Fehérjék szerkezete $IHKpUMpNIpOHDPLQRVDYEyOpSOQHNIHO(]HNDN|YHWNH]N glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, fenilalanin, tirozin, triptofán, cisztein, metionin, szerin, treonin, lizin, arginin, hisztidin, aszpartát, glutamát, aszparagin, glutamin, prolin. Az aminosavakban egy Catomhoz – az α-C-atomhoz – egy karboxilcsoport (–COOH), egy aminocsoport (–NH2), egy H-atom és egy oldallánc kapcsolódik. Az eltérés az aminosavak között az oldalláncokban van. Az aminocsoport protonálódhat (–NH3+), a karboxilcsoport disszociálhat (–COO–). Ezen csoportok ionizációs állapota a pH-tól függ. Savas pH-n csak az aminocsoport ionizálódik, lúgos pH-n csak a karboxilcsoport, semleges S+QiOWDOiEDQPLQGNHWW$]WDS+WDPelyen a fehérjék nettó töltése nulla – azaz ugyanannyi –NH3+ csoportjuk van, mint –COO– –, a fehérje izoelektromos pontjának nevezzük. A pK az a pH, amelyen egy gyenge savban vagy gyenge lúgban ugyanannyi ionizált molekula van, mint amennyi nem ionizált. Az aminosavak egyszerre savak is és lúgok is, ezért külön beszélünk az aminocsoporthoz tartozó pK-ról és a karboxilcsoporthoz tartozó S.UyO (OEEL XWyEEL (] W|EEQ\LUH PLQGHQ DPLQRVDYUD megegyezik. Fehérjékben ezek az értékek 8,0-ra és 3,1-re változnak. Minden aminosavnak kétféle konformációja lehetséges: L-izomer és D-izomer. Ezek az α&DWRPN|UOLQpJ\FVRSRUWHOUHQGH]GpVpEHQNO|QE|]QHNHJ\PiVWyO/L]RPHUDPLQoVDYDNEDQD]ROGDOOiQFIHOOYLVV]DQp]YHD]aminocsoport, a karboxilcsoport és a H-atom ilyen sorrendben az óramutató járásával ellentétes irányban követik egymást, D-izomer aminosaYDNQiOPHJIRUGtWYD$IHKpUMpNEHQNL]iUyODJ/L]RPHUHNIRUGXOQDNHO Az aminosavak peptidkötésekkel kapcsolódnak össze polipeptid lánccá:
A SHSWLGN|WpVW OpWHVtW QpJ\ DWRP HJ\ VtNEDQ KHO\H]NHGLN HO D N|WpV PHUHY D &±1 kötés körül nem valósulhat meg forgás. Az Cα–N kötés körül valamint a Cα–C kötés körül YLV]RQWDOiQFHOIRUGXOKDW$]HOIRUGXOiVV]|JpWD]HOEELHVHWEHQφ-vel, az utóbbi esetben ψvel jelöljük. G. N. Ramachandran észrevette, hogy hogy egy polipeptidláncban az egy aminosavhoz tartozó φ és ψ szögek nem vehetnek fel akármilyen értékeket. Ramachandran ábrák: IJJOHJHVWHQJHO\HQDψ, vízszintes tengelyen a φ. A fehérjék közötti különbségeket az aminosavsorrend határozza meg. Az aminosavsorrend és a diszulfidhídak lokalizációja – tehát a kovalens kötések teljes leírása – HJ\WWNpSH]LDIHKpUMpNHOVGOHJHVV]HUNH]HWét. Fehérjék aminosavsorrendjének meghatározása (OVOpSpVNpQWDszekvenálni kívánt peptidlánc aminosav-összetételét határozzuk meg (a sorrendjük nélkül). Ezt könnyen elvégezhetjük úgy, hogy kb. 120 °C-on, 10 atm nyomáson, VDYDVN|]HJEHQWDUWMXNNHWyUiLJ(]DODWWDpeptidlánc szétbomlik aminosavaira, amik valamilyen kromatográfiai módszerrel szétválaszthatók. Festésükre ninhidrint vagy IOXRUHV]NDPLQW KDV]QiOQDN (OEEL D] DPLQRVDYDNDW NpNUH D] iminosavakat (prolin) sárgára festi, utóbbi az α-aminocsoporttal fluoreszcens származékot hoz létre. Az aminosavak azonosítása a kimosásukhoz szükséges puffer mennyisége alapján történik. A szekvencia meghatározása az ún. Edman-degradálássalYpJH]KHWHO$]HOMiUiVVorán fenilizotiocianátot kevernek a fehérjéhez, ami hozzákapcsolódik annak semleges láncvégi aminocsoportjához, majd enyhén savas közegben a láncvégi aminosavval együtt leválik a lánc VpUWHWOHQ PDUDGpN UpV]pUO $ OHYiOW UpV]W feniltiohidantoin (PTH) -‘aminosav’-nak nevezzük
és valamilyen kromatográfiás módszerrel azonosíthatjuk. A lánc maradék részére ezután megismételhetjük a fenti eljárást és azonosíthatjuk a második aminosavat. A fenti módszerre alapozva kifejlesztettek egy automatizált és gyorsabb eljárást, melyben a fehérjét vékony filmre viszik fel, amit egy forgó lemezen rögzítenek. A szükséges reaJHQVHNHWiWiUDPROWDWMiNDOHPH]I|O|WWPDMGDNHOHWNH]PTH-‘aminosav’ komplexeket nagynyomású folyadék kromatográfiával (high pressure liquid chromatography, HPLC) azonosítják. Ezzel az Edman-degradálás egy lépése mindössze két órát vesz igénybe, de csak kb. 50 aminosavból álló láncok szekvenciája határozható meg vele megbízhatóan. Hosszabb láncok V]HNYHQiOiViKR]D]RNDWHOEEV]pWNHOOV]DEGDOQLNLVHEE NEDPinosavat tartalmazó) egységekre, azokat kromatográfiával egymástól el kell választani, majd a kapott szakaszokat Edman-degradálással szekvenálhatjuk. A láncok feldarabolására alapveten két módszer kínálkozik: kémiai és enzimatikus feldarabolás. Kémiaira példa a cianogénbromid (CNBr), ami a metionin karboxilcsoportjainál szakítja meg a láncot. Enzimatikusra SpOGDDWULSV]LQ DKDVQ\iOPLULJ\EHQWHUPHOGIHKpUMHERQWyHQ]LP DPLD]arginin és a lizin karboxilcsoportjainál hidrolizál. Az egész lánc aminosavsorrendjét ezek után még nem tudjuk meghatározni, ehhez valamely másik anyaggal más aminosavaknál is el kell szakítani a láncot, az így kapott kisebb szakaszokat ismét szekvenálni kell, és így mivel ezek a szakaszok átfednek a korábban kapott szakaszokkal, a teljes lánc aminosavsorrendje meghatározható. Ez az eljárás azonban csak egyláncú és diszulfid hidakat nem tartalmazó fehérjékre alkalmazható. Olyan fehérjék esetében, melyekben több polipeptidlánc kapcsolódik össze QHPNRYDOHQVN|WpVHNNHODIHKpUMpNHWHOV]|UGHQDWXUiOyYHJ\V]HUHNNHO±SpOGiXONDUEDPLGGDO vagy guanidin-hidrokloriddal – láncaira bontjuk, a kapott láncokat elkülönítjük egymástól, majd alkalmazzuk a fenti eljárást. A diszulfid hidakat β-merkaptoetanollal vagy ditiotreitollal szakíthatjuk fel, majd a rekombinálódás megakadályozása érdekében jódacetátot (ICH2COO–) alkalmazunk, ami hozzákapcsolódik a kénatomokhoz. A diszulfid hidak helyének meghatározására szolgál az átlós elektroforézis. Ebben elször a polipeptidláncokat kisebb peptidekre bontjuk olyan körülmények között, hogy a diszulfid hidak épen maradjanak. Ezután elektroforézist hajtunk végre a mintán, majd az így kapott IHKpUMpNHW WDUWDOPD]y JpOW VDYDV J]EH KHO\H]]N DKRO D GLV]XOILG KLGDN LV IHOV]DNDGQDN miközben SO3–-csoportok alakulnak ki rajtuk. Ekkor újabb HOHNWURIRUp]LVW YpJ]QN D] HO] LUiQ\iUDPHUOHJHVHQ$]RNDpeptidek, amelyek nem tartalmaztak diszulfid hidakat, most is XJ\DQRO\DQPR]JpNRQ\DNOHV]QHNPLQWD]HOVelektroforézisben, ezért a gélen az átló mentén helyezkednek el, a diszulfid hidakat tartalmazó fehérjék mozgékonysága viszont megváltozik, H]pUWH]HND]iWOyWyOWiYRODEENHUOQHNtJ\N|QQ\HQpV]UHYHKHWKRJ\PHO\LNpeptidek között alakult ki diszulfid híd. A V]HNYHQiOiVEDQQDJ\HOUHOpSpVWMHOHQWHWWDrekombináns DNS-technika felfedezése, amelyben a DNS Ei]LVVRUHQGMpWKDWiUR]]XNPHJDPLEOD]DPLQRVDYDNkodonjainak ismeretében a DNS által kódolt fehérje aminosavsorrendje meghatározható. Ez az eljárás megkönynyítette és meggyorsította a fehérjék V]HNYHQiOiViW VW QDJ\RQ KRVV]~ DPLQRVDYEyO iOOy IHKpUMpN HVHWpQ H] D] HJ\HWOHQ OHKHWVpJ PLYHO D '16 HVHWpEHQ KRVV]~ OiQFRN LV Yiszonylag könnyen szekvenálhatók. Mindez azonban nem teszi szükségtelenné a fehérjék közvetlen vizsgálatát, hiszen a WpUV]HUNH]HWN pV D PN|GpVN FVDN tJ\ YL]VJiOKDWy (]HQ NtYO D IHKpUMpN HONpV]OpVH XWiQ még számos ún. posztszintetikus módosulásban vehetnek részt, például foszfát- vagy szulfátcsoportok kapcsolódhatnak hozzájuk (amiket a foszfatáz, ill. a szulfatáz enzimek tudnak leYiODV]WDQL W|OWpVWDGYDDIHKpUMpQHNWRYiEEiGLV]XOILGKLGDNM|KHWQHNOpWUHYDJ\NO|QE|] oldalcsoportok kapcsolódhatnak valamelyik aminosavhoz, például a membránfehérjék eseté-
EHQ V]pQKLGUiW HJ\VpJHN N|WGQHN D] aszparaginsav oldalláncokhoz stb. Ezek rekombináns DNS-technikával nem vizsgálhatók. Fehérjék másodlagos szerkezete A fehérjék másodlagos szerkezete a helikális szerkezetet és a β-réteg szerkezetet foglalja magában. A hélixeknek három fajtáját különböztetjük meg: 3-10-hélix: minden harmadik aminosav létesít hidrogénhidat, α-hélix: minden negyedik aminosav létesít hidrogénhidat, π-hélix: minden ötödik aminosav létesít hidrogénhidat. A β-rétegek fajtái: paralell: a párhuzamos peptidláncok egy irányba futnak, antiparalell: a párhuzamos SHSWLGOiQFRNHOOHQNH]LUiQ\EDIXWQDN β-turn: a peptidlánc 180°-os fordulata.
α-hélix Az α-hélix menetemelkedése 5,4 Å, egy meneten 3,6 aminosav foglal helyet, így két szomszédos aminosav között 100°-ot fordul a lánc és 1,5 Å-öt emelkedik. Az α-hélixek lehetnek jobbkezesek (right-handed) és balkezesek (OHIWKDQGHG (OEELHVHWEHQ~J\WXGXQNHOUehaladni a láncon, ha az óramutató járásával PHJHJJ\H]LUiQ\EDQKDODGXQNUDMWD QRUPiOFVavarok menete), utóbbi esetben meg fordítva. A fehérjékben csak jobbkezes α-hélixek fordulQDNHO$]α-hélixek hossza 40 ÅWOÅ-ig terjed. Két vagy több α-hélix össze is fonódhat egy „kábellé”. Ezek angol elnevezése α helical coiled coil (α helikális tekercselt tekercs). ,O\HQ ILJ\HOKHW PHJ D NHUDWLQEDQ KDM D miozinban és a tropomiozinban (izom), az HSLGHUPLQEHQ EU pVDILEULQEHQ YpU
β-réteg A β-rétegben a polipeptidlánc csaknem teljesen ki van terítve, a szomszédos aminosavak tengely mentén mért távolsága 3,5 Å, szemben az αKpOL[UH MHOOHP] Å-mel. A βréteget szintén H-kötések stabilizálják az –NH és a –CO csoportok között, ám itt ezek a kötések a szomszédos láncokat kötik össze, és nem egy láncon (szakaszon) belül hatnak. β-turn-ben az nHGLNDPLQRVDY+N|WpVVHON|WGLND] n+3-ik aminosavhoz, és ezáltal HJ\KDMWFVDYDUM|QOpWUHβ-turn gyakran antiparallel β-láncokat köt össze – innen kapta a nevét. A harmadlagos szerkezet az α-hélix és a β-réteg lánc menti eloszlását jelenti. A több polipeptidláncból álló fehérjéket a negyedleges szerkezet is jellemzi, ami az egyes polipeptidláncok egymáshoz viszonyított helyzetét illetve kapcsolatát jelenti. $ IHKpUMpN V]HUNH]HWpUO KDV]QRV LQIRUPiFLyNDW Q\HUKHWQN D] ,QWHUQHW ROGDODLUyO (www.pdb.bnl.gov, ill. www.expasy.ch), melyeken sok fehérje szekvenciája, másodlagos szerNH]HWHpVWpUV]HUNH]HWHPHJWDOiOKDWy $ PiVRGODJRV V]HUNH]HWHW D WpUV]HUNH]HWEO KDWiUR]]iN meg pl. '663PyGV]HUUHO$NO|QE|]PyGV]HUHNIOHJD]α-hélixek, illetve a rendezetlen szakaszok meghatározásában különbözhetnek egymástól. Fehérjék szerkezetének meghatározása energiaminimalizációval Az alapállapotot azáltal definiáljuk, hogy a hozzá tartozó energia minimális. Fel kell tUQXQNWHKiWHJ\SRWHQFLiOLVHQHUJLDNpSOHWHW(UUHNO|QE|]DODN~HPSLULNXV~WRQIHOiOOtWRWW ún. forcefieldek léteznek, melyek tartalmazzák a kötéshosszakat, kötésszögeket, torziós szögeket, out of SODQHNRRUGLQiWiNDWD]H]HQ~QEHOVNRRUGLQiWiNN|]WLFVDWROiVRNDWYDODPLQWD van der Waals- és Coulomb-kölcsönhatást. Az említett koordináták függvényében felrajzolhatjuk az energiafelületet. A minimumkeresésben az alapállapottól távol a legmeredekebb esés, az alapállapothoz közel a konjugált gradiensek módszere bizonyul a legeredményesebbnek. A legmeredekebb esés módszerében minden lépésben úgy változtatjuk meg a konfigurációt, hogy az energia csökkenése a legnagyobb legyen, azaz az energiafelület gradiensének irányába mozdulunk el. A konjugált gradiensek módszerében az egyensúlyi helyzet körüli oszcillációkat elkeUOHQGPHJMHJ\H]]ND]HO]OpSpVLUiQ\YHNWRUiWpVJUDGLHQVpWpVH]HNILJ\HOHPEHYpWHOpYHO hatáUR]]XNPHJDN|YHWNH]OpSpVLUiQ\YHNWRUiW A számítások meggyorsítására a párkölcsönhatásokat csak az általunk definiált ún. cutoff-távolságokon belül vesszük figyelembe. Ezen FXWRIIWiYROViJRNDW FpOV]HU ~J\ GHILQiálni, hogy az összetartozó töltött molekularészek egy csoportba tartozzanak. A cutofftávolságokat természetesen minden lépésben újra kell definiálni, de használatos az ún. dulpaFXWRII PyGV]HU LV DPHO\EHQ NHWW FXWRIIWiYROViJRW GHILQLiOXQN PHO\HN N|]O D NOVW FVDN bizonyos számú lépés után frissítjük. Az oldószer hatásának pontos meghatározása az oldószermolekulák nagy száma miatt iOWDOiEDQQDJ\RQVRNLGWYHQQHLJpQ\EHH]pUWFVDNDOHiUQ\pNROyKDWiVWYHVV]NILJ\HOHPEH HJ\WiYROViJIJJdielektromos állandó bevezetésével. A molekulák konformációváltozásainak szimulációja során a potenciális energia (IRUFHILHOG QHJDWtY JUDGLHQVpEO V]iPROW HUNUH ROGMXN PHJ D 1HZWRQHJ\HQOHWHNHW QXPHUikus integrálással. A kezdeti sebességeket a 0D[ZHOO%ROW]PDQQHORV]OiVQDNPHJIHOHOHQYéOHWOHQV]HUHQ UHQGHOMN KR]]i D] HJ\HV DWRPRNKR] D KPpUVpNOHWHW D NLQHWLNXV HQHUJLiEyO származtatva. A cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia
A CD-spektroszkópia fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezetének és szerkezetváltozásának vizsgálatára szolgál. Lényege, hogy bizonyos frekvenciatartományban (UV) a NO|QE|]LUiQ\RNEDFLUNXOiULVDQSRODUL]iOWHOHNWURPiJQHVHVVXJiU]iVWDIHKpUMpNNO|QE|]képpen törik és nyelik el. Ennek magyarázata a delokalizált elektronok viselkedésében rejlik. A távoli UV tartományban (180 nm-260 nm) az amidcsoportok delokalizált elektronjai KDWiUR]]iNPHJD&'VSHNWUXPRWH]pUWH]DPiVRGODJRVV]HUNH]HWUHMHOOHP]$NDSRWWVSHNtUXPUDH]XWiQLVPHUWV]HUNH]HWIHKpUMpN&'VSHNWUXPDLQDNOLQHiULVNRPELQiFLyMiWLOOHV]WMN $]LOOHV]WpVHUHGPpQ\pEODNO|QE|]V]HUNH]HWLHOHPHNDUiQ\DPHJKDWiURzható. A közeli UV tartományban (260 nm-320 nm) felvett CD-spektrum az aromás oldallánFRN HOKHO\H]NHGpVpUH pV tJ\ D KDUPDGODJRV V]HUNH]HWUH MHOOHP] H]pUW VHJtWVpJpYHO H]HN megváltozását követhetjük nyomon. $VtNEDQSRODUL]iOWVXJiU]iVWHKiW±PHO\HOiOOtWKDWyNpWHOOHQWpWHVLUiQ\EDFLUNXOiUisan polarizált fény szuperpozíciójaként – a fehérjemintán áthaladva elliptikusan polarizált lesz. Így felvehetjük az HOOLSWLFLWiVWDIUHNYHQFLDIJJYpQ\pEHQDPLMHOOHP]DIHKpUMHV]HUNezetére. /pWH]LN HJ\ PiVLN HOMiUiV LV DPHO\EHQ FVDN D] DEV]RUSFLyNpSHVVpJ NO|QE|]VpJpW használják ki a kétféle cirkulárisan polarizált fényre. Ekkor a Lambert–Beer-törvényben szeUHSO DEV]RUSFLyV NRHIILFLHQVHN NO|QEVpJpW YHKHWMN IHO D IUHNYHQFLD IJJYpQ\pEHQ DPL szintén alkalmas a fehérjék szerkezetének jellemzésére. Fehérjék szerkezetének vizsgálata kalorimetriával (DSC) A kalorimetriai mérés során a fehérjék térszerkezetének megváltozását a termodinamikai paramétereik vizsgálatán keresztül követjük nyomon. Általában az állandó nyomáson vett KNDSDFLWiVW PpUMN DPLEO N|YHWNH]WHWKHWQN D] HQWDOSLD HQWUySLD pV D V]DEDG HQWDOSLD megváltozására. Az eljárás neve differenciális pásztázó kalorimetria (differential scanning calorimetry, DSC). /pQ\HJHKRJ\NO|QE|]KPpUVpNOHWHNHQPpUMNDNpWPLQWDWDUWyEDQHOKHO\H]HWWRldat KNDSDFLWiViQDN NO|QEVpJpW DPLW tJ\ D KPpUVpNOHW IJJYpQ\pEHQ iEUi]ROKDWXQN ËJ\ kapjuk a DSC-görbét. Az egyik mintatartóba a referencia-oldatot töltjük, ami a tiszta puffer, a másikba a vizsgált fehérje oldatát. A fehérje átalakulása (denaturációja) alatt a KNDSDFLWiVD HUVHQPHJYiOWR]LNtJ\DDSC-görbén éles csúcs jelentkezik. A csúcs maximumának megfeOHOKPpUVpNOHWHWWHNLQWMND]iWDODNXOiVLKPpUVpNOHWQHN A szabad entalpia változását a ∆G = RT⋅lnK összefüggés alapján követhetjük nyomon, DKRO.DQDWtYpVDGHQDWXUiOWiOODSRW~PROHNXOiNV]iPiQDNDUiQ\D.DKPpUVpNOHWIJJYéQ\HpV~J\KDWiUR]KDWyPHJKRJ\D]DGRWWKPpUVpNOHWLJNLV]iPtWMXNDJ|UEHDODWWLWHUOHWHWpV HORV]WMXNDWHOMHVWHUOHWWHO.pUWpNHQ|YHNYKPpUVpNOHWWHOGXUYiQOLQHiULVDQFV|NNHQ
