísérletben. Miután az oldott enzimet a Trichoderma által termelt enzimmel kívántam összehasonlítani, olyan táptalajt kellett választanom, mely mind az Aspergillusok, mind a Trichoderma számára megfelelo. A Trichoderma reesei RUT C-30 celluláz termeléséhez inducert igényel, mely többnyire Solka Flock (SF) vagy papírvatta. Az Aspergillusok jól nonek és enzimtermelésük is kiváló glükózon, azonban SF-on és papírvattán nem képesek szaporodni, amennyiben csak βglükozidáz termelok és nem termelik az egész enzimkomplexet. Emiatt fermentációs szénforrásként részben hidrolizált papírvattát alkalmaztam, mely jó kompromisszum, mivel a Trichoderma nem csak no, de enzimet is termel és az általam vizsgált Aspergillus törzsek is képesek szaporodni. Minden törzzsel 3-3 párhuzamos fermentációt végeztem el napi pH állítás

Kiindulási pH

β-glükozidáz aktivitás a 9. napon (U/ml)

Produktivitás (U/Lh)

A. phoenicus ATCC-1315B

5,7

3,3

15,3

A. niger BKM F-1305

5,7

3,35

15,5

A. foetidus Biogal 39

5,7

3,4

15,7

A. phoenicis QM 329

5,7

3,4

15,7

T. reesei RUT C-30

6,0

0,636

2,94

4,5

0,617

2,86

Törzs

5. táblázat: β-glükozidáz eloállítása különbözo Aspergillus törzsekkel és T. reesei-vel

Eredmények és tárgyalásuk

27

mellett ill. az Aspergillus törzsekkel pH állítás nélkül is. Ez utóbbi lombikokban a fermentlé az elso napon lesavanyodott 2,3-as pH-ra, majd 3 nap után fölemelkedett 5,8-as pH-ra, majd ezt követoen a pH lassan 6,0-6,5 közé állt be a fermentáció végére. A kiindulási pH-t a 5. táblázat mutatja be. A pH állítás nélkül és pH állítással fermentált lombikok enzim termelése között nem találtam különbséget, ezért mind a 6 lombikot párhuzamos fermentációnak tekintem, melynek szórása 0,0028. A fermentáció során az aktivitás változást a 6. ábra mutatja be. A T. reesei törzset két kiindulási pH-n vizsgálva különbséget vártam az enzim termelésben. Különbözo fermentációs lefutást tapasztaltam, azonban az enzim termelésben a fermentáció végére nem mutatkozott különbség (6. ábra). 4,0

β-glükozidáz aktivitás (U/ml)

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

240

fermentációs idõ (h)

6. ábra:β-glükozidáz aktivitás változása a fermentáció alatt (–? –A. phoenicus, –? –A. niger, –q –A. foetidus, – s–A. phoenicis, –¦ –T. reesei RUT pH 4,5, –? – T. reesei RUT pH 6,0)

Az Aspergillus törzsek között az eloállított enzim aktivitásában és a produktivitásában csak minimális különbséget tapasztaltam, azonban ez jelentosen, 4,8-szor magasabb volt, mint a T. reesei esetében mért. Az Aspergillus törzsek által fermentált β-glükozidáz tehát alkalmas a cellulóz enzimes hidolízisében a Trichoderma reesei celluláz enzim komplexének kiegészítésére.

5.1.1.2 A fermentlé felülúszók kinetikai tulajdonságainak összehasonlítása Mivel a fermentáció során az Aspergillus törzsek által eloállított β-glükozidáz, mind enzimaktivitásban, mind produktivitásban igen hasonló volt, ezért a fermentáció után mind a 4 törzs fermentlé felülúszójának kinetikai paramétereit vizsgáltam a mesterséges szubsztrát pNPG ill. a természetes szubsztrát cellobióz jelenlétében. Az enzimet nem tisztítottam ki a fermentlébol, mivel célom nem a tisztított enzim vizsgálata, melyrol számos publikáció jelent meg, hanem a gomba sejtek centrifugálása után a fermentlé felülúszóban lévo β-glükozidáz muködésének tanulmányozása volt. Ez azért is fontos, mivel az enzimtisztítás igen ido- és pénzigényes és ipari méretekben jelentosen megnöveli a cellulóz hidrolízis költségét. Amennyiben valamely fermentlé felülúszót tisztítás nélkül is alkalmazni tudunk az ipari technológiában, az nagy gazdasági elonnyel járhat.

28

5. Fejezet

A mesterséges szubsztrát pNPG estén a β-glükozidáz nem a Michales-Menten kinetika szerint viselkedett és Lineweaver-Burk féle kettosreciprok ábrázolásban az egyenestol a nagyobb szubsztrát koncentrációknál mért kísérleti pontok fölfelé tértek el (7. A betét ábra), annak ellenére, hogy a kinetikai vizsgálat körülményei megfeleltek a Michales-Menten kinetika feltételeinek. A β-glükozidáz tehát pNPG szubsztráton, szubsztrát felesleg gátlás jelenségét mutat. Az illesztett görbéket a 7. ábrán mutatom be, a kinetikai paramétereket a 6. táblázat tartalmazza. Cellobióz szubsztrát esetén a fermentlé felülúszókat vizsgálva nem tapasztaltam szubsztrát felesleg gátlást, a görbék jól illeszthetoek a hiperbola egyenletével, mely örvendetes, hiszen ez a β-glükozidáz valódi szubsztrátja. 1,4

2,0

A

B

1,8

1,2

1,6

v (µmol/min* ml)

1,4 0,8 6

0,6 1/v (min ml µmol-1 )

v (µmol/min*ml)

1,0

0,4

0,2

4

1,2 1,0 0,8 0,6

2

0,4 0 0

2

4

0,2

6

1/pNPG (1/mM)

0,0

0,0 0

1

2

3

4

5

6

0

2

4

6

pNPG (mM)

8

10

12

14

16

cellobióz (mM)

7. ábra: A vizsgált törzsek kinetikai viselkedése A pNPG, B cellobióz szubsztrát esetén. S A mérési pontokra nem lineáris regresszióval A szubsztrát felesleg gátlás V = Vmax egyenlet alapján, χ S  K m + S + S  B Michaelis -Menten kinetika alapján egyenletet illesztettem. χ KI ρ A betétábra L-B ábrázolásban mutatja az egyenestol való eltérést, mely többi törzs esetében is hasonló volt. (–? –A. phoenicus, –? –A. niger, – q –A. foetidus, –s –A. phoenicis, –¦ –T. reesei RUT)

Törzs

pNPG Km

A. phoenicus ATCC-1315B

2,18±0,38

Cellobióz

Vmax

Ki

Km

Vmax

2,26±0,28

8,29±2,7

4,64±0,75

1,9±0,11

A. niger BKM F-1305

2,3±0,6

2,44±0,32

7,9±3,8

5,02±0,76

2,05±0,12

A. foetidus Biogal 39

2,54±0,68

2,42±0,30

7,13±3,4

6,0±0,69

2,46±0,12

A. phoenicis QM 329

2,29±0,35

1,97±0,22

7,42±2,0

4,02±0,63

1,51±0,08

T. reesei RUT C-30

0,80±0,04

1,23±0,20

15,9±2,3

1,45±0,23

0,51±0,02

6.Táblázat: A vizsgált törzsek kinetikai paraméterei

Mivel a pNPG és a cellobióz kinetikai méréséhez ugyanazokat a hígításokat alkalmaztam és a kinetika mérési körülményei is azonosak volt, a két szubsztráttal mért kinetikai paraméterek összehasonlíthatóak. A T. reesei RUT C-30 törzs fermentlé felülúszójának β-glükozidáz kinetikája pNPG szubsztráton hasonló az Aspergillus törzsek kinetikájához, azonban Km értéke alacsonyabb, azaz az affinitása nagyobb, mint az Aspergillus-ok által termelt enzimeké. Cellobióz szubsztráton mért Km értékek minden vizsgált fermentlé felülúszó esetében kb. kétszeresére

Eredmények és tárgyalásuk

29

növekedett, de a T. reesei enzim cellobióz esetén is nagyobb affinitású, mint az Aspergillus törzsek enzimjei. A T. reesei enzim azonban kevésbé képes bontani a természetes cellobióz szubsztrátot mint a mesterséges, általánosan az aktivitás mérésére használt pNPG-t (Vmax 40%-ra csökken), míg mind a négy Aspergillus törzs a pNPG-hez hasonlóan bontja a cellobiózt is (nagyjából azonos Vmax ) Az Aspergillus törzsek fermenté felülúszójában a β-glükozidázok kinetikailag nagyon hasonlóan viselkednek, azaz mindegyik törzs hasonlóan jónak bizonyult. A pNPG szubsztrát vizsgálata során kiderült, hogy az irodalommal ellentétben (Dekker 4mM állapított meg (146)), már 1,5-2,0 mM pNPG esetén szubsztrát gátlás tapasztalható. A 8. ábra két enzim esetében bemutatja az elozoekben meghatározott Km és Vmax alapján számított hiperbola és az illesztett szubsztrát gátlási görbék eltérését, amely mind az öt vizsgált görbére hasonló. Ez a tény szükségessé teszi a rutinszeruen alkalmazott enzim aktivitás mérési módszerének újragondolását, hisz az ott alkalmazott 5 mM már erosen gátló hatású, így akár 30% hibát is okozhat az aktivitás mérés során. Javaslom tehát 1 mM pNPG szubsztrát alkalmazását, természetesen megfeleloen hígított enzimmel. 2,0 1,8 1,6

v (µmol/min*ml)

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

5,0

5,5

6,0

pNPG (mM)

8. ábra: Az illesztett szubsztrát gátlási görbe (folytonos vonal) és az Michalis -Menten kinetika alapján számított elméleti görbe (szaggatott vonal) eltérése (–? –A. niger, –¦ –T. reesei RUT)

Az Aspergillus törzsek nem csak jobb produktivitással képesek termelni a β glükozidázt, hanem a természetes cellobióz szubsztrátot is lényegesen jobban bontják, mint a T. reesei által termelt β-glükozidáz. Valamennyi általam vizsgált Aspergillus törzs alkalmas tehát a cellulóz enzimes hidrolízise folyamán, oldott enzimként, a celluláz enzim komplex kiegészítésére.

5.1.2 Pelletekben rögzített β-glükozidáz vizsgálata Rázatott lombikban A. phoenicis QM 329 pelleteket állítottam elo, melyek magában a pelletben tartalmazzák a β-glükozidázt (4.0 U/ml) és a fermentlében az enzim koncentrációja elenyészo. Az így eloállított pelletek önmagukban használhatók rögzített enzimként amint azt korábban Réczey és munkatársai már megállapították (78, 79). Azonban ahhoz, hogy a pelletek iparilag hasznosíthatóak legyenek, pl. reaktortöltetként, a pelletek megszárítása szükségszeru, mivel így jobban sterilezhetoek, könnyebb a szállításuk, raktározásuk is.

30

5. Fejezet

9. ábra: Szárított és nedves pelletek muködési stabilitásának összehasonlítása (–? –nedves pelletek, –? –szárított pelletek)

Megvizsgáltam és összehasonlítottam a szárított és nedves pelletek viselkedését hidrolízis kísérlet sorozat folyamán (9. ábra). 144 óráig folyamatos hidrolízis alatt a nedves pelletek kezdeti hidrolízis sebessége 68%-ra, míg a szárított pelletek esetén 37%-ra csökkent. Ezzel a jelentos csökkenéssel a szárított pelletekben lévo enzim féléletideje 48 órára csökkent, az irodalomban leírt nedves pelleteken mért 700 órával szemben (79). Összehasonlítva az irodalmi és a saját kísérleteimet (fermentációs pH, pelletek átméroje, kora), egyértelmuen arra a következtetésre jutottam, hogy ezt a csökkenést csak a szárítás okozhatja, mely a sejtmembrán széttöredezéséhez vezet. Így a sejtmembrán nem tudja ellátni a félig-átereszto hártya szerepét és az oldott formában lévo enzim az egymást követo hidrolízisek folyamán kiáramlik a sejtbol és csak a sejtfalhoz kötött enzim marad a pelletben. Erre utal az is, hogy a hidrolízisek során a hidrolizátumban mért β-glükozidáz aktivitás a szárított pelleteknél egyre csökkent és kiemelkedoen magas volt az elso hidrolízis folyamán (II. közlemény). A β-glükozidáznak szárítás elott a pelletben történo rögzítése megoldást nyújthat erre az enzim kiáramlási problémára.

5.1.2.1 Stabilizálási lehetoségek Az enzim pelletekben történo rögzítésére egy stabil kötést biztosító keresztköto-ágensre volt szükségem. A glutáraldehidet széles körben alkalmazzák ilyen célra és Linden 1982-ben αgalaktozidáz tartalmú mikrobiális pelletekben már végzett glutáraldehides rögzítését 8-szoros Km -nyi szubsztrát jelenlétében (81). E kezelés tapasztalataiból kiindulva terveztem meg kísérleteimet. β-glükozidáz kiáramlás (U/ml) Kezelés

1.)

Glutáraldehides kezelés 4.8 pH-jú citrát pufferben

2.)

8Km cellobióz szubsztrátban áztatás, utána glutáraldehides kezelés 4,8 pH-jú citrát pufferben

3.)

Glutáraldehides kezelés a fermentlében

Hidrolízis szám I.

II.

III.

0,02

0,006

0,0038

0,097

0,023

0,014

0,014

0,0075

Nem mérheto

7. táblázat: β-glükozidáz kiáramlása 3 tf%-os glutáraldehides kezelést követoen

Eredmények és tárgyalásuk

31

Három stabilizálási módot próbáltam ki a pelletekben az enzim rögzítésére, és vizsgáltam a hidrolízisek során kiáramló enzim mennyiséget ( 7. táblázat). A glutáraldehides kezelés növelte a muködési stabilitást, azonban jelentosen csökkentette az enzimaktivitást ( az 1. és 3. esetben 66%-kal). A kezelés elott cellobiózos eloáztatást alkalmazva az enzim aktivitása csak az eredeti 51%-ra csökkent, azonban az enzim kiáramlás mértéke jelentosen magasabb volt, mint csak glutáraldehidet használva (ld.7. táblázat). A fermentlében való kezelés nem különbözött jelentosen a pufferben alkalmazott glutáraldehides kezeléstol, így további munkám során egyszerusége és olcsósága miatt ezt alkalmaztam.

5.1.2.2 Glutáraldehides rögzítés optimalizálása A keresztköto reagens használata kettos hatású. Mialatt a glutáraldehid az enzimet a sejthez kötve csökkenti az enzim kiáramlást, szintén csökkenti az enzim aktivitását is. Ezért a glutáraldehides kezelés optimalizálása szükséges. Célom tehát, a minél nagyobb muködési stabilitás elérése volt, minél rövidebb kezelési ido és minél alacsonyabb glutáraldehid koncentráció alkalmazásával. Az optimalizáláshoz 32 kísérleti tervet alkalmaztam. A glutáraldehid koncentrációt 0,1, 0,25, és 0,5 v/v%-nak, a kezelési idot 24, 48, 72 órának választottam az elokísérleteim alapján. A kezelés hatását 114 óráig tartó egymást követo hidrolízisekkel vizsgáltam. Az utolsó hidrolízis kezdeti hidrolízis sebességét választottam célfüggvénynek, hiszen a célom pelletek hidrolizáló képességének, a leheto leghosszabb ideig történo megfelelo szinten tartása volt. A 10. ábra mutatja a válaszfelületet. A glutáraldehid koncentrációt meghatározónak találtam, míg a kezelési idonek alig mutatkozott hatása.

10. ábra: Elso optimalizálási lépcso válaszfelülete

11. ábra: Második optimalizálási lépcso válaszfelülete

A kísérletek során még nem sikerült meghatároznom az optimumot, így a következo optimalizálásnál a glutáraldehid koncentrációt 0,05, 1,025, és 2,0 v/v%-nak, a kezelési idot 24, 60, 96 órának választottam. A mérési hiba kiküszöbölése érdekében 3 párhuzamos hidrolízis kísérletsorozatot indítottam, melyek 1329 óráig tartottak. A második optimalizálás válaszfelületét a 11. ábra mutatja. Az optimális glutáraldehid koncentrációt 1,2 v/v% találtam. A kezelési ido

32

5. Fejezet

alig volt befolyással a pelletek stabilitására, így a alacsonyabb kezelési költséggel járó, rövidebb kezelési ido (24h) a megfelelo.

5.1.2.3 Optimális kezelési körülmény vizsgálata hidrolízis kísérlettel A pelleteket az optimalizált körülmények között (1,2 v/v% glutáraldehid, 24 h) kezeltem, majd a kezeletlen pelletekkel együtt hidrolízis kísérletekben teszteltem. A hidrolízis kísérleteket a korábban ismertetett egymást követo hidrolízis kísérletben vizsgáltam.

12. ábra: Optimálisan kezelt és szárított pelletek stabilitásának vizsgálata (–¦ –glutáraldehiddel kezelt pelletek, –? –szárított pelletek)

A kezeletlen pelletek drasztikus stabilitás vesztésével szemben, a kezelt pelletek stabilitása jelentosen megnott, a hidrolízis kísérlet ideje, 2196 óra alatt a kezdeti hidrolízis sebesség alig csökkent (12. ábra). A glutáraldehides kezelés megfelelo módszernek bizonyult az Aspergillus phoenicis QM 329 pelletek stabilizálására. Így a β-glükozidáz tartalmú pelletek felhasználhatók rögzített enzimkészítményként.

Eredmények és tárgyalásuk

33

5.2 Foszfoglicerát kináz 5.2.1 Szubsztrát antagonizmus és a domének közötti kommunikáció Mint az irodalmi bevezetoben tárgyaltam a foszfoglicerát kináz egyik különleges viselkedése abban mutatkozik, hogy bár az enzim random mechanizmussal muködik (124, 125) a két szubsztrát mégis hatással van egymás kötodésére. Az antagonizmus szerkezeti alapjának megállapításához eloször is a szubsztrátok egyes funkciós csoportjainak szerepét kívántam tisztázni. Ezért kinetikai vizsgálatokat végeztem oldott enzimmel a nukleotid foszfát lánc vizsgálatára. A MgADP kompetitív inhibitorként viselkedik a 3-PG-vel szemben (137). Megvizsgálva a MgAMP és az adenozin hatását (13. ábra), az adenozin nem kompetitív, míg a MgAMP kevert típusú inhibíciót mutat, azaz a 3-PG kötodésére a nukleotidoknak foszfát láncuk rövidülésével csökken a befolyásuk. A

B

C

25 20

20

15

15

20

1/v

1/v

1/v

15

10

10

10

5

5

5

0

0 -1

0

1

2

3

4

5

1/3-PG (1/mM)

6

7

8

9

-1

0 0

1

2

3

4

5

1/3-PG (1/mM)

6

7

8

9

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1/3-PG (1/mM)

13. ábra: MgADP (A), MgAMP (B) és adenozin (C) hatása PGK kinetikai viselkedésére (—? —0,1mM MgADP, —? —0,5mM MgADP, —¦ —5mM MgAMP—? —10mM MgAMP —p —10mM adenozin,—r —20mM adenozin, —+—minden esetben az inhibítor mentes kontroll) Az egyenesek a mérési pontokra lineáris regresszióval illesztettem. A méréshez 10nM PGK -t használtam.

Ezt követoen megvizsgáltam, hogy a 3-PG karboxil csoport nélküli analógja, a glicerol-3foszfát (G-3-P) kifejt-e a 3-PG-hez hasonló gyengíto hatást a nukleotid MgADP kötodésére. Másrészt vizsgáltam a Mg2+ ion szerepét Mg2+ mentes ADP használva kísérleteimhez. A nukleotidok disszociációs állandóit mind közvetett fluoreszcens ATP analóg jelenlétében végzett kiszorításos fluorimetriás titrálással, mind közvetlen egyensúlyi dialízissel meghatároztam, mely két módszerrel hasonló eredményeket kaptam. Adataimat a 8. táblázat foglalja össze, a korábbi kötodési adatokkal (135, 137) együtt. Az egyensúlyi dialízis eredményei (14. ábra) alátámasztják azt, hogy a 3-PG gyengíti a MgADP kötodését, míg kiderült, hogy a Mg2+mentes ADP kötodésére a 3-PG-nek a kísérleti hibahatáron belül nincs hatása. Tehát a Mg2+ ionnak fontos szerepe van a szubsztrát antagonizmus jelenségében. Figyelemre méltó az is, hogy 3-PG jelenlétében azonossá válik a MgADP és az ADP affinitása az enzimhez, tehát a 3-PG megszünteti a Mg2+ ion erosíto hatását az ADP kötodésére (vö. (137)). A 3-PG szerkezeti analógja, a glicerol-3-foszfát (G-3-P) jelenlétében nem tapasztaltam semmilyen hatást a MgADP kötodésére. 3-PG jelenlétében a MgATP is észrevehetoen gyengébben kötodik, mint annak távollétében, de a hatás nem olyan nagy, mint azt a MgADP esetében tapasztaltam.

34

5. Fejezet

Oldott enzim

Kristály

Nukleotid

MgADPa

MgATP

a

ADP

PGK*3-PG* PGK

PGK*3-PG

0.048±0.009b,d

0.34±0.13b,d

0.060±0.010c,e

0 38±0.05c

0.27±0.09b,d

0.51±0.22b,d ,f

0.23±0.05c,e

0.38±0.06c ,f

0.41±0.12b

0.48±0.14b

0.34±0.05c

0.39±0.07c

PGK*G-3-P

PGK*3-PG

0.058±0.009c

0.096±0.021

0.045±0.016

Nem mért

0.21±0.02

Nem mért

Nem mért

Nem mért.

Nem mért

MgAMP-PCP

8. táblázat: Nukleotidok disszociációs állandói (mM) 10 mM MgCl2 jelenlétében mért értékek. b Fluorimrtriás titrálással mért érték. c Egyensúlyi dialízissel mért érték. d Adatok (135). e Adatok (137). f 3-PG jelenlétében a MgATP kötodési állandója a MgATP és a MgADP átlaga, mivel a PGK muködik az egyensúlyi reakció elegyben, bár a MgATP koncentrációja dominál MgADP-hez képest.

1,0

1,0

0,8

0,8

ADP (kötött) (mM)

MgADP (kötött) (mM)

a

0,6

0,4

0,2

0,6

0,4

0,2

0,0

0,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

MgADP (szabad) (mM)

1,4

1,6

1,8

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

ADP (szabad) (mM)

14. ábra 3-PG hatása az ADP és a MgADP kötodésére egyensúlyi dialízissel mérve (λ ολ 3-PG nélkül, λ •λ 14mM 3-PG, λ ¦ λ 20mM G-3-P)

Ezek a kísérletek rámutatnak arra, hogy egyrészt a nukleotid foszfátlánca (és az azzal komplexkötésben lévo Mg2+), másrészt a 3-PG karboxil csoportja a felelos a szubsztrátantagonizmusért. Ugyanakkor az, hogy a Mg2+ mentes ADP esetén nem tapasztalható antagonizmus, arra utal, hogy ezt a jelenséget nem okozhatja a kötött nukleotid negatívan töltött foszfát és a 3-PG karboxil csoportjainak közelségének elektrosztatikus taszítása. Az aktív centrum geometriájának ismeretében feltételezhetoen az antagonisztikus hatás magyarázatához a terner komplexben egy olyan konformáció változás feltételezése szükséges, amely még a biner komplexben nem következik be. Ilyen jellegu változás lehet a doménzáródás, mely szintén mindkét szubsztrát kötodését igényli. Ezen hipotézis vizsgálatára felhasználtam azt az ismert tényt, hogy a sertésizom PGK 3-PG szubsztráttal alkotott biner komplexe nyitott konformációban kristályosodik (106). Megvizsgáltuk, hogy ezen nyitott konformációjú kristályban a kötött 3-PG befolyásolja-e a nukleotid szubsztrátok kötodését. Erre lehetoséget adott a Pármai Egyetemen használt

Eredmények és tárgyalásuk

35

egykristály-mikrospektrofotometria módszere. Tehát kollaborációban Dr. Angelo Merli közremuködésével a 3-PG*PGK biner komplex kristályba bediffundáltattunk TNP-ATP-t állandó és a vizsgált nukleotidot változó koncentrációban. Az így kapott nyitott konformációban stabil, kristályos enzim komplexekben mikrospektrofotometriával meghatároztuk a nukleotid-szubsztrát kötodésének disszociációs állandóját (8. táblázat). Az oldatkísérletektol eltéroen, itt nem tapasztalható szubsztrát antagonizmus, azaz a 3-PG nincs gyengíto hatással a nukleotid-szubsztrát kötodésére. Ez az eredmény egyértelmuen bizonyítja, hogy a domén-záródás nélkül nem lép fel szubsztrát-antagonizmus, azaz a domének összezáródása és a szubsztrát antagonizmus szorosan összefüggenek. A

B

C

15. ábra: MgADP és 3-PG tartalmú kristályszerkezetek összehasonlítása A B. Stearothermophilus PGK*MgADP biner komplex (piros) (102), B T.bruce PGK*MgADP*3-PG terner komplex (zöld) (147), C sertésizom PGK*3-PG biner komplex (kék) (106)szerkezetek. A vonalak a 3,5Å alatti kötéseket jelentik, míg nyilak a terner komplexben bekövetkezo változásokat mutatják.

A szubsztrát antagonizmus szerkezeti alapjainak megismerése érdekében molekuláris grafikai módszerrel összehasonlítottam a nukleotid-fehérje kapcsolatokat, az irodalomból már ismert MgADP nyitott (Bacillus stearothermophilus) (15. A ábra) és a MgADP*3-PG zárt (Trypanosoma brucei) (15. B ábra) kristályszerkezetekben. Ez az összehasonlítás azért lehetséges, mivel a nukleotid-fehérje kölcsönhatásokban csak a konzervatív oldalláncok vesznek részt. A biner szerkezetben a Mg2+ szorosan kötodik az ADP α- és β-foszfát oxigénjeihez valamint az α13-hélix N terminálisán lévo Asp 374 konzervatív csoporthoz, míg a terner komplexben ezek a kötések gyengülnek. 3-PG kötodésének különbözoségét a 3-PG nyitott (sertésizom) (15. C ábra) és a MgADP*3-PG zárt (Trypanosoma brucei) kristály szerkezetek összehasonlításával vizsgáltam, ahol jelentos eltéréseket figyeltem meg. A terner komplexben a 3-PG karboxil csoportja erosebben kötodik az Arg 38 oldallánchoz, mint a biner komplexben. A terner komplexben az Arg 38 a βL lemezen lévo Thr 393-mal létesít erosebb kötéseket. A zárt szerkezetben a βL-lemez Ser 392 és a α13-hélix Gly 375 H-híd kötést alakít ki, így közvetlen kapcsolat alakul ki a két domén között. A létrejött H-híd rendszeren keresztül a 3-PG karboxil csoportja módosíthatja a Mg2+ kötodését a nukleotid foszfátokhoz (15. ábra), amit alátámaszt az is, hogy G-3-P jelenlétében nem tapasztalható szubsztrát antagonizmus oldatban. Összemásolva a biner (15. A ábra) és terner (15. B ábra) szerkezetet a Mg2+ helyzete 0,81,0Å-mel elmozdul, természetesen az ADP foszfátjaival együtt. A fém elmozdulása nemcsak a 3-

36

5. Fejezet

PG és a kapcsolódó konzervatív oldallánc kölcsönhatásával magyarázható, hanem sokkal komplexebb, jól szervezett konformációs változás eredménye, amely a 3-PG-köto zsebtol a nukleotid köto zsebig terjed. Ez a folyamat tulajdonképpen a doménzáródás fo mozzanata, mely a Mg2+ által az α13-hélix N terminálisához kötött ADP foszfát láncának elengedésével járhat együtt. Feltételezhetoen a szubsztrát antagonizmus lényegében a katalizált reakció, a foszfotranszfer kezdeti lépését mutatta meg, amikor is a nukleotid-szubsztrát foszfátláncának, a Mg2+ közvetítésével, az enzim felszínén stabilizált helyzete meg kell, hogy gyengüljön, ahhoz, hogy a foszfo-csoport kémiai átvitelre kerülhessen.

5.2.2 A nukleotid kötodés hatása a doménzáródásra A PGK enzim vizsgálatának egyik fo célja, az enzim szubsztrát kölcsönhatások molekuláris szintu megismerése. Ennek elengedhetetlen feltétele a jó minoségu röntgen krisztallográfiás kristály térszerkezet. Azonban MgATP*3-PG terner komplex tartalmú kristály az enzim muködése miatt nem állítható elo, ezért az ATP helyett olyan stabil terner komplexet képezo analógok használata szükséges, mint az AMP-PNP és az AMP-PCP, melyek csak egy-egy atomban térnek el az ATP-tol.

5.2.2.1 MgAMP-PCP*3-PG*PGK terner komplex kristályszerkezete A MgAMP-PCP*3-PG terner komplex kristály szerkezetét az ELTE TTK Elméleti Kémia Tanszékén Kovári Z. határozta meg. A kristály felbontása 2,5Å, szerkezete nyitott. A kristályban a 3-PG kötodése hasonló a már ismert PGK szerkezetekben megfigyeltekhez, azonban a nukleotid kötodése erosen eltéro a már ismert MnAMP-PNP*3-PG (100) kristályszerkezettel összehasonlítva (16. A, B ábra), a MgAMP-PCP β-foszfátja a α8-hélix N terminális végén lévo Asp218-hoz a Mg2+-on keresztül kötodik, míg a MnAMP-PNP β- és γ-foszfátja a α13-hélix N terminálisához. A különbség a két ATP analóg foszfátláncának elhelyezkedésében igen szembetuno. A

B

16. ábra: A MgAMP-PCP és a MnAMP-PNP kristályszerkezetek összehasonlítása A sertésizom PGK*MgAMP-PCP*3-PG terner komplex (piros), B sertésizom PGK*MnAMP-PNP*3-PG terner komplex (kék) (100) nukleotid kötohelye. A vonalak a 3,5Å alatti kötéseket mutatják. Sárgával jelöltem az α13 hélix két gyorsan reagáló SH- csoportját.

Eredmények és tárgyalásuk

37

A két kristály szerkezetének összehasonlítása során felmerül a kérdés, vajon e két különféle kötodés miért jött létre. Esetleg csak a kristályosítás során képzodött mutermékrol van szó, vagy tényleges kötodési különbség áll-e fenn a két analóg között? Ennek kiderítésére megvizsgáltam, hogy milyen az oldott enzimnek az analógokkal való kölcsönhatása. E célból enzimkinetikai, kötodési és tiol-reaktivitási kísérleteket végeztem.

5.2.2.2 ATP analógok enzimmel való kölcsönhatása Összehasonlítottam a két analóg hatását a PGK által katalizált reakció kinetikájára (17. ábra), melyek gátló hatása várható volt, hiszen a szubsztrát MgATP helyére kötodnek. 1,2

1,2

pH 7,5

pH 8,5 1,0

0,8

K I =1,2±0,24

0,6

K I =0,58±0,28

v (∆A340/min)

v (∆A340/min)

1,0

0,8

K I =0,59±0,23

0,6

0,4

0,4

K I =0,039±0,012 0,2

0,2

0,0

0,0 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

MgATP, mM

2,5

3,0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

MgATP, mM

17. ábra ATP analógok gátló hatása a PGK aktivitásra (λ +λ inhibitor távollétében,λ ? λ 1,5mM MgAMP-PCP, λ ? λ 1,5mM MgAMP-PNP, λ Νλ 0,94mM MgADP)

A MgAMP-PNP és a MgAMP-PCP hatása foként a Ks(kat), a katalitikus kötohelyre jellemzo érték növekedésében nyilvánul meg, tehát gyengíti a MgATP katalitikus helyre való kötödését, míg az aktiváló helyre jellemzo Ks(akt) értékére alig van hatással. 7,5-ös pH-n a MgAMP-PNP valamivel erosebben gátol, mint a MgAMP-PCP. A két analóg kismértékben különbözo gátlását az eltéro pK értékük okozhatja, ami AMP-PNP esetén 7,7, míg AMP-PCP esetében 8,4. Ezért elvégeztem a kinetikai méréseket magasabb, 8,5-ös pH-n, ahol már mindkét analóg disszociáltabb állapotban van. A gátlási görbék közötti különbség megszunik, az analógok gátló hatása a mérési hiba határain belül egyformává válik, tehát a pH hatás jó egyezést ad az analógok különbözo pKa értékeivel. Ezt az analógok gátlási állandói (Ki) is alátámasztják, amit MgATPvel szemben kompetitív gátlást feltételezve számoltam ki. Összehasonlításként pH 7,5 esetén feltüntettem a sokkal erosebb inhibitor MgADP gátlási görbéjét is. Megvizsgáltam, hogy a kristályosításnál alkalmazott 7,5-s pH-n mutatkozik-e különbség a két analóg enzimhez való kötodési állandóiban. A disszociációs állandókat közvetett tiolreaktivitási vizsgálattal határoztam meg, mely alapja az, hogy a kötött ligand nagymértékben védi a nukleotid kötohelyhez közeli α13-hélixbeli Cys378 és Cys379 oldalláncokat (16. ábra) a DTNB módosító hatás ellen (142). Az így meghatározott disszociációs állandók jól egyeznek a közvetlen egyensúlyi dialízissel mért adatokkal (9. táblázat), bizonyítván a közvetett módszer használhatóságát.

38

5. Fejezet

3000

10mM 3-PG jelenlétében 800

2500

600

k (M-1s-1)

k (M-1s-1)

2000

1500

400

1000

200 500

0

0 0

2

4

6

8

10

0

2

4

6

8

10

MgAMP-PNP ill. MgAMP-PCP (mM)

MgAMP-PCP ill. MgAMP-PNP (mM)

18. ábra ATP analógok kötodésének vizsgálata (λ ? λ MgAMP-PCP,λ ? λ MgAMP-PNP)

3 PG távollétében az MgAMP-PCP kötodése csak kicsit gyengébb, mint a MgAMP-PNP-jé (18. ábra), a disszociációs állandók (9. táblázat) csupán kb. 2-s faktorban különböznek. 3-PG jelenlétében a két kötodési görbe közti különbség azonban eroteljessé válik. Tehát a 3-PG szignifikánsan gyengíti a MgAMP-PCP kötodését, a MgAMP-PNP kötodésére viszont gyakorlatilag alig van hatása. K d (mM) Nukleotid

MgAMP-PCP MgAMP-PNP MgADP

a

3-PG nélkül 1.07±0.18 1.28±0.42a 0.41±0.08 0.43±0.21a 0.039±0.014 0.060±0.01b,c

10 mM 3-PG jelenlétében 2.80±0.68 0.68±0.11 0.31±0.040 0.38±0.038c

9. táblázat Nukleotidok disszociációs állandói egyensúlyi dialízissel laborunkban korábban mért adatok. b Adatok (137).c Adatok a III. közlemény

5.2.2.3 Nukleotidok tiol-reaktivitásra gyakorolt hatása és a hélix fexibilitás Tiol módosítás segítségével nem csak az analógok disszociációs állandói határozhatóak meg, hanem az analógok kötodésmódjára is következtethetünk, a végtelen analóg koncentrációra extrapolált, un. maximális védohatás segítségével. Az analógok maximális védohatása biner komplexekben közel azonos (10. táblázat). Telítési 3-PG jelenlétében azonban a MgAMP-PCP védohatása jelentosen kisebb, mint a MgAMP-PNP-jé.

Eredmények és tárgyalásuk

39

A tiol módosítás sebességi állandói (k, M-1 s -1) és relatív viszonyuk (%) 3-PG nélkül (biner komplex)

Ligand DTNB

10 mM 3 -PG jelenlétében (terner komplex)

jódecetamid

DTNB

jódecetamid

Kontroll

2625±39

100

0.118±0.017

100

850±19

100

0.047±0.003

100

MgAMP-PCP

319±41

12,1

0.0107±0.0018

9,1

324±23

38,0

0.0147±0.0014

31,2

MgAMP-PNP

240±32

9,3

0.0104±0.0012

8,8

59±14

7,0

0.0044±0.0002

9,3

MgATP

280±30a

10,6

0.014a

12,0

MgADP

22±3a

0,8

0.0014±0.0006a

1,2

Nem mérhetob 18±5

2,1

0.0026±0.0002

5,5

10. táblázat Nukleotidok maximális védohatása a Adatok (110) b Muködo terner komplex

Arra, hogy mi okozhatja ezt a nagy különbséget a terner komplexben, két lehetséges magyarázat merülhet fel: •

A kötött ligand közvetlen sztérikus gátlást fejt ki a módosítással szemben,

•

A kötodés következtében lokális konformáció változás jön létre, mely befolyásolja a tiolok módosító hatását.

Mivel a DTNB viszonylag nagy molekula, közvetlen térbeli hatás nagyobb valószínuséggel közremuködhet az észlelt védohatásban. Ennek kivizsgálására a jóval kisebb méretu jódacetamidot használva is megmértem az analógok védohatását. Mind a két reagenst az analógok közel telítési koncentrációjában alkalmaztam. A %-s védohatást tekintve a DTNB estén mérthez hasonló eredményt kaptam. Ezek szerint az analógok maximális védohatása nem függ a módosítószer méretétol, tehát kicsi a valószínusége, hogy közvetlen sztérikus hatás okozza a terner komplexek esetén tapasztalt nagy különbséget. Ebbol az következik, hogy a kötött ligandok hatása következtében létrejövo lokális konformációs változás szabja meg a tiolcsoportok reakció képességét. Ez jó egyezést mutat a szerkezeti adatokkal is, ahol a nukleotid γ-P atomja az AMP-PCP esetében 15Å ill. AMP-PNP esetén 12Å távolságban van a Cys S atomjától (ábra). Összehasonlítás kedvéért, a MgATP és a MgADP tiolreaktivitás ellen védo hatását is megvizsgáltam és adatokkal egyezoen nagymértéku különbséget tapasztaltam. 3-PG távollétében a nukleotidok nagyon hasonló hatást fejtenek ki a tiol-reaktivitásra. Tehát az ATP-analógok biner komplexeiben a két analóg kötodésmódja hasonló lehet, azaz az AMP-PCP foszfát lánca is valószínuleg az α13-hélix N terminálisához kötodik, bár gyengébben, mint az AMP-PNP-jé. 3-PG jelenlétében, azonban az antagonisztikus hatásból eredoen a gyengébben kötodo AMP-PCP kötodése nagyobb mértékben meglazul (vö. szubsztrát antagonizmus molekuláris mechanizmusa), mint az AMP-PNP-jé és ennek következtében az AMP-PCP foszfát lánca átbillen a kristályszerkezetben megfigyelt új, alternatív kötohelyre, mely csak a 3-PG jelenlétében muködik. Ezáltal sokkal kisebb mértékben védi a tiolokat, mely a tiolok lokális környezetének nagyobb flexibilitását is jelenti. Ez az oldatkísérletekbol levont következtetés jól tükrözodik a terner komplexek kristályszerkezetében is (19. ábra).

40

5. Fejezet

19. ábra: A mozgékonyságra jellemzo B faktor szerintt színezet kristályszerkezetek A sertésizom PGK*MgAMP-PCP*3-PG terner komplex, B sertésizom PGK*MnAMP-PNP*3-PG terner komplex (100), C B. Stearithermophilus PGK*MgADP biner komplex (102).

Az új szerkezetben, ahol a MgAMP-PCP semmiféle kapcsolatban nincs a 13-as hélix N terminálisával, a hélix szerkezeti mobilitásával arányosnak tekintheto B faktor értéke valóban magas (19. A ábra). Ilyen körülmények között a tiol csoportok ennek a hélixnek a részeként, a módosítás ellen védtelenek, amint ezt a MgAMP-PCP gyenge védohatása is mutatja. A α13-hélix flexibilitása és a nukleotid foszfát lánc kötodése között nyilvánvalóan nem csak az új, hanem a többi kristályszerkezetben is kapcsolatnak kell lennie. Ezért a már ismert AMP-PNP-t (19. B ábra) (100) és MgADP-t (19. C ábra) (102) köto szerkezetekben is megvizsgáltam a hélix flexibilitást. A MnAMPPNP terner komplexben a foszfát O atomok H-híd kötése a α13-hélix N terminálisához kiterjeszti és stabilizálja a hélix hidrogén kötés rendszerét (16. ábra). Ehhez hozzájárul a negatívan töltött foszfát és a pozitívan polarizált hélix (hélix dipol) elektrosztatikus kapcsolata. Ennek megfeleloen az α13-hélix mozgékonysága relatíve korlátozott, amit az alacsonyabb B-faktor is mutat (19. B ábra). A MgADP-vel alkotott biner komplex szerkezetében a α13-hélix szoros kapcsolatot alakít ki a nukleotiddal és az α13-hélix rendezettsége nagy (102), a hélix flexibilitása minimálisra csökken (19. C ábra). Ennek megfeleloen, valóban a MgADP csökkenti a legnagyobb mértékben a tiol-csoportok reakcióképességét.

5.2.2.4 Az ATP-t ill. a MgATP–t köto biner enzim komplexek kristály szerkezete A MgAMP-PCP-t köto kristály szerkezet által megmutatott nukleotid foszfátlánc alternatív kötohely jelentoségét alátámasztották a természetes szubsztráttal a MgATP-vel ill. a Mg2+-mentes ATP-vel meghatározott kristályszerkezetek. Nagy felbontású MgATP (2,1Å) és ATP (1,9Å) binerkomplex tartalmú kristályok szerkezetét szintén Kovári Zoltán határozta meg (20. ábra). A két szerkezetben a foszfát lánc kötodési módja igen eltéro. Mg2+ távollétében az ATP foszfát lánca az α13 hélix felé hajlik és a

Eredmények és tárgyalásuk

41

γ-foszfát oxigénje a Asp 374 és a Thr 375 peptid N-vel H-hidat létesít, melyek a pozitív hélix dipol is erosítik. Ezzel szemben a MgATP γ-foszfátja az α13 hélixtol inkább elhajlik az α8 hélix felé és csak egy víz molekulával van kapcsolata. A β-foszfát oxigénje azonban egy víz molekulán keresztül az Asp 218-hoz kötodik, ami az α8 hélix N terminális végén található. Ez a különbség a fémion hatására jön létre, ezért oldatkísérletekben megvizsgáltam a fémion szerepét.

20. ábra: ATP és MgATP biner komplex tartalmú kristály szerkezetek A 1,9Å felbontású sertésizom PGK*ATP biner komplex és B 2,1Å felbontású sertésizom PGK*MgATP biner komplex kristályszerkezete. A nyilak a 3,5Å alatti kötéseket mutatják.

5.2.2.5 A Mg2+ szerepe a PGK által katalizált foszfo-transzferben Oldott enzimes kísérleteimben kvantitatíve jellemeztem a nukleotidok kötését. Egyrészt izotermális titráló kalorimetria (ITC) használatával ATP, MgATP, MgADP, MgAMP-PNP kötodését vizsgáltuk meg, Gugolya Zoltán és Vonderviszt Ferenc (Veszprémi egyetem) segítségével. Az eredmények alátámasztották az 1:1 kötodési sztöhiometriát és a kötodés energetikájára is információt nyerhettünk: az ATP kötodése inkább entalpia változással, a MgATP kötodése pedig inkább entrópia változással jár. Másrészt adenozin és anion (citrát vagy pirofoszfát) jelenlétében kiszorításos titrálást végeztem az ATP és az ADP kötodés jellemzésére, Mg2+ jelen ill. távollétében. Az adenozin teljes mértékben képes kiszorítani a MgATP-t és a MgADP-t, azaz ezek foként az adenozin gyurun keresztül kötodnek az aktív centrumba, míg a Mg2+ mentes nukleotidok adenozin gyurun való kötodése mellett, a kötodés ionos jellege is eros, amit az ITC-s kísérletek is alátámasztanak. Megvizsgáltam a nukleotidok fehérje konformációs stabilitására gyakorolt hatását pásztázó mikrokalorimetria (DSC) segítségével (21. ábra). Már ismert tény volt hogy a nukleotidok védik a PGK-t a hodenaturáció ellen (142), ezért megvizsgáltam a Mg2+ ion hatását erre a tulajdonságukra. Az ATP és ADP azonosan 2,7±0,3°C-kal emelte meg a fehérje átmeneti homérsékletét, a MgATP a kísérleti hibán belül nem változtatott ezen, míg a MgADP további 1,9°C-kal emelte azt.

42

5. Fejezet

60 58

Tm (o C)

56 54 52 50 48 0

10

20

30

40

50

60

Mg2+ (mM)

21. ábra: A nukleotidok fehérje konformációs stabilitásra gyakorolt hatása (? ¦ ? nukleotid nélküli, ? ? ? 10mM MgATP, ? ? ? 10mM ATP, ? p ? 10mM MgADP, ? r ? 10mM ADP) Az abcisszán megadott Mg2+ koncentráció a nukleotidok által kötött Mg2+.

A nukleotidok az α13 hélixben lévo tiol csoportok módosítása elleni védohatását és ezzel a hélix lokális flexibilitásra gyakorolt hatását korábban már vizsgáltam az ATP analógokkal végzett kísérleteim során. Ezen megfigyeléseket most kiterjesztettem a Mg2+ ion hatásának megfigyelésére is (11. táblázat). A Mg2+ mentes nukleotidok, a nukleotid analógok sot az AMP is igen hasonló védohatást mutattak, azonban a Mg2+ hatására jelentos különbség alakult ki közöttük. A MgADP védohatása eroteljesen megnott, addig a MgATP és a nukleotid analógok Mg komplexének védohatása megnott ugyan, azonban sokkal kisebb mértékben.

Ligandok Kontroll ADP ATP AMP-PCP AMP-PNP AMP Adenozin Adenin

A tiol módosítás sebességi állandói (k, M-1s -1 )és relatív viszonyuk (%) Mg 2+ mentes 25 mM Mg 2+ 0,1180±0,017 100 0,1180±0,017 100 0,0253±0,0007 21,4 0,0013±0,00018 1,1 0,0265±0,0053 22,8 0,0140±0,0025 12 0,0296±0,0014 25 0,0107±0,0018 9,1 0,0280±0,0019 24 0,0104±0,0012 8,8 0,0287±0,0007 24,3 0,0648±0,0018 22,2 0,0381±0,0076 32 0,1170±0,254 100 11. táblázat: A Mg 2+ és Mg-mentes nukleotidok védohatás a tiolreaktivitás ellen.

Az oldat kísérletekbol tehát egyértelmunek látszik, hogy specifikus jellegu kölcsönhatása az enzimnek a nukleotidokkal csupán fémion jelenlétében alakul ki, hisz a fémion távollétében az ATP és ADP konformációs stabilitásra, sot az α13 hélix lokális flexibilitására gyakorolt hatása sem különböztetheto meg és a PGK-val való kölcsönhatásuk erossége sem különbözik lényegesen. Úgy tunik tehát, hogy a fémion elengedhetetlen a szubsztrát-szeru nukleotid konformáció és kötés kialakításában. A fémion szerepére rámutat az a tény is, hogy a korábbiakban bemutatott szubsztrát antagonizmus jelensége csak a fémionnal komplexben lévo nukleotidok kötodésére van hatással. Tehát a fémionnal való kölcsönhatás segíti elo a foszfát lánc kötodésének 3-PG hatására bekövetkezo gyengülését, azaz a nukleotid foszfátlánc mozgékonyságát növeli, ami a katalízis lényeges elemének látszik.

Eredmények és tárgyalásuk

43

5.2.2.6 A nukleotid foszfátok alternatív kötohelye és a doménzáródás kapcsolata Az alternatív kötohelyre kötodo MgAMP-PCP*3PG terner, a MgATP biner és a MnAMPPNP*3-PG terner komplex tartalmú kristályszerkezetekben a nukleotidok helyzetét összehasonlítva (22. ábra), jól látszik, hogy a MgATP a két szélso pozició között helyezkedik el és minden valószínuség szerint muködés közben fel is veszi azokat.

22. ábra: A MgATP és az ATP analógok kötodésének összehasonlítása piros: MgAMP-PCP a IV. publikációból, zöld: MgATP az V. publikációból, kék :MnAMP-PNP (100)

Kérdésként merül fel, hogy mi lehet a jelentosége annak, hogy a nukleotid MgATP foszfátjainak két alternatív kötohelye is lehet az aktív centrumban. Elképzelhetonek tartom, hogy a katalízis során a nukleotid foszfátlánca mozog a két a kötohely között, ily módon segítve a domén-záródást azzal, hogy a 8-as és 13-as hélix N terminálisait közelíti egymáshoz (23. ábra). A 13-as hélix flexibilitását a nukleotid kötodési módja szabályozza, hozzájárulva a βL-redonél lévo fo csukló-régió muködéséhez, mely alapvetoen szabályozza a domének relatív (nyitott ill. zárt) helyzetét, mely a doménzáródás lehetséges molekuláris mechanizmusának korábbi analízise (103) alapján is várható.

23. ábra: A doménzáródás lehetséges mechanizmusa piros: MnAMP-PNP*3-PG nyitott terner komplex (100), sötétkék: MgAMP-PNP*3-PG zárt terner komplex (105) az α13 és a βL szerint szuperponálva a szerkezeteket.

44

6. Fejezet

6 ÖSSZEFOGLALÁS -TÉZISEK β-glükozidáz enzim vizsgálatakor a következo megállapításokat tettem: R

Négy Aspergillus törzs β-glükozidáz termelését és fermentlé felülúszóinak kinetikai tulajdonságát vizsgálva megállapítottam, hogy mind a négy törzset alkalmas oldott enzimként a celluláz enzimkomplex kiegészítésére.

R

Bemutattam, hogy a pNPG, a β-glükozidáz aktivitására általánosan használt szubsztrát, a βglükozidáz tartalmú fermentlé felülúszó estén már 1,5mM-ban gátló hatású, ezért az eddig alkalmazott 5mM szubsztrát helyett 1mM szubsztrát alkalmazását javasolom.

R

Kísérlettervezés segítségével optimalizáltam az Aspergillus phoenicis QM 314 törzs által termelt pelletek glutáraldehides rögzítését, amellyel jó muködési stabilitású rögzített enzimet állítottam elo.

A foszfoglicerát kinázzal végzett munkám során az alábbi következtetéseket vontam le: R

A doménmozgásokkal összefügg a szubsztrát antagonizmus, melynek molekuláris mechanizmusa során a terner komplexben létrejövo H-híd rendszeren keresztül a 3-PG karboxil csoportja gyengíti a nukleotid foszfátjainak kötodését. Az interdomén régióban mindkét szubsztrát jelenlétében bekövetkezo konformációváltozás a 3-PG-köto zsebtol a nukleotid köto zsebig terjed. Ez a folyamat a doménzáródás és az enzimreakció fo mozzanata, melynél a Mg2+ közvetítésével az enzimhez rögzített nukleotid foszfátok kötodésének gyengülése szükséges a foszfo-csoport kémiai átviteléhez.

R

A MgAMP-PCP ill. a MgAMP-PNP foszfátlánca 3-PG jelenlétében eltéro orientációban kötodik a PGK-hoz. Az oldott enzimmel végzett kötodési és tiolreaktivitási kísérleteim egyértelmuen alátámasztják, hogy ez a különbség nem csak a kristályban, hanem az oldott enzim esetén is fennáll és a nukleotid foszfátlánc kötodési módjától függoen szabályozza az interdomén régió flexibilitását.

R

A Mg2+-ion alapvetoen szükséges a MgATP-vel való szubsztrátszeru kölcsönhatás kialakításához. Feltételezheto, hogy a MgATP szubsztrát foszfátlánca idolegesen felveszi mindkét orientációt azaz két alternatív kötohely között elmozdulva szabályozza a fo molekuláris csukló régió muködését és a doménzáródást.

Összefoglalva, az értekezésemben bemutatott munkák enzimekkel foglalkozó kutatások mindkét szintjéhez az egyetemes tudásunkat gyarapító alap- és a gyakorlati célokat szolgáló alkalmazott kutatáshoz is kapcsolódnak. β-glükozidázt ipari alkalmazás céljára állítottam elo így mind oldott, mind rögzített enzimként alkalmas a celluláz enzimkomplex kiegészítésére. 3-foszfoglicerát kináz enzimmel folytatott vizsgálataim alapkutatás jelleguek, tehát jelentoségük is az alapkutatás számára van. Hozzájárulnak a természetben oly elterjedt foszforil-transzfert katalizáló enzimek reakció mechanizmusának tisztázásához. Eredményeim emellett gyarapítják a multidomén fehérjék doménzáródásáról rendelkezésre álló ismeretanyagot.

Irodalmi hivatkozások

45

7 KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE I.

Flachner, B., Réczey, K. (2003) β-glucosidase production and characterization of some Aspergillus strains Beküldve 2003 szeptemberben a Chemical and Bochemical Engineering Quarterly-be

II.

Flachner, B.; Brumbauer, A.; Réczey, K.;(1999) Stabilization of β-glucosidase in Aspergillus phoenicis QM 329 pellets Enzyme and Microbial Technology 24,362-369

III. Merli, A.; Szilágyi, A.N.; Flachner, B.; Rossi,G.L.; Vas, M. (2002) Nucleotide Binding to pig muscle 3-phosphoglycerate kinase in the crystal and in solution: Relationship between substrate antagonism and interdomain communication Biochemistry 41, 111-119 IV. Kovári, Z.; Flachner, B.; Náray-Szabó, G.; Vas, M. (2002) Crystallographic and thiol-reaktivity studies on the complex of pig muscle phosphoglycerate kinase with ATP and analogues: Correlation between nucleotide binding mode and helix flexibility Biochemistry 41, 8796-8806 V.

Flachner, B., Kovári, Z., Varga, A., Gugolya, Z., Vonderviszt, F., Náray-Szabó, G. Vas, M. (2003) Mg2+-induced differences in the interactions of ATP and ADP phosphates with 3phosphoglycerate kinase: Solution binding data and new crystallographic structures with ATP and MgATP Beküldve 2003 juniusában a Biochemistry-be

Eloadások: Flachner, B.; Brumbauer, A.; Réczey, K.: Stabilisation of the self-immobilised β-glucosidase from Aspergillus phoenicis QM329 th

9 European Bioenergy Conference Koppenhága, Dánia 1996 (poszter eloadás) Flachner, B.; Kováry, Z.; Náray-Szabó, G.; Kazinczyné Vas M.:

46

7. Fejezet

AMP-PCP és AMP-PNP ATP analógok kölcsönhatása foszfoglicerát kinázzal A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 7. Munkaértekezlete Kezthely, 2002 (poszter eloadás) Flachner, B.; Kováry, Z.; Kazincyné Vas, M.: ATP-analógok kötodési módja és kapcsolat az oldatban muködo enzimnél

a

foszfoglicerát

kináz

domén-flexibilitása

közötti

Straub-napok, Szeged, 2002 (szóbeli eloadás)

Flachner, B., Varga, A., Kovári, Z., Gugolya, Z., Vonderviszt, F., Náray-Szabó, G., Vas, M. A Mg2+ alapveto szerepe az ATP és ADP foszfoglicerát kinázzal való specifikus kölcsönhatásában A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 8. Munkaértekezlete, Tihany, 2003. (poszter eloadás)

Irodalmi hivatkozások

47

8 IRODALMI HIVATKOZÁSOK 1.

2. 3. 4. 5. 6. 7.

8. 9. 10. 11. 12. 13.

14. 15. 16.

17. 18.

19. 20. 21.

22. 23. 24. 25.

Sanz-Aparicio, J., Hermoso, J. A., Martinez-Ripoll, M., Lequerica, J. L., Polaina, J.: Crystal structure of beta-glucosidase A from Bacillus polymyxa: insights into the catalytic activity in family 1 glycosyl hydrolases. J Mol Biol 275 (1998) 491-502 Beguin, P.: Molecular biology of cellulose degradation. Annu Rev Microbiol 44 (1990) 219-48 Barrett, T., Suresh, C. G., Tolley, S. P., Dodson, E. J., Hughes, M. A.: The crystal structure of a cyanogenic beta-glucosidase from white clover, a family 1 glycosyl hydrolase. Structure 3 (1995) 951-60 Zechel, D., Boraston, A. B., Gloster, T., Boraston, C., Tilbrook, M., Macdonald, J., Stick, R. V., Davies, G. J.: Megjelenés alatt (1ODO PDF alapján). Woodward, J., Wiseman, A.: Fungal and other β-D-glucosidase-Their propertis and application. Enzym Microb. Technol 4 (1982) 73-79 Suto, M., Tomita, F.: Induction and catabolit repretion mechanism of cellulase in fungi. J Biosci Bioeng 92 (2001) 305-311 Kubicek, C. P.: Involvement of a conidial endoglucanase and a plasma-membrane-bound beta-glucosidase in the induction of endoglucanase synthesis by cellulose in Trichoderma reesei. J Gen Microbiol 133 ( Pt 6) (1987) 1481-7 Koes, R. E., Quattrocchino, F., Mol, J. N. M.: The flavonoid biosynthetic pathway in plants: function and evolution. BioEssays 16 (1994) 123-132 Kleczkowski, K., Schell, J.: Phytohormone conjugates:nature and funkcion. Crit Rev Palnt Sci 14 (1995) 283-298 Inoue, K., Ebizuka, Y.: Purification and characterization of furostanol glycoside 26-O-β-glucosidase from Costus speciosus rhizomes. FEBS Lett 378 (1996) 157-160 Orruno, E., Apenten, R. O., Zabetakis, I.: The role of b-glucosidase in the biosynthesis of 2,5-dimetyl-4hydroxy-3(2H)-furanone in strawberry. Flavor and Fragrance J. 16 (2001) 81-84 Poulton, J. E.: Cyanogenesis in plant. Plant Physiol 94 (1990) 201-231 Duroux, L., Delmotte, F. M., Lancelin, J. M., Kéravis, G., Jay-Allemand, C.: Insight into naphthoquinone metabolism:β-glucosidase-catalysed hydrolysis of hydojunglone β-D-glucopyranoside. Biochem J. 333 (1998) 275-283 Hsieh, M. C., Graham, T. L.: Partial purification and caracterisation of soybean β-glucosidase with high specific activity towards isoflavone conjugates. Phytochemistry 58 (2001) 995-1005 Sue, M., Ishihara, A., Iwamura, H.: Purification and characterization of a beta-glucosidase from rye (Secale cereale L.) seedlings. Plant Science 155 (2000) 67-74 Hopke, J., Donath, J., Blechert, S., Boland, W.: Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a beta-glucosidase and jasmonic acid. FEBS Lett 352 (1994) 146-50 Paré, P. W., Tumlinson, J. H.: Plant volatiles as a defence against insect herbivores. Plant Physiol 121 (1999) 325-331 Stotz, H. U., Pittendrigh, B. R., Kroymann, J., Weniger, K., Fritsche, J., Bauke, A., Mitchell-Olds, T.: Induced plant defence responses against chewing insects. Ethylene signalling reduces resistance of Arabidopsis against Egyptian cotton worm but not diamondback moth. Plant Physiol 124 (2000) 1007-18 Grabowski, G. A., Gatt, S., Horowitz, M.: Acid beta-glucosidase: enzymology and molecular biology of Gaucher disease. Crit Rev Biochem Mol Biol 25 (1990) 385-414 Grabowski, G. A., Leslie, N., Wenstrup, R.: Enzyme therapy for Gaucher disease: the first 5 years. Blood Rev 12 (1998) 115-33 Sawkar, A. R., Cheng, W. C., Beutler, E., Wong, C. H., Balch, W. E., Kelly, J. W.: Chemical chaperones increase the cellular activity of N370S beta -glucosidase: a therapeutic strategy for Gaucher disease. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (2002) 15428-33 Chan, L., Lin, H.: Enzyme repleacement therapy for Gaucher Disease: The only experience in Malaysia. Med J Malaysia 57 (2002) 348-352 Martino, A., Pifferi, P. G., Spagna, G.: Production of β-glucosidase By Aspergillus niger using carbon source derived from agricultural wastes. J Chem Techn Biotechnol 60 (1994) 247-252 Virginia Polytechnic Institute and State University: http://www.biol.vt.edu/faculty/esen/glycosidaselab/research.html Williams, P. J., Sefton, M. A., Francis, I. L.: Glycosodic precursors of varietal grape and wine flavour. In: flavor precursion. ACS Symp Ser 490 (1992) 74-84

48

26. 27. 28. 29.

30.

31.

32. 33. 34.

35. 36. 37. 38. 39. 40.

41.

42.

43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50.

8. Fejezet Gunata, Z. Y., Baynove, C. T., Tapiero, R. E., Condonnier, R.: Hydrolysis of grape monoterpentyl β-Dglucosides by various β-glucosidases. J. Agric Food Chem 38 (1990) 1232-1236 Winterhalter, P., Skouroumounis, G.: Glyconjugated aroma compounds: occurrence, role and biotechnological transformation. Adv Biochem Eng Biotechnol 55 (1997) 73-105 Fernandez, M., Ubeda, J. F., Briones, A. I.: Typing of non-Saccharomyces yeasts with enzymatic activities of interest in wine-making. Int J Food Microbiol 59 (2000) 29-36 Martino, A., Schiraldi, C., Di Lazzaro, A., Fiume, I. I., Spagna, G., Pifferi, P. G., De Rosa, M.: Improvement of the flavour of Falanghina white wine using a purified glycosidase preparation from Aspergillus niger. 36 (2000) 93-102 Spagna, G., Barbagello, R., Palmeri, R., Restuccia, C., Giudici, P.: Properties of endogenious βglucosidase of Pichia anomala strain isolated from Sicilian musts and wines. Enzyme Microb Tech 31 (2002) 1036-1041 Spagna, G., Barbagello, R., Palmeri, R., Restuccia, C., Giudici, P.: Properties of endogenious βglucosidase of a Saccharomyces cerevisiae strain isolated from Sicilian musts and wines. Enzyme Microb Tech 31 (2002) 1030-1035 Martino, A., Pifferi, P. G., Spagna, G.: Immobilization of β-glucosidase from a commercial preparation. Part 2. Optimalization of the immobilization process on citosan. Process Biochem 31 (1996) 287-293 Spagna, G., Barbagello, R. N., Pifferi, P. G., Blanco, R. M., Guisan, J. M.: Stabilization of βglucosidase from Aspergillus niger by binding to an amine agarose gel. J Mol Catalysis 11 (2000) 63-69 Riccio, P., Rossano, R., Vinella, M., Domizio, P., Zito, F., Sansevrino, F., D'Elia, A., Rosi, I.: Extraction and immobilization in one step of two β-glucosidase released from a yeast strain of Debaryomyces hansenii. Enzym Microb. Technol 24 (1999) 123-129 Mielenz, J. R.: Ethanol production from biomass: technology and commercialization status. Curr Opin Microbiol 4 (2001) 324-9 Goyal, A., Ghosh, M., Eveleigh, D.: Characteristics of fungal cellulases. Biores. Technol. 36 (1991) 37-50 Sun, Y., Cheng, J.: Hydrolysis of lignocellulostic materials for ethanol production: a review. Bioresource Techn. 83 (2002) 1-11 Eriksson, T., Börjesson, J., Tjerneld, F.: Mechanism of surfactant effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Enzym Microb. Technol 31 (2002) 353-364 Duff, S. J. B., Murray, W. D.: Bioconversion of forest products indrustry waste cellulosics to fuel ethanol: a reveiw. Bioresource Techn. 55 (1996) 1-33 Dizhbite, T., Zakis, G., Kizima, A., Lazareva, E., Rossinkaya, G., Jurkjane, V., Telysheva, G., Viesturs, U.: Ligni- a useful biosource for production of sorption-active materials. Biores. Technol. 67 (1999) 221-228 Philippidis, G. P., Smith, T. K., Wyman, C. E.: Study of the enzymatic-hydrolysis of cellulose for production of fuel ethanol by simultaneoussaccarification and fermentation process. Biotechnol. Bioeng. 41 (1993) 843-853 Golias, H., Dumsday, G. J., Stanley, G. A., Pamment, N. B.: Evaluation of a recombinant Klebsiella oxytoca strain for ethanol production from cellulose by simultaneous saccharification and fermentation: comparison with native cellobiose-utilising yeast strains and performance in co-culture with thermotolerant yeast and Zymomonas mobilis. J Biotechnol 96 (2002) 155-68 Sternberg, D.: Production of cellulase by Trichoderma. Biotechnol Bioeng Symp (1976) 35-53 Persoon, I., Tjerneld, F., Hang-Hägerdal, B.: Fungal cellulotyc enzyme production: a review. Process. Biochem. 26 (1991) 65-74 Ryu, D. D. Y., Mandels, M.: Cellulases:Biosynthesis and aplications. Enzym Microb. Technol 2 (1980) 91102 Bisaria, V. S., Ghose, T. K.: Biodegradation of cellulosic matherials: substrates, microorganism, enzymes and products. Enzym Microb. Technol 3 (1981) 90-104 Maguire, J. R.: Kinetics of hydrolysis of cellulose β-1,4-gluban cellobiohydrolyse of Trichoderma viride. Can. J. Biochem. 55 (1977) 644-650 Hsu, T. A., Gong, C. L., Tsao, G. T.: Kinetic studies of cellodextrin hydrolysis by exocellulase from Trichoderma reesei. Biotechnol Bioeng 22 (1980) 5305-2320 Tiraby, G.: Genetic improvement of Trichoderma reesei for large scale cellulase production. Enzym Microb. Technol 6 (1988) 341-346 Tangnu, S. K., Blanch, H. W., Wilke, C. R.: Enhanced production of cellulase, hemicellulase and βglucosidase by Trichoderma reesei (RUT C-30). Biotechnol Bioeng 1981 (1981) 1837-1849

Irodalmi hivatkozások

51.

52.

53. 54. 55. 56.

57.

58. 59.

60.

61. 62. 63.

64.

65.

66.

67. 68. 69. 70. 71. 72.

73.

49

Awafo, V. A., Chahal, D. S., Simpson, B. K.: Evaluation of combination treatments of sodium hydroxide and stream explosion for the production of cellulase-system by two T. reesei mutants under solid-state fermentation conditions. Biores. Technol. 73 (2000) 235-245 Thygesen, A., Homsen, A. B., Schmidt, A. S., Jorgensen, H., Ahring, B. K., Olsson, L.: Production of cellulose ash hemicellulose-degrading enzymes by filamentous fungi cultivated on wet-oxidised wheat straw. Enzym Microb. Technol 32 (2003) 606-615 Soni, R., Sandhu, D. K., Soni, S. K.: Localisation and optimalisation of cellulase production in Chaetomium erraticum. J Biotechnol 73 (1999) 43-51 Xin, Z., Yinbo, Q., Peiji, G.: Acceleration of etanol production from mill waste by supplementation with β-glucosidase. Enzym Microb. Technol 15 (1993) 62-65 Sternberg, D., Vijayakumar, P., Reese, E. T.: Beta-Glucosidase: microbial production and effect on enzymatic hydrolysis of cellulose. Can J Microbiol 23 (1977) 139-47 Srinivasan, K., Murakami, M., Nakashimada, Y., Nishio, N.: Efficient production of cellulolytic and xilanolytic enzymes by the rumen anaerobic fungus, Neocallimastix frontalis, in a repeated batch culture. J Biosci Bioeng 91 (2001) 153-158 McCabe, B. K., Kuek, C., Gordon, G. L., Phillips, M. W.: Production of beta-glucosidase using immobilised Piromyces sp. KSX1 and Orpinomyces sp. 478P1 in repeat-batch culture. J Ind Microbiol Biotechnol 30 (2003) 205-9 Skory, C. D., Freer, S. N., Bothast, R. J.: Properties of an intracellular beta-glucosidase purified from the cellobiose-fermenting yeast Candida wickerhamii. Appl Microbiol Biotechnol 46 (1996) 353-9 Desrochers, M., Jurasek, L., Paice, M. G.: high production of β-glucosidase in Schizophyllum commune:Isolation of the enzyme and effect of culture filtrate on cellulose hydrolysis. Appl Enviroment Microbiol 41 (1981) 222-228 Gomes, I., Gomes, J., Gomes, D. J., Steiner, W.: Simultaneous production of high activities of thermostable endoglucanase and beta-glucosidase by the wild thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus. Appl Microbiol Biotechnol 53 (2000) 461-8 Duff, S. J. B.: Effect of media composition and growth conditions on production of cellulase and βglucosidase by mixed fungal fermentation. Enzym Microb. Technol 9 (1986) 47-52 Friedrich, J., Cimerman, A., Perdih, A.: Mixed culture of Aspergillus awamori and Trichoderma reesei for bioconversion of apple distillery waste. Appl. Microbiol Biotechnol 26 (1987) 299-303 Gutierrez-Correa, M., Portal, L., Moreno, P., Tengerdy, R. P.: Mixed culture solid substrate fermentation of Trichoderma reesei and Aspergillus niger on sugar cane bagasse. Biores. Technol. 68 (1999) 173-178 Garcia-Kirchner, O., Munoz-Aguilar, M., Perez-Villalva, R., Huitron-Vargas, C.: Mixed submerged fermentation with two filamentous fungi for cellulolytic and xylanolytic enzyme production. Appl Biochem Biotechnol 98-100 (2002) 1105-14 Kalogeris, E., Iniotaki, F., Topakas, E., Christakopoulos, P., Kekos, D., Macris, B. J.: Performance of an intermittent agitation rotating drum type bioreactor for solid -state fermentation of wheat straw. Bioresour Technol 86 (2003) 207-13 Panagiotou, G., Kekos, D., Macris, B. J., Christakopoulos, P.: Production of cellulytic and xylanolytic enzymes by Fusarium osysporum grow on corn stover in solid state fermentation. Indust Crops Prod 18 (2003) 37-45 Iwashita, K.: Recent studies of protein secretion by filamentous fungi. Review. J Biosci Bioeng 94 (2002) 530-535 Grajek, W.: Comperative studies on the production of cellulases by termophilic fungi in submerged and solid-state fermentation. Appl Biochem Biotechnol 26 (1987) 126-129 Réczey, K., Brumbauer, A., Bollok, M., Szengyel, Z. S., Zacchi, G.: Use of hemicellulose hydrolysate for beta-glucosidase fermentation. Appl Biochem Biotechnol 70-72 (1998) 225-35 Srivastava, S. K., Gopalkrishnan, K. S., ramachandran, K. B.: The Production of β-glucosidase in shake-flasks by Aspergillus wentii. J Ferment Technol 65 (1987) 95-99 Kim, S. W., Kang, S. W., Lee, J. S.: Cellulase and xilanase production by Aspergillus niger KKS in various bioreactors. Biores. Technol. 59 (1997) 63-67 Shaker, H. S., Farid, M. A., El -Diwany, A. I.: Optimalization of the composition of the nutrient medium for cellulase and protein biosynthasis by thermophilic Aspergillus fumigatus NRC 272. Enzym Microb. Technol 6 (1984) 212-216 Cox, P. W., Paul, G. C., Thomas, C. R.: Image analysis of the morphology of filamentous microorganisms. Microbiology 144 ( Pt 4) (1998) 817-27

50

74.

75. 76. 77. 78. 79.

80. 81. 82. 83. 84.

85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93.

94.

95.

96.

97. 98. 99.

8. Fejezet Kerns, G., Okunev, O. N., Ananin, V. M., Golovlev, E. L.: Enhanced formation of β-glucosidase by Aspergillus niger VKMF-2092 in fed-batch operation with frequently intermittent glucose addition. Acta Biotechnol 7 (1987) 535-545 Wase, D. A. J., Raymahasay, S., Wang, C. W.: Production of β-D-glucosidase, endo-1,4-β-D-glucanase and D-xilanase from sters by Aspergillus fumigatus IMI 255091. Enzym Microb. Technol 7 (1985) Pulshalkar, S., Rao, K. K., Menon, K.: Production of β-glucosiase by Aspergillus terreus. Curr Microbiol 30 (1995) 255-258 Kerns, G., Dalchow, E., Klappach, G., Meyer, D.: Formation and release of β-glucosidase by Aspergillus niger ZIMET 43746 in correlation to process operations. Acta Biotechnol 6 (1986) 355-359 Réczey, K., Persson, I., Tjerneld, F., Hang-Hägerdal, B.: In situ immobilized β-glucosidase from Aspergillus phoenicis QM 329. Biotechnol Techniq 3 (1989) 205-210 Réczey, K., Stalbrand, H., Persson, I., Hang -Hägerdal, B., Tjerneld, F.: Continous cellobiose hydrolysis using self-immobilized β-glucosidase from Aspergillus phoencis QM 329 in fluidized-bed reactor. Appl Biochem Biotechnol 24 (1990) 637-649 Szabó, I.: Szakdolgozat (1989) Linden, J. C.: Immobilized α-D-galactosidase in the sugar beet indrusrty. Enzym Microb. Technol 4 (1982) 130-136 Busto, M. D., Ortega, N., Perez-Mateos, M.: Effect of immobilization on the stability of bacterial and fungal β-D-glucosidase. Process Biochem 32 (1997) 441-449 Ortega, N., Busto, M. D., Perez-Mateos, M.: Optimalisation of β-glucosidase entrapment in Alginate and polyacrylamide gels. Biores. Technol. 64 (1998) 105-111 Isgrove, F. H., Williams, P. J. H., Niven, G. W., Andrews, A. T.: Enzyme immobilization on nylon− optimalization and the steps used to prevent enzyme leakage the support. Enzym Microb. Technol 28 (2001) 225-232 Segel, G. B., Feig, S. A., Glader, B. E., Muller, A., Dutcher, P., Nathan, D. G.: Energy metabolism in human erythrocytes: the role of phosphoglycerate kinase in cation transport. Blood 46 (1975) 271-8 Xu KY, Z. J., Becker LC.: Functional coupling between glycolysis and sarcoplasmic reticulum Ca 2+ transport. Circ Res 77 (1995) 88-97 Miwa, S., Fujii, H.: Molecular basis of erythroenzymopathies associated with heredity hemolytic anemia: tabulation of mutant enzymes. Am. J. Hematol. 51 (1996) 122-132 Martinov, M. V., Plotnikov, A. G., Vitvitsky, V. M., Ataullakhanov, F. I.: Deficiencies of glycolytic enzymes as a possible cause of hemolytic anemia. Biochim Biophys Acta 1474 (2000) 75-87. Vishwanatha, J. K., Jindal, H. K., Davis, R. G.: The role of primer recognition proteins in DNA replication: association with nuclear matrix in HeLa cells. J Cell Sci 101 (1992) 25-34 Popanda, O., Fox, G., Thielmann, H. W.: Modulation of DNA polymerases alpha, delta and epsilon by lactate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase. Biochim Biophys Acta 1397 (1998) 102-17 Lay, A. J., Jiang, X. M., O., K., Flyn, E., Underwood, A., Condron, R., Hogg, P. J.: Phosphoglycerate kinase acts in tumor angiogenesis as a disulphide reductase. Nature 408 (2000) 869-873 Lay, A. J., Jiang, X. M., Daly, E., Sun, L., Hogg, P. J.: Plasmin reduction by phosphoglycerate kinase is a thiol-independent process. J Biol Chem 277 (2002) 9062-8 Cao, R., Wu, H. L., Veitonmaki, N., Linden, P., Farnebo, J., Shi, G. Y., Cao, Y.: Suppression of angiogenesis and tumor growth by the inhibitor K1-5 generated by plasmin -mediated proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 5728-33 Stathakis, P., Fitzgerald, M., Matthias, L. J., Chesterman, C. N., Hogg, P. J.: Generation of angiostatin by reduction and proteolysis of plasmin. Catalysis by a plasmin reductase secreted by cultured cells. J Biol Chem 272 (1997) 20641-20645 Krishnan, P., Fu, Q., Lam, W., Liou, J. Y., Dutschman, G., Cheng, Y. C.: Phosphorylation of pyrimidine deoxynucleoside analog diphosphates: selective phosphorylation of L-nucleoside analog diphosphates by 3-phosphoglycerate kinase. J Biol Chem 277 (2002) 5453-9 Banks, R. D., Blake, C. C. F., Evans, P. R., Haser, R., Rice, D. W., Hardy, G. W., Merrett, M., Phillips, A. W.: Sequence, structure and activity of phosphoglycerate kinase: a possible hinge-bending enzyme. Nature 279 (1979) 773-777 Mori, N., Singer-Sam, J., Riggs, A. D.: Evolutionary conservation of the substrate binding cleft of 3phosphog lycerate kinases. FEBS Lett. 204 (1986) 313-317 Watson, H. C., Littlechild, J. A.: Isoenzymes of phosphoglycerate kinase: evolutionary conservation of the structure of this glycolytic enzyme. Biochem Soc Trans 18 (1990) 187-90 Fleming, T., Littlechild, J.: Sequence and structural comparison of thermophilic phosphoglycerate kinases with a mesophilic quivalent. Comp Biochem. Physiol A Physiol 118 (1997) 439-451

Irodalmi hivatkozások

100.

101. 102.

103.

104. 105.

106. 107. 108. 109.

110.

111. 112. 113. 114. 115.

116.

117.

118.

119.

120. 121. 122. 123.

51

May, A., Vas, M., Harlos, K., Blake, C. C. F.: 2.0 A resolution structure of a ternary complex of pig muscle phosphoglycerate kinase containing 3-phospho-D-glycerate and the nucleotide Mn adenylylimidodiphosphate. Proteins 24 (1996) 292-303 Beissner, R. S., Rudolph, F. B.: Effect of anthraquinone dyes and evaluation of the kinetic mechanism of yeast phosphoglycerate kinase. J. Biol. Chem. 254 (1979) 6273-6277 Davies, G. J., Gamblin, S. J., Littlechild, J. A., Dauter, Z., Wilson, K. S., Watson, H. C.: Structure of the ADP complex of the 3-phosphoglycerate kinase from Bacillus stearothermophilus at 1.65 A. Acta Crystallogr. D50 (1994) 202-209 Szilágyi, A. N., Ghosh, M., Garman, E., Vas, M.: A 1.8 A resolution structure of pig muscle 3phosphoglycerate kinase with bound MgADP and 3-phosphoglycerate in open conformation: new insight into the role of the nucleotide in domain closure. J Mol Biol 306 (2001) 499-511. Bernstein, B. E., Michels, P. A. M., Hol, W. G. J.: Synergistic effects of substrate-induced conformational changes in phosphoglycerate kinase activation. Nature 385 (1997) 275-278 Auerbach, G., Huber, R., Grättinger, M., Zaiss, K., Schurig, H., Jaenicke, R., Jacob, U.: Closed structure of phosphoglycerate kinase from Thermotoga maritima reveals the catalytic mechanism and determinants of thermal stability. Structure 5 (1997) 1475-1483 Harlos, K., Vas, M., Blake, C. C. F.: Crystal structure of the binary complex of pig muscle phosphoglycerate kinase and its substrate 3-phospho-D-glycerate. Proteins 12 (1992) 133-144 Webb, M. R., Trentham, D. R.: Analysis of chiral inorganic (160, 170, 180) thiophosphate and the stereochemistry of the 3-phosphoglycerate kinase reaction. J. Biol. Chem. 255 (1980) 1775-1779 Pickover, C. A., McKay, D. B., Engelman, D. M., Steitz, T. A.: Substrate binding closes the cleft between the domains of yeast phosphoglycerate kinase. J. Biol. Chem. 254 (1979) 11323-11329 Sinev, M. A., Razgulyaev, O. I., Vas, M., Timchenko, A. A., Ptitsyn, O. B.: Correlation between enzyme activity and hinge-bending domain displacement in 3-phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 180 (1989) 61-66 Tompa, P., Hong, P. T., Vas, M.: The phosphate group of 3-phosphoglycerate accounts for conformational changes occurring on binding to 3-phosphoglycerate kinase. Enzyme inhibition and thiol reactivity studies. Eur. J. Biochem. 154 (1986) 643-649 Fairbrother, W. J., Bowen, D., Hall, L., Williams, R. J.: One- and two -dimensional NMR studies of yeast phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 184 (1989) 617-625 Yount, R. G., D. Babcock, Ballantyne, W., Ojala, D.: Adenylyl Imidodiphosphate, an Adenosine Triphosphate Analog Conatining a P-N-P Linkage. Biochemistry 10 (1971) 2484-2489 Hol, W. G., van Duijnen, P. T., Berendsen, H. J.: The alpha-helix dipole and the properties of proteins. Nature 273 (1978) 443-6. Hol, W. G.: The role of the alpha-helix dipole in protein function and structure. Prog Biophys Mol Biol 45 (1985) 149-95 Fairbrother, W. J., Minard, P., Hall, L., Betton, J. M., Missiakas, D., Yon, J. M., Williams, R. J.: Nuclear magnetic resonance studies of isolated structural domains of yeast phosphoglycerate kinase. Protein Eng. 3 (1989) 5-11 Lester, L. M., Rusch, A. A., Robinson, G. J., Speckhadr, D. C.: Mapping the active sites of 3phoshoglycerate kinase and glicerol kinase with monoammine chromium(III) ATP. Biochemistry 37 (1998) 5349-5355 Ray, B. D., Rao, B. D.: 31P NMR studies of enzyme -bound substrate complexes of yeast 3phosphoglycerate kinase. 2. Structure measurements using paramagnetic relaxation effects of Mn(II) and Co(II). Biochemistry 27 (1988) 5579-85 Shibata, C. G., Gregory, J. D., Gerhardt, B. S., Serpersu, E. H.: Kinetic, binding, and NMR studies of perdeuterated yeast phosphoglycerate kinase and its interactions with substrates. Arch. Biochem. Biophys. 319 (1995) 204-210 Raghunathan, V., Chau, M. H., Ray, B. D., Rao, B. D.: Structural characterization of manganese(II)nucleotide complexes bound to yeast 3-phosphoglycerate kinase: 13C relaxation measurements using [U13C]ATP and [U-13C]ADP. Biochemistry 38 (1999) 15597-605. Mozzarelli, A., Rossi, G. L.: Protein function in the crystal. Annu Rev Biophys Biomol Struct 25 (1996) 343-65 Kovári, Z.: közlés alatt (2003) Larsson-Raznikiewicz, M.: The phosphoglycerate kinase reaction and its metal ion specificity. Eur J Biochem 17 (1970) 183-92. Pappu, K. M., Kunnumal, B., Serpersu, E. H.: A new metal-binding site for yeast phosphoglycerate kinase as determined by the use of a metal-ATP analog. Biophys J 72 (1997) 928-935

52

124.

125. 126. 127. 128. 129. 130. 131.

132. 133. 134. 135.

136. 137. 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146.

147.

8. Fejezet

Larsson-Raznikiewicz, M.: Kinetic studies on the reaction catalyzed by phosphoglycerate kinase. II. The kinetic relationships between 3-phosphoglycerate, MgATP2- and activating metal ion. Biochim. Biophys. Acta 132 (1967) 33-40 Larsson-Raznikiewicz, M., Arvidsson, L.: Inhibition of phosphoglycerate kinase by products and product homologues. Eur. J. Biochem. 22 (1971) 506-512 Lee, C. S., O'Sullivan, W. J.: Properties and mechanism of human erythrocyte phosphoglycerate kinase. J. Biol. Chem. 250 (1975) 1275-1281 Scopes, R. K.: The steady-state kinetics of yeast phosphoglycerate kinase. Anomalous kinetic plots and the effects of salts on activity. Eur. J. Biochem. 85 (1978) 503-516 Vas, M., Batke, J.: Adenine nucleotides affect the binding of 3-phosphoglycerate to pig muscle 3phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 139 (1984) 115-123 Ali, M., Brownstone, Y. S.: A study of phosphoglycerate kinase in human erythrocytes. II. Kinetic properties. Biochim. Biophys. Acta 445 (1976) 89-103 Larsson-Raznikiewicz, M.: Graphical analyses on binding of ligands to a two -sited system. Theoretical treatments exemplified on yeast phosphoglycerate kinase. Arch. Biochem. Biophys. 158 (1973) 754-762 Roustan, C., Brevet, A., Pradel, L. A., Thoai, N. v.: Yeast 3-phosphoglycerate kinase. Interaction of enzyme with substrates studied by partial isotopic exchange and difference spectrophotometry. Eur. J. Biochem. 37 (1973) 248-255 Wiksell, E., Larsson-Raznikiewicz, M.: Affinity labeling of phosphoglycerate kinase by 5'-[p(fluorosulfonyl)benzoyl]-1,N6-ethenoadenosine. J. Biol. Chem. 262 (1987) 14472-14478 Fairbrother, W. J., Graham, H. C., Williams, R. J. P.: The roles of ATP 4- and Mg2+ in control steps of phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 190 (1990) 407-414 Graham, H. C., Williams, R. J. P.: The roles of ADP2- and Mg 2+ in control steps of phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 197 (1991) 81-91 Vas, M., Merli, A., Rossi, G. L.: Antagonistic binding of substrates to 3-phosphoglycerate kinase monitored by the fluorescent analogue 2'(3')-O-(2,4,6-trinitrophenyl)adenosine 5'-triphosphate. Biochem. J. 301 (1994) 885-891 Wiksell, E., Larsson-Raznikiewicz, M.: Substrate binding to phosphoglycerate kinase monitored by 1anilino-8-naphthalenesulfonate. J. Biol. Chem. 257 (1982) 12672-12677 Molnár, M., Vas, M.: Mg2+ affects the binding of ADP but not ATP to 3-phosphoglycerate kinase. Correlation between equilibrium dialysis binding and enzyme kinetic data. Biochem. J. 293 (1993) 595-599 Szilágyi, A. N., Vas, M.: Anion activation of 3-phosphoglycerate kinase requires domain closure. Biochemistry 37 (1998) 8551-8563 Varga, A., Flachner, B., Kovári, Z., Náray-Szabó, G., Vas, M.: Physiological anions regulate the activity and stabilizes the structure of 3-phosphoglycerate kinase. (Elokészületben.) Vogel, H. J.: Distribution of lysine pathway among fungi:Evalutionary implications. Am. Naturalist 98 (1964) 435Mandels, M., Weber, J.: Production of cellulase. Adv. Chem. Ser. 95 (1969) 391-414 Cserpán, I., Vas, M.: Effects of substrates on the heat stability and on the reactivities of thiol groups of 3phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 131 (1983) 157-162 Dékány, K., Vas, M.: Inactivation of pig muscle 3-phosphoglycerate kinase by thiol modification depends on reagent size. Eur. J. Chem. 139 (1984) 125-130 Box, G. E. P., Hunter, W. G., Hunter, J. S.:Statistics for experimenters. (1978) John Wiley and Sons, New York Montgomery, D. C.:Design and analysis of experiments. 3rd ed.,. (1991) John Wiley and Sons, New York Dekker, R. F. H.: Kinetic, inhibition amd stability properties of a commercial β-glucosidase (cellobiase) presentation from Aspergillus niger and its suitability in the hydrolysis of lignocellulose. Biotechnol Bioeng 28 (1986) 1438-1442 Bernstein, B. E., Hol, W. G.: Crystal structures of substrates and products bound to the phosphoglycerate kinase active site reveal the catalytic mechanism. Biochemistry 37 (1998) 4429-4436