FEJ-NYAKI RÁKOK MIKROKÖRNYEZETÉNEK HATÁSA A PROGRESSZIÓRA

FEJ-NYAKI RÁKOK MIKROKÖRNYEZETÉNEK HATÁSA A PROGRESSZIÓRA PhD disszertáció Dr. LUKITS JÚLIA

Témavezető: Dr. Tímár József Programvezető: Dr. Kopper László Patológiai Orvostudományok Doktori Iskola, Onkológiai Program Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 2006 Szigorlati bizottság: Dr. Kádár Anna professzor emeritus, az orvostudományok doktora Dr. Mayer Árpád egyetemi magántanár, az orvostudományok kandidátusa Dr. Zalatnai Attila egyetemi docens, az orvostudományok kandidátusa Hivatalos bírálók: Dr. Kulka Janina egyetemi docens, PhD Dr. Orosz Zsolt osztályvezető főorvos, PhD

Tartalomjegyzék Összefoglaló ..............................................................................................................3 Bevezetés ...................................................................................................................5 Irodalmi áttekintés .....................................................................................................6 1) Lokális növekedés, recidíva ..................................................................................6 2) Hipoxia szerepe a progresszióban .........................................................................7 3) Neoangiogenezis ...................................................................................................9 4) Limfangiogenezis, limfogén disszemináció..........................................................10 5) Szexhormonok szerepe a daganatok progressziójában .........................................13 6) Az immunrendszer szerepe ...................................................................................16 Célkitűzések ..............................................................................................................19 Anyag és módszer......................................................................................................20 Beteganyag ................................................................................................................20 I.) Angiogenezis ........................................................................................................20 A) Tumorméret és vaszkularizáció............................................................................20 B) Sugárkezelés hatására létrejött érdenzitás-változás..............................................21 II) Hormonreceptor-expresszió fej-nyaki daganatokban...........................................23 1) Ösztrogén- és progeszteronreceptorok mRNS-expressziójának kimutatása.........23 2) ERα kimutatása immunhisztokémiai módszerrel..................................................24 3) ERβ kimutatása immunhisztokémiai módszerrel..................................................25 4) PGR kimutatása immunhisztokémiai módszerrel .................................................25 III) Neoadjuváns leukocita-interleukin (LI) hatása fej-nyaki daganatokra ..……….26 Eredmények ...............................................................................................................33 I) 1. Gége- és hypopharyngealis daganatok erezettségének vizsgálata .....................33 2. Sugárkezelés hatására létrejött érdenzitás-változások jelentőségének vizsgálata ..........................................................................................................35 II) Hormonreceptorok expressziója fej-nyaki daganatokban ....................................41 III) Neoadjuváns leukocita-interleukin kezelés hatása szájüregi daganatok mikrokörnyezetére ..............................................................................................48 Megbeszélés ..............................................................................................................59

2

1) Gége- és hypopharyngealis rákok erezettsége ......................................................59 2) Az érdenzitás prediktív/prognosztikus szerepe a sugárterápiás érzékenység szempontjából....................................................................................................61 3) Hormonreceptorok expressziója fej-nyaki daganatokban .....................................63 4) Leukocita-interleukin kezelés hatása szájüregi daganatok mikrokörnyezetére ... 68 Következtetések.........................................................................................................73 A témakörben megjelent közlemények jegyzéke………………………………… 74 Disszertációval kapcsolatos előadások……………………………………………...75 Irodalomjegyzék ........................................................................................................77 Rövidítések jegyzéke………………………………………………………………. 99 Köszönetnyilvánítás ..................................................................................................101

ÖSSZEFOGLALÓ Manapság egyre nagyobb figyelem fordul a fej-nyaki daganatok felé, mert Magyarországon mind előfordulásuk, mind az e daganatok miatti halálozás az elmúlt 20 év során dinamikusan nőtt. Munkánk során a különböző anatómiai lokalizációjú fejnyaki daganatok mikrokörnyezetét vizsgáltuk, mert ennek a komplex rendszernek meghatározó szerepe van daganatok progressziójában, és mert ez megjelent az új daganatellenes terápiák célpontjaként is. Klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy a hypopharynxrákos betegek túlélése kedvezőtlenebb, mint a más lokalizációjú fej-nyaki daganatban szenvedőké. Megvizsgáltuk, hogy a tumor mérete és erezettsége mutat-e összefüggést a biológiai viselkedésbeli eltéréssel. Eredményeink azt mutatták, hogy a T2 stádiumú laryngealis daganatok volumene szignifikánsan nagyobb, mint a T4 stádiumú

hypopharyngealis

tumoroké,

ugyanakkor

erezettségüket

és

VEGF-

expressziójukat illetően nem találtunk különbséget a kétféle lokalizációjú laphámrák esetében, mely arra utal, hogy a hypopharyngealis rákok fokozottabb agresszivitásáért nem a tumor növekedése vagy beereződése felelős, hanem a tumorsejtek erősebb invazív hajlama, amely feltevésünket genomikai vizsgálatok is alátámasztják. Prospektív tanulmány keretében vizsgáltuk az összefüggést a daganat mikrovaszkuláris

3

denzitása és a kezelés sikere között, sugárkezeléssel ellátott helyileg előrehaladott szájgaratrákban szenvedő betegek esetében. Kimutattuk, hogy a sugárkezelés hatására a daganatokban létrejött érdenzitás-csökkenés a kezelésre adott válasz és a túlélés érzékeny prediktora. Az endokrin környezet esetleges szerepét is vizsgáltuk a progresszióban, ezért meghatároztuk a fej-nyaki daganatok szexhormonreceptor-státusát immunhisztokémiai módszerekkel, melyeket mRNS-szintű expresszió analízisével validáltunk.

Kimutattuk,

progeszteronreceptor

hogy

kifejeződik

az

esetek fej-nyaki

közel

felében

daganatokban.

az

ösztrogénA

és

funkcionális

hormonreceptor-expresszió – ösztrogén- és progeszteronreceptor együttes megjelenése – szintén gyakori jelenség volt fej-nyaki daganatokban (40,3%), míg a szoliter hormonreceptor-expresszió ritka volt. A szexhormonreceptorok expressziója nem volt összefüggésbe hozható a betegek túlélésével, viszont a laryngo-hypophyryngealis daganatok csoportjában az ER-expresszió rövidebb túléléssel párosult (p=0,0636 Mantel-Cox analízissel). Multicentrikus, fázis I/II vizsgálat keretében tanulmányoztuk egy természetes leukocita-interleukin (LI) helyi adagolását követő tumor- és stromalis reakciókat T2-3 stádiumú szájüregi daganatokban. A LI-t négy különböző dózisban adagoltuk. A tumorstroma/daganat sejtfészek aránya jelentősen lecsökkent az immunstimuláns kezelések hatására (fibrózisindukció), aminek hátterében intenzív nekrózisindukció állt. A sejtciklusban lévő sejtek meghatározásával kimutattuk, hogy a LI kezelés hatására dózisfüggően csökken a proliferáló stromális sejtek aránya, míg alacsonyabb dózisok esetében átmeneti fokozódás volt tapasztalható a daganatsejtek vonatkozásában. A LI kezelés jelentősen megnövelte az intraepithelialis neutrofilek denzitását és a klinikailag jól reagáló csoportban a stromálisat is. A CD68+ makrofágok denzitása nem változott a LI kezelést követően a tumorstromában, viszont intraepithelialisan jelentős csökkenést tapasztaltunk. Végül ezekben a tanulmányokban CD34+ ún. immunszuppresszív mononukleáris sejteket nem találtunk a vizsgált daganatokban. Vizsgálataink megerősítik azt a nézetet, hogy a daganatos stromának, annak valamennyi komponensének jelentős szerepe van a fej-nyaki daganatok progressziójában és ezek terápiás befolyásolása kihathat a daganatok progressziójára.

4

BEVEZETÉS A fej-nyaki régió laphámrákjai a progresszió szempontjából egyedülálló viselkedést mutatnak. A humán daganatok többsége a betegség szervi-áttét szakasza után halálhoz vezetnek. A fej-nyaki laphámrákokra a lokoregionális áttétek képzése jellemző, ez a szakasz általában hosszú ideig tart, a szervi áttétek a betegség késői szakaszában jelennek meg. Azt gondolhatnánk, hogy a lokoregionális invázióhoz és a limfatikus terjedéshez egy kevésbé bonyolult molekuláris mechanizmus szükségeltetik, de az igazság az, hogy nem rendelkezünk elegendő információval ennek a daganattípusnak a specifikus molekuláris mechanizmusáról (200). A tumorprogresszió klasszikus lépései a lokális invázió, disszemináció, majd limfogén és hematogén áttétképzés. A metasztáziskaszkád általában a disszemináció hematogén formáját foglalja magában, mely eredményeképpen távoli szervi áttétek keletkeznek, ez a daganatok miatti halálozás leggyakoribb oka. A klinikai lefolyás fej-nyaki laphámrákok esetében azt mutatja, hogy ezek a daganatok nem az általános trendet követik, tehát a metasztázis-kaszkád eltérő, e tumorok biológiai viselkedésének megfelelően. A limfatikus disszemináció és a lokális recidíva, valamint a neoangiogenezis, mely a limfatikus és vérerek képződését teszi lehetővé, a fej-nyaki daganatok progressziójának legfőbb jellemzői. Fej-nyaki daganatok esetében az az általános nézet, amelyet egyébként klinikopatológiai adatok is alátámasztanak, hogy a tumor anatómiai lokalizációjának – szájüreg, nyelv, gége vagy garat – szignifikáns hatása van e daganatok génexpressziós profiljára, és az ennek megfelelő biológiai viselkedésére. A különböző anatómiai lokalizációkban a stroma mátrixkomponensei változhatnak (például az elasztikus vagy a porcszövetben), az erezettség és a nyirokellátás is különböző. Az anatómiai lokalizációnak megfelelő génexpressziós profil fej-nyaki daganatok esetén meghatározhatja nemcsak a tumor biológiai viselkedését, hanem a daganat terápiás érzékenységét is.

5

IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1. Lokális növekedés, recidíva A legtöbb szolid tumor esetében a daganat mérete jelenti az egyik legfontosabb prognosztikai tényezőt, melyet a sejtproliferáció és az – apoptózis vagy nekrózis által indukált – sejthalál közötti egyensúly mértéke határoz meg. Azoknak a szabályozó mechanizmusoknak, melyek ezt a kényes egyensúlyi állapotot befolyásolják, klinikai és biológiai jelentőségük van. Ennek különös jelentősége van a fej-nyaki laphámrákok esetében, mivel ennek a daganattípusnak a progressziója leggyakrabban a lokális terjedés és recidíva útján valósul meg. Bizonyos lokalizációban, mint például a nyelv vagy glotticus régió, egy olyan alapvető dolog, mint a tumor vastagsága rendkívül hasznos prognosztikai faktornak bizonyult. Ezekben a daganatokban a 3 mm-es tumorvastagság egy olyan érték, mely alatt a regionális nyirokcsomóáttétek megjelenése rendkívül ritka, és az 5 éves túlélési ráta a legjobb – kissé hasonlóan a bőr malignus melanómájához (135, 227). Arra a kérdésre, hogy miért ez a tumorvastagság a meghatározó tényező ebben a daganattípusban, a válasz valószínűleg a szöveti hipoxiában és vaszkularizációban rejlik. A nagyméretű fej-nyaki daganatokban a p53 gén fokozott expresszióját találták (129). A fej-nyaki laphámrákok műtéti eltávolítása után megjelenő recidívákat még fokozottabb p53-expresszió (58), cyclin D1overexpresszió és magas Ki-67-ráta jellemzi (186, 155). A limfatikus disszemináció ezekben a daganatokban a PCNA/Ki-67 magasabb frekvenciájához társult (106, 130), az Skp2

protein

overexpressziójához,

valamint

a

p27/kip1

sejtciklus-inhibitor

alulműködéséhez (35). Egy hazai kutatócsoport molekuláris vizsgálataiból, melyet 152 fej-nyaki laphámrákos beteg műtéti anyagából végeztek, kiderült, hogy a cyclin D1 overexpressziója mellett szignifikánsan magasabb E2F1-expresszió figyelhető meg azokban az esetekben, ahol a későbbiek során recidíva alakul ki. Ez ennek a transzkripciós faktornak a kettős szerepéből adódhat, melyet a sejtciklus és az apoptózis szabályozásában végez. Az E2F1 szabályozza a G1 fázis cyclinek expresszióját – ide tartozik a cyclin D1 is –, melynek eredményeképpen fokozódik expressziójuk. Másrészt, az E2F1 szerepet játszik a tumorsejtek apoptózisában az ARF/CDKN2A indukálásával, mely megköti az MDM2-t, így a p53 gén stabilizálódik. A fej-nyaki daganatokban az E2F1 funkciójának megállapításához további vizsgálatok szükségesek. Ugyanebből a

6

tanulmányból az is kiderült, hogy a nagyon agresszív tumorokban a p16 gén expressziója jelentősen csökkent, ezt a megállapítást régebbi közlemények is alátámasztják (201). Nyelvdaganatok esetén figyelemre méltó az a megállapítás, hogy a nyirokcsomó-pozitív esetekben az apoptózisindex megnövekedett (130), melyet magasabb proliferációs index kísér, amely tény szintén arra utal, hogy fej-nyaki daganatok esetén a proliferáció és sejthalál közötti pozitív mérleg kritikus tényező. A túlélési

ráta,

a

fej-nyaki

daganatok

progressziójában

résztvevő

molekuláris

mechanizmusok legérzékenyebb indikátora. A p53 overexpressziója számos tanulmány eredménye szerint a rossz prognózis markere (208), a DNS-kötő régiók változása pedig, nagyobb jelentőséggel bír, mint egyéb strukturális változások (58). A cyclin D1 overexpressziója gyakori jelenség a fej-nyaki laphámrákokban, mely egyébként a STAT3 konstitutív expressziójától függ. A STAT3 expressziója önállóan, vagy a CDK4 kináz overexpressziójával együttesen a rossz prognózis markere (34). Újabb közleményekben azt találták, hogy az Rb2/p130 gén elvesztése, mely körülbelül a szájüregi daganatok felében előfordul, szintén a túlélési ráta csökkenésével társul (198). A p53-negatív fej-nyaki laphámrákokban a proapoptotikus Bcl-2 protein elvesztése és/vagy az antiapoptotikus Bax fehérje fokozott expressziója szintén az alacsony túlélési ráta markere (61). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a p53-dependens és independens

apoptotikus

tumorokban),

valamint

mechanizmusok a

STAT3-cyclin

(Bcl-2/Bax D1

által

rendszer

a

p53-negatív

szabályozott

proliferációs

mechanizmusok a fej-nyaki laphámrákok progressziójának jelentős molekuláris szereplői. A fej-nyaki daganatok különleges altípusai viszont más növekedésszabályozó mechanizmusokat is használhatnak. 2. A hipoxia szerepe a progresszióban Malignus tumorokban a neoangiogenezis indukciójában fontos szerepet játszanak a hipoxia-mediált mechanizmusok, melyekben kulcsszerepe van a HIF-1 faktornak és két alegységének: HIF-1α (hipoxia-indukálható alegység) valamint a HIF-1β/ARNT vagy aril-hidrokarbon nukleáris transzlokátor (konstitutívan termelődő alegység). Ha az oxigén jelen van a tumorban, a HIF-1α megköti a VHL fehérjét (von Hippel-Lindau fehérje), így a komplex ubiquitinálódik majd proteoszómák által degradálódik. Ha oxigén nincs jelen, akkor a HIF-1 kötődni tud a gének promoter régióiban elhelyezkedő

7

hipoxia-reszponzív

elemekhez

(HREs),

így

számos

célgént

aktiválhat,

pl.

proangiogenikus géneket, mint a VEGF, bFGF, vagy mitogéneket, pro-apoptotikus géneket, koagulációs faktorokat, glikolízis- és pH-szabályozó géneket, migrációban résztvevő géneket. A daganatsejtek nagy része képes „átvészelni” a hipoxia által indukált stresszt, és egy speciális fenotípust kialakítani, melyek általában rezisztensek a sugár és kemoterápiával szemben (55, 96). Ezek a tumorsejt-populációk a metasztázisok létrejöttében is fontos szerepet játszanak. Általános tapasztalat az, hogy a különböző humán malignus daganatokban a HIF-1α emelkedett expressziója rossz prognózissal társul (70). A hipoxia szabályozása kétélű fegyverként működik daganatok esetén. Bizonyos típusú agresszív tumorok nagymennyiségű oxigént fogyasztanak, mely hipoxiát hoz létre a daganaton belül, de az itt működő HIF-1 mechanizmus eltérő a szokásostól, tehát ha javítanánk az oxigénszinten, az csak tovább stimulálná a daganat progresszióját. Más típusú daganatokban a hipoxia jelenléte miatt sokkal agresszívebb daganatsejt-szubpopulációk jönnek létre a HIF-1 mechanizmus közreműködésével, tehát ezekben az esetekben az oxigénadagolás lassíthatja az agresszív daganatsejtek kialakulását. Fej-nyaki laphámrákok esetében terápiás szempontból fontos tényező a hipoxia, mivel a hipoxiás daganatok sokkal kevésbé érzékenyek a sugárterápiára (70). A daganatokban lévő erek körüli 250 µm átmérőnyi területen megtalálhatóak voltak proliferáló, valamint hipoxiás sejtek egyaránt (103). Fej-nyaki laphámrákok esetén az erek körül már 50 µm távolságban is találtak hipoxiás sejteket (219), mely akut hipoxiára utal, míg a nekrózis általában körülbelül 200 µm távolságban szokott kialakulni. Ezek a szerzők nem találtak összefüggést a hipoxia és a mikrovaszkuláris érdenzitás, valamint a T és N stádium között, viszont újabb közlemények adatai szerint a hipoxia egy erős, önálló prognosztikai faktor fej-nyaki laphámrákok esetében (38). Érdekes

módon

a

HIF-1α

nukleáris

expressziója

fej-nyaki

laphámrákokban

szignifikánsan hosszabb túléléssel társult (5). Hipoxiás fej-nyaki daganatsejtekben a HIF-1α valamint a VEGF expressziója stressz által aktivált kinázok (JNKI) valamint p38 által indukált (194). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a fej-nyaki daganatokban a hipoxia mechanizmusok megőrzöttek és funkcionálisak, emiatt a fej-nyaki daganatok azon tumorok kategóriájába tartoznak, ahol a hipoxa korrekciója meggátolhatja a progressziós folyamatokat. A hipoxiát szabályozó mechanizmus tehát fej-nyaki daganatok esetében meghatározó molekuláris tényező a progresszió szempontjából.

8

3. Neoangiogenezis Az angiogenezis és az érdenzitás fej-nyaki daganatok esetén nem szolgál progressziós markerként, és nem ad magyarázatot a fej-nyaki daganatok terjedésére, hiszen hematogén áttétképzés vagy nincs jelen, vagy csak a betegség nagyon késői fázisában lép fel. Ugyanakkor jelentősen befolyásolja a recidívát, illetve a terápiás érzékenységet, mégpedig abból az okból, hogy a tumorszövet térfogatának növekedése igen gyakran hipoxiához vezet. Az ilyen daganatok esetében tulajdonképpen peritumorális daganatsejtfészkek körüli angiogenezisről és mikrovaszkuláris hálózatról beszélhetünk. Az irodalom nagyon ellentmondásos, azonban elsősorban a korai vizsgálatok nem tettek különbséget a nyirok- illetve a vérerek között, újabb vizsgálatok pedig, amelyek a vérerek denzitásának és a progressziónak esetleges kapcsolatait vizsgálták, nem találtak összefüggést ezek között. Ugyanakkor az is egyértelmű, hogy a hipoxiás fej-nyaki daganatokban

fokozott

VEGF-expresszió

található,

méghozzá

annak

mindkét

izoformájáé (A és C), mely a vér- illetve a nyirokér-proliferációért lenne felelős (136). A

daganatok

vaszkularizációjára

általában

az

jellemző,

hogy

több

módon

megvalósulhat, pl. neoangiogenezis, érkoopció, glomeruláris érképződés, vagy vaszkuláris mimikri útján (50). Fej-nyaki daganatok esetén a neoangiogenezis az egyetlen formája az érképződésnek, valamint ezeknek a daganatoknak jellemzője hasonlóan más epidermoid daganatokhoz –, hogy nincs „intratumorális” érképletük, tehát valamennyi ér, mely a daganatot táplálja, gyakorlatilag peritumorálisan, a sejtfészkek körül helyezkedik el. Figyelembe véve a daganatsejtfészkek méreteit, nyilvánvalóvá válik ennek a daganattípusnak másik jellemzője, mégpedig az, hogy a daganatfészkek centruma és a sejtfészkeket körülölelő vérerek közötti viszonylag nagy távolság a sejtfészek centrumában krónikus hipoxiát idéz elő. Korábbi közleményekben azt találták, hogy a fej-nyaki laphámrákok mikrovaszkuláris denzitása (MVD) és a limfatikus áttétképzés között összefüggés van, valamint azt is, hogy az MVD meghatározó tényező a prognózisban (9, 56, 104, 126, 185). Későbbi közlemények eredményei szerint nem sikerült a fenti összefüggéseket kimutatni (64, 107, 197). A vizsgálatok eredményei közötti ellentmondás okai között azt találtuk, hogy a korábban megjelent közleményekben az ereket olyan endotheliális markerrel jelölték, melyek vér- illetve nyirokereket is jelöltek, ilyen marker volt a CD31. A későbbi

9

közleményekben a szerzők a CD34 markert használták az erek jelölésére, mely specifikusan

csak

a

vérerek

endotheliumához

kötődött.

Tehát

azokban

a

közleményekben, ahol összefüggést találtak az MVD és a fej-nyaki laphámrákok limfogén áttétképzése között, a vizsgált erek gyakorlatilag vér- és nyirokerek keveréke volt. A legtöbb daganattípusban a mikroérhálózat nem csak tápanyag- és oxigénforrást jelent a tumornak, hanem a hematogén áttétképzés egyik kulcseleme. Fej-nyaki laphámrákok esetében viszont leginkább a daganatok tápanyag- és oxigénellátását biztosítja, és ritkán vesz részt a hematogén áttétképzésben, emiatt valószínű, hogy nincs prognosztikai jelentősége. Megállapíthatjuk tehát, hogy a fej-nyaki daganatokat tipikusan limfatikus disszemináció jellemzi, a legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy ezekben a daganatokban nemcsak ér- hanem nyirokér-proliferáció is kialakul (204). A nyirokerek proliferációját pedig a VEGF-C és -D izotípusa generálja, a nyirokérdenzitás és a fej-nyaki daganatok nyirokcsomóáttét-képző képessége között egyértelmű és lineáris összefüggést mutattak ki. Így tehát úgy tűnik, hogy a limfangiogenezis egy nagyon fontos prognosztikus tényezője a fej-nyaki daganatoknak. Az utóbbi időben számos közlemény foglalkozik a VEGF-expresszió klinikai és biológiai jelentőségével fej-nyaki daganatok esetén, ezen belül is leginkább az angiogenikus fenotípussal. Megállapították, hogy a C-erbB nagyon gyakran fokozottan expresszált fej-nyaki daganatokban (151), és a receptor agonista ligandjai képesek a VEGF-A és -C expresszióját is fokozni, míg a receptorellenes antitestek gátolják ezt a hatást (137). Más citokinek, mint például a TNF-α és IL-1 fokozott expressziója is kimutatható fej-nyaki daganatokban, és részt vesznek a VEGF-expresszió szabályozásában is (101). Érdekes módon függetlenül az érdenzitástól, a VEGF-expresszió fokozódása a rossz prognózis markere fej-nyaki daganatokban, azonban ennek a mechanizmusa még nem tisztázott (122, 187). 4. Limfangiogenezis, limfogén disszemináció A limfatikus disszemináció alapeleme a daganat körüli nyirokérhálózat. Korábbi közleményekben az a felfogás uralkodott, hogy a daganatokban nem létezik peritumorális vagy intratumorális nyirokérhálózat (144, 193). Újabb kutatási eredmények azt mutatják, hogy bizonyos daganattípusok, ide tartoznak a fej-nyaki daganatok is, képesek limfangiogenezis indukálására, megnövelve ezáltal a daganat

10

limfatikus disszeminációjának esélyét. Az ilyen típusú daganatok felismerésének kulcseleme a nyirokér endothelium, mely egyedi antigénprofillal rendelkezik. Korábban a CD31 markert használták a vérerek azonosítására, viszont kiderült, hogy ez a marker nem tesz különbséget a vérerek és nyirokerek endotheliuma között. Ma már köztudott, hogy a CD34 marker specifikusan a vérerek endotheliumához kötődik, míg a LYVE1, podoplanin és VEGFR 2/3 a nyirokerek endotheliumának markerei. A daganatok limfangiogén fenotípusát a VEGF-C és -D termelése jellemzi, ezek a nyirokér endotheliumának specifikus növekedési faktorai. A nyirokér neoformációja kevésbé bonyolult összevetve a vérérképződéssel, mivel itt nem vesznek részt más típusú sejtek. A VEGF-C/D aktiválja a nyirokendothel-sejteken lévő VEGFR 2/3-t, aktiválva ezek tirozinkináz jelátvivő kaszkádját, aktiválódik a Prox-1 transzkripciós faktor, mely levezényli a nyirokérsejtek proliferációját (193). Fej-nyaki laphámrák-sejtvonalak és daganatszövetek vizsgálatából kiderült, hogy a VEGF-A és -C fokozottan expresszált, az expresszió mértéke pedig szoros összefüggést mutatott a daganat infiltratív növekedési jellegével és a nyirokcsomóáttétek incidenciájával (5, 135). A nyirokerek denzitása (LVD) orrgarati daganatok esetén jól látható összefüggést mutatott a nyirokcsomóáttétek incidenciájával (119), rávilágítva a nyirokérhálózat kiemelkedően fontos biológiai szerepére a fej-nyaki laphámrákok progressziójában. A limfatikus disszemináció alapelemei hasonlóak a hematogén disszemináció elemeihez, de vannak bizonyos specifikus különbségek, melyek biológiai jelentőségük mellett, fontos diagnosztikai és terápiás relevanciával bírnak. A limfatikus metasztáziskaszkád a primer tumornak a helyi nyirokérhálózattal történő kapcsolatával kezdődik (131, 204). A fej-nyaki daganatsejtek a nyirokerekkel kapcsolódhatnak véletlenszerűen vagy specifikusan, SDF1α limfatikus kemokin segítségével, melyet a tumorsejtek CXCR4 receptora ismer fel az invázió folyamata alatt. Miután a tumorsejtek találkoztak a nyirokerekkel, bizonyos tumorsejtek intravazációval bejutnak a nyirokérlumenbe. Hematogén disszemináció esetén ez a folyamat nehézkes, mivel a tumorsejteknek fel kell ismerniük a szubendoteliális, perivaszkuláris mátrixot, pericitákat, degradálniuk kell a mátrixot, majd csak ezután juthatnak be az érlumenbe, migrációval. A limfatikus intravazáció esetén a tumorsejteknek minimális migrációs készségre van szükségük, mivel a nyirokerek bazális membránja szakadozott, gyakorlatilag virtuális és nincsenek periciták (79, 150, 204). A tumorsejtek és a nyirokendothel között specifikus interakció

11

jön létre, melyet a PNAD (perifériás nyirokcsomó adresszin) mediál az endothelium részéről, és az L-szelektin adhéziós molekula a tumorsejt részéről. Nemrég megjelent közleményben kimutatták, hogy fej-nyaki daganatok esetén a mannózreceptor és a CLEVER-1 (common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor) a nyirokerek endotheliumán a limfatikus disszemináció esszenciális molekuláit jelentik (76). A nyirokkeringés és a vérkeringés között szintén alapvető különbségek vannak, melyek szintén befolyásolják a disszemináció folyamatát. A hidrosztatikus nyomás a nyirokerekben

sokkal

alacsonyabb,

így

kisebb

a

mechanikus

ellenállás

a

tumorsejtfelszínen, az immuneffektorok koncentrációja viszont magasabb, mint a perifériás érrendszerben. Azoknak a tumorsejteknek, melyeknek hiányzik vagy alacsony a tumorantigén- vagy HLA-expressziója, különösen, ha apoptózis-rezisztenciával társul, nagyobb esélyük van a túlélésre. A nyirokérrendszerben megmaradt tumorsejtek eljutnak a nyirokcsomókba, ahol leginkább a kortikális szinuszokban telepednek le, de a medulláris szinuszokban is, jóval kisebb mértékben. Az extravazáció folyamata a tumorsejtek számára nem nehéz feladat, hiszen ugyanazon a fenesztrált, szakadozott bazális membránon kell átjutniuk, mint az intravazáció alkalmával, egyetlen feltétele ennek a folyamatnak az, hogy rendelkezzen a tumorsejt migrációs készséggel. A nyirokcsomók extracelluláris mátrixa sokkal egyszerűbb felépítésű, mint más metasztázisban résztvevő szöveteké, ezért a mátrix degradációja kevésbé fontos tényező a tumorsejt-mikrokolóniák kialakulásában, viszont az immunszelekciós nyomás már a kezdetektől befolyásolja a mikrometasztázisok kialakulását, mivel a tumorsejtek immuneffektor

sejtek

aktivitásának

vannak

kitéve,

melyek

koncentrációja

a

nyirokcsomókban rendkívül magas. Mégis a mikrometasztázisok ki tudnak alakulni a nyirokcsomókban. Ennek magyarázata lehet az, hogy az az immunszelektív nyomás, mely befolyásolja a nyirokérhálózatba belépő tumorsejteket, mint szelekciós faktor hat, kiválasztva az immunrezisztens tumorsejteket. A lokális citokinmiliő sem ideális a tumorsejtek számára, hiszen a limfoid sejtekre specifikus. Míg a hematogén disszemináció esetén fontos tényező a szervspecificitás, a nyirokhálózatban terjedő daganatsejteknek nem kell alkalmazkodniuk különböző környezeti feltételekhez, hiszen ha egyszer már bejutottak ide, olyan képességgel rendelkeznek, mely hozzásegíti őket a teljes nyirokrendszerben való terjedéshez. Elég gyakran előfordul, hogy a tumorsejt, mely bejut a nyirokcsomóba, nem lép ki a nyirokérből és nem telepszik meg, hanem

12

egyszerűen

tovább

utazik

a

következő

nyirokcsomóba.

A

nyirokcsomóban

megtelepedett daganatsejteknek is ugyanazokon a „lépcsőfokokon” kell keresztül jutniuk, mint a más szervben megtelepedő daganatsejteknek, vagyis ki kell alakítaniuk saját vérellátásukat már néhány milliméternyi nagyságtól kezdve. A fej-nyaki laphámrákok számára a nem vaszkularizált mikrokolónia mérete 3 mm. Ilyen méretű mikrometasztázisok jelenléte gyakori főleg orális és hypopharyngealis daganatok esetén (44), ezek általában szubkapszuláris elhelyezkedésűek (194). Még nem teljesen tisztázott az a tény, hogy a limfatikus mikrometasztázisok ugyanúgy indukálják-e a limfangiogenezist, mint a primer tumor, hiszen a nyirokcsomókban már meglévő nyirokerek vannak, lehetővé téve a daganatsejtek tovább terjedését (204, 150). Fej-nyaki laphámrákok esetén világos összefüggés van a nyirokcsomó-érintettség és a távoli (szervi) áttét megjelenése között, utóbbi a betegség végstádiumában fordul elő (60). A nyirokcsomóáttét gyakran új területet jelent a daganat növekedése szempontjából, miután a nagyméretű tumor áttörte a nyirokcsomó tokját, egy új régióban növekedhet tovább (60). Az anatómiai lokalizáció jelentősen befolyásolja a fej-nyaki laphámrákok terjedését, a hypopharynx, supraglottis és nyelvgyök három olyan régiót jelent, ahol rendkívül gyakori a nyirokcsomó-érintettség. Azt is megállapították, hogy ha a tumor vastagsága meghaladja az 5 mm-t, a nyirokcsomó-érintettség lehetősége rendkívül magas (44, 194). 5. Szexhormonok szerepe a daganatok progressziójában Az endokrin miliő fontos tényező a tumorprogresszióban olyan daganatok esetén, amelyek szexhormon-receptorokat expresszálnak, mint például az emlő- (80), prosztata(123) vagy endometriumrák (143). Szexhormonok expresszióját megfigyelték már vaszkuláris endotheliumban (205), gégében (112) és a tüdő epitheliumában (139) is. Számos közlemény mutatott be olyan eseteket, ahol „nem szexuális” szervek daganatainak

egy

részében

kimutatható

ösztrogénreceptor

jelenléte,

például

meningeomákban és primer agydaganatokban (53, 87, 109), malignus melanómában (142, 212), sarcomákban (215), fej-nyaki daganatokban (43), pajzsmirigydaganatban (32), tüdődaganatokban (10, 19, 22), májdaganatokban (24), hasnyálmirigy-daganatban (65), gyomor-béldaganatokban (89, 118, 172, 222, 224).

13

A szteroid hormonokról több mint 30 éve köztudott, hogy különböző fiziológiás folyamatokban

vesznek

részt.

Specifikus

receptorokhoz

kötődnek,

melyek

transzkripciós faktorok, ezért pozitív vagy negatív hatással rendelkeznek a megfelelő célgének expressziójára (6, 7). A szteroid receptorok ligandkötő domént, DNS-kötő domént tartalmaznak és sokféle transzaktivációs funkcióval rendelkeznek (8, 42, 54). A celluláris funkciókra konvencionális jelátvivő kaszkádok segítségével hatnak, melyekben fontos szerepet töltenek be a foszfolipáz C (PLC), foszfoinozitol ciklus, az intracelluláris pH, a szabad intracelluláris kalcium és a protein-kináz C (PKC). Érdekes módon a szteroid hormonok rövid idejű hatásának vizsgálata korábbra datálódik, mint a nukleáris receptorok jelenlétének ismerete. 1942-ben Selye János volt az első tudós, aki tanulmányt közölt a progeszteron gyors hatásáról, intraperitoneális adagolást követően, mely azonnali anaesthesiát

okozott

patkányokban

(180).

1963-ban

az

aldoszteron

akut

kardiovaszkuláris hatását demonstrálták férfi betegeken (86). Majdnem egyidőben Spach és Streeten közölt egy tanulmányt

a fiziológiás aldoszteron-koncentráció

hatásáról a Na ion cseréjére, kutya vörösvérsejteken (191). Az ösztrogén gyors hatását az endometriumban lévő kalcium áramlására Szegő és Pietras közölte 1975-ben (146). E régi tanulmányok ellenére a szteroid hormonok hatásmechanizmusának alapos tanulmányozását csak az utóbbi évtizedben kezdték el. A szteroid hormonok közös tulajdonsága, hogy gének transzkripcióját modulálják intracelluláris vagy nukleáris receptorok segítségével, melyek mint ligand-dependens transzkripciós faktorok működnek. A szteroid hormonok hatásainak és hatásmechanizmusainak ismerete hosszú ideig tartó kutatás eredménye. A transzkripciós faktorként ható hormonreceptorok egyik prototípusa az ösztrogénreceptor (ER). Az ER intracelluláris, ligand által (azaz ösztrogénnel) aktivált transzkripciós faktor, foszforilációs helyekkel. Ligand nélkül a receptor a sejtmagban található, számos fehérjével, köztük a hősokkfehérjékkel alkotott komplexként. Az aktiválás konformációváltozást jelent; az ennek során képződött homodimer stabilan kötődik a megfelelő DNS-szekvenciához (a célgén promoter régiójában ösztrogénreszponzív elem található: ERE). Két ösztrogénreceptor-típus ismert: ERα és ERβ. Az ERα gén a 6-os kromoszómán helyezkedik el, míg az ERβ-é a 14q kromoszómán található. Miután a ligand kötődik a citoplazmatikus ERα-hoz, konformációváltozás jön létre, és a komplex a sejtmagba jut. A transzlokált komplex

14

felismeri az ösztrogénreszponzív elemeket, a célgén promoter régiójáról, és megváltoztatja a célgén expresszióját. Az ERβ-t az utóbbi időben fedezték fel. Az ERβ protein szerkezete hasonló a klasszikus ER szerkezetéhez, amelyet ma már ERα-nak hívunk, a DNS-kötő doménnel 95%-os, míg a ligandkötő doménnel 55%-os homológiát mutat (125). Az ERβ-hoz szintén specifikusan kötődik a 17β-ösztradiol, stimulálja az ösztrogén célgénjeinek a transzkripcióját ösztradioldependens módon (94, 125). Ez azt jelenti, hogy az ERα-val a 17β-ösztradiol stimulálja a transzkripciót, míg ERβ-val gátolja a transzkripciót (141). Bizonyos anti-ösztrogének, mint a tamoxifen, raloxifen képesek gátolni az ERα proliferációt stimuláló hatását, de ha ERβ van jelen, akkor hozzájárulnak a proliferáció stimulálásához (141). Ez magyarázatot adhat bizonyos típusú emlődaganatok tamoxifen-rezisztenciájára. Az emlőrákok többsége hormonfüggő betegségként indul, ebben az ösztrogén proliferációt serkentő hatása a legfontosabb tényező. Az ösztrogének fontos szerepet töltenek be a normális humán emlőszövet és emlődaganatok

növekedésében

és

fejlődésében.

Miután

kötődnek

az

ösztrogénreceptorokhoz, növekedésserkentő hatást fejtenek ki ugyanúgy a normális, mint a premalignus duktális epitheliumra (183). Emlődaganatok esetén az ERα-státust az endokrin terápiára adott válasz előrejelzőjeként használták (2, 15, 26). A legtöbb ERα-pozitív tumorral rendelkező páciensre az endokrin terápia jótékonyan hatott, az ERα-negatív tumoros betegekre viszont kevésbé. Így a pozitív ERα-státus jó prognózissal társult, az alacsony proliferációs ráta és a tumorszövet jobb szövettani differenciáltsága mellett, a túlélési ráta jobb ezekben az esetekben, míg az ERα-negatív emlődaganatoknak csak 5-10%-a válaszolt hasonló módon a hormonterápiára (39). Amióta a dohányzás elterjedt a nők körében is, a szájüregi daganatok incidenciája jóval magasabb lett (127). Begg és társai beszámoltak arról, hogy nők esetében jóval gyakoribb a második primer fej-nyaki daganat megjelenése, mely valószínűleg az ösztrogén hormon szerepének köszönhető (11). Továbbá, a szteroid hormonreceptorok, valamint a hormonfüggő proteinek jelenléte a normális humán gégeszövetben valamint a gégedaganatokban szintén alátámasztja azt a hipotézist, hogy a karcinogenezishez hormonális mechanizmusok is hozzájárulhatnak (43, 108, 159). Köztudott, hogy az ösztrogénreszponzív szövetekben (emlő, endometrium, cervix) az ösztrogén daganat keletkezését idézheti elő, valamint az is, hogy a különböző malignus folyamatokban az ösztrogén stimulálja a transzformált sejtek növekedési rátáját (181). Az ösztradiol, mely

15

az ösztrogén aktív formája, metabolizációja során két végtermék keletkezik: 2hidroxiösztron (2-OHE1) és 16α-hidroxiösztron (16α-OHE1). Az ösztron, mely az ösztradiol oxidált formája, a metabolikus folyamat végén – bizonyos enzimek által – hidroxilálódik. A 2-OHE1 általában inaktív és kevésbé antiösztrogén hatású (16, 116). A 16α-OHE1 viszont kovalens kötéssel kapcsolódik az ösztrogénreceptorhoz, és fokozott mértékű ösztrogénaktivitást mutat (196). Emelkedett 16α-OHE1-szint összefüggést mutatott cervikális-, emlő-, endometriumdaganatok valamint a larynx rekurrens respiratorikus papillomatózisának előfordulásával (49, 133, 175, 181). Fejnyaki régióban a kedvezőtlenebb lefolyású gégepapillomatózisok előfordulása fordított arányt mutatott a 2-OHE1/16α-OHE1 értékkel. Továbbá, in vitro kísérlettel kimutatták, hogy HPV vírussal fertőzött keratinocitákon az ösztradiol és 16α-OHE1 abnormális proliferációt és növekedést okozott. Ezek a megállapítások is arra utalnak, hogy a fejnyaki régióban rák esetén az ösztrogén metabolizációja eltérő módon zajlik egészséges kontrollokhoz képest, ezek a különbségek pedig, rizikófaktort jelentenek fej-nyaki daganatok kialakulása esetén. Már több mint 20 éve ismertek azok a közlemények, melyekben a szerzők fej-nyaki daganatok hormonreceptor-expressziójáról számoltak be. A korábban megjelent tanulmányokban az ösztrogén- és progeszteronreceptorok jelenlétét ligandkötő technikák alkalmazásával sikerült kimutatni (43, 140, 157, 159, 176), de nem sikerült bebizonyítani, hogy a fej-nyaki daganatok autentikus hormonreceptorokat expresszálnak. Másik elbizonytalanító tényező pedig az, hogy a vizsgálatokat kis esetszámú beteganyagon végezték (43, 159). Jelen tanulmányunkban immunhisztokémiai és molekuláris módszerrel vizsgáltuk a fej-nyaki daganatok hormonreceptor-expresszióját, viszonylag nagyszámú beteg bevonásával. 6. Az immunrendszer szerepe A tumor-gazdaszervezet interakciója a daganat progressziójának egy komplex jellemvonása, és egyre gyakoribb célpontja a daganatellenes stratégiáknak. Ebben immuneffektor sejtek, gyulladásos sejtek, daganatsejtek és stromasejtek közötti interakciókat találunk. Ennek a komplex és sokrétű interakciónak köszönhetően e hálózat egy-egy individuális elemének a terápiás modulációja hatással lesz a hálózat többi elemeire is, mely befolyásolja a progressziót. A kemoterápia, immun-adjuváns terápia vagy más biológiai alapú terápia során bekövetkező antitumor effektusokat az

16

immunrendszer megváltozott működése alapján célszerű elemezni. Az immunterápia, mely immuneffektor mechanizmusok révén pusztítja a daganatsejteket, a daganatok kezelésének specifikus formája. A sikeres daganatellenes immunterápiához megfelelő daganatantigén-expresszió szükségeltetik, valamint a daganatsejtek szenzitivitása az immuneffektor mechanizmusokra. A fej-nyaki daganatok, hasonlóan más tumor típusokhoz, különböző mennyiségű mononukleáris infiltrátumot tartalmaznak a daganatstromában és -sejtfészekben (intraepitheliálisan). Az orális, nasopharyngealis és laryngealis nyálkahártyában normális körülmények között is számos infiltráló sejttípus kimutatható (B- és T-sejtek, antigénprezentáló dendritikus sejtek, makrofágok), amelyeket a fej-nyaki daganatokban is meg lehet találni (218), és melyek denzitása időnként igen szembeötlő. Ennek ellenére a fej-nyaki daganatokat immunszuppresszív daganatnak tartják arra alapozva, hogy a dendritikus sejtek száma alacsonyabb, mint a normál epitheliumban, és az infiltráló T-sejtek funkciója is károsodott. A T-sejtek funkciójának gátolt voltát a T-sejt-receptor és jeltovábbító alegysége, a Zap-70 csökkent expressziójával, a gyenge IL-2-termeléssel és a fokozott apoptotikus készséggel magyarázzák

(218).

A

különböző

tanulmányok

számos

olyan

molekuláris

mechanizmusra derítettek fényt, amelyek közrejátszhatnak a fej-nyaki daganatok immunszuppresszív szerepében. Kiderült, hogy fej-nyaki daganatok esetén kifejeződhet a Fas/FasL rendszer, termelődhet TGF-β és PGE2, melyek a T-sejtek apoptotikus készségét fokozzák (218). Mindezek mellett a fej-nyaki daganatok termelhetnek GMCSF-et, ez pedig CD34+ immunszuppresszív csontvelői sejteket vonz a daganatba (226). A fej-nyaki daganatok immunszuppresszív jellegének klinikai szignifikanciája megmutatkozik a gyorsan kialakuló recidívák megjelenésében, rövidebb tünetmentes periódusban, rövidebb túlélési rátában, csökkent a T-sejt-receptor ζ lánc expressziója a tumort infiltráló limfocitákban és csökkent a dendritikus sejtek száma. Ez azt jelentheti, hogy a T-sejtek funkcionalitásának immunterápiával történő javítása növelheti a tünetmentes periódust és a túlélési rátát ebben a daganattípusban. Fej-nyaki daganatos betegek immunrestaurációját többféle módszerrel is megkísérelték. Ezek között szerepelt a különböző citokinekkel történő kezelések (IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-12) és a sejtek nonspecifikus stimulációja is Calmette-Guerin bacilussal (BCG) vagy Corynebacterium parvum által. A közelmúltban két protokollal értek el eredményeket. Az egyikben a humán rekombináns IL-2 adagolását végezték, aminek eredményeként a

17

tumorszövetben megemelkedett a CD25+ és a HLA-DR+ aktivált T-sejtek száma, gyakoribb lett az NK-sejtek jelenléte, azonban ez nem járt megfelelően mérhető pozitív klinikai válasszal (25, 29, 217, 203). Megkísérelték a fej-nyaki daganatokat természetes leukocita-citokinkeverékkel is kezelni. A vizsgálatok közül több esetben is sikerült pozitív klinikai választ detektálni elsősorban szájüregi daganatok esetében (3, 67, 206), és a daganatokban észlelhető volt a T- és B-sejt-infiltráció növekedése (121, 206). Ma még nem lehet megjósolni, hogy melyik daganatos csoport esetében van inkább létjogosultsága a specifikus vagy nonspecifikus immunterápiának: az amúgy is aktív vagy a nonreaktív betegcsoportban. Tudva azt, hogy a fej-nyaki daganat immunszuppresszív daganat, önmagában a nemspecifikus stimuláció nem feltétlenül vezet jobb antitumorális hatáshoz az immunszuppresszív mechanizmus áttörése nélkül. Szájüregi és oropharyngealis daganatok esetén az egyik legfontosabb prognosztikai tényező a nyirokcsomó-érintettség. Fej-nyaki daganatok lokoregionális metasztázisainak incidenciája átlagosan 57%, a szubklinikai lokoregionális metasztázisok pedig 34%-ban fordulnak elő. A tumorsejt-proliferáció mértéke, melyet a proliferáló tumorsejtek Ki-67 antigén-expressziójának alapján mérhetünk, szintén fontos prognosztikai faktor (13, 58), mely

segítségével,

kiegészítve

a

tumor

szövettani

stádiumával

és

TNM

klasszifikációjával, meghatározható a daganat agresszivitásának mértéke (84). Ki-67 antigén-expressziót csak a sejtciklusban lévő sejtek mutatnak (G1, S, G2, M), a G0 stádiumban lévő „nyugvó” sejteken ez az antigén nem expresszálódik. A ciklusban lévő daganatsejtek általában érzékenyek a sugár- és kemoterápiára, míg a nyugvó sejtek rezisztensek ezekre a terápiákra. A daganatok műtéti eltávolítását követően a Ki-67 jelenléte a reziduális tumorban előrejelezheti a kemo- és sugárterápia eredményességét (88, 156). Ezért fontos a tumort infiltráló mononukleáris sejtek elemzése fej-nyaki daganatokban, és meghatározni a proliferáció mértékét (Ki-67 antigén kimutatásával), mivel mindkettőnek prognosztikai jelentősége van. Bár a citokinkeverék helyi adagolása klinikai válasz megjelenését indukálta fázis I és fázis II vizsgálatokban (3, 67, 206), ezekben az esetekben nem végezték el az intratumorális mononukleáris sejtek elemzését.

18

CÉLKITÜZÉSEK A fej-nyaki laphámrákok mikrokörnyezetének hatását a tumor progresszióra számos tényező befolyásolja. Munkám során olyan tényezők szerepét igyekeztem megvizsgálni, melyek más típusú daganatokban bizonyítottan fontos szerepet játszanak a progresszióban. Részleteiben az alábbi kérdések kerültek megfogalmazásra:

1) A különböző anatómiai lokalizációjú és egyben eltérő progressziós képességű fejnyaki daganatok erezettségének vizsgálata 2) A fej-nyaki daganatokban a sugárterápia hatására létrejött vaszkularizációs hatások tisztázása 3) Szexhormonreceptor-expresszió vizsgálata fej-nyaki rákokban 4.) Leukocita-interleukint tartalmazó citokinkeverék (Multikine) helyi adagolását követő stromális reakciók analízise fej-nyaki daganatokban

19

ANYAG ÉS MÓDSZER Beteganyag Vizsgálatainkat 216 fej-nyaki daganatos beteg műtétileg eltávolított anyagán végeztük. Minden esetben, a daganatok szövettani diagnózisa laphámrák volt. A daganatok anatómiai

lokalizációja

a

következő

volt:

szájüregi

daganat

(tonsilla,

garatívek,szájgarat) 65 eset (30,09%), hypopharyngeális daganat 21 eset (9,72%), glotticus daganat 43 eset (19,9%), nyelv, nyelvgyöki daganat 51 eset (23,61%), lágyszájpad daganat 24 eset (11,11%), ajak daganat 12 eset (5,55%). TNM stádiumbeosztás az alábbiak szerint változott: T1 stádiumban 11 eset volt (5,16%); T2 stádiumban 114 eset (53,52%); T3 stádiumban 65 eset (30,51%) és T4 stádiumban 23 eset volt (10,79%). Nyirokcsomó áttéttel a betegek 35,21%-a rendelkezett (75 beteg), 64,78%-ban nem volt kimutatható nyirokcsomó érintettség (138 beteg), távoli (szervi) áttétet egy esetben tapasztaltunk. A betegek életkora 41-84 év között volt. . A különböző anatómiai lokalizációban lévő fej-nyaki daganatok érdenzitás vizsgálatát archivált tumorszöveteken végeztük, melyeket a Semmelweis Egyetem Fül-Orr-Gége Klinikájáról kaptunk. Az érdenzitás és sugárkezelés összefüggését, valamint a hormonreceptorok expresszióját az Országos Onkológiai Intézetben kezelt betegek műtétileg eltávolított daganatain végeztük. A leukocita-interleukin kezelés hatásának vizsgálatát az alábbi klinikákról származó betegek anyagain végeztük: Semmelweis Egyetem Fül-Orr-Gége Klinikája, SE Fogászati és Szájsebészeti Klinikája, a Fővárosi Uzsoki utcai Korház Fül-Orr-Gége és Fejnyaksebészeti Osztálya, Győri Városi Korház (Petz Aladár) Fül-Orr-Gége Osztálya, valamint az Országos Onkológia Intézet Fejnyaksebészeti Osztálya. A tanulmányok elvégzéséhez rendelkeztünk a szükséges etikai engedélyekkel. I. ANGIOGENEZIS A. Tumorméret és vaszkularizáció Immunhisztokémia és tumor-indukált angiogenezis mérése A sebészileg eltávolított daganatokat hagyományos paraffinos beágyazással dolgoztuk fel (I.). A szövettani diagnózis felállítása után metszeteket készítettünk, melyeket Superfrost tárgylemezre vettünk fel és 37ºC-on inkubáltuk. A deparaffinálás

20

xylol/alkohollal történt. Az endogén peroxidáz-aktivítás gátlása 10%-os methanolban oldott hidrogén-peroxiddal történt. Az antigénfeltárást 1,5%-os proteáz K (Sigma) emésztéssel (15 perc) végeztük. A nemspecifikus kötőhelyek blokkolását 3% BSA/PBS oldattal végeztük 30 percig. Az erek azonosítására kettős immunhisztokémiai jelölést alkalmaztunk, mely az endothelsejteket és az erek bazális membránját jelölte. Első lépésként anti-humán CD31 egér monoklonális IgG-vel (Dako, 1:40 hígítás, 1 óra , 37ºC ) jelöltük a metszeteket. A lekötődött egér IgG-t kecske anti-egér IgG-biotin konjugátummal (1:100, 1 óra, 37ºC ) jelöltük , és a komplexet Streptavidin-peroxidáz komplexxel növeltük (1:100, 15 perc , 37ºC ). A peroxidáz enzim elöhívására DAB barna kromogént használtunk. A következőkben az erek falában lévő bazális membránt nyúl anti-laminin savóval jelöltük (Dako, 1:50 hígítás, 1 óra, 37ºC ). A nyúl IgG kimutatására kecskében termelt anti-nyúl IgG biotin konjugátumot alkalmaztunk (1 óra, 37ºC), végül a nyúl komplexet Streptavidin-alkalikus foszfatáz konjugátummal mutattuk ki, az enzimet Fast Blue kromogénnel kékre hívtuk elő. A negatív kontrollokhoz vagy mindkét primer savót vagy csak egy-egy primer savót hagytunk ki a lépésekből, ezek a metszetek nem adtak színreakciót. A metszeteket glicerin-zselatin oldattal fedtük le. Az érdenzitást mintánként öt 20x nagyítású látótérben CUE 2 morfometriai programmal (Olympus) mértük, melynek során az érsűrűség mellett az erek kerületét is meghatároztuk. A VEGF kimutatására az előkezelt metszeteket poliklonális (kecske) anti-humán VEGF antitesttel jelöltük (R§D), majd megfelelő biotinált anti-kecske savóval és Streptavidin –peroxidázzal hívtuk elő. B. Sugárkezelés hatására létrejött érdenzitás-változás Betegek A vizsgálatba bevont betegeket fej-nyaksebészek, sugárterápiás és klinikai onkológus szakorvosok vizsgálták meg először (II.). Azok közül a betegek közül, akiknél a bizottság egyedüli sugárkezelést tartott indokoltnak, azokat a betegeket vontuk be a vizsgálatba, akiknél a szájgarat szövettanilag igazolt planocellularis karcinómája állt fenn, a várható túlélési idő legalább fél év volt, nem volt távoli áttét és a betegek a tájékoztatás alapján a vizsgálatban való részvételbe írásos beleegyezésüket adták. A szükséges

kivizsgálás

fizikális

vizsgálatot,

21

rutin

laboratóriumi

vizsgálatokat,

mellkasröntgent, metszetképalkotó vizsgálatot (lehetőség szerint MR-vizsgálatot) foglalt magában. Szükség szerint a stádium pontos meghatározásához endoszkópiát, csontröntgent, ultrahang-vezérelt aspirációs citológiát vettünk igénybe.

Sugárkezelés és terápiás válasz mérése A sugárkezelés medián dózisa 66 Gy (60-70), a kezelés medián időtartama 56 nap (4671) volt. A perkután sugárkezelést 6 MV lineáris gyorsítóval végeztük, két oldalsó és illesztett antero-poszterior mezőkből a felső, illetve alsó nyaki régió kezelésére. A tervezett dózis 66-70 Gy volt a középvonalra dozírozva. A gerincvelő megengedett maximális terhelése 46 Gy volt. A hátsó nyirokcsomóláncot szükség szerint elektron boost-tal egészítettük ki. A kezelés során a betegeket sugárterapeuta és fej-nyaksebész rendszeresen ellenőrizte. A terápiás választ a WHO kritériumai szerint osztályoztuk. A komplett

remisszió

(CR)

a

betegség

teljes

visszafejlődését

jelenti

minden

lokalizációban, fizikális és képalkotási eljárásokkal; a részleges remisszió a betegség legalább 50%-os visszafejlődése minden lokalizációban, amely legalább három hónapig tart; az állandó állapot (SD) a betegség kevesebb, mint 50%-os csökkenése és kevesebb, mint 25%-os növekedése közötti tartomány; a progresszív betegség (PD) pedig a betegség 25%-nál nagyobb növekedése bármely lokalizációban, vagy új manifesztáció megjelenése. A kezelés utáni kontrollvizsgálat két független orvos által végzett fizikális vizsgálatból, metszetképalkotási kontrollvizsgálatból, és szükség esetén kiegészítő vizsgálatokból állt. Az első kontroll 8 héttel a kezelés befejezése után történt, majd két évig 3 havonta, ezt követően a beteg állapotától függően individuális időközönként. Szövettani feldolgozás A daganatból biopsziás mintát a kezelés megkezdése előtt, minden betegnél 20 Gy dózis elérése után közvetlenül vettünk (többszörös excíziós próbabiopszia az élő szövetből). Paraffinos beágyazás és H&E-festés után meghatároztuk a daganat grade-jét és a mitózisszámot 10 nagy nagyítású látótérben. Mikrovaszkuláris denzitás A szövettani metszeteket xylol segítségével deparaffinizáltuk, majd felszálló alkoholsorral dehidráltuk. Ezután 3%-os hidrogén-peroxidba mártottuk, az endogén peroxidáz

22

reakció gátlása érdekében. Citrátpufferben (pH 6,0, 10 mM) végzett mikrohullámú előkészítés (750 W, 15 perc) és PBS-ben történt mosás után a metszeteket 3%-os bovin szérum albuminban blokkoltuk 30 percig. Ezután a metszeteket 1:50 hígításban monoklonális egér anti-humán CD34 antitesttel (DAKO, Glostrup, Dánia) inkubáltuk 1 óráig. PBS-sel történt mosás után a metszeteket a szekunder antitesttel és streptavidinperoxidázzal inkubáltuk 15 percig, melyhez LSAB-2 reagenst (DAKO) adtunk. A reakciót AEC kromogénnel ábrázoltuk, a sejtmagokat Hemalaunnal festettük. Az érdenzitást számítógép-asszisztált morfometriával számoltuk, a CUE2 számítógépes program segítségével. Az érdenzitást a nemzetközi konszenzusnak megfelelően legalább 5 „hot spotban” határoztuk meg (207). Statisztikai feldolgozás A statisztikai számításokat SPSS 9.0 programmal végeztük. A túlélést Kaplan-Meier eljárással becsültük meg. A csoportokat log-rank-teszt segítségével hasonlítottuk össze. A különböző klinikai és patológiai faktorok összevetésére Chi-négyzet próbát, t-tesztet és ANOVA-t használtunk

II. HORMONRECEPTOR-EXPRESSZIÓ FEJ-NYAKI DAGANATOKBAN 1) Ösztrogén- és progeszteronreceptorok mRNS-expressziójának kimutatása A fagyasztva homogenizált tumormintákból Tri ReagentTM-el (Sigma®) totál RNS-t izoláltunk a gyártó protokolljának megfelelően (V). A lehetséges DNS szennyeződést TURBO

DNA-freeTM

kit

(Ambion®)

segítségével

küszöböltük

ki.

Reverz

transzkripciónál 2 µg tisztított RNS-hez 1µl 10 mM dNTP mixet (Finnzyme®), illetve 1 µl random primer-oligo dT keveréket adtunk a végső 2,5 µM-os koncentráció eléréséhez. 10 perces 70ºC-on történő inkubálás után mintánként 2 µl 10x M-MLV reverz transzkriptáz puffert (Finnzyme®), 1 µl M-MLV reverz transzkriptázt (200 NE / µl, Finnzyme® ), 0,5 µl RNase inhibitort (40 NE /µl, Promega®) és 6,5 µl DEPC kezelt vizet adtunk a reakcióelegyhez. 37ºC-on 50 percig történt a reverz transzkripció, majd az enzimet 85ºC-on 10 percig inaktiváltuk. A reverz transzkripció megtörténtét β-aktin primerekkel (GTG GGG CGC CCC AGG CAC CCA, CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC) végzett PCR reakcióval ellenőriztük. A lehetséges DNS szennyezés

23

kimutatására minden mintából cDNS templát mellett az izolált totál RNS-t, mint templátot használtuk. Non-templát kontrollként DEPC kezelt víz szolgált. ER-α, ER-β valamint PGR kimutatásához nested-PCR technikát alkalmaztunk. Az első lépésben használt PCR reakcióelegy a következőket tartalmazta: 2,5 µl 10x PCR puffer + Mg2+

(DyNazymeTM), 2 µl dNTP mix (2,5 mM) 0,4 µl DNS polimeráz

(DyNazymeTM, 2 NE/µl), 2,5 – 2,5 µl outer primer (ERα: CTC AGC ATC CAA CAA GGC AC, AAG GAG ACT CGC TAC TGT GC; ERβ: TCA CTT CTG CGC TGT CTG CAG CG, CCT GGG TCG CTG TGA CCA G; PG: AAG ACG CAG GAC CAG CAG, CCT CAA CCT CCA CCG CAG), 2 µl cDNS és 13,1 µl DEPC kezelt víz a 25µl-es végtérfogat eléréséhez. A PCR feltételek a következőek voltak: 94ºC 1 perc; 55 ºC 1 perc, 72ºC 1 perc, 30 ciklus; majd 72ºC 7 perc. Második PCR reakcióelegy összetétele a következő volt : 2,5 µl 10x PCR puffer + Mg2+ (DyNazymeTM), 2 µl dNTP mix (2,5 mM), 0,2 µl DNS polimeráz (DyNazymeTM, 2 NE/µl), 2,5- 2,5 µl inner primer (ER-α: ATG ACT ATG CTT CAG GCT ACC A, TTG GCA GCT CTC ATG TCT CC; ER-β: GCC CAA GAG AAG TGG CGG CCA CG, AAA CCT TGA AGT AGT TGC CAG GAG C; PG: GCT CTT GGT GCC TGT TTG G, AGA GCC ATC CTC CTC CTC AA); 1 µl az első PCR reakciótermékből, valamint 14.3 µl DEPC-s víz a 25 µl-es össztérfogat eléréséhez. A PCR feltételek a következőek voltak: 94ºC 1 perc, 55ºC 1 perc, 72ºC 1 perc, 30 ciklus; majd 72ºC 7 perc. A PCR termékeket 2 %-os agaróz gélen választottuk szét, majd a detektálást ethidium-bromid festést követően Gel-Doc 2000 (Bio-Rad®) rendszerrel végeztük. Minden receptor-típus esetén random módon kiválasztott minták nested-PCR termékeit a gélből visszaizoláltuk (High PureTM PCR Product Purification kit, Roche, Mannheim) és bázissorendjét meghatároztuk (Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

2) ERα kimutatása immunhisztokémiai módszerrel A műtétileg eltávolított daganatokat folyékony nitrogénben hűtött izopentánban fagyasztottuk, majd

-70 ºC -on tároltuk (V). A daganatokból 5 µm vastagságú

fagyasztott metszeteket készítettünk. A szövetek tárgylemezre való rögzítését 5 percig tartó acetonban való inkubálással végeztük, melyet 2 óra szobahőn való szárítás követett. A nemspecifikus kötőhelyek blokkolása 3 % -os BSA /PBS oldattal történt 30

24

percig. Primer antitestként ERα specifikus monoklonális IgG–t alkalmaztunk (egér monoklonális antitest, Dako illetve Novocastra) 1:30 hígításban, 4ºC-on, egy éjszakán át. Ezután 1 órán át biotinált kecske anti-egér szekunder antitesttel (Vector Laboratories) szobahőn inkubáltuk a metszeteket, majd a komplexeket Streptavidin Texas Red-el jelöltük (1:100 hígítás, szobahő, 45 perc). Hoechst magfestést ( 1:10000) követően és a metszeteket Cityfluor + Vectashield 1/1 arányú keverékével fedtük. Az egyes lépések között a metszeteket 15 percen át PBS pufferrel mostuk.

3) ERβ kimutatása immunhisztokémiai módszerrel Az ERβ-t szintén fagyasztott metszeteken mutattuk ki, az eljárás megegyezik a fenti módszerrel, egészen a primer antitest alkalmazásáig. Primer antitestként ERβ specifikus IgG-t használtunk (nyúl anti-human oestrogen receptor beta 1- Novocastra) 1:30 hígításban, 4 ºC -on, 1 éjszakán át. A szekunder antitest biotinált kecske anti-nyúl IgG volt (Vector), mellyel 1:100 hígításban, szobahőn, 1 órán át inkubáltuk a metszeteket. A keletkezett komplexet Streptavidin Texas Red-el jelöltük (1:100 hígítás, szobahő, 45 perc). A magfestést (Hoechst festék, 1:10000 hígítás) követően a metszetek fedése Cityfluor + Vectashield 1/1 arányú keverékével történt. Az egyes lépések között a metszeteket 15 percen át PBS pufferrel mostuk. 4) PG-receptor kimutatása immunhisztokémiai módszerrel A PG-receptorok kimutatása ugyancsak fagyasztott metszeteken történt (V). Az eljárás a primer antitest alkalmazásáig megegyezik az ERα-nál leírt módszerrel. A primer antitestként szolgáló PGR-specifikus monoklonális IgG-vel (egér monoklonális antitest, Novocastra, hígítás 1:50) egy éjszakán át 4ºC-on inkubáltuk a metszeteket. Szekunder antitestként biotinált kecske anti-egér IgG-t használtunk (szobahő, 1 óra). A keletkezett komplexet Streptavidin Texas Red-el jelöltük (1:100 hígítás, 45 perc, szobahő), majd magfestés következett Hoechst festékkel 1 : 10000 hígításban (3 perc, szobahő). A metszeteket a fentiekhez hasonlóan Cityfluor + Vectashield 1/1 arányú keverékével fedtük. A lépések között a metszeteket TRIS pufferrel mostuk 15 percen át.

25

III. NEOADJUVÁNS LEUKOCITA-INTERLEUKIN (LI) HATÁSA FEJ-NYAKI DAGANATOKRA Ez a vizsgálat két önálló klinikai tanulmányon alapult. Az első tanulmányban (III), a természetes humán leukocita-interleukin injekciózást három különböző dózisban végeztük; a másodikban (IV) egy még magasabb dózissal kezeltük a fej-nyakrákos betegeket. A vizsgálatban összesen 93 beteg vett részt, az elsőben 27 kezelt eset 27 kontroll esettel, a másodikban pedig 19 kezelt eset 20 kontroll esettel. A betegek műtétileg eltávolított daganatait az Országos Onkológiai Intézet Tumor Progressziós Osztályán dolgoztuk fel, egységes protokoll alapján. A vizsgálati anyagok a következő egészségügyi intézményekből származtak: SE Fül-Orr-Gégészeti és Fejnyak-sebészeti Klinikája, SE Fogászati és Szájsebészeti Klinikája, Uzsoki utcai Korház Fül-OrrGégészeti és Fejnyak-sebészeti Osztálya, Győri Városi Korház (Petz Aladár) Fül-OrrGégészeti Osztálya valamint az Országos Onkológia Intézet Fejnyaksebészeti Osztálya.

Betegek A vizsgálatban résztvevő 54 betegnek előzetes biopsziával megállapított szájüregi laphámrákja volt. A betegek életkora 40-77 év között változott, a nemek közti arány 5,75:1 volt (46 férfi, 8 nő). A vizsgálatok második fázisában 39 beteg vett részt, itt is minden betegnek előzetes biopsziával megállapított szájüregi laphámrákja volt. 19 beteg részesült magas dózisú LI-kezelésben, 20 beteg a kontroll csoportot alkotta. A történelmi kontrollokat az Országos Onkológiai Intézet pathológiai anyagából választottuk ki, ugyanolyan kritériumok alapján, mint a kezelésben résztvevőket. A vizsgálatba bevont betegek, a következő kritériumoknak kellett megfelelniük: idősebb mint 18 év, írásos beleegyező nyilatkozatot adtak a vizsgálathoz, szövettanilag igazolt laphámrákjuk volt melyek TNM stádiumbeosztás szerinti : T2-3, N0,M0 stádiumban lehettek, visceralis áttétjük nem volt, a túlélés várható időtartama minimum 6 hónap volt. Terhes, besugárzott, duodénum vagy gyomorfekélyes, asthmás betegek nem vehettek részt a vizsgálatban. A betegek életkora 40-87 év között változott, 39 férfi beteg valamint 8 női beteg vett részt.

26

Leukocita-interleukin injekció A

leukocita-interleukin

mononukleáris

sejtekből

előállítása történt

választott

(melyet

az

humán

perifériás

Egyesült

Államok

vérből

nyert

Vöröskereszt

szervezetétől kaptunk), miután tesztelték táplálék és drogfogyasztás, valamint esetleges transzfúzió vonatkozásában (első alkalommal jelentkező donorokat kizárták). A mononukleáris sejteket mitogénnel kezelték, majd a szérummentes felülúszót aszeptikusan leválasztották. A felülúszót a továbbiakban tisztították, vírus jelenlétét kizárták, sűrítették majd mikrofiltrációnak vetették alá. Ezután humán szérum albumint adtak hozzá, pufferolták fiziológiás pH értékre, létrehozták a cél IL koncentrációt majd újabb

mikrofiltráció

körülmények

között

következett. steril

Az

így

csövecskékbe

keletkezett adagolták,

hatóanyagot és

aszeptikus

felcímkézték

az

IL

koncentrációnak megfelelően. A terméket tesztelték radioaktív thymidine beépülésre vonatkozóan, cytotoxikus T-lymphoid IL-2 dependens sejtvonal alkalmazásával (CTLL2). A végső injektábilis terméket tovább tesztelték (ELISA módszerrel)- 5 citokin marker jelenlétét vizsgálták: IL-2, interleukin 1α (IL-1α), GM-CSF, IFN-α, és tumor nekrózis faktor –α (TNF-α). Továbbiakban a leukocita interleukin injekció minőségét vizsgálták, tesztelve a sterilitást, baktérium endotoxin jelenlétét, pH értéket, protein koncentrációt, külső megjelenést. Végül, a leukocita interleukin injekciót fagyasztva tárolták boroszilikát üvegcsékben, minden egyes adag 2,2 ml hatóanyagot, azaz 400 NE/ml IL-2 ekvivalens terméket tartalmazott, melyet majd peritumorális, intratumorális és perilymphatikus úton adagolhattunk. A termék összfehérje tartalma 3 mg/ml, minden egyes adag sterilen és pyrogénmentesen lett adagolva, felhasználhatósági ideje 24 hónap volt – amennyiben a tárolási hőmérséklet -20 C. Cyclophosphamid A Cyclophosphamid USP (Bristol-Myers-Squibb, Morton UK) összetétele: 75 mg mannitol valamint kb. 82 mg nátrium–bikarbonát, 100 mg cyclophoshamid adagonként. A kiszerelés steril por formájában történt.

Indomethacin Az indomethacin USP (Sanofi-Synthelabo, Paris) 25 mg-s tabletta formájában lett adagolva, melyet a betegek az étkezések során vettek be.

27

Cink-szulfát és multivitamin A cink-szulfát (50 mg) (R.P. Schrerer Corporation, Clearwater, FL) és a multivitamint a klinikus adagolta minden betegnek.

Kezelési protokollok A kezelési elv megegyezett a Verastegui és mtsai (206) valamint Hadden és mtsai (67) által alkalmazott protokollal. A cyclophasphamid, indomethacin, cink-szulfát és multivitamin adagolása hasonló volt a Hadden és mtsai által alkalmazott mennyiségekkel. A leukocita interleukin adagolása pedig a következőképpen zajlott. Az alacsony dózissal kezelt betegeknek két héten át, heti három alkalommal peritumorálisan injektáltuk a 400 NE IL-2 equivalens egységet (összesen 2400 NE), a közepes dózissal kezelt betegeknek két héten át, heti három alkalommal injektáltunk peritumorálisan 800 NE LI-t (összesen 4800 NE), a magas dózissal kezelt betegeknek pedig két héten keresztül, heti öt alkalommal injektáltuk peritumorálisan a 800 NE LI-t (összesen 8000 NE)(III). Minden adag leukocita interleukin injekciózását a tapintható, vagy látható tumor tömeg külső kerületében, intradermálisan végeztük. A daganatok (valamint reziduális daganatok) műtéti eltávolítását a leukocita –interleukin adagolását követően a 21-ik és 28-ik nap között végezték el; a locoregionális postoperatív sugárterápiát a műtéti heg gyógyulása után kezdték (ennek meghatározását minden beteg egyéni állapota szerint végezték). Átlagban, a sugárterápia kezdete a műtét után 2 és 4 hét közötti időszakban volt. A leukocita interleukin kezelés nem befolyásolta a műtéti heg gyógyulását, összehasonlítva a kontroll csoporttal. A magas dózisú leukocita-interleukin kezelés esetében a helyi kezelés megegyezett az előző vizsgálatban alkalmazotthoz (IV). Az LI adagolása a következőképpen történt: a napi adag felét (400 NE IL-2) peritumorálisan injekciózva; a napi adag másik felét (400 NE IL-2) perilimfatikusan injekciózva, 3 héten keresztül, heti 5 alkalommal, addig, amíg elértünk a 12000 NE kumulatív dózishoz (mely sokkal magasabb adag, mint amelyet előző tanulmányunkban értünk el). A LI injekciót intradermálisan adagoltuk a tumor látható és tapintható kerületének megfelelően; a perilimfatikus adagolás a tumor ipsilaterális oldalán lévő hátsó submandibuláris régió juguláris limfatikus láncába történt. A LI kezelés előtt iv cyclophosphamide infúziót alkalmaztunk: 300 mg/m2 -, 3

28

nappal a LI adagolása előtt. Az indomethacint (25mg per os) minden beteg saját maga adagolta a táplálékkal együtt (napi dózis 75 mg), 3 nappal a cyclophosphamide adagolása után, egészen a műtét előtt 24 óráig. A cinkszulfátot és multivitamint minden beteg saját maga adagolta, szintén a cyclophosphamid adagolása után 3 nappal megkezdve, műtét előtt 24 óráig. A pácienseknek javasoltuk, hogy a cinkszulfát és multivitamin szedését műtét után is folytassák. A betegek vizsgálata Minden beteget egy általános kivizsgálásnak vetették alá, mely magába foglalt egy részletes anamnézist, hematológiai vizsgálatot, mellkas Rtg-t, EKG-t, és a tumor vizualizációját MRI vizsgálattal. Bidimenzionális képalkotó módszerrel meghatározták a tumor méretét, valamint két leghosszabb átmérőjét. Minden egyes vizit alkalmával a betegek életminőségével kapcsolatos változásokat feljegyezték: fájdalom jelenlétét és erősségét, nyelvmozgás mértékét, valamint a toxicitás tüneteit-amennyiben jelentkeztek.

Patológiai feldolgozás A szájüregi elváltozások diagnózisát előzetes próba-excíziós biopszia alapján állították fel, majd kiválasztották a T2-3, N0-2, M0 klinikai stádiumú daganatokat. Ezeket a betegeket kezelték leukocita-interleukin injekcióval, értékelték a kezelésre adott választ, majd attól függően, hogyan reagált a tumor, kiválasztották azon betegeket, akiknek eltávolították a tumort, vagy a reziduális tumort, vagy kis excíziós biopsziát végeztek. Teljes klinikai válasz esetén nem végeztek műtéti beavatkozást. Ennek megfelelően, a LI kezelést követően kétféle tumor minta állt rendelkezésre patológiai és immunhisztokémiai feldolgozásra: 1) teljes tumor, 2) biopsziával nyert tumor. Az utóbbi – tekintettel a kis méretre – patológiai feldolgozása bizonyos keretek közé szorult. A patológiai feldolgozás az Országos Onkológiai Intézet Tumor Progressziós Osztályának vezetésével történt. Egységes patológiai protokoll alapján történt a sebészileg eltávolított daganatok preparálása, fixálása, mikroszkopikus valamint makroszkopikus

vizsgálata,

továbbiakban

a

szövettani

és

immunhisztokémiai

feldolgozása. A daganatokat minden egyes intézet a patológiai protokollnak

29

megfelelően kezelte, majd továbbították a központi patológiai laboratóriumba, ahol feldolgozták és a kapott adatokat értékelték. Az eltávolított daganatszöveteket, előre felcímkézett formaldehidet tartalmazó tégelyekbe helyeztük egy éjszakán át, fixálás után paraffinba ágyaztuk, majd 5 µm vastagságú metszeteket készítettünk, melyet előbb H&E-nal festettünk, és előkészítettük az immunhisztokémiai jelölésre. A daganatok hisztopatológiai vizsgálatát három különböző régióban végeztük: 1.) tumorfelszín, 2.) tumorcentrum, 3.) tumor-stróma határ. A nekrotikus daganatrészeket a H&E metszetekből állapítottuk meg. Stroma/tumorszövet arányának meghatározása A fej-nyaki daganatok epithelialis komponensének valamint a stroma mennyiségének arányát két módszer segítségével határoztuk meg. Először a metszeteket Mallorytrichrom festéssel jelöltük, majd lemértük a daganatfészkek (tumor epithelia) arányát Image Pro Analysis szoftver segítségével (MediaCibernetics, Silver Spring MD). Második módszerként a metszeteket cytokeratinnal jelöltük, pan-cytokeratin antitestet alkalmazva (Dako, Glostrup, Denmark) (A1A3-CK19), mely a tumorsejteket jelölte, majd mikroszkóppal és az Image Pro Analysis programmal elemeztük a daganatfészek arányát a tumorszövetben. Proliferáló sejtek arányának meghatározása A metszeteket Ki-67 (Dako) antitesttel jelöltük, mely a proliferáló sejtekhez kötődött, így meghatározhattuk a ciklusban lévő daganatsejtek arányát. A proliferáló daganatsejteket a mikroszkóp 20x nagyítású látóterében számoltuk, a három különböző régióban. Továbbiakban, a ciklusban lévő stromasejteket is számoltuk, ugyanezen kritériumok alapján, látóterenként minimum 100 sejtet elemezve. Mononukleáris sejtek infiltrációjának vizsgálata A daganatok közvetlen szomszédságában elhelyezkedő mononukleáris sejteket a paraffinba ágyazott tumor metszeteiből határoztuk meg, immunhisztokémiai módszerrel. A metszeteket deparaffináltuk, majd az antigénfeltárást mikrohullámú sütő segítségével, korábban ismertetett módszer alkalmazásával (93) végeztük. Csakis olyan, forgalomban lévő antitesteket alkalmaztunk, melyeket paraffinba ágyazott metszeteken kipróbáltunk előzetesen. A neutrofil sejteket anti-mieloperoxidáz antitesttel (egér-monoklonális At,

30

Dako), a hemopoetikus őssejteket CD34 monoklonális antitesttel (Dako) jelöltük. A makrofágokat CD68 antitest segítségével vizsgáltuk (egér-monoklonális At, Dako) a dendritikus sejteket pedig a CD1a-expresszió segítségével azonosítottuk (egér antiCD1a At, Immunotech, Paris, Fr). A lymphoid sejtek azonosítása az LCA antigén expressziója segítségével történt (egér monoklonális anti-CD45 At, Dako), a B-sejt populáció jelölésére egér monoklonális anti-CD20 antitestet, a T-sejtekre pedig nyúlpoliklonális anti-CD3 antitestet (mindkettő Dako készítmény) alkalmaztunk. A citotoxikus T-sejtek azonosítására CD8 (egér monoklonális anti-CD8 At, Dako) antitestet, a NK-sejtekre a CD57 antitestet használtuk (egér monoklonális anti-CD57 At, Novocastra, Newcastle on Tyne, UK). Minden esetben negatív kontrollnak izotípus antitest kontrollt használtunk. Az összes immunhisztokémiai jelöléshez az LSAB-2 kitet alkalmaztuk, mely biotinált anti-egér és anti-nyúl IgG-t tartalmazott, valamint streptavidin-tormaperoxidázt a kapott komplex láthatóvá tétele céljából, kromogénnek pedig AEC (piros) festéket (amyno-ethyl-carbazol) használtunk. A metszeteken a sejtmagok láthatóvá tételét hematoxilinnel végeztük. „Hot-spot” technika A mononukleáris sejtek sűrűségét, valamint az érdenzitás mérését a „hot-spot” technika alkalmazásával végeztük, mely azt jelenti, hogy minden egyes daganatrégióban, a méréseket

a

legsűrűbben

infiltrált

területen

végeztük,

csökkentve

ezzel

a

heterogenitásból adódó hibalehetőségeket. Patológiai vizsgálati elvek A LI-vel kezelt tumorbiopsziás mintákat, valamint a kontroll mintákat először mikroszkopikusan vizsgáltuk a H&E-nal jelölt metszeteken, ahol értékeltük a tumor megjelenési formáját, majd a CD3, CD8, CD1a, CD25 immunjelöléseket végeztük elsődlegesen, a tumorok kis méretére tekintettel. Azokban a kontroll esetekben, valamint a kezelt esetekben, ahol a tumor mérete lehetővé tette a vizsgálatokat, az összes immunhisztokémiai jelölést és analitikai vizsgálatot elvégeztük. A mikroszkóp 40x nagyítású látóterében kiválasztottuk a vizsgálni kívánt területeket, majd általában 100x nagyítás alatt elemeztük a metszeteket. Minden eset szövettani értékelését három független patológus végezte (Lukits J, Döme B, Forster-Horváth Cs), eredmények eltérése esetén minden esetben vizsgálati konszenzust alakítottak ki. A morfometriai

31

méréseket szintén ez a három patológus végezte, anélkül hogy tudomásuk lett volna a vizsgált daganatok anamnéziséről (kezelt vagy kontroll esetek).

Statisztikai feldolgozás A statisztikai analízist ANOVA, chi-négyzet próbával, Kaplan-Meier valamint MantelCox eljárásokkal végeztük.

32

EREDMÉNYEK I. FEJ-NYAKI RÁKOK ÉRDENZITÁSÁNAK JELENTŐSÉGE 1.Gége és hypopharyngealis daganatok erezettségének vizsgálata Vizsgálataink során 21 esetet elemeztünk, melyek szövettani diagnózisa valamennyi esetben laphámrák volt (dedifferenciált vagy ritka formák nem kerültek a csoportba)(I). Tizenegy

tumor

gégerák

volt,

10

eset

a

hypopharynxra

lokalizálódott,

a

stádiumbeosztást a UICC protokoll alapján végeztük. A betegek között a férfiak domináltak. A gégerákok többségét T2 stádiumban diagnosztizálták (6/11eset, 28,57%), a hypopharyngealis esetek többsége T3 és T4 stádiumban volt, fatális kimenetel csak a T4 stádiumban következett be hypopharyngealis daganat esetén. T1 stádiumban 3 eset volt (14,28%), T3 stádiumban 7 beteg (33,33%), T4 stádiumban pedig 5 beteg volt (23,80%). Megdöbbentő volt látni, hogy a hypopharynxtumorokat elsősorban T4 stádiumban diagnosztizálták (4/10), s a betegek többsége a vizsgálati periódus végére meghalt. Nyirokcsomóáttéttel 8 beteg rendelkezett (38,09%), 14 betegnél még nem tapasztaltunk

nyirokcsomó-érintettséget

(66,66%),

hematogén

áttéttel

1

beteg

rendelkezett. Miután a hypoharynxtumorok között a T4 stádiumúak gyakorisága sokkal nagyobb volt, felmerült, hogy a malignusabb viselkedés a T4 stádiumnak és így az egyre nagyobb tumornak köszönhető. A daganatok volumenének meghatározása azonban ezt a feltevést nem erősítette meg, mivel a gégerákok még az alacsony T2 stádiumban is szignifikánsan nagyobb méretűek voltak, mint a T4 stádiumban lévő hypoharynxtumorok (1.ábra) 1. ábra. Gége- és hypopharynxrákok térfogatának összehasonlítása

térfogat (mm3)

5

L2 n=6 H4 n=6

4 3 2 1 0

L2

H4

33

A következőkben megvizsgáltuk, hogy a hypopharyngealis tumorok esetében megfigyelt kisebb tumorméretet okozhatja-e a tumor-indukált angiogenetikus képesség csökkent volta. Az immunhisztokémiai kettős jelölés módszere (CD31 és laminin érmarkerek együttes alkalmazása) nagy biztonsággal azonosította a tumorok körüli ereket (2.ábra) 2. ábra. Peritumorális érhálózat immunhisztokémiai kimutatása gégerákban. Az ereket CD31-gyel (lila szín) mutattuk ki.

1. táblázat. Laryngealis és hypopharyngealis rákok érdenzitása Lokalizáció MVD

Larynx n=11

Hypopharynx T2-larynx n=10 n=6

T4-hypopharynx n=6

211±40

205±20

232±70

178±20

96±9,9

88,4±7,3

N/mm2 átlag ± S.E.M. MVP μm, átlag ± S.E.M. MVD = átlagos peritumorális érdenzitás, MVP = átlagos érterület, T= klinikai stádium

A morfometriai analízis során a peritumorális érdenzitást és az erek kerületét határoztuk meg. Először a két tumorféleség összevont adatait hasonlítottuk össze, ahol nem voltunk tekintettel a tumorok méretére, illetve T stádiumára, s ebben az esetben a két csoport átlagos érdenzitása (MVD) azonosnak bizonyult. A továbbiakban annak kizárására, hogy túlságosan eltérő méretű tumorokat hasonlítunk össze, a legkisebb (T2) glotticus

34

és a legnagyobb (T4) hypopharyngealis tumorcsoportot is összehasonlítottuk, de szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk, bár a T4 hypopharyngealis tumorok érdenzitása alacsonyabb volt a T2 glotticus tumorokénál (1. táblázat). Hasonlóan nem volt eltérés az átlagos érkerületben (MVP) sem. Mérési adataink alapján megállapítható, hogy a glotticus illetve hypopharyngealis tumorok angiogenezist indukáló képessége azonos. A hypopharyngealis rákok esetében összehasonlítottuk a T4 stádiumú nem metasztatikus és nyirokcsomóáttétet képező tumorok érdenzitását is, azonban szignifikáns eltérést itt sem tapasztaltunk. Végezetül arra voltunk kíváncsiak, vajon a legfontosabb érnövekedési faktor expressziójában van-e eltérés a kétféle tumor között. Ebből a célból a szövettani metszetekben a humán VEGF-et mutattuk ki immunhisztokémiai eljárással. Megállapítottuk, hogy a kétféle tumorban gyakorlatilag azonos gyakorisággal fordul elő VEGF+ daganatsejt (40% a laryngealis régióban; 41,66% a hypopharyngealis régióban), és ez nem mutat összefüggést a tumorok stádiumával.

2. Sugárkezelés hatására létrejött érdenzitás-változások jelentőségének vizsgálata Ebben a vizsgálatban 35 szájgaratdaganatos beteg vett részt, mindenkinek szövettanilag igazolt planocellularis karcinómája volt (II). Az anatómiai lokalizáció az alábbi volt: 68,57% tonsilla és garatívek (24 eset), 20% nyelvgyöki régió (7 eset), 8,57% lágyszájpad (3 eset) és 2,82% garatfal (1 eset). TNM klasszifikáció: T1 stádiumban 4 eset (11,42%), T2 stádiumban 14 eset (40%), T3 stádiumban 11 eset (31,42%) és T4 stádiumban 6 eset (17,14%) volt. A medián életkor 51 év (40-73), a nő-férfi arány 2/33 volt. Huszonegy beteg (60%) III., tizennégy pedig a (40%) IV. stádiumba tartozott.

Objektív válasz és túlélés A sugárkezelés befejezése után 8 héttel 14 betegnél (40%) komplett, 10 betegnél (28,6%) részleges remissziót, 4 betegnél (11,4%) változatlan állapotot és 7 betegnél (20%) progressziót észleltünk (II.). A medián követési idő 59 (24-67) hónap volt. 5 évnél 4 (11,5%) beteg volt életben, hárman tünetmentesen, egy beteg pedig izolált lokális recidívával. A becsült medián teljes túlélés 13 hónap (95% CI: 8,1-17,9), a progressziómentes idő 6 hónap volt (95% CI: 4-8).

35

Mikrovaszkuláris denzitás Nem találtunk statisztikailag szignifikáns összefüggést a primer daganatok MVD-a és a fontosabb klinikopatológiai paraméterek között, mint a beteg kora, neme, a betegség stádiuma, a primer tumor nagysága, nyirokcsomóáttétek, hisztológiai grade, mitotikus aktivitás (3.ábra). A távoli áttétek ritka előfordulása miatt a vaszkularizáltság szerepét a disszeminációban nem tudtuk vizsgálni. A medián mikrovaszkuláris denzitás a kezelés előtt 1,09x104/mm2 (S.E.M.: 0,13x104/mm2) volt, mely 20 Gy leadását követően 0,825x104/mm2

(S.E.M.:

0,1x104/mm2)

értékre

csökkent,

mely

különbség

megközelítette a statisztikailag szignifikáns szintet (p=0,052).

MVD score (n / mm2) + S.D.

3. ábra. MVD-értékek és különböző klinikai és patológiai faktorok összevetése

300

200

100

0 Kor 60 év alatt vs felett

Férfi vs nõ

St.III. vs St.-IV.

T1-2 vs 3-4

N- vs N+

Gr 1-2 vs Gr 3

MAI nagyobb vs kisebb m int m edian

Kék= MVD< median, Piros=MVD>median

Klinikopathológiai faktorok, a válasz aránya és a túlélés összefüggései A sugárkezelésre kialakuló objektív választ legerősebben a stádium (p=0,02), a UICC szerinti T (p=0,02) és N stádium (p=0,05) befolyásolták. A besugárzás előtti medián hemoglobin-érték a normális tartományba esett (13,8 g/l, 11,8-14,6), és ennek megfelelően nem befolyásolta a válaszarányt. A mitotikus aktivitás (p=0,38), a grade (p=0,42) és a válasz között sem volt kimutatható összefüggés. Beteganyagunkban sem a stádium (III. vs. IV.), sem a T vagy N (N- vs. N+) nem volt statisztikailag szignifikáns hatással a progressziómentes- vagy a teljes túlélésre. A kiindulási és 20 Gy-nél mért MAI sem mutatott szignifikáns összefüggést a progressziómentes (p=0,17; 0,42) és a teljes túléléssel (p=0,55; 0,17).

36

Kezelés előtt mért MVD, terápiás válasz és túlélés

A statisztikai analízishez a medián alatti és feletti MVD-érték szerint két csoportra osztottuk a betegeket. A számítások szerint nem volt szignifikáns különbség a terápiás válaszban az alacsony, illetve magas kezdeti MVD-értéket mutató daganatok esetében (p=0,21) (4.ábra).

4. ábra. Objektív válaszarány összehasonlítása a sugárkezelés előtti MVD tükrében. MVD= mikrovaszkuláris denzitás, CR= komplett remisszió, PR= részleges remisszió

Betegek százaléka

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 CR

PR

SD

PD

RR

Irradiáció elõtti MVD < medián Irradiáció elõtti MVD > medián

Hasonlóan nem találtunk összefüggést a progressziómentes- (p=0,44) és a teljes túlélés (p=0,33) tekintetében a kezelés előtti MVD-értékek alapján (5. ábra).

37

5.ábra. A progressziómentes (A) és teljes túlélés (B) Kaplan-Meier görbéi, a kezelés előtti MVD alapján

A

1.00

Irradiáció elõtti MVD > median (n=24)

Túlélõ frakció

Irradiáció elõtti MVD < median (n=11) 0.75

p=0,33

0.50

0.25

0.00 0

10

20

30

40

50

60

A sugárkezelés megkezdésétõl eltelt idõ (hónap)

B

Irradiáció elõtti MVD > median (n=24)

1.0

Túlélõ frakció

Irradiáció elõtti MVD < median (n=11) 0.8

p=0,44 0.6 0.4 0.2 0.0 0

10

20

30

40

50

60

70

A sugárkezelés megkezdésétõl eltelt idõ (hónap)

38

Posztirradiációs MVD, a terápiás válasz és a túlélés

A betegeket ez esetben is a medián posztirradiációs MVD alapján osztottuk két csoportba. A terápiás válasz azoknál a betegnél, akiknél a 20 Gy leadását követően mért MVD alacsony volt, szignifikánsan jobbnak bizonyult (p=0,04), mint azoknál, akiknél magas MVD-értéket találtunk (6. ábra). 6.ábra. Objektív válaszarány összehasonlítása a sugárkezelést követő (20 Gy után mért) MVD tükrében. A betegeket az MVD medián értéke alapján osztottuk két csoportra.

*

Betegek százaléka

100 75 50 25 0 CR

PR

SD *: p=0,04

PD

RR

Irradiációt követõ MVD > medián Irradiációt követõ MVD < medián CR= komplett remisszió; PR= részleges remisszió; SD= állandó betegség; PD= progresszív betegség; RR= válaszarány (CR+PR), MVD= mikrovaszkuláris denzitás Az alacsony posztirradiációs MVD és kedvezőbb progressziómentes túlélés között statisztikai trendet találtunk (p=0,053), míg a teljes túlélés szignifikánsan jobbnak bizonyult (p=0,012) ebben az esetben (7. ábra). 7.ábra. A progressziómentes (A) és teljes túlélés (B) Kaplan-Meier görbéi, a sugárkezelést követő (20 Gy-nél mért) MVD értéke alapján. A betegeket két csoportra

39

osztottuk aszerint, hogy a sugárkezelés utáni MVD a medián értéke alatt vagy felett helyezkedett el.

A Irradiációt követõ MVD < median (n=18)

Túlélõ frakció

1.00

Irradiációt követõ MVD > median (n=16)

0.75

p=0,053

0.50 0.25 0.00 0

10

20

30

40

50

60

A sugárkezelés megkezdésétõl eltelt idõ (hónap)

B Irradiációt követõ MVD < median (n=18) Irradiációt követõ MVD > median (n=17)

Túlélõ frakció

1.0 0.8

p=0,012

0.6 0.4 0.2 0.0 0

10

20

30

40

50

60

70

A sugárkezelés megkezdésétõl eltelt idõ (hónap)

40

II.

HORMONRECEPTOROK

EXPRESSZIÓJA

FEJ-NYAKI

DAGANATOKBAN A betegek főbb klinikai jellemzői A vizsgálatban résztvevő betegek száma 67 volt, életkoruk 42-86 év között változott, férfiak és nők aránya 56/11 volt (V). A daganatok szövettani diagnózisa minden esetben laphámrák volt, a többség differenciáltsága grade II (36/67; 53,8%), TNM osztályozás szerint T1: 1,5% (1/67), T2: 29,8% (20/67); T3: 50,7% (34/67),T4: 17,9% (12/67) metasztázis nélküli (N0M0: 64,2%) forma. Az esetek majdnem felében, a daganatok lokalizációja a laryngealis régióban volt (32/67; 47,8%), egyharmad esetben a szájüregben (24/67; 35,8%) a többi pedig a hypopharynxban volt (11/67; 16,4%). Az elemzés megkönnyítése végett az eseteket két csoportra osztottuk: egyik a szájüregi lokalizációjú daganatok csoportja másik a laryngealis/hypopharyngealis régióban elhelyezkedő daganatok csoportja lett (anatómiailag egymás mellett elhelyezkedő régiók). Hormonreceptorok expressziója normális szájüregi- és gégenyálkahártyában Ösztrogén- (ER) és progeszteronreceptor (PGR) kimutatására irányuló próbálkozásaink, paraffinba ágyazott normális szájüregi- és gégenyálkahártyából készült metszeteken, pozitív kontrollként emlődaganatot használva, sikertelenek bizonyultak (V). Emiatt 10 darab

frissen

fagyasztott

immunhisztokémiai

normális

módszerrel

gégenyálkahártya

kimutatni

metszetein

kezdtünk

hormonreceptor-expressziót.

el Az

ösztrogénreceptor-α-t (ERα) sikerült kimutatni a normális laphámsejtek citoplazmájában (8.A. ábra), míg az ösztrogénreceptor-β-t (ERβ) inkább a mirigyhámsejtek citoplazmájában (8.B. ábra). Ezeknek a hormonreceptoroknak a jelenlétét alátámasztottuk nested-PCR analízissel is, ahol kiderült, hogy a 10 vizsgált esetből 7-ben kimutatható a normális szájüregi- és gégenyálkahártya szöveteiből az ERα, ERβ, és PGR mRNS, hasonlóan más tanulmányokban leírtakhoz (143, 205).

41

Hormonreceptorok kimutatása fej-nyaki laphámrákokban Immunhisztokémiával ösztrogén- és progeszteronreceptort nem sikerült kimutatni paraffinba ágyazott fej-nyaki daganatok metszetein, pozitív kontrollként emlődaganatszövetet használva (V). Emiatt frissen fagyasztott daganatok metszetein próbáltuk kimutatni ezeket a receptorokat, monospecifikus receptorellenes antitesteket használva. Pozitív immunhisztokémiai jelölés esetén (>10% reaktivitás) nested-PCR analízíst végeztünk annak érdekében, hogy igazoljuk, hogy valódi hormonreceptort sikerült kimutatni, a reakció autentikus voltát pedig szekvenálással

ellenőriztük. Az

immunhisztokémiai jelölés gyakori magi pozitivitást mutatott ERα esetében, de kismértékben citoplazmatikus pozitivitás is látható volt (8.C. ábra). Az ERβ főleg a citoplazmában volt látható, de néhány esetben magi pozitivitást is észleltünk (8.D. ábra). A PGR körülbelül egyenlő arányban volt kimutatható a sejtmagban és a citoplazmában (8.E. ábra). A tumor körüli stromában nem volt pozitív reakció egyik hormonreceptor esetében sem (8. ábra). A fagyasztott daganatszövetekből izolált mRNS nested PCR vizsgálatával igazoltuk, hogy a daganatok autentikus ERα-t expresszáltak, esetenként a receptor δ3 splice variánsa is megjelent. Az ERβ két izoformáját sikerült azonosítani nPCR segítségével, a wt (vad típus) és δ5 splice variánsát, míg a PGR autentikus formáját találtuk (9.A. ábra). Eredményeinket a PCR termékek szekvenálásával igazoltuk.

A

továbbiakban

vizsgáltuk

két

humán

fej-nyaki

daganatsejtvonal

hormonreceptor-expresszióját (PE/CA-PJ15 és -PJ41), ahol azt találtuk, hogy az ERα expresszálódik mindkét sejtvonalon, anélkül, hogy ERβ és PGR kifejeződne, míg a PJ15 sejtvonal expresszálta az ERα δ3 splice variánsát is (9.B. ábra).

42

A–B C–D E-F

8. ábra. Fej-nyaki daganatok hormonreceptor-fehérje kimutatása immunfluoreszcenciával. A: a normális gégeszövetben citoplazmatikus ERα-expresszió látható piros jelöléssel, sejtmagok kékre festődtek. B: gége mirigyhám ERβ-expressziója. C: ERα nukleáris expressziója; egymásra vetülő kék és piros szignálok láthatók (rózsaszín árnyalat) valamint intenzív citoplazmatikus pozitivitás is. D: ERβ-expresszió fej-nyaki laphámrákban. E: PGR-expresszió fej-nyaki laphámrákokban, intenzív citoplazmatikus jelölés látható. F: negatív kontroll; az immunfluoreszcens jelölés ugyanúgy zajlott, mint az A-E esetekben, csakhogy a primer antitestek hozzáadása elmaradt.

43

A * *

ER α ERβ

PgR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 1516 171819 20

B

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5

ERα

ERβ

PgR

9. ábra. ER és PGR mRNS kimutatása fej-nyaki laphámrákokban és fej-nyaki laphámrák sejtvonalakon. A: Fej-nyaki laphámrákszövet. *-gal jelöltük az autetentikus (vad típusú) sávokat; Δ3 (ERα= 287 bp), Δ5 (ERβ= 269bp). 1: bázispár-marker; 2-20: fej-nyaki daganatminták . B: Humán PE/CA-PJ15 és PJ41 fej-nyaki daganatsejtvonalak. 1: PJ15 sejtvonal; 2: PJ41 sejtvonal; 3: MCF7 (emlődaganat) sejtvonal; 4: OVCAR (ováriumdaganat) sejtvonal; 5: negatív kontroll (víz)

44

Vizsgált

fej-nyaki

daganatos

eseteink

felében

találtunk

ösztrogén-

és

progeszteronreceptor-expressziót (5. táblázat). 5. táblázat. Hormonreceptorok expressziója fej-nyaki daganatokban ER*

PG*

Esetszám

ERα (%)

ERβ (%)

(%)

(%)

67

28/67

19/67

34/67

33/67

41,80%

28,40%

50,70% 49,30%

12/24

8/24

14/24

50,00%

33,30%

58,30% 50,00%

16/43

11/43

20/43

37,20%

25,60%

46,50% 48,80%

Fej-nyaki daganatok Szájüregi daganatok

24

12/24

Laryngealis/ hypoph.

43

daganatok

21/43

* = a receptorpozitivitást immunhisztokémiai módszerrel valamint PCR reakcióval egyaránt kimutattuk

Az ER-expresszió szájüregi daganatokban gyakoribb volt, mint a gége-hypopharynx régióban (58,3% versus 46,5%), a PGR-expresszió viszont körülbelül azonos mértékű volt az említett két régióban (5. táblázat). Szoliter hormonreceptor-expresszió fej-nyaki daganatokban eléggé ritka jelenségnek bizonyult, a laryngealis-hypopharyngealis régióban keletkezett daganatok kis hányadát jellemezte (6/43). A PGR-expressziót az ösztrogén hormon aktivitása szabályozza, ezért az ER és PGR együttes expresszióját a funkcionális ER-expresszió molekuláris jelének tekintjük (80). Ennek a feltételezésnek megfelelően, a funkcionális ER-expresszió eléggé gyakori jelenség volt mind a szájüregi, mind a laryngealis-hypopharyngealis régióban, tehát független volt a daganatok anatomiai lokalizációjától. (27/67; 40,3%).

45

6. táblázat. Fej-nyaki daganatok funkcionális hormonreceptor-státusa Laryng.Receptor-

Szájüregi dag.

hypoph.

Státus

n= 24

HR +

0/24 (0%)

6/43 (13,9%)

6/67 (8,9 %)

FHR +

9/24 (41,7%)

18/43 (41,9%)

27/67 (41,8%)

n= 43

Fej-nyaki dag. n=67

HR+ = csak ER-pozitivitás FHR+ = ERα- és/vagy ERβ-pozitivitás egyidejű PGR-pozitivitással

Fej-nyaki daganatok hormonreceptor-expressziójának prognosztikai jelentősége Sem az ER-, sem a PGR-expresszió jelensége nem befolyásolta jelentősen a betegek túlélését: átlagban 36 hónap túlélési idő volt jellemző a betegek 55-70%-ában. Továbbá, a funkcionális ösztrogénreceptor-expresszió sem befolyásolta a túlélési időt. Mivel a szájüregi daganatos betegek száma ebben a vizsgálatban elég alacsony volt (35,8%), itt eléggé egyenlőtlen volt a receptor-pozitív és -negatív betegek aránya, ezért a laryngealis-hypopharyngealis régió daganatos betegeinek csoportját elemeztük. KaplanMeier analízissel megállapítottuk, hogy ebben a régióban megjelenő ER-expresszió (ERα és ERβ egyaránt) rövidebb túlélést eredményezett, összehasonlítva az ER-negatív esetekkel (p<0,0636,10.A. ábra). Másrészt a PGR-expresszió önmagában nem befolyásolta a laryngealis-hypopharyngealis régió daganatában szenvedő betegek túlélését (10.B. ábra)

46

10. ábra. A laryngo-hypopharyngealis daganatos betegek túlélésének Kaplan-Meier analízise A. Az ER+ betegek túlélése rövidebb az ER- betegek túléléséhez viszonyítva (p<0,0636). B. A PGR+ és PGR- betegek között nincs jelentős eltérés a túlélést illetően (p=0,689)

survival fraction (%)

A

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

ER+ (n=14) ER- (n=19)

0

12

24

36

month

survival fraction (%)

B

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

PgR- (n=16) PgR+(n=17)

0

12

24

36

month

Összehasonlítva az ER+ és ER- eseteket (laryngealis-hypopharyngealis régióban) megállapítottuk, hogy a T3-as és grade 3-as csoportban magas az ER-pozitivitás, míg az N stádium nem volt meghatározó az ER-pozitivitást illetően.

47

III. NEOADJUVÁNS

LEUKOCITA-INTERLEUKIN

KEZELÉS

HATÁSA

SZÁJÜREGI DAGANATOK MIKROKÖRNYEZETÉRE Ebben a vizsgálatban összesen 54 beteg vett részt, 27 beteg alkotta a kontroll csoportot, 27 beteg pedig leukocita-interleukin (Multikine) kezelésben részesült (III). A kontroll csoportban résztvevők daganata minden esetben laphámrák volt, Broder skála szerint (138) meghatározott különböző elszarusodási stádiumban (BR1-BR3). A leukocitainterleukinnel kezelt csoport hasonló összetételű volt a daganat típusát és elszarusodási stádiumát illetően. Ezt egyébként immunhisztokémiai vizsgálattal is ellenőriztük, CK19 és pan-CK markert használva, mindkét csoportban (7. táblázat). A daganatok anatómiai lokalizációja többségben a nyelv területén volt (22/54; 40,74%), ezt követte a lágyszájpad (14/54; 25,92%) és a nyelvgyök területe (9/54; 16,66%), majd ajak (6/54; 11,11%), retromoláris régió (2/54; 3,70%) valamint a szájgarat régiója (1/54; 1,85%). TNM stádiumbeosztásuk az alábbi volt: T1: 2 eset (3,77%), T2: 42 eset (79,24%), T3: 9 eset (16,38%); N0M0: 13 beteg (24,52%), N(1-2-3)M0: 40 beteg (75,47%).

48

7. táblázat. A kontroll csoport betegeinek vizsgálati eredményei Sorszám

Diagnózis

Grade

Stádium

Tumor-

Nekrózis

méret mm

Nekrózis- Nekrózis típus

%

1

SCC

BR3

PT2N0

15 x 8

-

-

2

SCC

BR1

PT2N0

11 x 6

-

-

3

SCC

BR2

PT2N0

22 x 10

+

mező

1,4

4

SCC

BR1

PT2N0

12 x 8

+

mező

8, 3

5

SCC

BR3

PT2N1

12 x 7

-

-

6

SCC

BR3

PT2N0

7x5

+

unicell.

7

SCC

BR2

PT2N0

11 x 9

-

-

8

SCC

BR3

PT2N2

15 x 11

+

mező

9

SCC

BR2

PT2N0

10 x 5

-

-

10

SCC

BR3

PT3N0

22 x 13

+

mező

11

SCC

BR3

PT2N0

10 x 5

-

-

12

SCC

BR3

PT2N0

14 x 10

-

-

13

SCC

BR1

PT2N0

14 x 10

+

mikrofok.

14

SCC

BR1

PT2N0

9x6

-

-

15

SCC

BR1

PT3N0

24 x 12

-

-

16

SCC

BR3

PT2N0

12 x 3

-

-

17

SCC

BR1

PT2N0

18 x 12

+

mező

18

SCC

BR3

PT3N0

20 x 17

-

-

19

SCC

BR1

PT2N0

13 x 8

+

mikrofok.

20

SCC

BR3

PT2N2

13 x 9

-

-

21

SCC

BR3

PT2N0

17 x 10

+

mező

22

SCC

BR3

PT2N0

13 x 8

-

-

23

SCC

BR2

PT2N0

14 x 9

-

-

24

SCC

BR1

PT2N0

10 x 2

-

-

25

SCC

BR3

PT2N0

14 x 4

-

-

26

SCC

BR1

PT2N0

13 x 4

+

unicell.

27

SCC

BR3

PT2N0

14 x 6

+

unicell.

44 2

8, 4

12

SCC=laphámrák; BR=Broder skála szerinti stádium; méret: leghosszabb átmérők, unicell.=csak unicelluláris nekrózis volt látható; mikrofok.=a nekrózis csak mikroszkopikus gócokban látható; mező=a nekrózis nagyobb zónákra kiterjed

49

8. táblázat. Magas dózisú (8000 NE) LI-vel kezelt betegek eredményei

Sorszám

Diagnózis

Grade

Stádium

Tumor-

Nekrózis

méret mm

Nekrózis-

Nekrózis

típus

%

24

SCC

BR3

PT3N0

B

+

unicell.

29

SCC

BR1

PT2N0

10 x 15

+

unicell.

27

SCC

PT2N1

1x1

-

PT3N0

B

26

SCC

31

Dysplasia

BR3

+

unicell.

-

-

30

SCC

BR1

PT3N1

5x6

-

-

21

SCC

BR1

PT2N0

10 x 15

-

-

9. táblázat. Közepes dózisú LI-vel kezelt betegek eredményei Sorszám

Diagnózis

Grade

Stádium

Tumor

Nekrózis

Méret mm

Nekrózis

Nekrózis

típus

%

25

SCC

BR3

PT3N0

15 x 7,5

+

mező

2

20

SCC

BR3

PT2N0

12 x 10

+

mező

10

7

SCC

BR3

PT2N1

B

-

-

13

SCC

BR1

PT2N0

B

-

-

14

SCC

BR2

PT1N0

6x5

-

-

15

SCC

BR2

PT1N0

8x5

+

superfic.

23

SCC

BR3

PT3N2

B

-

-

17

SCC

BR3

PT2N0

9x3

-

-

18

SCC

BR2

PT2N0

15 x 13

+

unicell.

6

SCC

BR3

PT2N1

8x1

+

superfic.

12

SCC

BR2

PT2N0

1 x 36

-

-

22

SCC

BR1

PT3N1

B

-

-

10. táblázat. Alacsony dózisú LI-vel kezelt betegek eredményei Sorszám

Diagnózis

Grade

Stádium

Tumor-

Nekrózis

Nekrózis-

Nekrózis

8

SCC

BR2

PT2N1

típus

%

+

mikrofok.

4

SCC

BR1

PT2N0

9x5

-

-

9

SCC

BR3

PT2N1

3 x 1,5

-

-

3

SCC

BR3

PT2N1

B

-

-

1

SCC

BR3

PT2N2

10 x 9

+

mező

10

2

SCC

BR2

PT2N0

14 x 8

+

superfic.

2

méret mm 4x3

5

SCC

BR2

PT2N0

14 x 3

-

-

11

SCC

BR3

PT2N0

B

-

-

B=biopsziás mintadarab; SCC=laphámrák; BR=Broder skála szerinti stádium; méret=leghosszabb átmérők; superfic.=tumorszél–levegő határon lévő nekrózis; unicell.=csak unicelluláris nekrózis volt látható; mikrofok.=a nekrózis csak mikroszkopikus gócokban látható; mező=a nekrózis nagyobb zónákra is kiterjed

50

A daganatokban előforduló nekrózis valamint a proliferáló sejtek mennyisége A leukocita-interleukin kezelést követően megvizsgáltuk a daganatokban előforduló nekrózis mértékét, valamint a proliferáló sejtek mennyiségét a Ki-67 marker segítségével. Szövettani elemzés során a nekrózis különböző formáit észlelhettük a leukocita-interleukinnel kezelt betegcsoportokban, valamint a kontroll csoportban is (7,8,9,10 táblázatok). A különböző nekrózistípusok jelenléte vagy hiánya egyforma mértékben volt jelen mind a kezelt, mind a kontroll csoportokban, a tumor méretének 1%-ával egyenlő vagy ennél nagyobb kiterjedésű nekrózisa szintén egyforma mértékben volt megfigyelhető a vizsgált esetekben A Ki-67 marker a ciklusban lévő daganatsejteket, valamint stromasejteket jelölte (mononukleáris sejtek, fibroblasztok, endothél sejtek stb.). A daganatok morfometriai analízise kimutatta, hogy a Ki-67-pozitív sejtek gyakorisága jelentősen növekedett a LIvel kezelt csoportokban (11. ábra) (P<0,05), kivéve a legmagasabb dózisú LI-vel kezelt csoportot. 11. ábra. LI hatása a ciklusban lévő sejtekre. A: Ki-67 antigént expresszáló sejtek, immunhisztokémiai jelöléssel. B: Ki-67-pozitív sejtek morfometriai analízise . A stromában és daganatsejt-fészkekben megjelenő Ki-67-pozitív sejtek mennyisége, a három különböző dózisú LI adagolását követően A

51

*

sejtszám/látótér

125

daganatsejt stromasejt

*

100 75 50

*

*

25 0 0

2400

4800

7200

9600

Leukocyte Interleukin Inj. IU

B

Másrészt a ciklusban lévő stromasejtek mennyisége csökkent a növekvő LI dózissal (11.B. ábra), és a hatás szignifikánsnak bizonyult a legalacsonyabb és a legmagasabb dózisú LI-vel-vel kezelt csoportokban (P<0,05). A daganatok mononukleáris sejtes infiltrációjának vizsgálata Mononukleáris sejtes infiltrátumot a daganat két komponensében vizsgáltuk, mégpedig a daganatsejtfészkekben és a daganat stromális részében. Konvencionális H&E-festéssel nem volt különbség a kezelt és kontroll csoport mononukleáris infiltrátumában, mindkét csoportban nagyfokú heterogenitás volt észlelhető; egyes daganatokban sűrű leukocitainfiltrátum, másokban plazmocita-predominancia, vagy limfoid sejtek többsége volt látható. A daganatoknak ilyen jellegű tulajdonsága a mononukleáris infiltrátum részletesebb

vizsgálatát követelte.

A

tumorfészkekben

és

a

tumorstromában

elhelyezkedő makrofágok mennyiségét CD68 marker segítségével állapítottuk meg. Az intraepitheliális makrofág-sűrűség hasonló volt a tumorstromában lévővel. A kontroll csoport intraepitheliális makrofág-denzitása viszonylag magasnak bizonyult, de ugyanilyen mértékű denzitás volt észlelhető némely LI-vel kezelt daganat esetében is. Morfometriai méréseket végeztünk a daganatok három zónájában: 1. zóna – daganatfelszín; 2. zóna – tumor centruma; 3. zóna – tumor-stroma határ; de szignifikáns különbséget a makrofágok vagy a kötőszövet mennyiségére vonatkozóan nem találtunk ezekben a régiókban.

52

A CD34-pozitív hematopoetikus őssejtek jelenléte szájüregi daganatokban Számos tanulmányban közölték, hogy a szájüregi daganatokban észlelhető volt CD34pozitív őssejt a tumorstromában (174, 226). Ebben a tanulmányban 54 paraffinba ágyazott tumor metszeteit vizsgálva nem találtunk CD34+ őssejtet a daganatszigetek között, ami nem annak tulajdonítható, hogy technikailag hibásan dolgoztunk, mert a tumor ereiben lévő CD34+ endothélsejtek minden esetben intenzív reakciót adtak. . Magas dózisú leukocita-interleukin kezelés hatása szájüregi daganatokra Klinikai válasz A két vizsgált csoport (19 kezelt és 20 kontroll daganat) nem különbözött sem szövettanilag, sem a keratinizáció mértékében (melyet CK19 és panCK jelöléssel igazoltunk)(IV). A daganatok anatómiai lokalizációja a következő volt: lágyszájpad: 10 eset (25,64%), nyelv: 20 eset (51,28%), ajak, szájgarat, bucca, gingiva: 9 eset (23,07%). TNM stádiumbeosztásuk: T1: 1 eset (2,70%), T2: 32 eset (86,48%), T3: 4 eset (10,81%); N0M0: 34 eset (91,89%). Két esetben a szövettani metszeteken dysplasia volt. A kezelt 19 eset műtéti anyagából 2 esetben nem sikerült daganatsejtfészket kimutatni a szövettani metszeteken, így ezeket a betegeket komplett válaszadóknak minősítették. Másik két esetben képalkotó eljárásokkal 50%-os csökkenést észleltek a tumortérfogat tekintetében, így ezeket részleges válaszadóknak minősítették. Négy esetben a képalkotó eljárások 30%-os tumorvolumen-csökkenést jeleztek; ezek az esetek gyenge válaszadásnak feleltek meg. Együttesen az objektív válasz a LI-kezelt csoportban 8/19, azaz 42,1%-nak bizonyult. Vizsgálatainkban a két csoportot (válaszadók és nem reagálók) külön is elemeztük. Ciklusban lévő sejtek arányának változásai Az alacsonyabb LI dózisok sejtciklus-hatásai felvetették annak lehetőségét, hogy a klinikailag esetleg hatékony LI dózisok esetében nemkívánatos hatásokkal kell számolni, mivel átmenetileg megemelkedett a Ki-67+ daganatsejtek aránya az alacsonyabb dózisok esetében (11. ábra). Ezért ezt a vizsgálatot megismételtük a magas

53

dózisú LI-kezelt daganatok esetében is. Megfigyeléseink szerint a 12000 NE LI dózissal kezelt szájüregi daganatok esetében a LI nem változtatta meg a ciklusban lévő daganatsejtek arányát és ez a jelenség függetlennek bizonyult attól, hogy a klinikailag válaszadó vagy a rezisztens betegcsoportot vizsgáltuk (12. ábra). Ugyanakkor, a korábbi alacsony dózisoknál tett megfigyelésekkel összhangban a LI kezelés szignifikánsan csökkentette a stromális gazdasejtek proliferációs aktivitását (Ki-67pozitivitását),

a

reaktív

stromát,

függetlenül

a

LI

kezelés

daganatellenes

hatékonyságától. (12. ábra). 12. ábra. Ki-67+ sejtek denzitása magas dózisú LI kezelést követően (12000 NE)

Density of Ki-67+ cells (n/HPF, mean+SEM)

75

CTR Non-resp Resp

50

25

0

cancer cells

stromal cells

Gyulladásos sejtek jelenléte Megállapítottuk, hogy mindkét csoportban (kezelt és kontroll) jelen voltak a gyulladásos sejtek különböző mértékben. Mindkét esetben a neutrofil sejtek jelen voltak úgy a tumorstromában, mint a tumor epitheliális részében, hasonlóan a makrofágokhoz; míg az eozinofil sejtek csak a stromában voltak jelen. A makrofágok és neutrofilek jelenlétét a tumorinfiltrátumban CD68 és mieloperoxidáz enzim markerrel mutattuk ki. A makrofágdenzitás vizsgálatával kimutattuk, hogy a LI kezelést követően a reszponder csoportban jelentősen csökkent a stromális CD68+ sejtek mennyisége (p<0,01

54

ANOVA), és szignifikánsan csökkent intraepithelialisan (p<0,002 ANOVA) (13.ábra). Neutrofilek jelen voltak úgy a tumorstromában, mint intraepithelialisan, a LI kezelés fokozta a stromális denzitást a reszponder csoportban. Fokozott neutrofil-infiltráció a kezelt csoportban, főleg azoknál volt észlelhető, akiknél multifokális mikroszkopikus nekrózis is jelen volt. Az eozinofil sejtek sűrűsége magas heterogenitást mutatott mindkét csoportban. Morfometriás mérések nem mutattak szignifikáns eltérést az eozinofil sejtpopuláció denzitását illetően a tumorstromában a LI kezelés hatására. Alaposabb vizsgálat azonban azt mutatta, hogy a kezelt esetekben kétszer akkora volt a magas eozinofilinfiltráció gyakorisága, mint a kontroll esetekben (47% versus 25%). 13. ábra. CD68+ sejtek denzitása magas dózisú LI kezelést követően

CTR N o n -resp R esp

35

(mean+SEM)

number of cells/HPF

40

30 25 20 15 10 5 0

stro m al

in t r a e p it h e lia l

A LI kezelés szignifikánsan növelte a stromális neutrofil-denzitást, de csak a klinikailag jól reagáló betegcsoportban, viszont mindkét csoportban szignifikánsan fokozta az intraepithelialis inváziójukat (14. ábra).

55

14. ábra Mieloperoxidáz+ sejtek denzitása magas dózisú LI kezelést követően szájüregi rákokban

number of cells/HPF (mean+SEM)

100

CTR Non-resp Resp

75

50

25

0

stromal

intraepithelial

Tumorstroma és daganatsejtfészkek aránya A LI kezelés megváltoztatta a tumor-stroma arányt. Az eltávolított daganatokat szövettanilag Mallory trichrome technika szerint jelöltük, így a daganatsejtek lila festődést mutattak, az epithelialis sejtfészkeket pedig morfometriai szoftver segítségével mértük (Image Pro Analysis) (15.A,B,C. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a LI kezelés jelentős tumor-sejtfészek csökkenését eredményezett a daganatszövetben a kontroll csoporthoz képest (p=0,005, 15.C.ábra). Vizsgáltuk a fibrózis mértékét a daganatban (kollagén stromát). Megállapítottuk, hogy a kontroll csoportban a kollagénrostok periepithelialisan helyezkedtek el a daganatsejtfészkek körül. A periepithelialis kollagenózis mértéke hasonló volt a kezelt és a kontroll csoportokban, míg az intrestitialis intraepithelialis fibrózis mértéke szignifikánsan megemelkedett a kezelt csoportban (15.A,B. ábra, 11. táblázat). A kezelt csoportban 17 esetből 12-ben csökkent a daganatsejtfészkek mennyisége, helyette kollagénrostok voltak láthatók (70%-ban, 15.C. ábra), míg a kontroll csoportban a 20 esetből kettőben (10%) tapasztaltuk a daganat sejtfészkekben a kollagénrostok mennyiségének növekedését (11. táblázat). A kontroll csoportban az esetek 40%-ában (8/20) egyáltalán nem fordult elő fibrózis. A reszponderek és a non-reszponderek csoportjában a stromális fibrózis mértéke megközelítően egyformán fokozódott a kontroll csoporthoz képest (P <0,001), sőt a kezelésre rezisztens csoportban

56

fokozottabb volt ez a reakció nemcsak a kontroll csoporthoz képest (P < 0,001), hanem a válaszadó esetekhez viszonyítva is (72,72%- 8/11 eset, vs. 66,66%- 4/6 eset). 15. ábra. LI kezelés hatása a fej-nyaki daganatok stromájára (morfometria) A. Periepithelialisan elhelyezkedő kollagén stróma B. Interstitialis fibrózis C. Tumorsejtfészek és stróma aránya a kezelt és kontroll csoportban

C

% area of stroma (mean+SEM)

100

75

50

25

0

CTR

Non-resp

Resp

CTR= kezeletlen kontroll, non-resp= nem-reagáló csoport, resp= reagáló csoport

57

11. táblázat. Fibrózis kvalitatív változásai magas dózisú LI kezelést követően. LI-kezelt csoport Fibrózis típusa

kontroll

rezisztens

Válaszadó

Nincs

8/20

0/11

0/6

Periepiteliális

10/20

3/11

4/6

Stromális

2/20

8/11

4/6

Az adatok előfordulási gyakoriságot jelentenek: kontroll: n=20, rezisztens: n=11, válaszadó: n=8. Non-reszponderek vs. kontroll: p<0.001, reszponderek vs. kontroll: p<0.05, nonreszponderek + reszponderek vs. kontroll: p<0.001 (χ2 test)

58

MEGBESZÉLÉS 1) Gége- és hypopharyngealis rákok erezettsége A malignus daganatok kialakulásában és progressziójában az angiogenezis esszenciális szerepet tölt be, egyre több vizsgálati eredmény szól arról, hogy az érdenzitást (MVD) a neo-angiogenezis indirekt markerének tekinthetjük (115). Az angiogenezis gátlása, azáltal, hogy az angiogén citokineket vagy azok hatásmechanizmusát gátoljuk, az experimentális daganatterápia egyik fő célpontjává vált (134). A tudomány fejlődésével a kimutatott angiogenikus faktorok száma is megnövekedett, egy évtizeddel ezelőtt az érdenzitást a VIII-as faktor segítségével mérték (20, 36, 97, 105, 199, 228), majd később más markerek segítségével végezték mint, a CD31+ (1, 52, 69, 99), VEGF különböző formái (18, 132, 160, 170, 195, 197), thymidine phosphorylase (TP) (91, 92), CD34+ (23, 37, 41, 148, 164, 165, 179), CD105+ sejtek (114). Ezeket a markereket önállóan vagy egymással kombinálva is alkalmazzák a jobb és precízebb eredmény elérése érdekében (71, 147, 165). Számos markert vizsgáltak korábban a gégerákok esetében, melyek a sejtproliferációval, illetve annak szabályozásával állnak kapcsolatban. Gégerákokban a tumorprogresszió a proliferációs markerek -Ki67, MIB-1, PCNA- (27, 95, 100) expressziójával mutatott összefüggést. Napjainkig nagyszámú közlemény jelent meg például a mátrix metalloproteinázok

overexpressziójáról

fej-nyaki

daganatokban,

a

daganat

növekedésében és progressziójában betöltött szerepéről. Franchi és mtsai vizsgálatának eredményei szerint az MMP9-t expresszáló fej-nyaki daganatok erezettsége fokozottabb volt, a p53 mutáció is társult ehhez, míg az MMP1 és MMP2 expressziója nem mutatott összefüggést az erezettséggel és a p53 mutáció megjelenésével (52). Riedel és társai közleményében szintén azt találták, hogy az MMP9-t expresszáló fej-nyaki daganatok erezettsége fokozottabb, szoros korreláció van az MMP9 expresszió és a VEGF expresszió valamint a rosszabb prognózis között (199). Természetesen találunk olyan közleményt is, amelyből az derül ki, hogy az MMP9 expressziónak semmiféle kapcsolata nincs a fej-nyaki daganatok erezettségével, sem a klinikopathológiai paraméterekkel (18). A különböző onkogének és onkoszupresszor gének közül csak az EGF-receptor expressziójának szintje mutatott összefüggést a gégerákok progressziójával (216, 229), a p53-és az mdm2 expresszió nem (1, 71, 100). Viszont a tumor szupresszor p53 gén és

59

angiogenezis kapcsolatát vizsgáló tanulmányból az derül ki, hogy a p53 mutáció és VEGF expresszió mértéke között szignifikáns összefüggés van (160). Egy másik tanulmányban pedig kimutatták, hogy pozítiv összefüggés van a p53 és a VEGF expresszió között (23). A VEGF pozítivitás sokkal fokozottabb volt a cervikális nyirokcsomó metasztázissal társuló daganatokban, mint a nyirokcsomó negatív daganatokban. Az nm23 fehérje expresszió és VEGF expresszió között nincs összefüggés, az érdenzitást intenzívebbnek találták az nm23 negatív és VEGF pozítiv tumorokban. Bár a larynx és hypopharynx daganatainak eltérő biológiai viselkedése régóta ismert, igen kevés összehasonlító tanulmány kísérelte meg feltárni ennek biológiai alapjait. A hypopharynxban előforduló daganatok biológiai sajátosságaival foglalkozó tanulmányt csak elvétve lehet találni az irodalomban, a kutatók általában a laryngeális

daganatok

biológiai

sajátosságaiból

próbálnak

következtetni,

és

magyarázatot találni a fej-nyaki daganatok sajátos viselkedésére. Egy hypopharynx daganatokban expresszálodó markereket és érdenzitást vizsgáló tanulmányból (33) az derül ki, hogy az érdenzitás szignifikánsan különböző a T1-T2 stádiumú daganatokban és a T3-T4 stádiumú daganatokban, a PDGF és VEGF expresszió valamint az érdenzitás mértéke is szorosan korrelációban volt: a VEGF és MVD-nek együttesen prognosztikai jelentősége volt, a PDGF expresszió a nyirokcsomó áttéttel rendelkező betegekben magasabb volt, az MVD mértéke viszont a nyirokcsomó áttéttel nem rendelkező daganatokban volt magasabb. Eltérő malignitású daganatok esetében elsőként mindig a proliferáció illetve a tumorméret összehasonlítása történik meg. Vizsgálataink arra az eredményre jutottak, hogy a hypopharyngeális tumorok még a T4 stádiumban is szignifikánsan kisebbek, mint a sokkal alacsonyabb stádiumban (T2) lévő glotticus tumorok. Ez arra utal, hogy a kétféle lokalizációban lévő hasonló szövettani szerkezetű daganatféleség eltérő biológiai viselkedését nem lehet a hypopharyngeális tumorok fokozottabb növekedésével magyarázni. Tulajdonképpen ennek éppen az ellenkezőjét lehet feltételezni; a lassúbb növekedést. Ennek hátterében számos tényező tételezhető fel, ezek között a csökkent proliferáló képesség illetve a csökkent angiogenetikus képesség szerepelhetnek, azonban ezekre nézve nem állnak még rendelkezésünkre irodalmi adatok. Jelen vizsgálataink a kisszámú eset alapján is felvetik azt, hogy a sokkal invazívabb hypopharingealis rákok ugyanolyan angiogenetikus képességgel rendelkeznek, mint a glotticus tumorok, tehát ez a tényező nem tehető felelőssé

60

metasztatikus fenotípusukért. Érdekes azonban ebből a szempontból, hogy a sokkal nagyobb glotticus és a kisméretű hypopharynx tumorok esetében az érdenzitás azonosnak bizonyult, ami arra utalhat, hogy a nagyobb glotticus tumorokban talán még aktívabb is az angiogenezis. Vizsgálataink során összehasonlítottuk a nyirokcsomóba áttétet képező és azt nem adó T4 stádiumú hypopharynx tumorok angiogenetikus sajátosságait is, mivel irodalmi adatok alapján fej-nyaki rákokban kapcsolat mutatható ki a regionális nyirokcsomó-áttétek kialakulása és a primer tumor angiogenezise között (23, 105, 147, 164, 166, 170, 179, 192). Ezeket a megfigyeléseinket tovább erősítették azok az adataink, hogy a két tumorban azonos gyakorisággal fordulnak elő a fő angiogenezist indukáló faktort (VEGF) termelő daganatok és ez a sajátosság nem függ a tumorok aktuális stádiumától. Mindezek alapján megállapíthatjuk, hogy nem áll fenn kapcsolat a kétféle tumor angiogenetikus képessége és progressziós-invazív készsége között, tehát a tumorok invazív-metasztatikus fenotípusa felelős a fokozott malignitásért. Vizsgálataink arra is felhívják a figyelmet, hogy bizonyos daganattípusok esetében

a

proliferációs

invazív/metasztatikus

sajátosságok

sajátosságokkal,

nem

mivel

a

hozhatók

összefüggésbe

hypopharynx

tumorokban

az az

invazív/metasztatikus képesség a gégerákokhoz képest jóval kisebb tumorméret mellett már megjelenik. Ennek fényében valószínüleg át kell gondolni az alkalmazandó terápiás stratégiát, amely hatékony gégerákok esetében, de sokkal kevésbé sikeres a relatíve lassubb növekedésű de invazívabb hypopharynx tumorok esetében. 2) Az érdenzitás prediktív/prognosztikus szerepe a sugárterápiás érzékenység szempontjából A daganatok növekedésének elengedhetetlen feltétele érellátásuk (50, 51). Ennek megfelelően a vaszkularizáltságot számos daganatféleségben prognosztikai tényezőként tartják számon (214). Kimutatták, hogy az MVD összefüggést mutathat a daganat kiterjedésével, a terápiás válasszal, vagy a túléléssel (21, 73, 152, 153, 161, 202). Mindamellett a vaszkuláris denzitás az idő folyamán változhat is. A daganatok gyors fejlődésével párhuzamosan az elmaradó érújdonképződés miatt mintegy „felhígulva” az MVD csökkenhet, de a daganat angiogenetikus fenotípusa is megváltozhat és ez is a vaszkularitás változásához vezethet. Továbbá, a különböző kezelések hatására is jelentősen változhat a daganatok érellátása. Ezeknek a hatásoknak prognosztikai, vagy

61

prediktív jelentősége is lehet. Tanulmányunkban szájgaratrákos betegek daganatának MVD-értékeit vizsgáltuk a sugárkezelés előtt és megkezdése után (20 Gy-nél, két hét kezelés után). Azt találtuk, hogy a kiindulási MVD és a daganat prognózisa között nincs kapcsolat. A kezelés előtti MVD és a fej-nyaki daganatok progressziója közötti összefüggés megítélése ellentmondásos az irodalomban. Gasparini (59) egyenes összefüggést talált a kezelés előtti MVD és a fej-nyaki daganatok nyirokcsomó- és távoli áttétei között, míg Ravi (155), Dray (36) és Gleich (63) nem talált semmilyen kapcsolatot. Ugyanakkor a vaszkularizáció esetleg számos mechanizmus révén befolyásolhatja a terápiás választ és túlélést. Lehetséges, hogy a gazdagon vaszkularizált daganatok jobban oxigenizáltak, a kemoterápiás szerek is jobban eljutnak a daganatsejtekig, tehát jobban reagálnak a kezelésekre. Ezzel szemben elképzelhető, hogy

a

dús

érhálózat

miatt

könnyebben

disszeminálódnak,

ami

jelentősen

befolyásolhatja a prognózist. Ez az ellentmondás jól tükröződik a szakirodalomban is. Egyes szerzők nem találtak összefüggést az MVD, a terápiás válasz és a túlélés között (36, 59, 63, 71, 228). Mások kimutatták, hogy a magas MVD kedvezőbb válaszaránnyal és túléléssel jár (59, 78, 155), megint mások ennek pont az ellenkezőjét találták (148). Giatromanolaki és munkatársai pedig arra a következtetésre jutottak, hogy sem a magas, sem az alacsony, hanem az intermedier MVD-érték a jó prognózis jele (87). Ezeknek az adatoknak alapján ki lehet jelenteni, hogy a fej-nyaki daganatok kezelés előtti mikrovaszkuláris denzitásának prognosztikai értéke legnagyobb jóindulattal is bizonytalan. Nemrég Kaanders azt javasolta, hogy az MVD-vel szemben a teljes tumor vaszkuláris denzitása (VD) hatékonyabb prediktív faktor, de tanulmányukban csak a loko-regionális kontrollal találtak összefüggést, a túléléssel nem (81). A besugárzás erekre gyakorolt és anti-angiogén hatását már számos kísérleti modellben vizsgálták (81, 83, 177, 178, 213). Nemrég Garcia-Barros arról számolt be egy in vivo preklinikai modell kapcsán, hogy a bélhámsejtek sugárterápiára adott válaszát elsősorban nem a klonogén sejtek pusztulása, hanem az endothelsejtek apoptózisa alakítja ki (57). Vizsgálatunkban mi is a besugárzás vaszkularitásra gyakorolt hatását vizsgáltuk klinikai körülmények között. Azt találtuk, hogy a sugárkezelés hatására a kezelés korai szakaszában (20 Gy után) létrejött alacsony MVD szignifikáns összefüggést mutat a kedvezőbb terápiás válasszal és a túléléssel is. Eredményeinket támogatja Kourkourakis korábbi megfigyelése, mely szerint azon daganatok prognózisa rosszabb, melyek a

62

kezelések során megőrzik angiogenetikus potenciáljukat (91). A különféle kezelésekre létrejött MVD-változásokról már közöltek megfigyeléseket, mint például tamoxifennel kezelt méhnyakrákok, illetve kemoterápiás kezeléssel ellátott fej-nyaki daganatok esetében (37, 45). Eredményeink jelentősége abban rejlik, hogy klinikai körülmények között, prospektív tanulmány keretében tudtuk alátámasztani, hogy a besugárzás endothelsejtek elleni hatásának komoly szerepe lehet a daganatellenes sugárhatás létrejöttében fej-nyaki daganatok esetében. További fontos eredmény, hogy a kezelés korai szakaszában kimutatható, hogy melyek azok a daganatok, melyek nem reagálnak kellőképpen a besugárzásra, így ezekben az esetekben nagyobb sikerrel kecsegetető, aktívabb kezelési formát lehet választani és ezzel a terápiás eredmények javíthatóak. Ennek bizonyítására további, nagyobb beteganyagot felölelő vizsgálatok elvégzésre van szükség.

3.) Hormonreceptorok expressziója fej-nyaki daganatokban A szexhormonok szerepe fej-nyaki daganatokban hosszú idő óta vitatott téma. Számos kutatócsoport figyelt fel arra a tényre, hogy „hormon-independens” szövetekben hormonreceptorok expresszálódnak (90), és próbáltak választ találni arra, hogy miért férfiakban gyakoribb a fej-nyaki daganatok előfordulása, milyen hormonális mechanizmusok játszhatnak szerepet a karcinogenezisben, és melyek azok a mechanizmusok, amelyek nőknél „védelmet” biztosítanak a daganatok kialakulása ellen (85). A legrégebbi közlemény, melyben igazolták ösztrogénreceptor jelenlétét fej-nyaki daganatokban, valamint a fej-nyaki régió normális szöveteiben, 1981-ben jelent meg (124). Molteni és munkatársai ösztradiol-kötő fehérjét mértek 42 fej-nyaki daganatban és normális szövetben. Pár évvel későbbi közleményben, melyben különféle fej-nyaki daganatsejtvonalakon vizsgálták a szexhormonreceptorok jelenlétét (210) szintén pozitív eredményeket találtak; 10 laryngealis régióból származó laphámcarcinomás sejtvonalból 7-ben találtak ösztrogénreceptor-expressziót (70%), 8-ban progeszteronreceptorexpressziót (80%), és egy sejtvonalon, mely egy laryngealis rekurrens daganatból származott, találtak androgénreceptort. Ugyanebben az évben Shuller és társai közleményéből az derül ki, hogy fej-nyaki daganatok 89,3%-a nem expresszál ösztrogénreceptort, 78%-a pedig progeszteronreceptort sem (176), bár azért 2,7%-ban ők is találtak ER-t. Egy orosz munkacsoport kísérletében, ahol metilkolantrénnal kezelt

63

állatokban laryngealis daganat keletkezését idézték elő, azt állapították meg, hogy a citoplazmatikus

fehérjék

androgénkötő

kapacitása

növekedik,

prekancerózus

stádiumban lévő állatokra pedig relatív hiperandrogénizmus jellemző (4). Ugyanebben az évben egy német kutatócsoport közölt egy tanulmányt (82), melyben 25 férfi és 25 női laryngealis daganatos beteg vett részt, és azt találták, hogy a daganatos betegek szérumában sokkal magasabb a tesztoszteronszint, mint a kontroll csoportban, a hiperpláziás (prekancerózus) stádiumban lévő betegek szérumában a tesztoszteronszint nem volt szignifikánsan magasabb a normális (kontroll) csoport értékeinél. A következő évben egy szintén német kutatócsoport közlölte, hogy ők nem találtak összefüggést a hormonális státus és a laryngealis daganatok patogenezise között (31), eredményeiket 43 beteg hormonmetabolizmusának vizsgálatával támasztották alá, melyből 20 betegnek laryngealis daganata volt (laphámrák), 23 betegnek pedig laryngealis benignus elváltozása. Úgy tűnik, a kutatócsoportokat továbbra is a laryngealis daganatok hormonális státusa foglalkoztatja. Virolainen és társai szintén androgénreceptor jelenlétét vizsgálják laryngealis daganatokban (209), egyenlő számú férfi és női pácienst bevonva,

eredményeik

androgénreceptorokat

pedig:

úgy

férfi,

31%-ban

sikerült

mint

esetekben,

női

kimutatni

specifikus

emelett

kimutattak

ösztrogénreceptort 69%-ban és progeszteronreceptort 53%-ban. Ösztrogén- és progeszteronreceptorokat

expresszáló

laryngealis

rákos

sejtvonalakon

végzett

kísérletekből az derül ki, hogy a tamoxifen gátolni tudja a laphámdaganatok növekedését, bár jóval nagyobb koncentráció szükséges ehhez, mint például emlődaganat-sejtvonal

esetében

(74),

ha

pedig

megvonták

a

tamoxifent,

a

laphámdaganat-sejtek újra visszanyerték növekedési képességüket, mely egyforma mértékűnek bizonyult ösztradiolos és ösztradiolmentes közegben egyaránt (182). Egy későbbi tanulmány, mely a tamoxifen és ösztradiol hatását hasonlítja össze laryngealis daganatsejtvonalakon megerősítette a tamoxifen gátló hatását a daganatsejtek osztódására, az ösztradiolnak pedig növekedésserkentő hatását tapasztalták (162). Az androgén hormonreceptorok jelenléte és pontos lokalizációja laryngealis daganatokban valamint normális laryngealis nyálkahártyában más munkacsoportokat is foglalkoztat, Marugo és társai (117) kimutattak androgénreceptorokat a sejtmagban és citoszolban, majd felvetik a hormonterápia alkalmazását, mint alternatív vagy kiegészítő terápiát ezekben az esetekben. Reiner és társai (117) szintén kimutattak androgén- és

64

ösztrogénreceptorokat laryngealis daganatok citoplazmájában, más módszert alkalmazva ők is arra a következtetésre jutottak, hogy a laryngealis daganatok egy része hormondependens lehet, így alkalmazható lenne az antiandrogén hormonterápia ezekben az esetekben. Egy kínai kutatócsoport kimutatta, hogy a laryngealis daganatok 48%-a expresszál ER-t, 68%-a pedig PGR-t, emelett megfigyelték, hogy összefüggés van a hormonreceptor-expresszió és a daganat differenciáltsági foka között, miszerint a kevésbé differenciált daganatok alacsony hormonreceptor-szinttel jellemezhetők (102). Hasonló eredményről számolt be egy olasz kutatócsoport is hormonreceptor-expressziót illetően (158), csakhogy ők nem találtak összefüggést a daganat mérete, kiterjedése, metasztázisképzése, grade-je, valamint a hormonreceptor-expresszió szintje között. A laryngealis daganatok hormonreceptor-expressziójának és a daganatmentes túlélési időszak hosszának összefüggését vizsgáló tanulmányban arra a következtetésre jutott a kutatócsoport, hogy az ösztradiolreceptor-pozitív valamint progeszteronreceptor-negatív daganatos betegek tumormentes periódusa hosszabb volt (17), mint a többi betegé. A szexhormonreceptorok kimutatását a legtöbben radioimmunoassay technikával végezték fej-nyaki daganatokban (43, 112, 140, 157). Az első utalás arra, hogy sejtmagban expresszálódó hormonreceptor mutatható ki laryngealis daganatban több mint 15 éve jelent meg egy közleményben (43); ezt az állítást immunoblotting módszer alkalmazásával támasztották alá (113), de molekuláris szinten való ellenőrzését ezeknek az eredményeknek nem végezték el. Munkacsoportunknak sikerült elsőként kimutatni azt, hogy fej-nyaki daganatok kb. 50%-a expresszál autentikus ösztrogénreceptorokat (α és β izoformát) valamint progeszteronreceptort, és ezt mRNS-szinten is igazoltuk, valamint szekvenálással is megerősítettünk. Vizsgálatainkkal kimutattuk az ERα és β több formáját: vad típust (wt) és splice variánsokat: δ3 és δ5-t (72), ugyanakkor kimutattuk azt is, hogy a szexhormonreceptorok a daganatsejtekre lokalizáltak, a stromasejtekben nem találtunk hormonreceptorokat. Meg kell jegyeznünk, hogy fejnyaki daganatokat alacsony szintű hormonreceptor-expresszió (protein és mRNS) jellemzi, ezért molekuláris szinten történő kimutatásukhoz nested-PCR technikát alkalmaztunk, az immunhisztokémiai jelöléseket pedig csak fagyasztott szövetek metszetein tudtuk elvégezni. Szoliter

szexhormonreceptor-expresszió

fej-nyaki

daganatokban

eléggé

ritka

jelenségnek bizonyult, a pozitív esetek többségében az ER-expresszió PGR-

65

expresszióval társult (41,8%), ERα + PGR-expresszió volt a gyakoribb fenotípus, ezt követte az ERα/β + PGR-expresszió. Vizsgálatunknak ez a megfigyelés jelentős eredménye volt, hiszen az ösztrogénreceptorok koexpressziója progeszteronreceptorral indirekt jele a funkcionális ösztrogénreceptor jelenlétének (80, 143). Eredményeink szerint a fej-nyaki daganatok több mint 40%-a funkcionális ösztrogénreceptort expresszál, és az anatómiai lokalizáció – a fej-nyaki régión belül – nem befolyásolja ezt a fenotípust. Az anatómiai lokalizáció és a hormonreceptor-expresszióval kapcsolatosan létezik egy korábbi közlemény, mely szerint a legmagasabb ösztrogén- és progeszteronreceptor-expresszió a larynx vestibularis régiójában és az epiglottis petiolusa területén van, de ez a tanulmány is kisszámú beteget vizsgál (16 férfi és 2 nő), valamint nem részletezi, hogy a hormonreceptorok külön-külön és együttesen milyen mennyiségben fejeződnek ki (145). Humán fej-nyaki daganatsejt-tenyészeten végzett vizsgálataink alátámasztják ezeket az eredményeket, hiszen itt is kimutatható volt az ER és PGR expresszió in vitro, hasonlóan más tanulmányokban közöltekkel (46, 66). Szintén korábbi közleményekben leírtakhoz hasonlóan kimutattuk, hogy azok a humán fej-nyaki laphámrákos sejtvonalak, melyek autentikus ösztrogénreceptort expresszálnak, mitotikus aktivitást mutattak a ligand jelenlétében (46, 66, 190). Próbáltunk választ keresni arra a kérdésre, hogy mi lehet a jelentősége a funkcionális ösztrogénreceptor jelenlétének fej-nyaki daganatokban. Leggyakrabban ez a típusú daganat férfi alkoholista páciensekben alakul ki, akiknél alkoholos májkárosodás komplikációival együtt, jellemző kísérő betegség. A májfunkció romlása együtt jár a metabolikus

folyamatok

károsodásával,

így

természetesen

a

szexhormonok

metabolizmusának károsodásával is (tesztoszteron és ösztrogén) (157, 225). Nagyszámú fej-nyaki daganatos beteg széles körű vizsgálata, melyben összehasonlításra került alkoholista betegcsoport valamint kontroll – nem alkoholista – betegcsoport, azt mutatta, hogy ezeknek a betegeknek emelkedett az FSH és LH szintjük, az alkoholista betegcsoportban pedig emelkedett ösztrogénszint és csökkent tesztoszteronszint található (157, 225). Ugyanebben a betegcsoportban az emelkedett FSH szint csökkent tesztoszteronszinttel együttesen csökkent túlélési aránnyal párosult (157). Más közleményben (85), ahol az ösztrogén feedback mechanizmust vizsgálták férfiakban és nőkben (a perifériás ösztrogénszint szabályozza a hipofizisben termelődő FSH és LH mennyiségét) azt találták, hogy nőkre tipikusan pozitív ösztrogén feedback, a férfiakra

66

negatív ösztrogén feedback jellemző normális körülmányek között. Laryngealis daganatos nőknél negatív ösztrogén feedback mechanizmust találtak, csak sajnos kisszámú betegen végezték ezeket a vizsgálatokat. Nyelvcarcinomás betegeket vizsgáló tanulmányban emelkedett prolaktinszintet találtak, amely szintén csökkent túlélési aránnyal párosult, és még érdekesebb tényezőként említjük, hogy molekuláris technikával prolaktinreceptort is kimutattak (14). A PGR expresszióra vonatkozóan közöltek olyan tanulmányt, mely szerint összefüggés van a cathepsin D és a PGR expressziója között (110, 113). Szignifikánsan magasabb (p<0,001) cathepsin D expresszió volt megfigyelhető azokban a gégedaganatokban, melyek PGR pozitívak, mint azokban, melyek PGR negatívak voltak, de olyan tanulmány is megjelent, melynek eredménye szerint nincs a

kliniko-patológiai paramétereknek összefüggése a

szteroidhormonstátusszal vagy az EGFR státusával. A cathepsin D jelenlétére laryngealis daganatokban nem találtak magyarázatot (47), utóbbiról pedig kiderült később, hogy fontos szerepet játszik a fej-nyaki daganatok progressziójában. Előfordulhat, hogy az ösztrogénreceptort nem az ösztrogén aktiválja, hanem – a jelátvivő utak közötti kapcsolat (cross-talk) révén – más növekedési faktor, tehát az ER nem a normális szabályozás keretében válik aktívvá. (173). Ma már köztudott, hogy az EGFR expresszió és az ER expresszió között kapcsolat van (220). Scambia és társai kimutatták,

hogy

gégedaganatok

esetében

az

EGFR

expresszió

fokozott

a

tumorsejtekben, bár ők nem találtak összefüggést a szteroidhormon-receptorstátus és patológiai paraméterek között (171), hasonlóan a Wilson és társai által közölt eredményekhez (221). Mára már evidencia, hogy a fej-nyaki daganatok egyik molekuláris markere az EGFR expresszió (163), feltételezhetjük tehát, hogy az EGFR konstitutív expressziója kontrollálhatja az ER és/vagy PGR expressziót (108). Nagyobb betegszámú – több mint 100 larynxdaganatos beteget vizsgáló – tanulmányban kimutatták, hogy szteroid hormonok jelen vannak a sejtmagban, valamint a citoszolban, sikerült azonosítaniuk az ösztrogénreceptort és annak izoformáit, a cathepsin D, EGFR és ER-D5 mellett (159), és bár látszólag nincs semmiféle összefüggés a különféle hormonreceptorok expressziója és a daganatok metasztatizáló tendenciája között, a hormonreceptorok jelenléte arra ösztönöz, hogy ezt rutinszerűen határozzuk meg (111). Az ER expresszió funkcionális jelentőségét mutatta az az in vitro kísérlet, amikor antiösztrogén hatású tamoxifen ER pozitív fej-nyaki daganat sejtvonalon gátolta a

67

sejtproliferációt és apoptózist indukált (46, 66). Másrészt olyan kísérletet is bemutattak, mely eredménye laryngealis daganat növekedése volt ösztradiol adagolás után, SCID egerekben (190). Munkacsoportunk vizsgálati eredményei, melyek a fej-nyaki daganatok progressziója valamint az ER expresszió kapcsolatára vonatkoznak, alátámasztják a fenti kísérletek eredményeit. Laryngealis-hypopharyngealis régió daganatos betegeinek túlélése, akiknél ösztrogénreceptor-pozitivitást mutattunk ki, rövidebb volt, mint az ösztrogénreceptor-negatív betegeké, bár a különbség nem volt statisztikailag elég erősen szignifikáns (p=0,0636). Ezek az adatok mégis arra utalnak, hogy az ER expresszió vagy ösztrogén által aktivált ER progressziót fokozó faktorként működhet. Mindenképpen további vizsgálatok szükségesek, nagyobb számú páciens bevonásával, az eddigi adatok igazolására, valamint arra is, hogy megállapítsuk, hogy az ER szerepe ugyanaz-e szájüregi daganatok, mint laryngealis-hypopharyngealis daganatok esetén. Munkacsoportunk vizsgálata viszonylag kisszámú betegen történt, így az ER+, és ER- betegek számának egyenlőtlensége miatt pontos következtetéseket nem vonhattunk le. Továbbá, az ER gyakori expressziója, főleg ha PGR-rel együtt történik, azt sugallja, hogy antiösztrogén terápia, ER vagy aromatázinhibitorokok alkalmazása fej-nyaki daganatok esetén egy újabb terápiás lehetőség lenne ezeknek a pácienseknek.

4) Leukocita-interleukin kezelés hatása szájüregi daganatok mikrokörnyezetére Munkacsoportunk vizsgálatából, melyben 27 szájüregi daganatos beteget kezeltek az immunmodulátor leukocita-interleukinnel, kiderült, hogy a szájüregi laphámrákok immunogén daganatok, a LI kezelés limfocita-infiltráció fokozódását okozta a daganatokban (III.). Hasonlóan más tumortípushoz, a mononukleáris infiltrátum összetétele jelentős egyedi variabilitást mutatott a különböző betegektől származó mintákon, ami arra utal, hogy meg kell határozni pontosan, hogy a mononukleáris infiltrátum mely komponensei (T-sejtek, dendritikus sejtek, makrofágok) játszanak fontos szerepet a betegség prognózisában vagy terápiás válasz kialakulásában. Ebből a vizsgálatból kiderült, hogy a LI kezelésnek specifikus hatása van a szájüregi daganatok mononukleáris infiltrátumára. A normális peritumorális epithéliumban volt a legmagasabb dendritikus sejt-sűrűség mindkét vizsgált csoportban. Ez a megállapítás arra enged következtetni, hogy a szájüregi daganatok olyan faktort (faktorokat) expresszálhatnak, melyek gátolják közvetlenül az antigénprezentáló sejtek aktivitását a

68

tumor felszínén. Ezt a megállapítást – a dendritikus sejtek eloszlására vonatkozóan a tumorban és a tumor körüli stromában – melanoma malignum esetében is megfigyelte munkacsoportunk (nem közölt adatok). Véleményünk szerint valószínűleg ez egy általánosan zajló jelenség része inkább, mint a specifikus kezelés eredménye, a LI alkalmazása a három különböző dózisban nem volt összefüggésbe hozható a dendritikus sejtek eloszlásával. A LI injekciós kezelés a legalacsonyabb dózisban alkalmazva (400 NE/nap) a limfoid sejtek szignifikáns felszaporodását okozta a daganatsejtfészkekben, anélkül, hogy látható hatása lett volna a stromális denzitásra. Továbbá, ez az alacsony dózisú

terápia

szignifikánsan

növelte

a

CD25+

limfoid

sejtek

sűrűségét

intraepitheliálisan és a tumorstromában egyaránt. Hasonló eredményeket közölt korábban egy angol kutatócsoport fej-nyaki laphámrákok IL-2 kezelését követően (50). A limfoid sejtek B-sejt populációjának vizsgálata azt mutatta, hogy ezeket a sejteket nem

befolyásolta

a

LI

kezelés,

és

nem

voltak

egyáltalán

kimutathatóak

intraepitheliálisan. A T-sejtek elemzése sem vezetett jelentős következtetésekre ebben a vizsgálatban, bár a LI kezelést követően a CD3+ és CD8+ T-sejtek száma csökkenő tendenciát

mutatott

a

tumorstromában

és

szignifikáns

sűrűségnövekedést

intraepitheliálisan. Ez a jelenség arra utal, hogy lehetséges, hogy a LI kezelés a CD4+ T-sejtek mennyiségét befolyásolhatja (amit a következő magas dózisú fázis II vizsgálatban kitüntetetten elemeztünk). A LI kezelésnek látszólag nincs hatása a szájüregi daganatok bizonyos jellemzőire, mint pl. a citokeratin-expresszióra és a Broder szerinti grade-re (138), továbbá nem volt változás a tumor-stroma arányban alacsony dózisú LI kezelést követően, sem a nekrózis előfordulásában (mikroszkopikus, makroszkopikus formák között) a daganatsejtfészkekben. Erre kétféle magyarázat lehetséges: az egyik az, hogy az alacsony dózisú LI kezelésnek semmiféle hatása nincs a szájüregi daganatokra, a másik, hogy a kezelés végén (3-4 hét) a változások már megkülönbözhetetlenek a nem kezelt csoporthoz hasonlítva. A kérdés megválaszolására a magasabb dózissal folytatott kezelés eredményei alkalmasak. A vizsgálat egyik legérdekesebb eredménye az volt, hogy az alacsony dózisú LI kezelés nagyszámú nyugvó daganatsejtet léptetett vissza a sejtciklus körfolyamatába, ezt a Ki67 marker által jelölt sejteken tudtuk mérni, hasonlóan más közleményekben leírtakhoz (77, 88, 156). Ez az eredmény viszont felhasználható a páciensek terápiájának kialakításakor, hiszen a szájüregi daganatok terápiájának egyik fő problémája az, hogy a

69

daganatsejtek többsége nyugvó állapotban van, a kemo- és sugárterápia pedig elsősorban a sejtciklusban lévő sejtekre hat, így a nyugvó sejtek a terápia alatt rezisztenciát fejleszthetnek ki. Úgy tűnik, hogy ennek a vizsgálatnak az egyik jelentős eredménye a szájüregi nyugvó daganatsejteknek a sejtciklusba való visszaléptetése, ez az eredmény valószínűleg a LI-injekció összetételében szereplő egyéb citokinek hatásának is köszönhető (IL-1-β, IL-2, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF). Mivel ha a sejtciklusban lévő sejtek száma növekedik, gyorsulhat a tumor növekedése is, a recidívák megjelenése is hamarabb bekövetkezhet, összehasonlítottuk a rekurrens daganatok arányát a kezelt és a nem kezelt csoportban. A kezelt csoportban a kezelést követő 24 hónapban nem észleltük a recidívák megjelenésének felgyorsulását, sőt a vizsgálatban résztvevő egyik egészségügyi centrumban, ahol 8 beteget kezeltek LIinjekcióval, senkinél nem találtak recidívát a kezelést követő 24 hónapban. Eddig megjelent közleményekben, ahol természetes humán vagy rekombináns IL-2-t és más citokineket használtak lokoregionális terápiaként különböző daganatokban, arról számoltak be, hogy ezek a citokinek a daganatok különböző régióiban fejtették ki a daganatellenes hatásukat pl.: IL-2 a pleurális üregben (223), májban (120) és húgyhólyagban (149), az IFN-α ováriumban (12), az IFN-β az agyban (48), az IFN-γ a bőrben (40), a TNF-α a genitáliákon (75); egy citokinkeverék pedig fej-nyaki daganatokon (154). Rekombináns IL-2 alkalmazását – perilimfatikusan, fej-nyaki daganatokban – vizsgáló tanulmányban azt találták, hogy a kezelés után eltávolított daganatmintákban különböző mértékű nekrózis és limfocita-infiltráció volt látható, de a tumor mérete nem változott (29, 203). Saiko és társai által végzett tanulmányban, ahol 20 fej-nyaki daganatos beteget kezeltek magas dózisú (800 000 NE 4 hét alatt) rekombináns interleukin-2-vel, két esetben teljes remissziót tapasztaltak (167), a daganatok mikroszkopikus vizsgálatával pedig a daganatszövetben lévő limfocitainfiltrátum mennyiségének a megnövekedését látták, mely összefüggést mutatott a klinikopatológiai sajátosságokkal (168). Az eddig idézett közlemények, valamint más hasonló témával foglalkozó közlemények, melyekben IL-2-t és más citokineket alkalmaztak (128, 169, 211) közös vonása az, hogy kisszámú páciensen végezték kísérleteiket és a patológiai paramétereket nem hasonlították össze kontroll csoporttal, míg a mi munkacsoportunk egy hasonló tulajdonságokkal rendelkező kontroll csoporthoz mérte a vizsgálati eredményeket. Ezért mi úgy gondoljuk, hogy a

70

vizsgálatunkból származó eredmények, melyek a tumort infiltráló sejtek összetételére vonatkoznak (fej-nyaki daganatokban) LI injekciós kezelést követően, a gazdaszervezet immunrendszere és a szájüregi daganatok interakciójának alapjait sikerült feltérképezni. Egy nemrég végzett multicentrikus fázis III vizsgálat eredményei szerint (28), melyben alacsony dózisú (5000 NE/nap) humán rekombináns IL-2-t adtak perilimfatikusan az ipsilateralis cervikális nyirokcsomó-láncolatba a műtét előtt 10 napig 202 szájüregi daganatos betegnek, a betegek tünetmentes periódusa szignifikánsan megnövekedett (p<0,01), így a túlélés is jelentősen hosszabb idejű lett (p<0,03). Saját vizsgálati eredményeink alapján arra következtethetünk (III.), hogy a LI kezelés elsődleges célpontja a CD3+ T-sejtek, a kezelés következtében láthattuk, hogy a stromát infiltráló T-sejtek a tumor intraepitheliális része felé vándorolnak, mely az antitumorális hatás szempontjából fontos tényező. Az alacsony dózisú LI kezelés nem okozta a tumorban lévő limfoid sejtek aktív proliferációját, és a stromális Ki-67-pozitív limfoid sejtek mennyisége is csökkent, viszont a Ki-67-pozitív tumorsejtek mennyisége a kezelést követően jelentősen megemelkedett. Ezek a változások, melyeket a LI kezelés okoz, talán fogékonyabbá teszik a reziduális szájüregi daganatokat a kemoterápia, sugárterápia vagy mindkettő iránt. A munkacsoportunk által végzett fázis II vizsgálatban, melyben a daganatok eltávolítását megelőzően, magas dózisú LI keverékkel kezeltük a betegeket, jelentős változásokat tapasztaltunk a mononukleáris sejtes infiltráció, tumor-stroma arány és az objektív válasz tekintetében (IV). Ezekben az esetekben a mononukleáris sejtek összetételének olyan változását tapasztaltuk, mely akut gyulladásos reakcióra utalt, ezt a folyamatot pedig nagymértékben a neutrofil sejtek mediálták, kisebb mértékben az eozinofilek és makrofágok. Más közleményekben, melyben melanómás betegek reakcióit vizsgálták autológ tumorsejtek által termelt GM-CSF peritumorális injektálása után, azt tapasztalták, hogy a neutrofil sejtek mennyisége jelentősen megnövekedett a daganatsejtfészkekben, közvetlenül a vakcináció után (188, 189). Mivel az általunk alkalmazott LI keverék több citokint is tartalmazott, többek között GM-CSF-t is, ez a tény magyarázatot adhat a neutrofil sejteknek a tumorsejtfészkekbe való migrációjára, melyet itt is a peritumorális injekciózást követően tapasztaltunk. A tumort infiltráló mononukleáris

sejtek

összetételének

komplex

változásaival

párhuzamosan,

a

daganatsejtfészkek multifokális nekrózisának és a sejtfészkeken belüli kötőszövet

71

mennyiségének jelentős növekedését észleltük a kezelt csoportban, a kontroll csoporthoz

képest.

Ezeket

a

változásokat

a

gazdaszervezet

tumorellenes

immunválaszának következményeként értékelhetjük, melyet a neoadjuváns LI keverék adagolása váltott ki. A neoadjuváns LI keverék adagolását követően, a kezelt csoportban az objektív válaszráta 42% volt (ezeknek az eseteknek 21%-a patológiai szempontból teljes válaszadónak

minősült

–

itt

nem

találtunk

daganatsejtfészket

a

szövettani

metszeteken)(IV). Ez az eredmény arra utal, hogy a LI keverék hatására létrejött antitumor effektus ezekben az esetekben különböző mértékű, és nem minden páciens esetében vezet objektív klinikai válasz megjelenéséhez. A LI keverékkel kezelt szájüregi daganatok esetén még nem teljesen tisztázott, hogy a keverékben lévő specifikus mediátorok között melyek azok, amelyek elősegítik a tumorellenes immunválasz megjelenését.

Az

intraepithelialis

neutrofil

sejtek

mennyiségének

növekedése

párhuzamosan a mikroszkopikus nekrózisok megjelenésével arra utal, hogy a nemspecifikus antitumor mechanizmusok aktiválása rendkívül fontos abban, hogy klinikopatológiailag detektálható tumordestrukció jöjjön létre. A LI keverékkel kezelt rezisztens csoport hisztopatológiai összehasonlítása a kezelésre reagáló csoporttal (melyben klinikai és hisztopatológiai választ 19 esetből 8 esetben tapasztaltunk) azt mutatta, hogy a vizsgált immunológiai paraméterek hasonlóak voltak a két csoportban. Ez az eredmény azt mutatta, hogy a kezelt csoport homogén módon reagált a LI kezelésre, de a daganatellenes hatások rendkívül heterogének voltak. Ennek a diszkrepanciának egyik magyarázata az lehet, hogy a szájüregi daganatos betegek individuális immunszenzitivitással rendelkeznek (különböző tumorantigénekkel és/vagy HLA összetétellel), és a funkcionális immunválasz csökkenése is különböző mértékű. A vizsgálat másik eredménye az, hogy az immunmediált folyamatok, melyeket a LI kezelés váltott ki, változóan hosszú időn át fejtik ki hatásukat a kezelés befejezését követően, ezt bizonyítja az észlelt immunohisztopatológiai változások megjelenése a kezelés utáni 14 és 54-ik nap között. Ennek a neoadjuváns kezelésnek a hatékonyságát bizonyítja az, hogy ezekben az előrehaladott stádiumban lévő szájüregi daganatokban fokozottan mutatkozott a daganatsejtfészkek mennyiségének csökkenése (a páciensek 42%-ában) összehasonlítva a kiindulási értékekhez. Az előző vizsgálat eredményeit is

72

figyelembe véve azt láthatjuk, hogy a neoadjuváns LI immunterápia szájüregi daganatok esetében klinikailag jó eredménnyel végződő terápiát jelentene ezeknek a betegeknek.

A DISSZERTÁCIÓ FŐBB KÖVETKEZTETÉSEI 1.)

A különböző lokalizációjú fej-nyaki daganatok vaszkularizáltsága nem kritikus

tényező a gége- és algaratdaganatok progressziójában mutatkozó különbségek tekintetében. 2.) Az alacsony dózisú sugárkezelés (20 Gy) hatására létrejött érdenzitás-csökkenés szignifikáns összefüggést mutat a kedvezőbb terápiás válasszal és túléléssel. 3.) A vizsgált fej-nyaki daganatok felében találtunk ösztrogén- és progeszteronreceptorexpressziót (34/67 és 33/67 esetben). Míg az ER expresszió gyakoribb volt szájüregi daganatokban, összehasonlítva a glotticus/hypopharyngealis régióval, a PGR expresszió körülbelül azonos mértékű volt a két régióban. Funkcionális ösztrogénreceptorexpresszió

is

gyakori

jelenségnek

bizonyult

fej-nyaki

daganatokban.

Az

ösztrogénreceptor-expresszió a gégerákok esetében negatív prognosztikus tényezőnek tűnik. 4.) A szájüregi laphámrákok, melyek patológiailag meglehetősen homogének, a tumort infiltráló sejtek denzitása és összetétele szempontjából igen heterogének. 5.) A Ki-67 antigént expresszáló daganatsejtek mennyisége növekedett leukocitainterleukin kezelés után, de érdekes módon a magas dózissal kezelt esetekben ez a növekedés nem volt észlelhető. Ez a hatás fontos lehet a terápia eredményességének szempontjából, hiszen minél magasabb a ciklusban lévő daganatsejtek aránya, annál hatékonyabb lehet a kemo- vagy sugárterápia. 6.) A LI kezelés hatására 41,2%-ban észleltünk objektív választ, amit a patológiai vizsgálat illetve a tumor/stroma arány meghatározása érzékenyebben mutatott, mint a

73

képalkotó eljárás. Megállapíthatjuk, hogy a kezelt csoport daganatstromája relatíve egységesen reagált a kezelésre, de a létrejött daganatellenes effektusok eltérőek voltak, melynek oka valószínűleg a daganatok különböző érzékenysége a LI kezelésre. A TÉMAKÖRBEN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE I. Lukits J, Timár J, Juhász A, Döme B, Paku S, Répássy G. Progression difference between cancers of the larynx and hypopharynx is not due to tumor size and vascularization. Otolaryngol Head Neck Surg 2001, 125(1): 18-22 IF: 0.88 II. Lövey J,* Lukits J,* Remenár E, Koronczay K, Kásler M, Németh G, Timár J. Antiangiogenic effects of radiotherapy but not initial microvessel density predict survival in inoperable oropharyngeal squamous cell carcinoma. Strahlenther Onkol 2006, 182(3): 149-56 IF: 3.49 (egyenlő hozzájárulása a két szerzőnek) III. Timár J, Forster-Horváth Cs, Lukits J, Döme B, Ladányi A, Remenár É, Kásler M, Bencsík B, Répássy G, Szabó G, Velich N, Suba Zs, Élő J, Balatoni Zs, Bajtai A, Chretien P, Talor E. The effect of leukocyte interleukin injection (Multikine) treatment on the peritumoral and intratumoral subpopulation of mononuclear cells and on tumor epithelia: a possible new approach to augmenting sensitivity to radiation therapy and chemotherapy in oral cancer- a multicenter phase I/II clinical Trial. Laryngoscope 2003; 113(12): 2206-17 IF: 1.449 IV. Timár J, Ladányi A, Forster-Horváth Cs, Lukits J, Döme B, Remenár É, Gödény M, Kásler M, Bencsík B, Répássy G, Szabó G, Velich N, Suba Zs, Élő J, Balatoni Zs, Pocza K, Zemplén B, Chretien P, Talor E. Neoadjuvant immunotherapy of oral squamous cell carcinoma modulates intratumoral CD4/CD8 ratio and tumor microenvironment : a multicenter phase II clinical trial. J Clin Oncol 2005; 23(15): 3421-32

IF: 9.835

74

V. Lukits J, Remenár É, Rásó E, Ladányi A, Kásler M, Timár J. Molecular identification, expression and prognostic role of estrogen and progesterone receptors in head and neck cancer. Int J Oncol (in press) IF 2,68

DISSZERTÁCIÓVAL KAPCSOLATOS ELŐADÁSOK Lukits J, Döme B, Paku S, Répássy G. Nincsen összefüggés a gégerákok különböző altípusainak nagysága és erezettsége között. Semmelweis Egyetem, PhD Tudományos Napok, 1999. május31-június 1 Répássy G, Forster-Horváth Cs, Lukits J, Döme B, Tímár J. Progression markers of glottic and hypopharyngeal carcinoma (metastasis associated proteins, angiogenesis and lymphoid infiltrate). 16th International Conference on Human Tumor Markers, Budapest, 1999, június13-16 Lukits J, Forster-Horváth Cs, Döme B, Paku S, Tímár J.A gégerákok altípusainak eltérő biológiai viselkedése nem függ az erezettségüktől. Fiatal Onkológusok Fóruma, Pécs, 2001. május 11 (poszter) Forster-Horváth Cs, Répássy G, Derecskei K, Ladányi A, Lukits J, Tímár J. Lymphoid aktivációs marker gége és garat malignus tumoraiban. Fiatal Onkológusok Fóruma, Pécs, 2001. május 11 (poszter) Lukits J, Remenár É, Tímár J, Rásó E. Ösztrogén receptor expresszió fej-nyaki laphámrákokban. Semmelweis Egyetem, PhD Tudományos Napok 2002. június 7-8 Forster-Horváth Cs, Lukits J, Döme B, Ladányi A, Remenár É, Kásler M, Bencsik M, Répássy G, Szabó Gy, Velich N, Suba Zs, Élő J, Balatoni Zs, Bajtai A, Talor E, Tímár J. Szájüregi rákok leukocita interleukin injekciós kezelésének hatása a tumorinfiltráló sejtek összetételére. Multicentrikus fázis II tanulmány. Magyar Onkológusok Társasága XXV. Kongresszusa, Szeged, 2003. november 12-15.

75

Lövey J, Lukits J, Remená É, Koronczay K, Kásler M, Németh Gy, Tímár J. A sugárzás hatására létrejött érdenzitáscsökkenés a sugárkezelés eredményességének érzékeny prediktora mesopharynx-tumoros betegeknél. Magyar Onkológusok Társasága XXV. Kongresszusa, Szeged, 2003. november 12-15.

76

IRODALOM 1.

Aebersold DM, Beer KT, Laissue J, Hug S, Kollar A, Greiner RH, Djonov V. Intratumoral microvessel density predicts local treatment failure of radically irradiated squamous cell cancer of the oropharynx. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000; 48 (1): 17-25

2.

Andersen J, Poulsen HS. Immunohistochemical estrogen receptor determination in paraffin embedded tissue. Prediction of response to hormonal treatment in advanced breast cancer. Cancer 1989; 64: 1901-1908

3.

Barrera JL, Verastegui E, Meneses A, Zinser J, de la Garza J, Hadden JW. Combination immunotherapy of squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2000; 126: 345-351

4.

Bassalyk LS, Iaglinskii VA, Kuznetsova IM, Muraveva NI, Kushlinskii NF .Sex steroid hormones, their receptors and local immunologic processes in experimental carcinogenesis of the larynx. Vopr Onkol 1985; 31 (9): 71-7

5.

Beasley NJP, Leek R, Alam M, Turley H, Cox GJ, Gatter K, Millard P, Fuggle S, Harris AL. Hypoxia-inducible factors HIF-1α and HIF-2α in head and neck cancer: relationship to tumor biology and treatment outcome in surgically resected patients. Cancer Res 2002; 62: 2493-2497

6.

Beato M, Chavez S, Truss M. Transcriptional regulation by steroid hormones. Steroids 1996; 61: 240-251

7.

Beato M, Klug J. Steroid hormone receptors: An update. Hum Reprod Update 2000; 6: 225-236

8.

Beato M. Gene regulation by steroid hormones. Cell 1989; 56: 335-344

9.

Beatrice F, Cammarota R, Giordano C, Corrado S, Ragona R, Sartoris A, Bussolino F, Valente G. Angiogenesis: prognostic significance in laryngeal cancer. Anticancer Res 1998; 18: 4737-4740

10.

Beattie CW, Hansen NW, Thomas PA. Steroid receptors in human lung cancer. Cancer Res 1985; 45: 4206-4214

11.

Begg CB, Zhang ZF, Sun M. Methodology for evaluating the incidence of second primary cancers with application to smoking-related cancers from the surveillance, epidemiology, and end results (SEER) program. Am J Epidemiol 1995; 142: 653-656

77

12.

Berek JS, Hacker NF, Lichenstein A , Jung T, Spina C, Knox RM, Brady J, Greene T, Ettinger LM, Lagasse LD. Intraperitoneal recombinant α-interferon for „salvage” immunotherapy in stage III epithelial ovarian cancer: a gynecologic oncology group study. Cancer Res 1985; 45: 4447-4453

13.

Bettendorf O, Herrman G. Prognostic relevance of Ki-67 antigen expression in 329 cases of oral squamous cell carcinoma. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 2002; 64: 200-205

14.

Bhatavdekar JM, Patel DD, Shah NG, Vora HH, Suthar TP, Ghosh N, Chikhlikar PR, Trivedi TI. Prolactin as a local growth promoter in patients with locally advanced tongue cancer: GCRI experience. Head Neck 2000; 22: 257-64

15.

Bonadonna G, Valagussa P, Tancini G, Di Fronzo G. Estrogen-receptor status and response to chemotherapy in early and advanced breast cancer. Cancer Chemother Pharmacol 1980; 4: 37-41

16.

Bradlow HL, Telang NT, Sepkovic DW. 2-Hydroxiestrone: the „good” estrogen. J Endocrinol 1996; 150: 5259-5263

17.

Budai B, Remenár E, Orosz Zs, Szamel I, Kralovanszky J, Kasler M. Steroid hormone receptors in squamous cell carcinoma of the head and neck. Orv Hetil 1997 Mar 23; 138 (12): 723-7

18.

Burian M, Quint C, Neuchrist C. Angiogenic factors in laryngeal carcinomas: do they have prognostic relevance? Acta Otolaryngol 1999; 119 (2): 289-92

19.

Cagle PT, Mody DR, Schwartz MR. Estrogen and progesterone receptors in bronchogenic carcinoma. Cancer Res 1990; 50: 6632-6635

20.

Carrau RL, Barnes EL, Snyderman CH, Petruzelli G, Kachman K, Rueger R, D'Amico F, Johnson JT. Tumor angiogenesis as a predictor factor of tumor aggressiveness and metastatic potential in squamous cell carcinoma of the head and neck. Invasion Metastasis 1995; 15 (5-6): 197-202

21.

Chaudhary R, Bromley M, Clarke NW, Betts CD, Barnard RJ, Ryder WD, Kumar S. Prognostic relevance of micro-vessel density in cancer of the urinary bladder. Anticancer Res 1999; 19: 3479-3484

22.

Chaudhuri PK, Thomas PA, Walker MJ, Brielle HA, Das Gupta TK, Beattie CW. Steroid receptors in human lung cancer cytosols. Cancer Lett 1982; 16: 327-332

78

23.

Cheng W, Li X, Quan C, Guo X. Role of p53, nm23 proteins and vascular endothelial growth factor in angiogenesis and metastasis of laryngeal cancer. Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi 2000; 35 (2): 147-9

24.

Ciocca DR, Jorge AD, Jorge O. Estrogen receptors, progesterone receptors and heat-shock 27-kD protein in liver biopsy specimens from patients with hepatitis B virus infection. Hepatology 1991; 13: 838-844

25.

Cortesina G, de Stefani A, Galeazzi E, Cavallo GP, Jemma C, Giovarelli M, Vai S, Forni G. Interleukin-2 injected around tumor-draining lymph nodes in head and neck cancer. Head Neck 1991; 13: 125-131

26.

Crowe JP, Hubay CA, Pearson OH, Marshall JS, Rosenblatt J, Mansour EG, Hermann RE, Jones JC, Flynn WJ, McGuire WL. Estrogen receptor status as a prognostic indicator for stage in breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 1982; 2: 171-176

27.

Csuka O, Remenár É, Koronczay K. Predictive value of p53, bcl2 and bax in the radiotherapy of head and neck cancer. Pathol Oncol Res 1997; 3: 204-210

28.

De Stefani A, Forni G, Ragona R, Cavallo G, Bussi M, Usai A, Badellino F, Cortesina G. Improved survival with perilymphatic interleukin-2 in patients with resectable squamous cell carcinoma of the oral cavity and oropharynx. Cancer 2002; 95: 90-97

29.

De Stefani A, Valente G, Forni G, Lerda W, Ragona R, Cortesina G. Treatment of oral cavity and oropharynx squamous cell carcinoma with perilymphatic interleukin-2: clinical and pathologic correlations. J Immunother 1996; 19: 125-13

30.

de Vicente JC, Herreo- Zapatero A, Fresno MF, Lopez-Arranz JS. Expression of cyclin D1 and Ki-67 in squamous cell carcinoma of the oral cavity: Clinicopathological and prognostic significance. Oral Oncol 2002; 38: 301-308

31.

Deitmer T, Knuth UA. Does sex hormone balance modify the pathogenesis of laryngeal cancer? Laryngol Rhinol Otol (Stuttg) 1986 Jul; 65 (7): 392-4

32.

Diaz NM, Mazoujian G, Wick MR. Estrogen-receptor protein in thyroid neoplasms. Arch Pathol Lab Med 1991; 115: 1203-1207

33.

Dong P, Yoshimi M, Tadashi N. The expression difference of VEGF, PDGF/dThPhase and MVD on primary hypopharyngeal carcinoma and metastasis lymph nodes. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Hi 2002; 16 (9): 451-3

79

34.

Dong Y, Sui L, Sugmimoto K, Tay Y, Tokuda M. Cyclin D1-CDK4 complex, a possible critical factor for cell proliferation and prognosis in laryngeal squamous cell carcinomas. Int J Cancer (Pred Oncol) 2001; 95: 209-215

35.

Dong Y, Sui L, Watanabe Y, Sugimoto K, Tokuda M. S-phase kinase-associated protein 2 expression in laryngeal squamous cell carcinomas and its prognostic implications. Oncol Rep 2003; 10: 321-325

36.

Dray TG, Hardin NJ, Sofferman RA. Angoigenesis as a prognostic marker in early head and neck cancer. Ann Otol Rhinol Laryngol 1995; 104: 724-729

37.

Dunphy F, Stack B, Boyd JH, Dunleavy TL, Kim HJ, Dunphy CH.. Microvessel density in advanced head and neck squamous cell carcinoma before and after chemotherapy. Anticancer Res 2002; 22: 1755-1758

38.

Dunst J, Stadler P, Becker A, Lautenschlager C, Poelz T, Hängsen G, Molls M, Kuhnt T. Tumor volume and tumor hypoxia in head and neck cancer. The amount of the hypoxic volume is important. Strahlenter Onk 2003; 179: 521-526

39.

Edwards DP, Chamness GC, McGuire WL. Estrogen and progesterone receptor proteins in breast cancer. Biochim Biophys Acta 1979; 560: 457-486

40.

Edwards L, Whiting D, Rogers D, Luck K, Smiles KA. The effect of intralesional interferon gamma on basal cell carcinomas. J Am Acad Dermatol 1990; 22: 496500

41.

Erovic BM, Neuchrist C, Berger U, EL-Rabadi K, Burian M. Quantitation of microvessel density in squamous cell carcinoma of the head and neck by computer-aided image analysis. Wien Klin Wochenschr 2006; 117 (1-2): 53-7

42.

Evans RM. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science (Wash DC) 1988; 240: 889-895

43.

Ferguson BJ, Hudson WR, McCarty KS, Jr. Sex steroid receptor distribution in the human larynx and laryngeal carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1987; 113:1311-5

44.

Ferlito A, Shaha AR, Rinaldo A. The incidence of lymph node micrometastases in patients pathologically staged N0 in cancer of oral cavity and oropharynx. Oral Oncol 2002; 38: 3-5

45.

Ferradina G, Raneletti FO, Larocca LM, Maggiano N, Fruscella E, Legge F, Santeusanio G, Bombonati A, Mancuso S, Scambia G. Tamoxifen modulates the

80

expression of Ki67, apoptosis, and microvessel density in cervical cancer. Clin Cancer Res 2001; 7: 2656-2661 46.

Ferrandina G, Almadori G, Maggiano N, Lanza P, Ferlini C, Cattani P, Piantelli M, Scambia G, Ranelletti FO. Growth-inhibitory effect of tamoxifen and quercetin and presence of type II estrogen binding sites in human laryngeal cancer cell lines and primary laryngeal tumors. Int J Cancer 1998; 77: 747-54

47.

Ferrandina G, Scambia G, Benedetti Panici P, Almadori G, Paludetti G, Cadoni G, Distefano M, Maurizi M, Mancuso S. Cathepsin D in primary squamous laryngeal tumors: correlation with clinico-pathological parameters and receptor status. Cancer Lett 1992 Dec 24; 67(2-3): 133-8

48.

Fetell MR, Housepian EM, Oster MW, Cote DN, Sisti MB, Marcus SG, Fisher PB. Intratumoral administration of beta-interferon in recurrent malignant gliomas: A phase I clinical and laboratory study. Cancer 1990; 65: 78-83

49.

Fishman J, Schneider J, Hershope RJ. Increased estrogen 16 alpha-hydroxylase activity in women with breast and endometrial cancer. J Steroid Biochem Mol Biol 1984; 20: 1077-1081

50.

Folkman J. Role of angoigenesis in tumor growth and metastasis. Semin Oncol 2002; 29 (6 Suppl 16):15-18

51.

Fox SB. Tumor angiogenesis and prognosis. Histopathology 1997; 3: 294-301

52.

Franchi A, Santucci M, Masini E, Sardi I, Paglierani M, Galio O. Expression of matrix

metalloproteinase

1,

matrix

metalloproteinase

2,

and

matrix

metalloproteinase 9 in carcinoma of the head and neck. Cancer 2002; 95 (9): 1902-10 53.

Fujimoto M, Yoshimo E, Hirakawa K, Fujimoto J, Tamaya T. Estrogen receptors in brain tumors. Clin Neuropharmacol. 1984; 7: 357-362

54.

Fuller LZ, Lu C, McMahon DG, Lindeman MD, Jorgensen MS, Rau SW, Sisken JE, Jackson BA. Stimulus-secretion coupling in porcine adrenal chromaffin cells. Effect of dexamethasone. J Neurosci Res 1997; 49: 416-424

55.

Fyles AW, Milosevic M, Wong R, Kavanagh MC, Pintilie M, Sun A, Chapman W, Levin W, Manchul L, Keane TJ, Hill RP. Oxygenization predicts radiation response and survival in patients with cervix cancer. Radiother Oncol 1998; 48: 149-156

81

56.

Gallo O, Masini E, Morbidelli L, Franchi A, Fini-Storchi I, Vergari WA, Ziche M. Role of nitric oxide in angiogenesis and tumor progression in head and neck cancer. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 587-596

57.

Garcia-Barros M, Paris F, Cordon-Cardo C, Lyden D, Rafii S, HaimovitzFriedman A, Fuks Z, Kolesnick R. Tumor response to radiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis. Science 2003; 300: 1155-1159

58.

Gasco M, Crook T. The p53 network in head and neck cancer. Oral Oncol 2003; 39: 222-231

59.

Gasparini G, Weidner N, Maluta S, Pozza F, Boracchi P, Mezzetti M, Testolin A, Bevilacqua P. Intratumoral microvessel density and p53 protein: correlation with metastasis in head and neck squamous cell carcinoma. Int J Cancer 1993; 55: 739744

60.

Genden EM, Ferlito A, Bradley PJ, Rinaldo A, Scully C. Neck disease and distant metastases. Oral Oncol 2003; 39: 207-212

61.

Georgiou A, Gomatos IP, Ferekidis E, Syrigos K, Bistola V, Giotakis J, Adamopoulos G. Prognostic significance of p53, bax and bcl-2 gene expression in patients with laryngeal carcinoma. Eur J Surg Oncol 2001; 27: 574-580

62.

Giatromanolaki A, Kourkourakis MI, Georgoulias V, Gatter KC, Harris AL, Fountzilas G. Angiogenesis vs. response after combined chemoradiotherapy of squamous cell head and neck cancer. Int J Cancer 1999; 80: 810-817

63.

Gleich LL, Biddinger PW, Duperier FD, Gluckman JL. Tumor angiogenesis as a prognostic indicator in T2-T4 oral cavity squamous cell carcinoma: a clinicalpathologic correlation. Head Neck 1997; 19:276-280

64.

Grammatica L, Piepoli S, D'Auria C, Achille G, Marzulo F, Zito FA, Labriola A, Salvatore C, Paradiso A. Primary tumours neoangiogenesis and p53 expression in oral carcinoma patients. J Exp Clin Cancer Res 2001; 20: 225-230

65.

Greenway B, Iqbal MJ, Johnson PJ, Williams R. Oestrogen receptor proteins in malignant and fetal pancreas. BMJ 1981; 283: 751-753

66.

Grenman R, Virolainen E, Sharipa A, Iand Carey T. In vitro effects of tamoxifen on UM-SCC head and neck cancer cell lines: correlation with the estrogen and progesterone receptor content. Int. J Cancer 1987; 39: 77-81

82

67.

Hadden JW, Endicott J, Baekey P, Skipper P, Hadden EM. Interleukins and contrasupression induce immune regression of head and neck cancer. Arch Otolaryngol Head Surg 1994 ; 120 : 395-403

68.

Hagedorn HG, Nerlich AG. Analysis of sex-hormone-receptor expression in laryngeal carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol 2002; 259: 205-10

69.

Hagedorn HG, Nerlich AG. Microvessel density and endothelial basement membrane composition in laryngeal squamous cell carcinomas. Acta Otolaryngol 2000; 120 (7): 891-8

70.

Harris AL. Hypoxia- A key regulatory factor in tumour growth. Nature Rev Cancer 2001; 2: 38-47

71.

Hegde PU, Brenski AC, Caldarelli DD, Hutchinson J, Panje WR, Wood NB, Leurgans S, Preisler HD, Taylor SG 4th, Caldarelli L, Coon JS. Tumor angiogenesis and p53 mutations: prognosis in head and neck cancer. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1998; 124: 80-85

72.

Herynk MH, Fuqua SA. Estrogen receptor mutations in human disease. Endocrine Rev 2004; 25: 869-898

73.

Hironaka S, Hasebe T, Kamijo T, Ohtsu A, Boku N, Yoshida S, Saitoh H, Ochiai A. Biopsy specimen microvessel density is a useful prognostic marker in patients with T(2-4) M(0) esophageal cancer treated with chemotherapy. Clin Cancer Res 2002; 8: 124-130

74.

Hoffmann TK, Bojar H, Eckel J, van Lierop A, Balz V, Friebe-Hoffmann U, Hauser U, Bier H. Effects of tamoxifen on human squamous cell carcinoma lines of the head and neck. Anticancer Drugs 2002 Jun; 13 (5): 521-31

75.

Irie K, Satonaka K, Matsuura M, Miura Y, Nakayama H. A case of vulva cancer responding to the recombinant human tumor necrosis factor (PT-950) local injection therapy. Gan No Rinsho 1988; 34: 946-950

76.

Irjala H, Alanen K, Grenman R, Heikkilä P, Joensuu H, Jalkanen S. Mannose receptor (MR) and common lymphatic endothelial and vascular receptor (CLEVER)-1 direct the binding of cancer cells to the lymph vessel endothelium. Cancer Res 2003; 63: 4671-4676

83

77.

Itaya M, Yoshimoto J, Kojima K, Futagawa S. Usefullness of p53 protein, Bcl-2 protein and Ki-67 as predictors of chemosensitivity of malignant tumors. Oncol Rep 1999; 6: 675-682

78.

Ito Y, Kamijo T, Yokose T, Kawashima M, Ogino T, Ikeda H, Hayashi R, Sasaki S, Ochial A. Mivrovessel density predicts the radiosensitivity of metastatic head and neck squamous cell carcinoma in cervical lymph nodes. Int J Oncol 2001; 19: 1127-1132

79.

Jain RK, Fenton BT. Intratumoral lymphatic vessels: A case mistaken identity or malfunction? J Natl Cancer Inst 2002; 94: 417-421

80.

Jensen EV, Jordan C. The estrogen receptor: a model for molecular medicine. Clin Cancer Res 2003; 9: 1890-9

81.

Kaanders JH, Wijffels KI, Marres HA, Ljungkvist AS, Pop LA, van den Hoogen FJ, de Wilde PC, Bussink J, Raleigh JA, van der Kogel AJ. Pimonidazole binding and tumor vascularity predict for treatment outcome in head and neck cancer. Cancer Res 2002; 62: 7066-7074

82.

Kambic V, Radsel Z, Prezelj J, Zargi M. Testosterone – an etiological factor in the development of laryngeal carcinoma? . HNO 1985 Mar; 33 (3): 115-7

83.

Kardamakis D, Hadjimichael C, Ginopoulos P, Papaioannou S. Effects of paclitaxel in combination with ionizing radiation on angiogenesis in the chick embryo chorioallantoic membrane. A radiological study. Strahlenther Onkol 2004; 180: 152-156

84.

Kerdpon D, Rich MA, Reade PC. Expression of p53 in oral mucosal hyperplasia, dysplasia and squamous cell carcinoma. Oral Dis 1997; 3: 36-41

85.

Kleemann D, Kunkel S, Bellin T. Estrogen feedback tests in women with laryngeal carcinomas. Laryngorhinootologie 1996 Feb; 75 (2): 88-90

86.

Klein K, Henk W. Klinish-experimentelle untersuchungen über den einfluβ von aldosterone auf hämodynamik und gerinnung. Z Kreisl Forsch 1963; 52: 40-53

87.

Kobayashi S, Mizuno T, Tobioka N. Sex steroid receptors in diverse human tumors. Jpn J Cancer Res (Gann) 1982; 73: 439-445

88.

Koelbl O, Rosenwald A, Haberl M, Müller J, Reuthr J, Flentje M. p53 and Ki-67 as predictive markers for radiosensitivity in squamous cell carcinoma of the ora

84

cavity? An immunohistochemical and clinicopathologic study. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001; 49: 147-154 89.

Kojima O, Takakashi T, Kawakami S, Uehara Y, Matsui M. Localization of estrogen receptors in gastric cancer using immunohistochemical staining of monoclonal antibody. Cancer 1991; 67: 2401-2406

90.

Kolar Z, Kod'ousek R, Ehrman J Jr, Macak J, Starek I, Kucera J. Expression of estrogen receptors and estrogen-induced proteins in tumors of „hormon nondependent tissues”. Cesk Patol 1994 Feb; 30 (1): 12-5

91.

Kourkourakis MI, Giatromanolaki A, Fountzilas G, Sivridis E, Gatter KC, Harris AL. Angiogenesis, thymidin phosphoriylase and resistance of squamous cell head and neck cancer to cytotoxic and radiation therapy. Clin Cancer Res 2000; 6: 381389

92.

Kourkourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E, Simopoulos K, Pissakas G, Gatter KC, Harris AL. Squamous cell head and neck cancer: evidence of angiogenic regeneration during radiotherapy. Anticancer Res 2001; 21 (68): 43019

93.

Kovács L, Szende B, Elek G, Lapis K, Horvath O, Hiszek I, Tamási A, Schmidt O.

Working

experience

with

a

new

vacuum-accelerated

microvawe

histoprocessor. J Pathol 1996; 180 : 106-110 94.

Kuiper GGJM, Carlsson B, Grandien K, Enmark E, Haggblad J, Nilsson S, Gustaffson JA. Comparision of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors α and β. Endocrinology 1997; 138: 863-874

95.

Kumar RV, Shenoy AM, Daniel R, Shah KV. Cyclin D1, p53, MIB1, intratumoral microvessel density, and human paoillomavirus in advanced laryngeal carcinoma: association with nodal metastasis. Otolaryngol Head Neck Surg 2004; 131 (4): 509-13

96.

Kung AL, Wang S, Kleo JM, Kaelin WG, Livingston DM. Supression of tumor growth through disruption of hipoxia-inducible transcription. Nat Med 2000; 6: 1335-1340

97.

Kupisz K, Chibowski D, Klatka J, Klonowski S, Stepulak A. Tumor angiogenesis in patients with laryngeal cancer. Eur Arch Otorhinolaryngol 1999; 256 (6): 303-5

85

98.

Kyzas PA, Stefanou D, Batistatou A, Agnantis NJ. Prognostic significance of VEGF immunohistochemical expression and tumor angiogenesis in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res Clin Oncol 2005; 131 (9): 624-30

99.

Lentsch EJ, Goudy S, Sosnowski J, Major S, Bumpous JM. Microvessel density in head and neck squamous cell carcinoma primary tumors and its correlation with clinical staging parameters. Laryngoscope 2006; 116 (3): 397-400

100. Lingen MW, Polverini PJ, Bouck NP. Retinoic acid and interferon alpha act synergistically as antiangiogenic and antitumor agents against human head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 1998;58: 5551-5558 101. Liss C, Fekete MJ, Hasina R, Lam CD, Lingen MW. Paracrine angiogenic loop between head-and –neck squamous cell carcinomas and macrophages. Int J Cancer 2001; 93: 781-785 102. Liu S, Lin D, Hong B, Yao X, Meng X. Estrogen and progesterone receptors in laryngeal carcinoma. Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 1992 Mar; 23(1): 68-70 103. Ljungkvist AS, Bussink J, Rijken PF, Kaanders JH, van der Kogel AJ, Denekamp J. Vascular architecture, hypoxia, and proliferation in first-generation xenografts of human head-and-neck squamous cell carcinomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002; 54: 215-228 104. Lopez-Graniel CM, Tamez de Leon D, Meneses-Garcia A, Gomez-Ruiz C, FriasMendivil M, Granados-Garcia M, Barrera-Franco JL. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in oral cavity carcinoma.J Exp Clin Cancer Res 2001; 20: 463468 105. Lu YY, Shen P, Ding W. Study on the relationship between microvascular density and prognosis in laryngeal cancer. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi 2000; 14 (12): 538-9 106. Lui M, Lawson G, Delos M, Jamart J, Ide C, Coche E, Weynand B, Desuter G, Hamoir M, Remacle M, Marbaix E. Predictive value of the fraction of cancer cells immunolabeled for proliferating cell nuclear antigen or ki-67 in biopsies of head and neck carcinomas to identify lymph node metastasis: comparison with clinical and radiologic examinations. Head Neck 2003; 25: 280-288

86

107. Lukits J, Timár J, Juhász A, Döme B, Paku S, Répássy G. Progression difference between cancers of the larynx and hypopharynx is not due to tumor size and vascularisation. Otolaryngol Head Neck Surg 2001; 125:18-22 108. Maiorano E, Botticella MA, Marzullo A, Resta L . Expression of ER-D5 and EGFR in laryngeal carcinoma and malignant epithelium. Acta Otolaryngol Suppl 1997; 527: 95-9 109. Maiuri F, Montagnani S, Gallichio B. Estrogen receptors in meningiomas. Surg Neurol 1986; 26: 435-440 110. Marsigliante S, Biscozzo L, Resta L, Leo G, Mottaghi A, Maiorano E, Colucci G, Storelli C .Immunohistochemical and immunoradiometric evaluation of total cathepsin D in human larynx .Eur J Cancer B Oral Oncol 1994 Jan; 30B(1) : 51-5 111. Marsigliante S, Leo G, Resta L, Storelli C. Steroid receptor status in malignant and non-malignant larynx. Ann Oncol 1992 May; 3 (5): 387-92 112. Marsigliante S, Muscella A, Storelli L, Storelli C. Human larynx expresses isoforms of the oestrogen receptor. Cancer Letters 1996; 99: 191-6 113. Marsigliante S, Resta L, Leo G, Mazzotta D, d’Amore R, Biscozzo L, Storelli C. Expression of cathepsin D in malignant and in the corresponding non-malignant node negative laryngeal samples: correlation with receptors for androgen, glucocorticoid, oestrogen and progesterone. Cancer Letters 1993; 68: 135-42 114. Martone T, Rosso P, Albera R, Migliaretti G, Fraire F, Pignataro L, Pruneri G, Belione G, Cortesina G. Prognostic relevance of CD105+ microvessel density in HNSCC patient outcome. Oral Oncology 2005; 41 (2): 147-55 115. Martone T, Rosso P, Albera R, Migliaretti G, Fraire F, Pignataro L, Pruneri G, Bellone G, Cortesina G. Prognostic relevance of CD105+ microvessel density in HNSCC patient outcome. Oral Oncol 2005; 41 (2): 147-55 116. Martucci C, Fishman J. Direction of estradiol metabolism as a control of its hormonal action: uterotropic activity of estradiol metabolites. Endocrinology 1977; 101: 1709-1715 117. Marugo M, Cordone G, Fazzuoli L, Rochetti O, Bernasconi D, Laviosa C, Bessarione D, Giordano G. Cytosolic and nuclear androgen receptor activity in the cancer of the larynx. J Endocrinol Invest 1987 Oct ; 10(5) : 465-70

87

118. Matsui M, Kojima O, Uehara Y, Takahashi T. Characterization of estrogen receptor in human gastric cancer. Cancer 1991; 68: 305-308 119. Maulu S-M, Luukkaa M, Grenman R, Jackson D, Jalkanen S, Ristamäki R. Intratumoral lymphatics are essential for the metastatic spread and prognosis in squamous cell carcinoma of the head and neck region. Cancer Res 2003; 63: 1920-1926 120. Mavilgit GM, Zukowski AA, Guttermann JU, Salem P, Charnsangav C, Wallace S. Splenic versus hepatic artery infusion of interleukin-2 in patients with liver metastases. J Clin Oncol 1990; 8: 319-324 121. Meneses A, Verastegui E, Barrera JL, Zinser J, de la Garza J, Hadden JW. Histologic findings in patients with head and neck squamous cell carcinoma receiving perilymphatic natural cytokine mixture (IRX-2) prior to surgery. Arch Pathol Lab Med 1998; 122: 447-454 122. Mineta H, Miura K, Ogino T, Takebayashi S, Misawa K, Ueda Y. Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression correlates with p53 and Ki-67 expression in tongue squamous cell carcinoma. Anticancer Res 2002; 22: 10391044 123. Mohler JL, Gregory CW, Ford III OH, Kim D, Weaver CM, Petrusz P, Wilson EM, French FS. The androgen axis in recurrent prostate cancer. Clin Cancer Res 2004; 10: 440-448 124. Molteni A, Warpeha RL, Brizio-Molteni L, Fors EM . Estradiol receptor-binding protein in head and neck neoplastic and normal tissue . Arch Surg 1981 Feb; 116(2) : 207-10 125. Mosselman S, Polman J, Dijkema R. ER β: Identification and characterization of a novel human estrogen receptor. FEBS Lett 1996; 392: 49-53 126. Murray JD, Carlson GW, McLaughlin K, Pennington M, Lynn M, DeRose PB, Williams JK, Cohen C. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in laryngeal cancer. Am J Surg 1997; 174: 523-526 127. Muscat JE, Richie JP, Thompson S. Gender differences in smoking and risk for oral cancer. Cancer Res 1996; 56: 5192-5197 128. Musiani P, De Campora E, Valitutti S, Castellino F, Calearo C, Cortesina G, Giovarelli M, Jemma C, De Stefani A, Forni G. Effect of low doses of interleukin-

88

2 injected perilymphatically and peritumoralli in patients with advanced primary head and neck squamous cell carcinoma. J Biol Res Modif 1989; 8: 571-578 129. Narayana A, Vaughan TM, Kathuria S, Fisher SG, Walter SA, Reddy SP. p53 overexpression is associated with bulky tumor and poor local control in T1 glottic cancer. Int J Radiation Oncology Biol Phys 2000; 46: 21-26 130. Naresh KN, Lakshminaraanan K, Pai SA, Borges AM. Apoptosis index is a predictor of metastatic phenotype in patients with early stage squamous carcinoma of the tongue. Cancer 2001; 91: 578-584 131. Nathanson SD. Insights into the mechanisms of lymph node metastasis. Cancer 2003; 98: 413-423 132. Neuchrist C, Quint C, Pammer A, Burian M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and microvessel density in squamous cell carcinomas of the larynx: an immunohistochemical study. Acta Otolaryngol 1999; 119 (6): 732-8 133. Newfield L, Goldsmith A, Bradlow HL. Estrogen metabolism and human papillomavirus-induced tumors of the larynx: chemo-prophylaxis with indole-3carbinol. Anticancer Res 1993; 13: 337-342 134. Ninck S, Reisser C, Dyckhoff G, Heimke B, Bauer H, Herold-Mende C. Expression profiles of angiogenic growth factors in squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J Cancer 2003; 106 (1): 34-44 135. O-Charoenrat P, Pillai G, Patel S, Fisher C, Archer D, Eccles S, Rhys-Evans P. Tumour thickness predicts cervical nodal metastases and survival in early oral tongue cancer. Oral Oncol 2003; 39: 386-390 136. O-Charoenrat P, Rhys-Evans P, Eccles SA. Expression of vascular endothelial growth factor family members in head and neck squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis. Cancer 2001; 92: 556-568 137. O-Charoenrat

P,

Rhys-Evans

PH,

Eccles

SA.

Expression

of

matrix

metalloproteinases and their inhibitors correlates with invasion and metastasis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2001; 127: 813-820 138. Odell EW, Jani P, Sheriff M, Ahluwalia SM, Hibbert J, Levison DA, Morgan PR. The prognostic value of individual histologic grading parameters in small lingual

89

squamous cell carcinomas: the importance of the pattern of invasion. Cancer 1994; 74: 789-794 139. Omoto Y, Kobayashi Y, Nishida K. Expression, function and clinical implication of the estrogen receptor beta in human lung cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 285: 340-347 140. Ögremenoglu O, Ayas K. Laryngeal carcinoma and estrogen receptor analysis in patients after long-term follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol 1998; 255: 457-61 141. Paech K, Webb P, Kuiper GG, Nilsson S, Gustafsson J, Kushner PJ, Scanian TS. Differential ligand activation of estrogen receptors ER-α and ER-β at AP-1 sites. Science 1997; 277: 1508-1510 142. Paridaens DA, Alexander RA, Hungerford JL, McCartney ACE. Oestrogen receptors in conjunctival malignant melanoma: immuncytochemical study using formalin fixed paraffin wax sections. J Clin Pathol 1991; 44: 840-843 143. Pearce ST, Jordan VC. The biological significance of estrogen receptors alpha and beta in cancer. Crit Rev Oncol Hematol 2004; 5: 3-22 144. Pepper MS, Skobe M. Lymphatic endothelium: morphological, molecular and functional properties. J Cell Biol 2003; 163: 209-213 145. Piatkowski K, Kruk-Zagajewska A, Thielemann A, Kopczynski Z. Concentration of estrogen and progesterone receptors in normal and neoplastic tissue in patients with laryngeal neoplasm. Otolaryngol Pol 2002; 56 (4): 445-50 146. Pietras RJ, Szegő CM. Endometrial cell calcium and oestrogen action. Nature (Lond) 1975; 253: 357-359 147. Pietruszewska W, Kobos J, Gryczynski M. Microvessel density and endothelial area in assesment of angiogenesis in patients with laryngeal cancer. Otolaryngol Pol 2003; 57 (1): 5-15 148. Pignataro L, Carboni N, Midolo V, Bertolini F, Buffa R, Cesana BM, Neri A, Viale G, Pruneri G. Clinical relevance of microvessel density in laryngeal squamous cell carcinomas. Int J Cancer 2001; 92: 666-670 149. Pizza G, Severini P, Menniti D, de Vionci C, Corrado F. Tumor regression after intralesional injection of interleukin-2 (IL-2) in bladder cancer: preliminary report. Int J Cancer 1984; 34: 359-367

90

150. Podgrabinska S, Braun P, Kloos B, Pepper MS, Jackson DG, Skobe M. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. PNAS 2002; 99: 160069-16074 151. Pomerantz RG, Grandis JR. The role of epidermal growth factor receptor in head and neck squamous cell carcinoma. Curr Oncol Rep 2003; 5: 140-146 152. Poon RT, Ng IO, Lau C, Yu WC, Yang ZF, Fan ST, Wong J. Tumor microvessel density as a predictor of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma: a prospectiv study. J Clin Oncol 2002; 20: 1775-1785 153. Pruneri G, Ponzoni M, Ferreri AJ, Decarli N, Tresoldi M, Raggi F, Baldessari C, Freschi M, Baldini L, Goldaniga M, Neri A, Carboni N, Bertolini F, Viale G. Microvessel density, a surrogate marker of angiogenesis, is significantly related to survival in multiple myeloma patients. Br J Haematol 2002; 118: 817-820 154. Pulley MS, Nagendran V, Edwards JM, Dumonde DC. Intravenous, intralesional and endolymphatic administration of lymphokines in human cancer. Lymph Res 1986; 5: S157-S163 155. Ravi D, Ramadas K, Mathew BS, Panikkar KR, Nair MK, Pillai MR. Apoptosis, angiogenesis and proliferation: a trifunctional measure of tumour response to radiotherapy for oral cancer. Oral Oncology 2001; 37: 165-171 156. Raybaud H, Fortin A, Bairati I, Morency R, Monteil RA, Tetu B. Nuclear DNA content, an adjunct to p53 and Ki-67 as a marker of resistance to radiation therapy in oral cavity and pharyngeal squamous cell carcinoma. Int J Oral Maxillofac Surg 2000; 29: 36-41 157. Remenár É, Számel I, Buda B, Orosz Zs, Kralovánszky J, Kásler M. „Why men?” Hormones and hormone receptors in male head and neck cancer patients. In: Advances in Laryngology in Europe. Eds: Klainsasser O, Glanz H, Olofsson J, editors. Elsevier, 1997. pp. 137-140 158. Resta L, Fiorella R, Marsigliante S, Leo G, Di Nicola V, Marzullo A, Boticella MA. The status of receptors in laryngeal carcinoma: a study of receptors for estrogen, progesterone, androgens and glucocorticoids. Acta Otorhinolaryngol Ital 1994 Jul-Aug; 14 (4): 385-92 159. Resta L, Marsigliante S, Leo G, Fiorella R, Di Nicola V, Maiorano. Molecular biopathology of metaplastic, displastic, and neoplastic laryngeal epithelium. Acta Otolaryngol Suppl 1997 ;527 : 39-42

91

160. Riedel P, Gotte K, Schwalb J, Schafer C, Hormann K. Vascular endothelial growth factor expression corelates with p53 mutation and angiogenesis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Acta Otolaryngol 2000; 120 (1): 105-11 161. Rioux- Leclercq N, Epstein JI, Bansard JY, Turlin B, Patard JJ, Manunta A, Chan T, Ramee MP, Lobel B, Moulinoux JP. Clinical significance of cell proliferation, microvessel density, and CD44 adhesion molecule expression in renal cell carcinoma. Hum Pathol 2001; 32: 1209-1215 162. Robbins KT, Vu TP, Diaz A ,Vorki NM . Growth effects of tamoxifen and estradiol on laryngeal carcinoma cell lines .Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1994 Nov; 120(11): 1261-6 163. Rogers SJ, Harrington KJ, Rhys-Evans P, O-Charoenrat P, Eccles SA. Biological significance of c-erbB family oncogenes in head and neck cancer. Cancer Metast Rev 2005; 24: 47-69 164. Ross CD, Gomaa MA, Gillies E, Juengel R, Medina JE. Tumor grade, microvessel

density,

and

activities

of

malate

dehydrogenase,

lactate

dehydrogenase, and hexokinase in squamous cell carcinoma. Otolaryngol Head Neck Surg 2000; 122 (2): 195-200 165. Rubio L, Burgos JS, Morera C, Vera-Sempere FJ. Morphometric study of tumor angiogenesis as a new prognostic factor in nasopharyngeal carcinoma patients. Pathol Oncol Res 2000; 6 (3): 210-6 166. Russo A, Bazan V, Gebbia N, Pizzolanti G, Tumminello FM, Dardanoni G, Ingria F, Restivo S, Tomasino RM, Leto G.. Flow cytometric DNA analysis and lyosomal cathepsin B and I in locally advanced laryngeal cancer. Relationship with clinicopathologic parameters and prognostic significance. Cancer 1995; 76: 1757-1764 167. Saito T, Kakiuti H, Kuki K, Yokota M, Jinnin T, Kimura T, Fujiwara K, Yoda J, Kunimoto M, Aral H. Clinical evaluation of local administration of rIL-2 in head and neck cancer. Nip Jibi Gakkai Kaiho 1989; 92: 1265-1270 168. Saito T, Kawaguti T, Yoda J, Kimura T, Tabata T. Immunohistology of tumor tissue in local administration of recombinant interleukin-2 in head and neck cancer. Nip Jibi Gakkai Kaiho 1989; 92: 1271-1276

92

169. Salter J, Maclennan KA, Moore J, Dadian G, Riches PG, Gore ME. The phenotypic changes in tumour infiltrating lymphocytes and tumour cells following intra-arterial infusion of interleukin-2 in patients with squamous cell carcinoma. J Pathol 1995; 176: 73 170. Sauter ER, Nesbit M, Watson JC, Klein-Szanto A, Litwin S, Herlyn M. Vascular endothelial growth factor is a marker of tumor invasion and metastasis in squamous cell carcinomas of the head and neck. Clin Cancer Res 1999; 5 (4): 775-82 171. Scambia G, Panici PB, Battaglia F, Ferrandina G, Paludetti G, Maurizi M, Mancuso S. Receptors for epidermal growth factor and steroid hormones in primary laryngeal tumors. Cancer 1991 Mar 1; 67 (5): 1347-51 172. Scambia G, Panici PB, Bellantone R. Receptors for epidermal growth factor and steroid hormones in primary colorectal tumors. J Surg Oncol 1991; 48: 183-187 173. Schiff R, Massarweh SA, Shou J, Bharwani L, Mohsin SK, Osborne CK. Crosstalk between estrogen receptor and growth factor pathways as a molecular target for overcoming endocrine resistance. Clin Cancer Res 2004; 10: (Suppl) 331s-6s. 174. Schimdt-Pak A, Wright MA, Matthews JP, Collins SL , Petruzzelli GJ, Young MR. Mechanisms of immune supression in patients with head and neck cancer: presens of CD34+ cells which supress immune functions within cancers that secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Clin Cancer Res 1995 ; 1:95-103 175. Schneider J, Kinne D, Fracchia A. Abnormal oxidative metabolism of estradiol in women with breast cancer. Proc Soc Acad Sci U S A 1982; 79: 3047-3051 176. Schuller DE, Abou-Issa H, Parrish R. Estrogen and progesterone receptors in head and neck cancer. Arch Otolaryngol 1984; 110: 725-7 177. Schultze-Mosgau S, Grabenbauer GG, Wehrhan F, Radespiel-Troger M, Wiltfang J, Sauer R, Rodel F. Histomorphological structural changes of head and neck blood vessels after pre- or postoperative radiotherapy. Strahlenther Onkol 2002; 178: 299-306 178. Schultze-Mosgau S, Rodel F, Keilholz L, Grabenbauer GG, Wiltfang J, Radespiel-Troger M, Sauer R, Neukam FW. Vascularization of free

93

myocutaneous gracilis flaps in replacement transplantation after preoperative radiotherapy.An experimental study. Strahlenther Onkol 2000; 176: 498-505 179. Sedivy R, Beck-Mannagetta J, Haverkampf C, Battistutti W, Honigschnabi S. Expression of vascular endothelial growth factor-C correlates with the lymphatic microvessel density and the nodal status in oral squamous cell cancer. J Oral Pathol Med 2003; 8:455-460 180. Selye J. Correlation between the chemical structure and the pharmacological actions of the steroids. Endocrinology 1942; 30: 437-453 181. Sepkovic DW, Bradlow HL, Ho G. Estrogen metabolite ratios and risk assesment of hormone-related cancers: assay, validation and prediction of cervical cancer risk. Ann N Y Acad Sci 1995; 768: 312-316 182. Shapira A, Virolainen E, Jameson JJ, Ossakov SJ, Carey TE . Growth inhibition of laryngeal UM-SCC cell lines by tamoxifen . Comparison with effects on the MCF-7 breast cancer cell line . Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1986 Nov ; 112(11) : 1151-8 183. Shekbar MP, Nangia –Makker P, Wolman SR, Tait L, Heppner GH, Visscher DW. Direct action of estrogen on sequence of progression of human preneoplastic breast disease. Am J Pathol 1998; 152: 1129-1132 184. Shemiani B, Crowe DL. Hypoxic induction of HIF-1alpha and VEGF expression in head and neck squamous cell carcinoma lines is mediated by stress activated protein kinases. Oral Oncol 2002; 38: 251-257 185. Sion-Vardy N, Fliss DM, Prinsloo I, Shoham Vardi I, Benharroch D. Neoangiogenesis in squamous cell carcinoma of the larynx- biological and prognostic associations. Pathol Res Pract 2001; 197: 1-5 186. Sittel C, Ruiz S, Volling P, Kvasnicka HM, Jungehülsisng KM, Eckel HE. Prognostic significance of Ki-67 (MIB1), PCNA and p53 in cancer of the oropharynx and oral cavity. Oral Oncol 1999; 35: 583-589 187. Smith BD, Smith GL, Carter D, DiGiovanna MP, Kasowitz KM, Sasaki CT, Haffty BG. Molecular marker expression in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2001; 127: 780-785 188. Soiffer R, Hodi FS, Haluska F. Vaccination with irradiated autologous melanoma cells engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by

94

adenoviral-mediated gene transfer augments antitumor immunity in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol 2003; 21: 3343-3350 189. Soiffer R, Lynch T, Mihm M. Vaccination with irradiated autologous melanoma cells engineered to secrete human granulocyte-macrophage colony stimulating factor generates potent antitumor immunity in patients with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci U.S.A 1998; 95: 13141-13146 190. Somers KD, Koenig M, Schechter GL. Growth of head and neck squamous cell carcinoma in nude mice: potentiation of laryngeal carcinoma by 17 β-estradiol. J Natl Cancer Inst 1988; 80: 688-91 191. Spach C, Streeten DH. Retardation of sodium exchange in dog erythrocytes by physiological concentrations of aldosterone, in vitro. J Clin Invest 1964; 43: 217227 192. Spafford MF, Koeppe J, Pan Z, Archer PG, Meyers AD, Franklin WA.. Correlation of tumor markers p53, bcl2, CD34, CD44H, CD44v6 and Ki67 with survival and metastasis in laryngeal squamous cell carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1996; 122: 627-632 193. Stacker SA, Achen MG, Jussila L, Baldwin ME, Alitalo K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nature Rev Cancer 2002; 2: 573-583 194. Stoeckli SJ, Pfaltz M, Steinert H, Schmid S. Histopathological features of occult metastasis detected by sentinel lymph node biopsy in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Laryngoscope 2002; 112: 111-115 195. Strauss L, Volland D, Kunkel M, Reichert TE. Dual role of VEGF family members in the pathogenesis of head and neck cancer (HNSCC): possible link between angiogenesis and immune tolerance. Med Sci Monit 2005 11 (8): BR 280-92 196. Swaneck GE, Fishman J. Covalent binding of the endogenous estrogen 16hydroxyestrone

to

estradiol

receptors

in

human

breast

cancer

cells:

characterization and intranuclear localization. Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85: 7831-7835 197. Tae K, El-Naggar AK, Yoo E, Feng L, Lee JJ, Hong WK, Hittelman WN, Shin DM. Expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density in head and neck tumorigenesis. Clin Cancer Res 2000; 6 (7): 2821-8

95

198. Tanaka N, Ogi K, Odajima T, Dehari H, Yamada S, Sonoda T, Kohama G. pRB2/p130 protein expression is correlated with clinicopathological findings in patients with oral squamous cell carcinoma. Cancer 2001; 92: 2117-2125 199. Teknos TN, Cox C, Barrios MA, Chepeha DB, Bradford CR, Fisher SG, Wolf GT. Tumor angiogenesis as a predictive marker for organ preservation in patients with advanced laryngeal carcinoma. Laryngoscope 2002; 112 (5): 844-51 200. Tímár J. Clinicopathology of Tumor Metastasis. In. Diagnosis and Suregery of Organ Metastases. Ed. Besznyák I. Akadémiai Kiakdó, Budapest, 2001. pp. 2361. 201. Tímár J, Csuka O, Remenár É, Répássy G, Kásler M. Progression of head and neck squamous cell cancer. Cancer Metast Rev 2005; 24:107-127 202. Ushijama C, Tsukamoto S, Yamazuki K, Yoshimo I, Sugio K, Sugimachi K. High vascularity in the peripheral region of non-small cell lung cancer tissue is asociated with tumor progression. Lung Cancer 2001; 34: 233-241 203. Valente G, De Stefani A, Jemma C, Giovarelli M, Geuna M, Cortesina G, Forni G, Palestro G. Infiltration leukocyte populations and T-lymphocyte subsets in head and neck squamous cell carcinomas from patients receiving perilymphatic injections of recombinant interleukin-2. Mod Pathol 1990; 3: 702-708 204. Van Trappen PO, Pepper MS. Lymphatic dissemination of tumour cells and the formation of micrometastases. Lancet Oncol 2002; 3: 44-52 205. Venkov CD, Rankin AB, Vaugham DE. Identification of authentic estrogen receptor in cultured endothelial cells. A potential mechanism for steroid hormon regulation of endothelial function. Circulation 1996; 94: 727-33 206. Verastegui E , Barrera JL , Zinser J , Del Rio R, Meneses A, De La Garza J, Hadden JW. A natural cytokine mixture (IRX-2) and interference with immune supression induce immune mobilization and regression of head and neck cancer . Int J Immunpharmacol 1997; 19: 619-627 207. Vermeulen PB, Gasparini C, Fox SB. Second international consensus on the methodology and criteria of evaluation of angiogenesis quantification in solid human tumors. Eur J Cancer 2002; 38: 1564-1579 208. Vielba R, Bilbao J, Ispizua A, Zabalza I, Alfaro J, Rezola R, Moreno R, Elorriagga J, Alonso I, Baroja A, de la Hoz C. p53 Cyclin D1 as a prognostic

96

factors in squamous cell carcinoma of the larynx. Laryngoscope 2003; 113: 167172 209. Virolainen E, Tuohimaa P, Altasalo K, Kytta J, Vanharanta-Hiltunen R. Steroid hormon receptors in laryngeal carcinoma. Otolaryngol Head Neck Surg 1986 Apr; 94 (4): 512-7 210. Virolainen E, Vanharanta R, Carey TE. Steroid hormone receptors in human squamous carcinoma cell lines. Int J Cancer 1984 Jan15; 33 (1): 19-25 211. Vlock DR, Snyderman CH, Johnson JT, Myers EN, Eibling DE, Rubin JS, Kirkwood JM, Dutcher JP, Adams GL. Phase B trial of the effect of peritumoral and intranodal injections of interleukin-2 in patients with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck: an Eastern Cooperative Oncology Group trial. Immunother 1994; 15: 134-139 212. Walker MJ, Ronan SG, Han MC, Beattie CW, Das Gupta TK. Interrelationship between histopathologic characteristics of melanoma and estrogen receptor status. Cancer 1991; 68: 184-188 213. Wehrhan F, Grabenbauer GG, Rodel F, Amann K, Schultze-Mosgau S. Exogenous modulation of TGF-beta (1) influences TGF-betaR-III-associated vascularization during wound healing in irradiated tissue. Strahlenther Onkol 2004; 180: 526-533 214. Weidner N. Intratumoral microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Pathol 1995; 147: 9-19 215. Weiss SW, Langloss JM, Shmookler BM. Estrogen receptor protein in bone and soft tissue tumors. Lab Invest 1986; 54: 689-694 216. Welkoborsky HJ, Hinni M, Dienes HP. Predicting recurrence and survival in patients with laryngeal cancer by means of DNA cytometry, tumor front grading and proliferation markers. Ann Otol Rhinol Laryngol 1985; 104: 503-510 217. Whiteside TL, Letessier E, Hirabayashi H, Vitolo D, Bryant J, Barnes L, Synderman C, Johnson JT, Myers E, Herberman RB, Rubin J, Kirkwood JM, Vlock DR. Evidence for local and systemic activation of immune cells by peritumoral injections of interleukin 2 in patients with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck. Cancer Res 1993; 53: 5654-5662

97

218. Whiteside TL. Immunobiology and immunotherapy of head and neck cancer. Current Oncol Rep 2001; 3: 46-55 219. Wijffels KI, Kaanders JH, Rijken PF, Bussink J, van der Hoogen F, Marres HA, de Wilde PC, Raleigh JA, van der Kogel AJ. Vascular architecture and hypoxic profiles in human head and neck squamous cell carcinomas. Br J Cancer 2000; 83: 674-683 220. Wilson CA, Slamon DJ. Evolving understanding of growth regulation in human breast cancer: interaction of the steroid and peptide growth regulatory pathways. J.Natl Cancer Inst 2005; 97: 1238-39 221. Wilson JA, Rogers MJ, Hawkins RA, Gilmour HM, Maran AG .Epidermal growth factor receptors and oestrogen receptors in head and neck . Clin Otolaryngol 1993 Feb; 18(1): 66-8 222. Wu C-W, Chang H-M, Kao H-L, Lui W-Y, Peng F-K, Chi C-W. The nontransformed progesterone and estrogen receptors in gastric cancer. Gastroenterology 1992; 102: 1639-1646 223. Yasumoto K, Mivazaki K, Nagashima A, Ishida T, Kuda T, Yano T, Sugimachi K, Nomoto K. Induction of lymphokine-activated killer cells by intrapleural instillation of recombinant interleukin-2 in patients with malignant pleurisy due to lung cancer. Cancer Res 1987; 47: 2184-2187 224. Yokozaki H, Takekura N, Takanashi A, Tabuchi J, Haruta R, Tahara E. Estrogen receptors in gastric adenocarcinoma: a retrospective immunohistochemical analysis. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 1988; 413: 297-302 225. Yoo HJ, Sepkovic DW, Bradlow HL, Yu GP, Sirilian HV, Schantz SP. Estrogen metabolism as a risk factor for head and neck cancer. Otolaryngol Head Neck Surg 2001; 124: 241-7 226. Young MRI, Wright MA, Lozano Y, Matthews JP, Benefield J, Prechel MM. Mechanisms of immune supression in patients with head and neck cancer : influence on the immune infiltrate of the cancer . Int J Cancer 1996 ; 13:125-131 227. Yuen APW, Lam KY, Lam LK, HoCM, Wong A, Chow TL, Yuen WF, Wei WI. Prognostic factors of clinically stage, thickness, shape, growth pattern, invasive front malignancy grading, Martinez-Gimeno score, and pathologic features. Head Neck 2002; 24: 513-520

98

228. Zatterstrom UK, Brun E, Willen R, Kjellen E, Wennerberg J. Tumor angiogenesis and prognosis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck 1995; 17:312-318 229. Zetter BR. Angiogenesis and tumor metastasis. Ann Rev Med 1998; 49: 407-424

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AEC : amino-ethyl-carbazol bFGF : basic Fibroblast Growth Factor BSA : Bovin Serum Albumin CLEVER 1 : Common Lymphatic Endothelial and Vascular Endothelial Receptor CTLL : Cytotoxic T-Lympatic cell Line DAB : 3,3’-diaminobenzidin-tetrahidrochlorid DEPC : dietil-pirokarbonát ER : Estrogen Receptor E2F1 : transzkripciós faktor EGF : Endothelial Growth Factor GM-CSF : Granulocyte-Macrophage Colony-Stymulating Factor HIF-1 : Hipoxia Inducing Factor-1 HLA : Human Leukocyte Antigen HPV : Human Papilloma Virus IFN-γ : interferon-γ IL-1,2,12 : interleukin 1,2,12 LVD : Lymphatic Vascular Density LYVE1 : Lymphatic Vessel Endothelial Receptor 1 MDM2 : Murine Double Minute 2

99

MIB-1 : proliferációs marker MMP : Matrix Metalloproteinase MVD : Micro Vessel Density 2-αOHE1 : 2-αHidroxyEstrone 16-αOHE1 : 16-α HydroxiEstrone PBS : Phosphate Buffered Saline PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen PCR : Polimerase Chain Reaction PDGF : Platelet Derived Growth Factor PGR : Progesterone Receptor PKC : Protein Kinase C PLC : Phospho Lipase C PNAD : Peripheral lymph Node Adressin STAT 3 : Signal Transducers and Activators of Transcription -3 TNF-α : Tumor Necrosis Factor-α TRIS : Tris –Buffered-Saline Tris : Tris(hidroximetyl) aminometán Tris(hidroximetyl) metylamin VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VEGF-R : Vascular Endothelial Growth Factor Receptor

100

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném köszönetemet és hálámat kifejezni Dr. Tímár József professzor Úrnak,

aki

bizalommal

felvett

kutató

munkacsapatába,

képzésemhez

és

kutatómunkámhoz minden feltételt biztosított, valamint éveken át támogatta és irányította munkámat. Köszönetet mondok az Országos Onkológia Intézet vezetőjének, Dr. Kásler Miklósnak, hogy hozzájárult ahhoz, hogy kutató tevékenységemet ebben az intézményben folytathassam. Köszönöm Prof. Dr. Szende Bélának és Prof. Dr. Kopper Lászlónak, akik intézetvezetőként, és Prof. Dr. Jeney Andrásnak, hogy programvezetőként lehetővé tették tudományos tevékenységemet a Semmelweis Egyetem 1.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetében. Külön köszönettel tartozom dr. Rásó Erzsébetnek, aki fáradtságot nem ismerve segített a molekuláris biológia minden nehézségének leküzdésében, dr. Lövey Józsefnek, akivel hosszú ideig együtt dolgoztunk, dr. Ladányi Andreának a disszertációm elkészítéséhez nyújtott értékes tanácsokért, prof. Dr. Répássy Gábornak, aki mindvégig támogatta munkámat, és dr. Remenár Éva főorvos asszonynak, akivel együtt dolgozhattam a fejnyaki daganatos betegek hormonvizsgálatán. Szeretném megköszönni a megjelent közleményeim összes szerzőtársának a munkámhoz nyújtott támogatást, név szerint a következő személyeknek: Balatoni Zsuzsanna, Bajtai Attila, Bencsik Beáta, Döme Balázs, Chretien Paul, Forster-Horváth Csaba, Gődény Mária, Juhász Attila, Élő János, Koronczay Krisztina, Németh György, Paku Sándor, Pócza Károly, Suba Zsuzsa, Szabó György, Talor Eyal, Velich Norbert, Zemplén Béla. Ezen kívül köszönöm az Országos Onkológia Intézet Tumor Progressziós Osztálya és a Semmelweis Egyetem 1.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet dolgozóinak, hogy segítették a munkámat. Végül szeretném megköszönni férjemnek valamint családomnak, hogy éveken át bíztak bennem, megteremtették a képzésemhez és tudományos tevékenységemhez szükséges hátteret, támogattak és segítettek minden felmerült akadály esetében.

101