Fehérjék Bevezető A fehérjék szerkezeti hierarchiája: - elsődleges szerkezet (aminosav sorrend) - másodlagos szerkezet (α-hélix, β-redő, stb.) - harmadlagos szerkezet (domének és modulok) - negyedleges szerkezet (alegység-struktúrák) A fehérjék térszerkezet-viszgálati módszerei A fehérjék belső mozgékonysága Bevezetés az enzimek világába - oxidoreduktázok (az alkohol-dehidrogenáz) - transzferázok - hidrolázok (a szerinproteázok, a lizozim) - liázok - izomerázok - ligázok Érdekes fehérjék
Fehérjék - az élő rendszerekben a víz után a fehérje a legelterjedtebb molekulatípus, - a fehérjék lokális koncentrációja igen magas, - sokrétű feladatot látnak el: motorfehérjék, enzimek, antitestek, hormonok, szállítanak, etc. - a sejtben előforduló szinte összes kémiai átalakítást fehérjék végzik
RNS vírus: DNS vírus: Baktérium:
1-25 gén 10-1 000 gén 500-6 000 gén
Ember (3 000 000 000 bp): 23 000-24 000 gén ~ 100 000 fehérjét kódol Növény: > 50 000 gén
A fehérjék természetes lineáris polimerek: poliamidok
Poliamid polimerek: kémiai összetétel Egyetlen amino-karbonsavból is felépíthetünk lineáris poliamid rendszereket:
1 mol ε-kaprolaktám poliaddíciós reakciója 1 mol vízzel elindítható, amely ε-peptideket eredményez (~260°C /N2 atmoszféra, 4-5 óra reakcióidő után az ismert műanyagot a poliamid 6-ot vagy más néven a Nylon 6-ot kapjuk).
Poliamid polimerek: az amidkötés téralkata A határszerkezetek szemléltetik hogy 2 nemkötő elektronpár 3 centrumra (O, C’ és N) delokalizálódik, így a C-N kötésnek is van kettőskötés jellege, s ezért válik a peptidkötés síkalkatúvá: 6 atom (Cα,C’,O és a Cα, NNH,HNH) egy síkban van.
Az amidkötés adatai:
Az amid síkalkatú, s ennek következménye, hogy a polipeptidlánc nem teljesen flexibilis. A főláncban az ismétlődő amidokat a Cα atomok „kötik” össze. Az NNH-Cα és a Cα-C’ kovalens σ-kötések mentén az elfordulás viszonylagosan szabad, annak mértékét a φ és a ψ torziósszögek nagysága méri. (Az oldalláncok torziósszög értékeit a χ(i) változók rögzítik.)
A fehérjék szerkezeti hierarchiája: - elsődleges szerkezet (aminosavsorrend) - másodlagos szerkezet (α-hélix, β-redő, stb.) - harmadlagos szerkezet (domének és modulok) - negyedleges szerkezet (alegység-struktúrák) Az elsődleges szerkezet a fehérjét felépítő aminosavak sorrendje: balról jobbra, az N-terminálistól a C-terminális felé írjuk és rajzoljuk a polipeptidláncot. A kémiai összetételt, tehát az aminosavakat és azok sorrendjét a megfelelő gén(ek) kódolják.
H-Thr--His--Ile--Ser--Ser--Ile-Met-Pro-Leu-Glu-OH
A fehérjék szerkezeti hierarchiája: - elsődleges szerkezet (aminosavsorrend) - másodlagos szerkezet (α α-hélix, β-redő, stb.) - harmadlagos szerkezet (domének és modulok) - negyedleges szerkezet (alegység-struktúrák) A szabályos (periodikus és aperiodikus) valamint szabálytalannak (fokozott belső mozgásúnak leírt, rendezetlennek) mondott fehérjerészek együttese. Elsőként Linus Pauling javasolta az α-hélix és a β-redőzött rétegek megjelölést. E két fajta, valamint a többi tipikus konformációs építőelem a Ramachandranfelület jellegzetes régióiban azonosítható. Meghatározásukhoz gyakran ismétlődő alapalkatok (foldamer) és mintázatok (pl. H-híd) felismerése vezet.
α-hélix
β-redő
γ-kanyar tipikus peptidkonformerek elhelyezkedése a Ramachandran-felületen: 0o ≤ ϕ,ψ ≤360o intervallum esetén a E=E(ϕ, ψ) térképen
A másodlagos szerkezeti elemek: α-hélix, β-redő, stb. Polipeptidek térszerkezete tipikus konformerek
periodikus, homo-konformerek φ(i) = φ(i–1) és ψ(i) = ψ (i–1) - 310-, α-, π- hélix, - β-redőzött réteg, - kollagén-hélix (PPII szerkezet)
aperiodikus, hetero-konformerek φ(i) ≠ φ(i–1) és ψ(i) ≠ ψ (i–1) β-kanyar szerkezetek: - I (és I’) típusú - II (és II’) típusú - VIa (és VIb) típusú - VIII típusú
atipikus konformerek
A másodlagos szerkezeti elemek: α-hélix, β-redő, stb. - alfa hélix (α-hélix): a természetes L-aminosavak esetében a jobb csavarmenet téralkat a szokásos (rugó). Itt minden (i+4). amidcsoport H-donor az i. amid C=O felé. alfa hélix: Pauling-Corey-Branson jobbmenetes α-hélix
C-terminális
balmenetes α-hélix
N-terminális
φ(i) = φ(i–1) ~ –54º és ψ(i) = ψ (i–1) ~ –45º memo: a 2 db α-hélixből feltekeredő coiled-coil szerkezet, balmenetes szupramolekuláris komplexet eredményez. => harmadlagos szerkezet
A másodlagos szerkezeti elemek: α-hélix, β-redő, stb. Helikális vagy spirális téralkat: lehet jobbmenetes vagy balmenetes 1) ha a spirális szerkezeti elemnek nincs kitüntetett vége (vagy eleje) (pl. rugó) akkor is meglehet a tükörképi pár. 2) ha a spirális szerkezeti elemnek van kitüntetett vége (vagy eleje): pl. oszlop (töve és teteje), csavarhúzó (feje), peptid hélix (N- és C-term.) N-term.
C-term.
tehát ez egy jobbmenetes csavar
A jobbkéz szabály:
memo: Jobbkezesek a fehérjékben található α-hélixek,a DNS A és B formái, stb.
tehát ez egy jobbmenetes α-hélix
def.: Nézzük a hélixet a hossztengelye mentén. Ha a helikális elmozdulás, amely a nézőtől távolodik az óramutató járásával megegyező irányú, akkor az a hélix jobbmenetes. (Ezt a hélix típust szokás P-helixnek (plusz) nevezni.
A másodlagos szerkezeti elemek: α-hélix, β-redő, stb. Az α-hélix tipikus geometriai jellemzői:
• jobbmenetes • 3,6 aminosav menetenként • 0,54 nm menetmagasság • 0,15 nm emelkedés/aminosav • periodikus: 5 csavar/18 aminosavrész után • d = 1,05 nm • R-csoportok a palástra merőlegesen kifelé • H-kötések hélix tengellyel párhuzamosak
Robert Brainard Corey (1897 –1971) Az α-hélix és a β-redő felfedezője Animáció → http://www.youtube.com/watch?v=eUS6CEn4GSA
A másodlagos szerkezeti elemek: α-hélix, β-redő, stb. A kollagén: (a görög kolla (‘enyv’) és gennao (‘nemz, létrehoz’) elemekből, tehát ‘enyvképző’.
a kollagén téralkata: a természetes L-aminosavak esetében az egyes szálak balcsavarmenetűek. Ideális aminosav összetétel: POG-.
X Y Gly X Y Gly
a tropokollagén: a három kollagén szál együttese, amely jobbmenetes hélixet eredményez! (1954)
φ(i) = φ(i–1) ~ –60º és ψ(i) = ψ (i–1) ~ +135º Animáció → http://www.youtube.com/watch?v=FYbe8hAWvjU
Y Gly X Y Gly X
Gly X Y Gly X Y
memo: Testtömegünk közel negyedét ez a fehérje teszi ki; hialuronsavval és kondroitin szulfáttal „kiegészülve” a bőr, a porc, az ín, az ízület és csont meghatározó komponense.
A másodlagos szerkezeti elemek: α-hélix, β-redő, stb. −β β-redőzött réteg (vagy β-redő) téralkat esetén - antiparallel és - parallel redőket különböztetünk meg. Ezen másodlagos szerkezeti forma a gerincatomok H-hidas összekapcsolódásának következménye, – melyben az oldalláncok csak közvetetten vesznek részt – s ezért sokfajta aminosav azonosítható a a különböző β-redőkben. (Az oldalláncok a redő síkja „alatt és felett” helyezkednek el)
- az antiparallel redőzött réteg térszerkezet: φ(i) = φ(i–1) ~ –150º ψ(i) = ψ (i–1) ~ +150º
Animáció→ http://www.youtube.com/watch?v=wM2LWCTWlrE
N
N
A parallel redőzött réteg térszerkezet:
Cα
Cα O
O
C N
N
H
H
C
O H
N
Cα O
C N
O
N
Cα O
H
Cα
Cα C
C
H
C N
H
Egy érdekes példa: a selyemszál: - aminosav összetétele konzervatív (Gly:Ala:Ser = 3:2:1) - szekvenciális összetétele: –Gly–Ala–Gly–Ala–Gly–Ser– - térszerkezete jellegzetes β-szál
jellemzői: feszes lánc — nem nyújtható hajlékony — rétegek elcsúszhatnak selyemfény — rétegek fénytörése
A másodlagos szerkezeti elemek: α-hélix, β-redő, stb. -a β-kanyar térszerkezet:
i+1
i+2
-a hurkok:
i
i+3
A fehérjék szerkezeti hierarchiája: - elsődleges szerkezet (aminosavsorrend) - másodlagos szerkezet (α-hélix, β-redő, stb.) - harmadlagos szerkezet (domének és modulok) - negyedleges szerkezet (alegység-struktúrák)
Egy fehérje harmadlagos szerkezete azonos az azt felépítő egyetlen polipeptidlánc (3D-) térszerkezetével. A másodlagos szerkezeti elemek feltekeredése következtében létrejövő téralkat egy időátlagban “kvázi azonos” konformer. Jellegzetes hidrofób- és ionos (só-híd) kölcsönhatások, illetve a diszulfid-hidak stabilizálják a kialakult 3D szerkezetet.
A fehérjék téralkatát stabilizáló 5-fajta kötés: – – – – –
peptidkötés, hidrogén-híd (kötés), diszulfid kötés, ionos kötések, hidrofób erők (kötés)
A harmadlagos szerkezet (domének és modulok) Milyen erősek a fehérjéket összetartó kötések és erők? Kovalens kötés
Hidrogén-híd
Ionos-kötés
Van der Waals
Hidrofób erők
~100 kcal/mol
~3 kcal/mol
~ 5 kcal/mol
~1 kcal/mol
~3 kcal/mol
„megosztott” elektronok
víz-víz
teljes töltésátadás
fluktuál
nem igazi kötés
szerves-vizes
H-híddal kompetícióban
indukált dipól
entrópia vezérelt
szerves-szerves
erős „száraz” kristályokban
csak sztérikus közelség esetén
csak vízben hatásos
gyenge, orientáció érzékeny
vízben gyenge
gyenge
gyenge
erős
A biomolekulák harmadlagos szerkezetének kialakítása során a gyenge kötések (kölcsönhatások) összessége igen jelentős.
Van der Waals(hidrofób) potenciál - „túl távol” aszimmetrikusan polarizált elektronfelhők vonzása
3
V/εk
r0= 2.58 Å
2,5 2 1,5
(r0/r)-12
1
- „túl közel” elektronfelhők egymásba hatolása taszítást okoz
(r0/r)-12 - (r0/r)-6
0,5 0 2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
r
-0,5 -1 -1,5
Johannes Diderik van der Waals (1837 - 1923)
ideális (van der Waals) távolság
-(r0/r)-6
-2
túl közel taszítás
ideális egyensúly
túl távol vonzás
A harmadlagos szerkezet (domének és modulok) α-domén szerkezetek: négyes hélixköteg (four-helix bundle) citokróm b562 (a légzési elektrontranszportlánc része) Keratin fibrilláris szerkezeti fehérje α-keratin (haj, gyapjú, köröm) és β-keratin (köröm, kagylóhéj, teknőspáncél)
Aktin: mikrofilament monomer egysége
Miozin
coiled-coil GCN4 transzkripciós faktor
A harmadlagos szerkezet (domének és modulok) β-redő topológiák N
C
aszpartát transzkarbamoiláz enzim C βαβ-motívumok βαβ N flavodoxin (redox fehérje) Greek key motívum C N
C
tripszin (vágva)
N
plasztocianin (elektrontranszporter)
A harmadlagos szerkezet (domének és modulok)
C
A βαβ-motívum: βαβ
N részlet az alkohol dehidrogenáz enzim szerkezetéből (szalagmodell)
A harmadlagos szerkezet (domének és modulok)
Még a globuláris fehérjék térszerkezete is sokféle lehet.
A fehérjék feltekeredése A szerkezeti biokémia „dogmája” •Általánosan elfogadott, hogy az aminosav-szekvencia meghatározza a térszerkezetet • Bizonyíték: denaturációs-renaturációs kísérletek (Anfinsen) • A fehérje natív térszerkezete az esetek túlnyomó többségében a globális energiaminimumnak felel meg •Hogyan „találja meg” a fehérje a natív térszerkezetet? • Levinthal-paradoxon: • egy polipeptidlánc lehetséges konformációs állapotainak száma csillagászati (100 aminosav, 9 gerinckonformer/aminosav: 9100 ≈ 2.6 x 1095) • Az ismert fehérjék néhány másodperc (vagy rövidebb idő) alatt feltekerednek: nincs idő a lehetséges téralkatok töredékének kipróbálására sem (világegyetem kora < 1018 s) • A feltekeredés adott útvonalon (útvonalakon) zajlik, lényeges a lokális kölcsönhatások és az azok révén kialakuló szerkezeti „magok” szerepe másodlagos • Alapvető feltekeredési modellek: szerkezeti elemek kialakulása feltekeredett (folded) fehérje „hidrofób összeomlás” kitekeredett (unfolded) fehérje
feltekeredési mag (folding nucleus)
A ribonukleáz redukciója és denaturálódása
Chrisian B. Anfinsen 1972 Nobel-díj Ribonukleáz feltekeredése
A ribonukleáz renaturálódása
feltekeredés “folding”
A harmadlagos szerkezet (domének és modulok) Fehérjék denaturálásához használt reagensek: kaotróp molekulák
Fehérjék denaturálásához használt reagensek: az –SS- kötések redukciójához
A harmadlagos szerkezet (domének és modulok)
definíció: 50%-os feltekeredés: amikor a molekulák fele feltekeredett, ám a másik fele kitekeredett marad. memo: nincs félig feltekeredés!!!
A harmadlagos szerkezet A hődenaturálás: Ubiquitin (76 as., 8,5kDa)
Cp,exp / (mJoC-1) 6
DSC: Differential Scanning Calorimetry
Tm≈50oC
3
Θ/oC
0 30
45
60
75
Az Ubiquitin DSC termogramja alapján a fehérje 40oC alatt megtartja natív téralkatát, aztán endotermikus konformáció változáson megy át. Tm, olvadáspont (olvadási hőmérséklet, melting temperature) az a hőmérséklet, ahol egy adott nyomáson a folyadék és a szilárd fázis egyensúlyban van.
Ribonukleáz T1 Tm= 320K. pH=7 és T=298K a fehérje letekeredéshez szükséges ∆G mindössze 22.5 kJ.mol-1, ami alig több, mint egy H-híd (∆G≈20 kJmol-1). Hogy lehet ez, amikor ugyanez a fehérje tele van α-hélixszel és β-redővel, amely egy sor H-hidat tartalmaz? Atkins de Paula 118
Ribonukleáz T1 Tm= 320K. pH=7 és T=298K a fehérje letekeredéshez szükséges ∆G mindössze 22.5 kJ.mol-1, ami alig több, mint egy H-híd (∆G≈20 kJmol-1).
Példa:
Kérdés: Hogy lehet ez, amikor ugyanez a fehérje tele van α-hélixszel és β-redővel, amely egy sor H-hidat Atkins de Paula 118 tartalmaz?
Becsüljük meg a ∆H-t: ~ 4 menet hélix →3.6*4→ ~ 15 a.s → ~ 12 H-híd → ~ 12*2= 24 kcal.mol-1 ~ 3 hosszabb β-redő → 3*8→ ~ 24 a.s → ~ 22 H-híd → ~ 22*2 = 44 kcal.mol-1 Σ ∆H > 68 kcal.mol-1 Becsüljük meg a ∆S-t: 1) Legyen a fehérje letekeredett állapotában minden aminosavnak 3 lehetséges és egyforma valószínűséggel megjelenő gerinc konformere. Ekkor S = R ln (3100). 2) Ha feltekeredik egy ötös peptid rész (pl. kanyar) és annak már csak 1 lehetséges konformere van, akkor S = R ln (395) már csak. (A változás Rln(35) ami szobahőn (T=25oC) ~ 3.2 kcal.mol-1. 3) Ha az egész feltekeredik, akkor az S ~ 20* 3.2 = 64 kcal.mol-1.
∆G = ∆H-T∆S = 68 -64 = 4 kcal.mol-1
A fehérjék szerkezeti hierarchiája: - elsődleges szerkezet (aminosavsorrend) - másodlagos szerkezet (α-hélix, β-redő, stb.) - harmadlagos szerkezet (domének és modulok) - negyedleges szerkezet (alegység-struktúrák) A fehérjék negyedleges szerkezetének kialakulása során több, akár eltérő, akár azonos polipeptidlánc vagy fehérje kapcsolódik össze, s alkot funkcionális egységet. A keletkező dimerek, trimerek, tetramerek stb. akkor nevezzük homodimernek, homo-trimernek stb. ha a felépítő egységek azonosak. Ha eltérőek, akkor a hetero- előtagot használjuk.
Az IL-8 biológiai szerepe: a legfontosabb a célsejteken (fehérvérsejteken) a kemotaxis kiváltása.
A negyedleges szerkezet
A hemoglobin térszerkezete és működése:
kék: α-alegységek, sárga: β-alegységek, lila: vas centrumok
eritrocita, thrombocita, leukocita vörösvérsejt, vérlemezke, fehérvérsejt
A hemoglobin a vörösvértest szállító metalo-fehérje, amely az oxigén transzportban vesz részt. (A gerincesekben jellegzetes)
Egyetlen Glu→Val aminosav csere befolyásolja a hemoglobin tészerkezetét és működését, amely fiziológiás koncentrációban a sarlósejtes anémia betegségéhez vezet. (De a maláriával szemben ellenállóbb a szervezet.)
sarló alakú vörösvérsejtek
A negyedleges szerkezet Több doménből felépülő fehérjék a működéshez elengedhetetlen a domének kooperativitása
sejt-mátrix kapcsolatot kialakító fehérjék (integrinek) aktiválódása során jellegzetes makroszkopikus szerkezetváltozás következik be.
A fehérjék térszerkezet-viszgálati módszerei Fehérjék analitika és térszerkezet-vizsgálati módszerei:
Az atomi szintű szerkezetkutatás legfontosabb eszközei:
- NMR-spektroszkópia - röntgen-krisztallográfia - molekula-modellezés
A fehérjék térszerkezet-viszgálati módszerei Mit rejt a kristály? Fehérje röntgenkrisztallográfia: kémiai Nobel-díj, 1962 Max Perutz, John Kendrew
kristályban az egyes atomok helye térben jól meghatározott ⇒ részletgazdag térszerkezet
A negyedleges szerkezet Mit rejt az oldat: NMR-spektroszkópia Fehérje NMR: kémiai Nobel-díj, 2002 Kurt Wüthrich
anyagszükséglet: 1 mM vizes oldatból 300-600 µl
szerkezeti sokaság
A fehérjék belső mozgékonysága A makroszkopikus mozgás mikroszkopikus háttere: „ a táncrend”
0,1 mm
10 cm
szervezet
sejtek
1 nm
0,1 µm
fehérjemolekulák
sejtalkotók
A fehérjék belső mozgékonysága Minden fehérje határozott, belsőleg kódolt mozgékonysággal rendelkezik:
szinkronizáltabb mozgás, rendezettebb téralkat
szinkronizálatlan mozgás, rendezetlenebb téralkat
memo: egymásba ágyazott, eltérő időskálájú mozgások
~ 1s
105 s ~ 1h
3. 107 s ~ 1év
hurkok és kanyarok záródása 0.1ms ↔ 10ms
A fehérjék belső mozgási időskálája
másodlagos szerkezeti elemek 10ns ↔ 1ms
H/D
Rex
feltekeredés 1ms ↔ 1h
Rot. Dif. korrel. idő 1ns<τc< 10ns
gerinc dinamika 1ps ↔ 10ns
τlokális aggregáció 1 s ↔ 1 év
τeffektiv= τC +τlok.
oldallánc forgás 0.1ps ↔ 10 ps
Bevezetés az enzimek világába a sejtben előforduló szinte összes kémiai átalakítást biológiai katalizátorok, az enzimek végzik! - a legtöbb enzim fehérje - az átalakítás sebessége akár 106 -1012 szeres lehet a biokatalízis hatására. - így lehetséges, hogy a reakciók végbemennek már 37oC-on és neutrális pH-n.
energia
specificitás: az enzim nagy affinitással kötödik mind a saját szubsztrátjához, mind a termékhez. (E. Fischer kulcs-zár modell megalkotása.)
memo: Arrhenius egyenlet (a sebességi egyenlet T függése): k= A exp (–Ea/RT) k Ea
növekvő Ea
reakció koordináta
Tipikus enzimreakció:
Keeler 138
enzim + szubsztrát ↔ enzim-szubsztrát komplex ↔ enzim + termék A reakció helye: az aktív hely („centrum”), ahová a szubsztrát tipikusan nem-kovalans kötésen keresztül kötődik. Az enzimreakciók leggyakrabban teljesen sztereospecifikusak.
Τ(Κ)
Bevezetés az enzimek világába példa:
egy lipáz enzimmel történő észterhidrolízis: alapreakció: a lipáz enzimek a zsírsavészterek szelektív hidrolízisében vesznek részt. A „glicerin” rész megfelelő pontján hidrolizálnak:
sztereospecificitás: legyen az észter királis és használjunk egy racemátot megfigyelés: az egyik enantiomer észter elhidrolizál, a másik nem vagy csak nagyon lassan. (a jelenség neve: kinetikus rezolválás) O O C
OEt
lipáz H
F racemát észter kiindulási anyag
C
OH F (R)-(+)-2-fluorhexánsav-etil-észter >99% enantiomer túlsúly O
(S)-(+)-2-fluorhexánsav >69% enantiomer túlsúly
- a lipáz aktív zsebébe nem fér be az (R)-enantiomer, ezért az visszamarad és a hidrolízis során 99%-ig dúsul, - míg az (S)-(-)-sav éppen 69%-ban keletkezik.
C
OH
O
Et
F H
magyarázat:
OEt
Geometriai specificitás azt adja meg, hogy mennyire szigorúan csak egyetlen szubsztrátot fogad el az enzim: pl: 1) Karboxipeptidáz A a polipeptidlánc C-terminálisáról lehasít egy aminosavat, ha az nem Arg, Lys, Pro és a megelőző aminosav nem Pro. O O 2) kimotripszin: észtert is, amidot is hidrolizál. R' R
O R' N
+ H2O
kimotripszin
R
+ H 2O
kimotripszin
+
R
O R
N
O−
+
H3N+
HO
R'
OH
H R'
észter
H peptid
Inhibitor: molekula, amely az enzimműködésre negatívan hat, azt gátolja. Kompetitív inhibitor: amelyik a szubsztráttal versenyez az aktív helyért vagy annak bekötését oda gátolja. Kofaktor: nem-fehérje jellegű, de az enzimhez ideiglenesen kötött molekula/ion, olyan amelyik a katalízist segíti (apoenzim [fehérje] + kofaktor = holoenzim) Fe2+ Koenzim: (spec. kofaktor): olyan segédmolekula, amely nincs permanensen az enzimhez kötve pl. NAD Prosztetikus csoport: (spec. kofaktor): olyan molekula, amely permanensen az enzimhez van kötve pl. Fe-S centrum, hem, stb. memo: sok vízoldható vitamin koenzim prekurzor: nikotinsav → NAD, pantoténsav → CoA O
Koenzim A OH
N niacin
Szerinproteázok (sok egymással nem - feltétlenül - rokon fehérje) A fehérjék lebontó enzimek (proteázok): pl. kimotripszin, tripszin és elasztáz (Azért szerinproteáz, mert van benne egy a katalízis szempontjából döntő fontosságú Ser.)
A Kimotripszin: specificitása: főleg Trp, Tyr, Phe, de Leu, Met után is hasítja az amidkötést memo: észtereket is hidrolizál memo: a tripszin más specificitású: Arg vagy Lys után hasít. Az inaktív kimotripszinogénből (245 as.) két dipeptid kihasadása és egy „refolding” során képződik az enzim. A konformációs átrendeződés eredményeként sztérikusan közel kerül a katalitikus triád 3 eleme.
A katalitikus triád: Asp…His…Ser
Szubsztrátkötő hely Aktív hely, benne a katalitikus triáddal
oxianion üreg
ez a peptidkötés fog elhasadni szubsztrátkötő zseb egy aromás (R1) csoporttal rendelkező szubsztrát Nterminális része
His 57
Biodegradáció: Az amidok hidrolízise kapcsán a kémiai reakciótípusok: - nukleofil addíció, - elimináció
Asp 102 H2C
CH2
O
Ser 195
C O
H
N CH2
N
A szerinproteázok működési mechanizmusa:
O
H
O
H N
nukleofil addíció
C R
R
His 57 Asp 102 H2C
szubsztrátkötő zseb
CH2
O
Ser 195
C O
H
N CH2
N H
O O
H N R
C R
tetraéderes intermedier
Asp 102 H 2C
His 57 CH2
O
Ser 195
C O
H
N CH2
N
H
O O
H
N
H2O
acilezett szerin
C R
R Az aktív hely regenerálódása
Asp 102 H2C
His 57 CH2
O
Ser 195
C O
H
N N
RNH2
H
CH2
H
O
O
C
O R
acilezett szerin
Asp 102 H 2C
His 57 CH2
O
Ser 195
C O
H
N CH2
N H
O
O
C
H 2C
O
memo: lehet készíteni olyan enzimet, amelyik a fordított folyamatot katalizálja.
R
H
Asp 102
tetraéderes intermedier
His 57 CH2
O
Ser 195
C O
H
N CH2
N
karbonsav termék
Feltehetőleg a riboszómán a fehérjeszintézis során (RNSrészek közreműködésével) ilyen fordított folyamat zajlik.
H
H
O
O
C
O R
regenerált aktív centrum
Összefoglalás:
A kimotripszin irreverzibilis inhibitora: pl. DIPF
Lizozim: egy tipikus enzimműködés (Lysozyme:= lyse: felold + enzyme) A Lizozim feloldja (kilukasztja) a baktériumok sejtfalát, mivelhogy katalizálja a sejtfal poliszacharid egy adott részének hidrolízisét: Alexander Fleming 1922-ben „megfázott”
Nag-Nam-Nag-Nam-Nag-Nam
R2 HO OH
R2
R1 O OR3 B
A O
O R
R
2
R1 = CH2OH
HOCH2 OH
OH HO NHCOCH3
β-D-N-acetil-glükozamin (Nag) HOCH2 O
OH
R:
CH3 H COOH
OR
OH
C O
1
O
O
HO NHCOCH3
β-D-N-acetil-muraminsav (Nam)
R1 OR3 O
1
R2 O
D 2
R
R R2 = NHCOCH3
O
OH
E O
1
R
R3 = CH(CH3)COOH
R1 O
O OR3 F R2
OH
A Lizozim biokatalizált glikozidkötés hidrolízisének molekuláris háttere: 1) A D-E glükopiranóz gyűrűk elhidrolizálása: David Chilton Phillips 1924-99
memo: a D-gyűrű a bekötés következtében konformációsan eltorzul, a térszerkezet „feszült” lesz. 2) A molekuláris felismerés és a hexaszacharid (zöld) megkötésének atomi részletei:
O
3) A hidrolízis legvalószínűbb mechanizmusának kétfajta bemutatása:
Glu-35
HO HO
O
CH2OH Nag R'O
D
O HO
O
CH3CONH
Nam
OR
OR
O
NHCOCH3 O
Nam
NHCOCH3 O
E
O
E
CH2OH O
H
RO
CH2OH O
R: sejtfal oligoszacharid-lánc R': sejtfal peptidoldallánc
Glu-35
O
O
H CH2OH O O
Asp-102 RO Nag
R'O
H
D O CH3CONH
O Asp-52
O Glu-35
O H OH
CH2OH RO
Nag R'O
DO CH3CONH
O
O Asp-52
memo: a természetes védekezésünk fontos enzimje tehát a Lizozim, amely patogének (pl. Salmonella, E.coli vagy Pseudomonas) ellen nyújt védelmet.
Alkohollebontás (oxido-
R
redukció, aromatizáció):
NH2
N
A NADH egyensúlyi reakciója az acetaldehidet etil-alkohollá redukálja.
NADH
HS
1) A NADH és az aldehid megkötődik, utóbbit a Zn2+ koordinálja,
H ++ H3C
S-Cys
O Zn
2) a nikotinsavamid nitrogénjének nemkötő elektronpárja delokalizálódik, a dihidropiridin gyűrű aromássá válik az egyik C4-es hidrogénatomot anionként leadva. (oxidáció)
N-His S-Cys HR
H C H3C
O
etoxid anion NH2 H N
O
H +
HS
méregtelenítés:
alkohol-dehidrogenáz enzim (NADH + inhibitor komplex)
O
HR
A működés lépései és leírása:
3) A hidridion redukálja az acetaldehidet, majd a képződő alkoholát anion protonálódik. A cink mint Lewissav fokozza a karbonil-szén pozitív R polározottságát, s így annak elektrofil jellegét. NAD+
az alkohol-dehidogenáz enzim aktív centruma
HR etanol
C H3C
OH
ha nagy az alkoholkoncentráció, akkor az egyensúlyi reakció megfordul és az etilalkohol acetaldehidé oxidálódik.
memo: Miért mérgezők az alkohol végzetes adalékai: metanol, etilénglikol?
az alkohol-dehidrogenáz enzim apoenzim + koenzim + inhibitor (80 kDa dimer, az emberben legalább 6 variánsa van, előfordulás, máj és gyomor)
O
NH2 N
N
O N
O
N O H
H
OH
OH
P OH
O O
P O
H
H2N O
N
feladatuk: - egyensúlyt tartani az alkoholok aldehidek és ketonok között. - méregtelenítés (emlősben): a toxikus alkoholból aldehidet csinál
O H
H
OH
OH
A NAD+ (Nikotinsavamid-adenin-dinukleotid) (az élő sejt egyik oxidáló vagy dehidrogénező szere)
- fermentálás (baci és élesztő): aldehidből alkoholt készít (redukció)
A ”kulcs & zár” modell (Emil Fischer)
Hogyan tervezzünk gyógyszert?
Minél többet meg kell tudnunk a fehérjék dinamikus téralkatáról, annál nagyobb a sikeres tervezés esélye!
Érdekes fehérjék Újrahasznosítás: mit őrizzünk meg és mit dobjunk ki? Az Ubiquitin
Számos sejten belüli folyamat szabályzó és kontroláló fehérjéje a viszonylag kicsi, egy doménből felépülő Ubiquitin. Az evolúció során nem változott: az élesztőben vagy a humán sejtekben rendre ugyanúgy néz ki. Legfontosabb feladata, hogy megjelölje a valamilyen okból sérült fehérjéket, amelyeket később a sejt felismer, majd lebont. A lebontott fehérjék aminosavai újrahasznosításra kerülnek, új peptidek vagy fehérjék épülnek fel belőlük. (Nincs hulladék!)
Érdekes fehérjék Sejten belüli kommunikáció és információ-feldolgozás A TNF-α α: tumor nekrózis faktor-α α
A sejtben sok molekula feladata a jelátadás vagy a jelfeldolgozás; melyre jó példa a TNF-α. Olyan esetekben, amelyekben az organizmust külső támadás éri (pl. baktériumok) az immunsejtek TNF-α-t termelnek és bocsájtanak ki. A TNF-α túltermelődése a tumoros megbetegedés egy jele.
Érdekes fehérjék
An army of emergency doctors cares for the health of the proteins in each cell Legend: The small heat shock protein – a chaperone One of the most severe dangers for a cell is the loss of the 3-dimensional structure and function of its proteins. This so-called denaturation can be caused by various influences, among them aging or heat. Denaturation is also the reason why egg white becomes turbid when cooked. Special proteins, the chaperones, rescue denatured proteins by re-folding them. Chaperones thus are the molecular emergency doctors of the cell.
Érdekes fehérjék
Staples hold our body together Legend: Cadherin Our body consists of trillions of cells that all work together to keep us alive. Between the cells there is a complex network of molecular cables and connection proteins that keep the cells together. They prevent our body from falling apart. Cadherin is one of these connection proteins. It is a long protein that staples together the membranes of two adjacent cells.
Érdekes fehérjék
A molecular drill Legend: P22 tailspike protein. The semi-transparent surface shows the global shape of the protein. Viruses can infect not only higher organisms, such as birds or humans, but also bacteria. Viruses of this type are called bacteriophages, or phages for short. The bacteriophage P22 infects salmonella that cause, e.g., typhus. In order to infect bacteria, phages have a special injection machine that drills through the membrane of the bacterium. These are the so-called “tailspike” proteins.
Érdekes fehérjék
A bacterial defense against antibiotics (β-lactamase/inhibitor complex) In the past years, alarming news about antibiotics-resistant bacteria repeatedly appeared in the media. The enzyme beta-lactamase is one of the main defense mechanisms of bacteria against the class of beta-lactam antibiotics such as the well-known penicillin. These antibiotics have a chemical ring structure called beta-lactam. Beta-lactamase cleaves this ring and hence deactivates the anti-bacterial activity of antibiotics.
Érdekes fehérjék
How is oxygen transported from the lungs to the cells and why is blood red? Legend: Hemoglobin and its pigment heme (in pink) In our blood, hemoglobin is responsible for transporting oxygen. It consists of four proteins and the red pigment heme. Hemoglobin thus is the reason for the red color of blood. In the lungs, the hemoglobins are loaded with oxygen, which they then transport to the cells of our body. The image shows an enlarged detail of hemoglobin with the oxygen-carrying pigment heme shown in pink.
Érdekes fehérjék
Why are we hung over after a night of excessive drinking? Legend: Alcohol dehydrogenase Alcohol dehydrogenase is responsible for the degradation of alcohol in our liver. Each molecule of alcohol that we drink ends up in the liver, where it is broken down to acetaldehyde by this protein. The degradation product is, however, even more toxic than alcohol itself, and it causes headaches and digestion problems. Fortunately our liver also has a protein that degrades the toxic acetaldehyde. This protein, however, works slower than its colleague alcohol dehydrogenase, providing one of the limits to our drinking capabilities.
Érdekes fehérjék Where poisons attack us… Legend: The star-like structure of the nicotine-acetylcholine receptor Nicotine-acetylcholine receptors (AChR) are, e.g., responsible for muscle contraction. In addition, they also play essential roles in the processes of thinking and learning in our brain. AChR are the target of many naturally occurring poisons such as, e.g., nicotine, which leads to the production of adrenaline, or snake and spider venoms that paralyze the muscles. Also synthetic poisons such as the lethal nerve gas Sarin, or clinically used painkillers and anesthetics act through AChR.
N H N
CH3
nikotin f p 246o higroszkópos szintelen olaj a N icotina tabacum f õ alkaloidja (75%)
szarin
Érdekes fehérjék
Arteriosclerosis: touchy giant proteins transport fat Legend: Two units of apolipoprotein B100 interact In our blood, cholesterol is transported in so-called LDL particles. LDL particles contain several lipids (fats) as well as a lipid membrane. They are kept together by apolipoprotein B100, one of the largest proteins known. The lipids, as well as apoB, are very sensitive to oxidation. When oxidized, LDL particles can stick together and deposit on the interior walls of the blood vessels. The result is one of the most frequent causes of death in the western world: arteriosclerosis.
