Farmaceutická fakulta Univerzity Karlovy v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd
ZBIO – odborný pracovník v laboratorních metodách, 2011
Diagnostika a terapie urogenitálních infekcí způsobených Chlamydia trachomatis
Bc. Miroslava Förstlová
Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Vladimír Buchta, CSc. 1
Poděkování:
Poděkování patří vedoucímu mé diplomové práce, panu Drábkovi z Ústavu klinické mikrobiologie FN a LFUK Hradec Králové za pomoc při zpracování dat i paní Haně Kotlandové z Ústavu klinické imunologie a alergologie FN a LFUK Hradec Králové za převzatá schémata. 2
Prohlášení:
Prohlašuji, že tato práce je mým autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.
Data uvedená v této práci byla již použita při přípravě následujících odborných publikací z našeho pracoviště:
Ad. Studie 2:
Fajfr, M., Förstl, M., Štěpánová, V., Plíšková, L., Fajfrová, J., Valenta, Z., Špliňo, M.: Zkušenosti s detekcí chlamydií pomocí metody PCR. Klinická mikrobiologie a infekční lékařství, 2005; 4: s. 133-137.
Ad. Studie 3:
Förstl, M., Kalousek, I., Navrátil, P., Štěpánová, V., Fajfr, M.: Zkušenosti s enzymoterapií v rámci komplexní léčby urogenitálních infekcí Chlamydia trachomatis Urologie pro praxi, 2006; 5: s. 243-245.
Ad. Studie 4: Förstl, M., Förstlová, M, Ryšková, O, Kalousek, I., Navrátil, P.: Enzymoterapie u urogenitálních infekcí Chlamydia trachomatis Urologie pro praxi, 2011; 3 – v době odevzdání práce teprve vychází, proto není v citacích
3
OBSAH:
1. ABSTRAKT
str. 5
2. CÍL PRÁCE
str. 6
3. HISTORIE
str. 7
4. ETIOLOGIE A PATOGENEZA
str. 8
5. KLINICKÝ OBRAZ
str. 10
6. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA 6.1. Světelná mikroskopie
str. 13
6.2. Elektronová mikroskopie
str. 13
6.3. Kultivace
str. 14
6.4. Stanovení antigenu (STUDIE 1)
str. 15
6.5. Detekce genomu (STUDIE 2)
str. 22
6.6. Průkaz specifických protilátek, sérologie
str. 26
7. TERAPIE 7.1. Antibiotika
str. 27
7.2. Podpůrná terapie
str. 28
7.2.1. Azitromycin a Wobenzym (Studie 3)
str. 29
7.2.2. Klaritromycin a Wobenzym (Studie 4)
str. 32
8. DISKUZE A ZÁVĚR
str. 35
9. LITERATURA
str. 36
10. OBRAZOVÁ PŘÍLOHA
str. 38 4
1. ABSTRAKT
Diagnostika a terapie urogenitálních infekcí způsobených Chlamydia trachomatis
Práce stručně shrnuje problematiku urogenitálních infekcí Chlamydia trachomatis. Zabývá se jejich etiologií i patogenezí, klinickým obrazem, diagnostickými možnostmi a terapií. Její součástí je stručný popis a výsledky již publikovaných studií zabývajících se imunofluorescenční diagnostikou antigenu, detekcí genomu polymerázovou řetězovou reakcí a samotnou terapií.
Diagnostics and therapy of urogenital infections caused by Chlamydia trachomatis
The study considers problems of urogenital infections caused by Chlamydia trachomatis. It deals with their etiology, pathogenesis, the clinical outcome, diagnostics and therapy. It contains the short description and results already published studies dealing with the detection of the antigen by the direct fluorescent procedure, the detection of the genome by polymerase chain reaction and the therapy.
5
CÍL PRÁCE (ZADÁNÍ) Cílem mé bakalářské práce byla snaha přehledně shrnout problematiku chlamydiových urogenitálních infekcí, která není dodnes zcela jasná ani přehledná. Přitom se jedná o celosvětově nejrozšířenější pohlavně přenosné onemocnění (které ale v České republice paradoxně dodnes nepodléhá hlášení). Diagnostice chlamydií se naše pracoviště věnuje dlouhodobě (STUDIE 2 a 3) a ano, většina dat v ní byla zpracována lékaři (viz výše uvedené publikace), ale byla jsem celou dobu u této práce a aktivně se na ní v laboratoři podílela. V magisterské práci jsem rozšířila práci bakalářskou o výsledky již publikované STUDIE 4, kde jsem řádnou spoluautorkou. Další data ze STUDIE 1, tedy výsledky přímého průkazu antigenu z let 2008-2010, mají jednak nahradit již neaktuální a jinými autory publikovaná data z našeho pracoviště z let 1997-2003, ale pracuji na tom, aby posloužily i k přípravě dalšího publikačního výstupu – tentokrát již jen mého vlastního.
6
3. HISTORIE
První záznamy o výskytu trachomu pochází již ze starověké Číny a Egypta. Halberstaedter a Prowazek jako první objevili a popsali Chlamydia trachomatis v roce 1907 – tzv. Prowazekova tělíska ve stěru z víčka postiženého trachomem. V roce 1910 pak tato tělíska objevil i Lindner a to ve stěru z děložního hrdla pacientky s cervicitidou. Zajímavostí je, že chlamydie byly postupně řazeny k prvokům a pak dokonce k virům! Teprve v roce 1975 Wang a Grayston přesně popsali a prokázali přenos pohlavní cestou i významné komplikace a od té doby zájem o tuto bakterii narůstá. V roce 1999 došlo k zásadním taxonomickým změnám - od rodu Chlamydia byl oddělen rod Chlamydophila s druhy Ch. pneumoniae, Ch. psittaci nebo Ch. pecorum - Everett a kol.. I když jsou to změny jistě správné, v praxi, tedy v mluvě některých mikrobiologů, ale dokonce i vněkterý odborných publikacích se prosazují dodnes těžko. Rutinní diagnostika zaznamenala úspěchy dokonce až na konci 20. století, ale dodnes je problematická její kvalita v praxi.
7
4. ETIOLOGIE A PATOGENEZA (1, 7, 11, 12, 14)
Chlamydia trachomatis je gramnegativní bakterie. V lidském těle se množí v epitelu urogenitálního systému, spojivek, dýchacích cest, v makrofázích a u chronických infekcí se setkáme s poškozením kloubní výstelky nebo endotelu. Manifestace infekce v močových a pohlavních orgánech ji řadí mezi sexuálně přenosné nemoci, ale povinnému hlášení zatím nepodléhá. Extracelulárně mají chlamydie podobu drobných infekčních elementárních tělísek (ET; 250–400 nm). Až v napadených buňkách, tedy intracelulárně, se ET transformuje v neinfekční, ale metabolicky aktivní retikulární tělísko (RT; 800-1200 nm). Již po 8–9 hod. probíhá první binární dělení, jehož výsledkem jsou po kondenzaci dvě nová ET. To vše za spotřeby „hostitelské ATP“ (adenosin tri fosfát), tedy energie (energetický parazitizmus). Výsledkem celého vývojového cyklu (obr. 1) může být až 10 000 nových infekčních elementárních tělísek v jediné buňce. K jejich uvolnění dochází buď při ruptuře buňky, nebo exocytózou, postupným uvolňováním tělísek z buňky, což je charakteristické pro chronickou formu infekce. Pro člověka jsou z rodu Chlamydia patogenní 3 druhy, někteří autoři uvádějí dokonce 4 (tabulka 1 a 2). V této práci se dále zabýváme pouze druhem Ch. trachomatis, který lze dále dělit na 18 sérovarů – tomuto dělení odpovídá i klinická manifestace (tabulka 3).
8
Tabulka 1 – Chlamydie patogenní pro člověka a typické antigeny pro jejich diagnostiku, (dřívější klasifikace) čeleď
Chlamydiacae
rod
Chlamyda
společný rodový lipopolysacharidový antigen
druh
Chlamydia trachomatis
proteinové antigeny –
Chlamydia pneumoniae
vnější membránové
Chlamydia psittaci
proteiny pro rozlišení
(Chlamydia pecorum)
druhů
Tabulka 2 – Nové rozdělení čeledi Chlamydiacae do dvou rodů (1999) rod
Chlamyda
LPS – lipopolysacharid; rodově specifický
druh
Chlamydia trachomatis
MOMP – zevní membránový protein; druhově specifický
rod
Chlamydophila
druh
Chlamydophila pneumoniae Chlamydophila psittaci (Chlamydophila pecorum)
9
MOMP
5. KLINICKÝ OBRAZ (1, 4, 6, 7, 8, 9)
Stručný přehled manifestace chlamydióz je uveden v tabulce č. 3. Stejnou formou je v tabulce č. 4 zpracován i přehled o správných odběrech materiálu pro jejich diagnostiku. Zvláštní kapitolou v problematice chlamydií je dětské lékařství. V pediatrické praxi stojí Ch. trachomatis v popředí především pro možnost vertikálního přenosu z matky, tedy především jde o klinicky závažnou problematiku novorozeneckých konjunktivitid a pneumonií. Klinicky se tyto infekce získané v porodních cestách nejčastěji manifestují jako akutní inkluzní konjunktivitida novorozenců nebo jako primární atypická pneumonie (v praxi by měl být prováděn vždy sdružený odběr spojivka + materiál z dolních cest dýchacích), raritně snad i zánět středního ucha. S rostoucím věkem dětí nadále představují nebezpečí konjunktivitidy a atypické pneumonie až s obrazem fibrotického procesu, vzácností nejsou ani kloubní manifestace. Navíc je třeba u všech uvedených projevů počítat i s etiologií Ch. pneumoniae popř. s plicní manifestací Ch. psitaci. S urogenitální infekcí Ch. trachomatis se lze v dětském věku setkat jen raritně (přenos při společné koupeli nebo trestněprávní případy, ale se získáváním prvních sexuálních zkušeností adolescentů se situace zásadně mění.
10
Tabulka 3 – Onemocnění vyvolaná jednotlivými sérovary Ch. trachomatis. sérovar
onemocnění
A, B, Ba, C
- trachom (endemický výskyt v tropech a subtropech, v ČR ne)
D, Da, E, F. G, H, I, Ia, J, K
- inkluzní konjuktivitida - uretritida (primární nekapavčitá nebo postgonokoková uretritida) - epididymitida, prostatitida - cervicitida, endometritida, bartolinitida, salpingitida - chronický zánět v malé pánvi, periapendicitida, perihepatitida - Fitz-Hugh-Curtisův syndrom (akutní perihepatitida) - Reiterův syndrom (konjuktivitida, uretritida a artritida popř. i mukokutánní léze) - reaktivní artritida - proktitida, faryngitida - chlamydiové infekce novorozenců (akutní inkluzní konjuktivitida, pneumonie i za několik měsíců, mesotitida) - pneumonie starších dětí a dospělých - ateroskleróza (?) - astma (?) - některé karcinomy (?)
L1, L2, L2a, L3
- lymfogranuloma venereum (endemický výskyt v tropech a subtropech, v ČR ne)
11
Tabulka 4 – Odběry materiálu na průkaz antigenu děložní čípek a po důkladném odstranění hlenu (s ním je preparát nehodnotitelný) provést vagina
speciální odběrovou soupravou buď dva samostatné stěry, nebo jen jeden společný; získaný materiál nanést v tenké vrstvě na odmaštěné podložní sklo a nechat zachnout
ženská uretra
jeden zaschlý stěr na podložním skle
mužská uretra
pacient před odběrem 2-3 hodiny nemočí; z ústí močové trubice provést sterilní bakteriologickou kličkou razantní stěr epitelií z hloubky cca 4 cm a přenést jej krouživým pohybem do kapky fyziologického roztoku na podložním skle a nechat zachnout
moč
její hodnocení ať již IF, nebo PCR je přinejmenším sporné – chlamydie se množí v epiteliích a sediment vzorku jich nemusí obsahovat dostatek (v případě, že je tento vzorek přesto doporučen, nesmí pacient před odběrem 2-3 hodiny močit a odebírá se první porce)
prostatický
nátěry na sklíčku, sperma je jen obtížně hodnotitelné
sekret, sperma oko – spojivka
výtěr z očí může být pro průkaz antigenu problematický materiál, ale jen při chybném odběru; pokud je setřeno dostatečné množství epitelií a jsou ze suchého odběrového tampónu řádně otisknuty (válivým pohybem) na podložní sklo, je odečet celkem snadný a podle porovnání se souběžně provedenou metodou PCR (opět suchý odběrový tampón) spolehlivý
dolní cesty
sediment z laváží a aspirátů je sice vyšetřován až po centrifugaci, přesto je
dýchací – laváž odečet velmi obtížný, protože nacházíme jen malé množství epitelií; IF (BAL), aspirát, vyšetření by mělo sloužit jen pro orientaci a vždy (!) by mělo být doplněno sputum a u
metodou PCR
malých dětí žaludeční aspirát extirpovaná
pouze u lymfogranuloma venereum
uzlina
12
6. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA (citace 1, 2, 4, 7, 10, 13)
Naše laboratoř disponuje jak metodou přímého imunofluorescenčního (IF) průkazu antigenu, tak jsme schopni nálezy konfirmovat pomocí metody detekce genomu – polymerázovou řetězovou reakcí (PCR – na společném pracovišti v Laboratoři molekulární biologie ÚKBD). Naše možnosti doplňuje metoda stanovení sérových protilátek proti lipopolysacharidovému antigenu rodu Chlamydia. Komplexní hodnocení mikrobiologického materiálu založené na více metodikách je dnes už pro kvalitní laboratoř nezbytné, jedna jediná naprosto spolehlivá metoda opravdu neexistuje.
6.1. Světelná mikroskopie (tuto metodu na našem pracovišti nevyužíváme)
V epiteliích v preparátu ze stěru nebo seškrabu obarveném Lugolovým roztokem je možné nalézt charakteristické buněčné inkluze, u Ch. trachomatis totiž obsahují fagosomy napadené buňky jódem hnědě se barvící glykogen. K dispozici jsou i další barvící techniky (Giemsa-Romanowski, barvení dle Macchiavella, dle Gimeneze). (Fluorescenční mikroskop je využíván pro průkaz antigenů – viz výše 5.4.)
6.2. Elektronová mikroskopie (tuto metodu na našem pracovišti nevyužíváme)
V odůvodněných případech je k dispozici na specializovaných pracovištích. (Národní referenční laboratoř pro přímou diagnostiku virů, bakterií a cizorodých buněk v klinickém materiálu pomocí elektronmikroskopických metod, Státní zdravotní ústav, Praha.)
13
6.3. Kultivace (Tuto metodu nevyužíváme a rutinně již není bohužel ani v České republice k dispozici)
Vyšetřovaný materiál lze kultivovat na žloutkovém vaku kuřecího embrya, na buněčných kulturách (McCoy, HeLa), popř. ho očkovat do mozku, peritonea nebo nosu laboratorní myši.
6.4. Stanovení antigenu
Pro vyšetření přítomnosti antigenu Ch. trachomatis pomocí přímé imunofluorescence (IF) je třeba do laboratoře zaslat buď nefixovaný preparát na podložním skle, nebo materiál tekutý (laváž, aspirát, sputum; sperma). Doručený preparát se v laboratoři chemicky fixuje, pak označí konjugátem (monoklonální druhová protilátka proti hlavnímu membránovému proteinu značená fluorescenčním barvivem) a po přidáni kapky glycerolu a překrytí krycím sklíčkem se pomocí fluorescenčního mikroskopu hodnotí přítomnost „drobných svítících bodů“. Zpracování a vyhodnocení materiálu je otázkou několika hodin. (obr. 2, 3, 4, 5) Pro stanovení antigenu dále připadají v úvahu i metody enzymoimunoanalytické (EIA) a nově jsou testovány i metody imunochromatografické – tzv. „rapid testy“ určené pro screening přímo v ambulanci lékaře. Problematické je ale vyhodnocení reakce, protože naprosto chybí jakákoli kontrola, jsou-li vůbec přítomné buňky epitelu a navíc je nutné zdůraznit, že jde o screeningové testy jejichž výsledek (pozitivní i negativní) by měl být konfirmován v laboratoři.
14
STUDIE 1
Cílem retrospektivní studie bylo zjistit četnost pozitivity přímého průkazu antigenu Ch. trachomatis výše uvedenou imunofluorescenční metodou ve vyšetřeném souboru vzorků/stěrů od pacientů s podezřením na urogenitální chlamydiovou infekci ve spádové bývalého Východočeského regionu z let 2008-2010 (naše dnes jediná dostupná databáze po zavedení nového laboratorního informačního systému).
MATERIÁL V letech 2008-2010 byly k vyšetření do naší laboratoře Ústavu klinické mikrobiologie FN Hradec Králové doručeny vzorky z urogenitálního systému mužů i žen – zaschlé stěry na podložních sklech z močových trubic a z děložních čípků. Byly zavzaty ivýsledky stěrů z očí a to záměrně, protože se v praxi stává, že právě izolobaná pozitivita z očí je prvním vodítkem pro urogenitální infekci pacienta, který o ní neví nebo se stydí před lékařem přiznat obtíže - tyto případy však zatím nejsme schopni dále analyzovat.
METODIKA Pro vyšetření přímého průkazu antigenu Ch. trachomatis byly použity komerční soupravy Pathfinder firmy BIO-RAD Chlamydia trachomatis direct specimen (Direct antigen detection system), které jsou určeny k detekci membránových proteinů elementárních i retikulárních tělísek všech sérotypů Ch. trachomatis. Práce s detekční soupravou je uživatelsky velice jednoduchá: Na zaschlý stěr na podložním skle (limity pro transport jsou pouze vhodné zabezpečení proti rozbití (doporučujeme lékařům např ochranu buničitou vatou - zasílání je pak možné pro externí žadatele i poštou) se přesně dle návodu výrobce soupravy nejprve nanese z příslušné lahvičky s kapátkem fixační roztok, následně se opláchne a „barví“ - je tedy opět z příslušné lahvičky s kapátkem nanesena protilátka označená fluoresceinem. Po inkubaci je nutný opět oplach, pak se přidá kapka glycerolu a krycí sklíčko. Jestliže je detekce poměrně jednoduchá, odečet v fluorescenčním mikroskopu je naopak náročný. U nás jej zatím provádí pouze zkušený vysokoškolák s delší praxí a navíc se odečítající navzájem kontrolují. Těžké pro vyhodnocení jsou zejména pozitivní preparáty s 15
nízkou kvantitou - ty právě ale mnohdy odpovídají u pacienta tolik obávanému subchronickému nebo dokonce chronickému klinickému stavu!
EXPORT DAT A JEJICH ZPRACOVÁNÍ Data byla exportována z databáze našeho LIS pomocí funkce PED (podmíněný export dat) ve formě tabulky Excel. Nebyla provedena eliminace opakovaných výsledků stejných pacientů, protože dodnes není stanoveno jasné kritérium časového rozmezí.
16
VÝSLEDKY STUDIE 1
1. Stěry k vyšetřené v letech 2008-2010
2008 2009 2010 Celkem
Nelze Celkem Pozitivní Negativní hodnotit 1693 158 1404 131 1618 241 1314 63 1729 304 1405 20 5040 703 4123 214
1. Stěry vyšetřené v letech 2008-2010 6000
5000
4000 2010 3000
2009 2008
2000
1000
0 Celkem
Pozitivní
Negativní
2. Rozdělení pozitivit 2008- 2010 v %
2008 2009 2010 Celkem
Celkem Pozitivní % 9,3 1693 158 14,9 1618 241 17,6 1729 304 5040 703 13,9
17
Nelze hodnotit
3. Rozdělení pozitivit 2008-2010 dle diagnóz (četnost 10 a více) 176 N 342 Jiná uretritida 87 N 760 Akutní zánět pochvy - vaginitis acuta (colpitis) 44 H 100 Mukopurulentní konjunktivitis 38 N 979 Ženská neplodnost, NS 35 N 761 Subakutní a chronická vaginitida 29 A 562 Chlamydiová infekce pohlavního a močového ústrojí, NS 28 N 949 Neurčené stavy sdr. s ženskými pohlavními orgány a menstruačním cyklem 18 N 309 Cystitida, NS 18 N 369 Onemocnění močové trubice, NS 17 Z 008 Jiná celková vyšetření (prohlídky) 13 N 341 Nespecifická uretritida 11 Z 014 Gynekologické vyšetření (všeobecné) (rutinní) 10 A 749 Chlamydiová infekce, NS
4. Rozdělení pozitivit dle lokalizace Celkem 703 UGS* 642 Oči 61 *UGS = urogenitální systém
18
5. Rozdělení pozitivit v UGS dle pohlaví a věku (n = 642) Ročník Muži Počet Ženy Počet 73 1 1937 1938 72 2 1939 1940 1941 69 1 1942 68 2 1943 67 2 1944 66 1 1945 65 2 1946 64 2 1947 1948 62 1 62 3 1949 61 6 61 3 1950 60 3 1951 59 1 59 5 1952 58 1 58 2 1953 57 2 57 5 1954 56 6 1955 55 8 1956 54 2 54 1 1957 53 3 53 5 1958 52 7 1959 51 4 1960 50 4 50 6 1961 49 1 49 2 1962 48 3 1963 47 3 47 5 1964 46 3 1965 45 7 45 8 1966 44 2 44 4 1967 43 7 43 13 1968 42 1 42 12 1969 41 4 41 5 1970 40 4 40 8 1971 39 2 39 9 1972 38 6 38 8 1973 37 11 37 10 1974 36 5 36 13 1975 35 8 35 20 1976 34 12 34 20 1977 33 5 33 22 1978 32 12 32 20 1979 31 1 31 16 1980 30 5 30 16 1981 29 4 29 17 1982 28 5 28 14
19
1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993
27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17
8 18 14 8 2 4 8 2 4 1 2
27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17
19 16 14 12 13 9 17 11 10 1 5
Celkem pozitivních 196 mužů a 446 žen. 5. Rozdělení pozitivit v UGS dle pohlaví a věku (n = 642) 40 35 30
Ženy (n=446)
20
Muži (n=196)
15 10 5
Věk
20
19
22
25
28
31
34
37
40
43
46
49
52
55
58
61
64
67
70
0 73
Počet
25
ZÁVĚR STUDIE 1
Zajímalo mne, zda se situace v našem regionu mění a chtěla jsem prostřednictvím této studie aktualizovat údaje – moje práce navázala na práci dřívější a její publikované výsledky z let 1997-2003 (2; plné znění viz odkaz na Internet v 5. LITERATURA ). Počty z obou studií jsou vzhledem k jejich rozlišnému časovému intervalu vztaženy na jeden kalendářní rok a zaokrouhleny.
V naší studii 2008-2010 vzhledem ke studii 1997-2003: o Celkově bylo průměrně vyšetřeno ročně 1680 vzorků oproti 818ti. o Prokázali jsme ročně 234 pozitivit oproti 119ti. o Přesto vztaženo na % 2008-2010 došlo celkově (!) k nepatrnému poklesu pozitivit na 13,9 % z 14,6 %. o Za jednotlivé kalendářní roky ale naopak sledujeme postupný vzestup pozitivit 2008-2010 z 9,3 přes 14,9 až na konečných 17,6 %.
Závěrem lze tedy říci, že absolutní nárůst počtu vyšetření signalizuje buď rostoucí povědomí a zájem o „moderní“ téma chlamydií, nebo jej vysvětluje rostoucí kredit naší laboratoře. Přestože prudký nárůst celkového počtu určených pozitivit vyšetření za sledované období mohl vyvolat dojem vzrůstající incidence onemocnění, a i dojem personálu naší příslušné laboratoře byl takový, v řeči procent se stav pozitivit v regionu dokonce mírně zlepšil - to ovšem platí pouze o celkovém průměru. Naopak data po jednotlivých letech, tedy prudký vzestup pozitivit v kalendářních letech 2008-2010 znamenají buď cílenější diagnostiku, nebo opravdu vzrůstající incidenci tohoto onemocnění! Problematice se budeme i nadále věnovat a data analyzovat – podstatná bude především užší spolupráce s žadateli, tedy klinickými lékaři.
21
6.5. Detekce genomu V současnosti se v diagnostice chlamydií stále více využívají molekulárně biologické metody – podle světových „guidelines“ je nutné použít amplifikační metody buď polymerázové řetězové reakce (PCR), nebo transkriptní mediované amplifikace (TMA). V úvahu přichází z metod amplifikačních ještě ligázová řetězová reakce (LCR), nebo metody bez amplifikace, tzn. genové sondy (GS). V Laboratoři molekulární biologie (společné pracoviště ÚKBD a ÚKM FN Hradec Králové; vedoucí PharmDr. Lenka Plíšková) je pro detekci chlamydiových infekcí používána metoda tzv. „nested“ PCR, což je zjednodušeně řečeno dvojstupňová PCR. Takto modifikovaná metoda je schopna zachytit mnohem menší počet kopií DNA nežli klasická PCR. V první reakci, trvající zpravidla 35 cyklů, jsou použity tzv. vnější primery (outer primer). Ve druhé, následné reakci jsou použity tzv. primery vnitřní (inner primer). Reakce trvá opět 35 cyklů a produkt je následně analyzován na agarovém gelu s ethidium bromidem pomocí elektroforézy. Jako materiál slouží stěr na suchém sterilním odběrovém tampónu (popř. speciální komerční souprava), biopsie, moč, krev. Výsledek lze získat řádově v hodinách, maximálně dnech.
22
STUDIE 2:
Cílem druhé retrospektivní studie bylo sumarizovat a zhodnotit výsledky pacientů vyšetřovaných pomocí metody PCR s podezřením na infekci způsobenou zástupci čeledi Clamydiaceae. Studie zpracovala dataza tříleté období z bývalého regionu východních Čech z databáze Laboratoře molekulární biologie (společné pracoviště ÚKBD a ÚKM). Celkem bylo za období v letech 2001 až 2003 vyšetřeno na Oddělení molekulární biologie ÚKBD 1613 vzorků, z toho bylo 556 z FN Hradec Králové a 1057 z jiných nemocnic či zařízení. Z celého souboru bylo celkem 90 vzorků pozitivních, 20 vzorků s nejasným výsledkem či hraniční hodnotou, u 28 vzorků nešlo vyšetření provést, 1478 vzorků bylo vyhodnoceno jako negativní (viz Graf 2) I přes poměrně vysokou cenu jednotlivého vyšetření lze i na této malé studii dokumentovat vzrůstající počet vyšetření touto metodou. Bylo-li v roce 2001 provedeno 291 vyšetření, tak v roce 2002 to bylo již 526 a v roce 2003 dokonce 760.
23
Graf 2 PCR Chlamydia trachomatis 2001-2003 1613
všechny vzorky spojivky dolní cesty dýchací 381 60 vyšetřeno celkem
89
1
40
5,5 1,7 11,8
pozitivní
pozitivita v %
24
Dále bylo zjištěno že bylo vyšetřeno celkem 662 vzorků od mužů, z nichž bylo 40 pozitivních (6,0 % ) a 9 s nejasným výsledkem (1,4 % ) a 951 vzorků od žen , kde bylo 50 pozitivních (5,3 % ) a 11 s nejasným výsledkem (1,2 % ). Pozitivity vzorků viz následující tabulka:
Tabulka 5 vzorky
vyšetřeno celkem
pozitivní
pozitivita v %
všechny vzorky
1613
89
5,5
spojivky
60
1
1,7
dolní cesty dýchací
381
40
11,8
Spektrum vyšetřovaných vzorků – klinik si nejčastěji žádá vyšetření z moči, BALu (bronchoalveolární laváž) a z plné krve (viz Tabulka 5). Maximum vyšetřovaných vzorků bylo z věkové skupiny 20-29letých (25 %) a 3039letých (17 %). U žen věkové rozvrstvení vcelku koreluje s celkovými počty (29,8 % u věkové skupiny 20-29 let a 15,6 % u věkové skupiny 30-39 let), zatímcé u mužů je viditelný rozdíl, kdy nejvíce vzorků pochází ze skupiny 0-9 let (19,8 %) následováno skupinou 30-39 letých (18,6 %). Co se týká pozitivních výsledků, tak zde je jich nejvíce v celém souboru u věkových skupin 20-29 let (5,8 %) a 40-49 let (6,4 % ). U žen bylo nejvíce pozitivních vzorků ve věkových skupin 20-29 let (5,3%) a 10-19 let ( 7,5% ). U mužů pak ve věkových skupinách 0-9 let (6,1 %) a 20-29 let (7,1 %) .
25
6.6. Průkaz specifických protilátek, sérologie (metodu využíváme; její výsledky nejsou součástí této práce – jsou zpracovávány a budou publikovány jiným autorem)
Předcházející diagnostické metody jsou metody přímého průkazu. Pro nepřímou diagnostiku, tzv. sérologii, slouží sérum (nesmí být chylózní ani hemolytické!) získané ze srážlivé krve. U lokálních zánětů je ale vypovídající hodnota nálezu sérových protilátek problematická a v indikovaných případech je vhodné toto vyšetření ordinovat až po konzultaci konkrétního případu s klinickým mikrobiologem. Metody typu komplement fixační reakce (KFR) nebo imunofluorescenční (IF) se již pro stanovení protilátek neužívají, sérologické laboratoře již ovládly enzymoimunoanalýzy (EIA). Pro serologickou diagnostiku chlamydií existují komerčně vyráběné soupravy využívající buď rodový lipopolysacharidový antigen, nebo vnější membránové proteiny. Spolehlivější i přesnější jsou diagnostické soupravy využívající vnější membránové proteiny, protože ty jsou charakteristické pro konkrétní druh. Na druhé straně je nutné počítat s dvojnásobným zvýšením finančních nákladů, protože je prokázáno, že i Ch. pneumoniae vzácně vyvolá některé klinické projevy charakteristické pro Ch. trachomatis a naopak (konjunktivitida Ch. pneumoniae; pneumonie Ch. trachomatis u starších dětí a dospělých). V praxi zatím není zcela doceněn význam zpřesnění detekce protilátek, tedy metody western blot stejně jako význam slizničních IgA, ani jejich stanovení se běžně neprovádí. Výsledky jsou podle vybavení laboratoře dostupné do několika hodin nebo dnů po odběru. I když se v této práci vyšetřováním protilátek dále nezabýváme, tvoří u chlamydióz důležitou součást komplexního diagnostického spektra. Vždy je třeba si uvědomit:
•
Tzv. „diagnostické okno“ – tedy dobu uběhlou od nákazy do vytvoření dostatečně vysokého množství volných sérových protilátek, které je již daná diagnostická souprava schopna detekovat. U lokálního zánětu navíc může být protilátková odpověď značně opožděná, pokud se dostatečná hladina protilátek vytvoří vůbec.
26
•
Anamnestické protilátky třídy IgG nás pouze informují o tom, zda se s touto infekcí pacient v minulosti již setkal. Jejich negativita stejně jako pozitivita nevylučuje ani nepotvrzuje právě probíhající infekci.
•
Pozitivita IgM nebo sérových IgA protilátek nás informuje o primoinfekci, reinfekci nebo o chronické infekci. Jejich negativita ale nikdy nevylučuje akutní lokální chlamydiózu, při které je ze stěru pozitivní antigen i průkaz nukleové kyseliny. Na druhé straně při chybném odběru nebo při chlamydiovém zánětu mimo dosah odběrové soupravy může být právě pozitivita IgM a IgA jediným vodítkem. Interpretačním problémem zůstává dlouhodobé přetrvávání těchto protilátek.
7. TERAPIE (5, 6, 7)
7.1. Antibiotika (ATB)
Léky vhodné k terapii chlamydióz musí splňovat následující kritéria. Chlamydie by na ně měly být citlivé, terapeutických hladin musí dosahovat v endosomech (přeměna RT na nová ET) a lze je podávat dlouhodobě (týdny). Za lék volby u akutních stavů (a u těhotných a dětí) je dnes považován azitromycin, který je transportován makrofágy přímo do místa zánětu a má velmi dobrou farmakokinetiku, tkáňovou a buněčnou penetraci. Z makrolidů lze použít ještě roxitromycin, spiramycin a josamycin. Další terapeutickou možností jsou antibiotika tetracyklinová, zejména doxycyklin. Lék je kontaindikován u dětí do 8mi let, těhotných a kojících, pozor na hepatotoxicitu, gastro a fototoxicitu. Dále lze použít chinolony, zejména ciprofloxacin a ofloxacin. Chinolony jsou kontraindikovány do 18ti let věku, v graviditě a laktaci. Náležitou pozornost je třeba věnovat i jejich dalším četným nežádoucím účinkům včetně vzniku rezistence na jiné bakterie – indikace jsou proto vyhrazeny pro vážné a chronické stavy, v těchto případech je navíc volena kombinace s antibiotiky výše uvedenými, zejména s azitromycinem. Zvláště u fibrotických procesů se podávají kortikosteroidy. Preferuje se dlouhodobá antibiotická léčba po dobu více týdnů, protože eradikace chlamydií in vivo je často obtížná, 27
dochází pouze k jejich redukci s rizikem vzniku perzistence. Kontrolní výtěry s dostatečným časovým odstupem (alespoň 4 týdny) musí být samozřejmostí!
7.2. Podpůrná terapie
28
STUDIE 3:
Cílem třetí práce publikované kolektivem naší laboratoře ve spolupráci s klinickými odborníky bylo v praxi ověřit dobré zkušenosti s podpůrnou enzymoterapií. Do našeho sledování bylo zařazeno 32 pacientů (16 mužů a 16 žen z heterosexuálních partnerských párů) s nově zjištěnou akutní nekomplikovanou chlamydiovou urogenitální infekcí. Diagnostika byla provedena ve výtěrech z močové trubice mužů a z močové trubice i hrdla děložního žen pomocí přímého průkazu antigenu Chlamydia trachomatis komerční imunofluorescenční metodou (viz 6.4. a STUDIE 1). Všichni pacienti byli léčeni azitromycinem (AZT) v dávkách 1 x 500 mg/den po 3 dny, polovina párů navíc užívala jako podpůrnou léčbu ještě Wobenzym (W) v dávkách 3 x 5 tbl/den po 14 dní (Tabulka 6). Studie nebyla zaslepená – pacienti věděli jaké léky dostávají. Za 4 týdny po dobrání antibiotik byly provedeny u každého kontrolní výtěry. Úspěšnost zvolené terapie: Pacienti léčení pouze AZT – 9 pacientů negativních z 16, tedy úspěšnost léčby 56,25 % (muži 5 z 8, 62,5 %; ženy 4 z 8, 50 %). Pacienti léčení AZT v kombinaci s W – 13 negativních pacientů z 16, tedy úspěšnost léčby 81,25 % (muži 6 z 8, 75 %; ženy 7 z 8, 87,5 %) (Tabulka 7 a Graf 3).
29
Tabulka 6 (vyňato ze Souhrnů údajů o přípravcích)
azitromycin
Wobenzym
-
makrolidové bakteriostatické antibiotikum II. generace
-
inhibice proteosyntézy bakteriální buňky
-
úzké antibakteriální spektrum
-
výjimečně dlouhý biologický poločas (60 hodin)
-
vysoký průnik do tkání a buněk
-
velmi dobrá tolerance
-
směs proteolytických enzymů s protizánětlivým účinkem (pankreatinum, papainum, bromelaina, lipasum, amylasum, trypsinum, chymotrypsinum, rutosidum trihydricum)
-
tzv. efekt vehikula (dosažení vyšší sérové i tkáňové koncetrace ATB při současném podávání)
-
imunomodulační efekt (proteinázy odbourávají cirkulující, shluklé i fixované imunokomplexy a brzdí jejich tvorbu, dále zvyšují fagocytární i cytolytickou aktivitu granulocytů, optimalizují produkci některých cytokinů jako je TNF alfa, IL 1 beta, IL 6, INF gama apod.
-
fibrinolytický a lipolytický efekt (aktivuje fibrinolýzu cestou aktivace plazminogenu, rozpouští mikrotromby a snižuje viskozitu krve, tzn. zlepšuje narušenou mikrocirkulaci)
-
antiflogistický efekt a antiedematózní účinek (redukce otoků zánětlivého i nezánětlivého původu)
-
velmi dobrá tolerance
30
Tabulka 7 Muži (16)
Ženy (16)
Celkem
5/8
4/8
9/16
62,5 %
50 %
56,25 %
6/8
7/8
13/16
75 %
87,5 %
81,25 %
(vyléčení/z kolika) AZT *
AZT + W **
*azitromycin 1 x 500 mg/den po 3 dny ** azitromycin 1 x 500 mg/den po 3 dny + Wobenzym 3 x 5 tbl/den po 14 dní
Graf 3 87,50% 81,25% 75% 62,50% 56,25% 50%
AZT AZT + W
Muži (8 + 8)
Ženy (8 + 8)
Celkem (16 + 16)
31
STUDIE 4:
(V této studii jsem již byla řádně uvedena jako spoluator – zpracovávala jsem data)
Cílem práce bylo po publikaci výsledků efektu systémové enzymoterapie Wobenzymem (W; 3 x 5 tbl/den po 14 dní) v kombinaci s azitromycinem (AZT; 1 x 500 mg/den po 3 dny) u akutních nekomplikovaných urogenitálních infekcí Chlamydia trachomatis předložit výsledky i druhé studie s jiným ATB – s klaritromycinem, tedy ATB ze stejné skupiny makrolidů 2. generace. Opět jsme se opřeli o průkaz antigenu ve stěru imunofluorescenční metodou a opět sledovali 16 heterosexuálních párů a výsledky kombinace stejné enzymoterapie (W) s klaritromycinem (CLR, 2 x d 500 mg tbl neretardované formy po 14 dnů). Úspěšnost samotné terapie CLR byla u mužů naprosto stejná jako AZT, tedy 62,5%, ale u kombinované terapie u nich vzrostla ze 75% u AZT+W na 87,5% u CLR + W. Oproti tomu úspěšnost terapie žen, která v první studii vyšla u AZT 50% a AZT+W 87,5%, u CLR i CLR+W byla naprosto nulová a tímto problémem je nutné se i nadále zabývat. Jedna z teorií/možností: Průnik AZT i CLR do buněk by měl být obdobný, ale chemickou strukturu azitromycinu tvoří 15ti členný laktonový kruh, kdežto klaritromycin má laktonový kruh 14ti členný – tedy stejně jako erytromycin. Erytromycin i klaritromycin mají interakce s léčivy obsahujícími theofylin (součást analgetik) a ergotamin (léky při migréně a poruchách menstruace) a s midazolanem (součást léků při nespavosti). U azitromycinu tato interakce uváděna není. Existuje tedy předpoklad, že tyto léky užívají především ženy a mohlo by tedy dojít k ovlivnění účinku klaritromycinu (zvyšuje se hladina ergotaminu, který kupříkladu zužuje cévy – co když brzdí diapedézu fagocytů?)… U pacintek v naší studii jsme bohužel užívání výše uvedených léků (ale ani např. hormonální antikoncepce a dalších) nezjišťovali a zpětné dohledání je prakticky nemožné. Neúspěch terapie CLR u žen tím ale samozřejmě nedokážeme s naprostou jistotou zcela vysvětlit, bude třeba dále vzít do úvahy poměry anatomické i zejména imunologické...
32
Tabulka Muži (negativní / z počtu) %
Ženy (16) (negativní / z počtu) %
Celkem (negativní / z počtu) %
AZM
5/8 62,5 %
4/8 50 %
9/16 56,25 %
AZM + W
6/8 75 %
7/8 87,5 %
13/16 81,25 %
CLR
5/8 62,5 %
0/8 0%
5 / 16 31,25 %
CLR + W
7/8 87,5 %
0/8 0%
7 / 16 43,75 %
33
Graf Graf
87,50% 81,25%
87,50%
75% 62,50%
62,50% 56,25%
Muži
50% 43,75%
Ženy Celkem
31,25%
AZM
AZM + W
0%
0%
CLR
CLR + W
Pozn: U neúspěšně léčených pacientů v obou studiích byli tito následně léčeni a vyléčeni dlouhodobou kombinovanou ATB léčbou (její výsledky budou prezentovány jinde).
34
8. DISKUZE A ZÁVĚR
Přímá diagnostika infekcí Chlamydia trachomatis pomocí průkazu antigenu imunofluorescenční metodou je stále spolehlivá metoda, která měla a má své místo v diagnostickém spektru mikrobiologických laboratoří. Ke kontrole nebo konfirmaci sporných výsledků je pro kvalitní laboratoř však bezpodmínečně nutné mít k dispozici vždy i další metody, např. PCR a průkaz protilátek. Problematickou kapitolou nadále zůstávají chronické chlamydiózy ve vyšších etážích urogenitálního systému, kde existuje možnost negativního stěru z etáže nižší – musíme připustit, že takové případy opravdu mohou přímé diagnostice unikat. Zde je nutné pro vyšší citlivost považovat za metodu volby PCR. Naše data ukázala na možný vzestup incidence urogenitálních chlamydióz v našem regionu – problém je však nutné dále analyzovat, protože vše lze vysvětlit při absenci jakýchkoli epidemiologických dat (nemoc nepodléhá ani hlášení a epidemiologické studie chybí zcela) cílenější diagnostikou. Terapii pouze azitromycinem (tedy „lékem volby“) již nelze bez výhrad doporučit jako lék volby urogenitálních chlamydiových infekcí. Ověřili jsme si vlastní praktické zkušenosti – tato terapie není univerzální, téměř polovina našich pacientů nebyla vyléčena a tvrzení o spolehlivém léku volby se tak jeví přinejmenším jako sporné. Kombinovaná terapie azitromycin+Wobenzym je pro akutní nekomplikované urogenitální chlamydiózy výrazně účinnější než samotná terapie AZT, i když ani ona není (a nemůže být) ve všech případech 100% zárukou úspěchu. Kombinovaná terapie klaritromycin+Wobenzym je stejně efektivní ale jen pro muže. Naprosté selhání klaritromycinu v léčbě urogenitálních chlamydióz u žen je nutné také dále studovat. Kontrolní výtěry v dostatečném odstupu alespoň 4 týdny po léčbě jsou naprostou nutností pro hodnocení její úspěšnosti, spoléhat se pouze na ATB nebo na ústup příznaků u manifestní formy nikdy nelze.
35
9. LITERATURA
1. Bednář, M., Fraňková, V., Schindler, J., Souček, A., Vávra, J.: Lékařská mikrobiologie. Marvil, 1996: s. 325–333. 2. Cribb, P., Scapini, J.P., Serral, E.: One-tube Nested Polymerase Chain Reaction for Detection of Chlamydia trachomatis. Mem Inst Oswaldo Crus, Rio de Janeiro, September 2002; Vol.97(6): p. 897–900. 3. Förstl, M., Štěpánová, V., Mlynář, J., Plíšková, L., Fajfr, M., Špliňo, M.: Přímá diagnostika infekcí Chlamydia trachomatis – průkaz antigenu imunofluorescenční metodou. Interní medicína pro praxi, 2004; 8: s. 412-415. http://www.solen.cz/pdfs/ped/2004/04/07.pdf 4. Gebouský, P., Kapla, J., Kosina, P.: Doporučené postupy pro praktické lékaře. 2002: http://www.cls.cz/dp/2002/t230.rtf 5. Jarčuška, P.: Liečba chlamýdiových infekcií. In: Medková, Z., Kalousek, I., Jarčuška, P.: Chlamydiové infekce. Triton Praha, 2001: s. 72–93. 6. Marešová, V.: Infekce močových cest. In: Havlík, J., et al.: Infekční nemoci. 2002, Galén: s. 99–103. 7. Medková, Z., Kalousek, I., Jarčuška, P.: Chlamydiové infekce. Triton Praha, 2001. 8. Ondrovčík, P.: Močové infekce. In: Votava, M., Ondrovčík, P.: Vybrané kapitoly z klinické mikrobiologie. Masarykova univerzita Brno, 2000: s. 61–66. 9. Ondrovčík, P.: Sexuálně přenosné nemoci. In: Votava, M., Ondrovčík, P.: Vybrané kapitoly z klinické mikrobiologie. Masarykova univerzita Brno, 2000: s. 66–74. 10. Ong, G.M., Wyatt, D.E., ONiell, H.J., McCaughey, C., Coyle, P.V.: A comparison of nested polymerase chain reaction and immunofluorescence for the diagnosis of respiratory infections in children with bronchiolitis, and the implications for a cohorting strategy. Journal of Hospital Infection, 2001; 49: p. 122–128. 11. Schachter, J., Ridgway, G.L., Collier, L.: Chlamydial diseases. In: Collier, L., Balows, A., Sussman, M.: Topley & Wilson´s Microbiology and Microbial Infections, Volume 3, Bacterial Infections. 9 ed., Arnold London, 1998: p. 977–994. 12. Smith, I.W.: Chlamydie. In: Greenwood, D., Slack, R.C.B., Peutherer, J.F., a kol.: Lékařská mikrobiologie. Grada, 1999: s. 369–377. 36
13. Votava, M.: Rod Chlamydia. In: Votava, M. a kol.: Lékařská mikrobiologie II – Přehled vyšetřovacích metod. Masarykova univerzita Brno, 2000: s. 204–05. 14. Woznicová, V.: Chlamydie. In: Votava, M. a kol.: Lékařská mikrobiologie speciální. Neptun, 2003: s. 173–176.
37
10. OBRAZOVÁ PŘÍLOHA
Obrázek 1 – Vývojový cyklus chlamydií.
(Schéma Hana Kotlandová, ÚKIA FN a LFUK Hradec Králové)
38
Obrázek 2 – Princip detekce antigenu pomocí přímé imunofluorescence.
(Schéma Hana Kotlandová, ÚKIA FN a LFUK Hradec Králové) 39
Obrázek 3 – Preparát k odečtu; akutní zánět pochvy.
(Foto MUDr. Miroslav Förstl, ÚKM FN a LFUK Hradec Králové)
40
Obrázek 4 – Imunofluorescenční snímek, negativní nález z vagíny; zachyceny pouze epitelie a buněčné elementy
(Foto RNDr. Ctirad Andrýs, Ph.D., ÚKIA FN a LFUK Hradec Králové)
41
Obrázek 5 – Imunofluorescenční snímek, Chl. trachomatis masivně pozitivní výtěr ženské uretry (svítící body).
(Foto MUDr. Miroslav Förstl, ÚKM FN a LFUK Hradec Králové)
42
Obrázek 6 – PCR, výsledek detekce.
(Foto Mgr. Radka Bolehovská, Ph.D., ÚKBD FN a LFUK Hradec Králové)
43
Plyšová hračka firmy GIANTmicrobes Chlamydie (Chlamydia trachomatis)
