Exploring fungal diversity for the biobased economy
Utrecht Universiteit
Ronald P. de Vries
1
Exploring fungal diversity for the biobased economy
ORATIE Gehouden bij de aanvaarding van het ambt van bijzonder hoogleraar ‘Fungal Molecular Physiology’ aan Utrecht Universiteit op vrijdag 27 februari 2015.
INAUGURAL LECTURE Given at the acceptance of the position of Professor in Fungal Molecular Physiology at Utrecht University on Friday February 27 th 2015
Dr. ir. Ronald P. de Vries
2
Contents Inleiding ............................................................................................................................................ 4 Schimmel Biodiversiteit .................................................................................................................... 5 Planten biomassa afbraak door schimmels ......................................................................................... 7 Traditionele en nieuwe toepassingen van schimmel enzymen ............................................................. 8 Het verbeteren van commerciële enzym mengsels............................................................................ 11 Het grotendeels ongebruikt potentieel van basidiomycete schimmels ............................................... 14 Het mijnen van schimmel biodiversiteit voor nieuwe biosynthetische routes .................................... 14 Een veranderende aanpak voor onderzoek in dit veld ....................................................................... 15 Van verleden naar toekomst ............................................................................................................. 16 Fundamenteel en toegepast onderzoek ............................................................................................. 17 Dankwoord...................................................................................................................................... 18
3
Mijnheer de Rector, familie, vrienden, collega’s, Dames en heren, Van harte welkom bij mijn oratie waarmee ik het ambt van bijzonder hoogleraar Fungal Molecular Physiology aanvaard aan Utrecht Universiteit.
Inleiding Wetenschap is evenzeer een slachtoffer van mode verschijnselen als elk ander aspect van de maatschappij en het zal zeker niet de eerste keer zijn dat ieder van u de term ‘biobased economie’ hoort. Het staat hoog op de agenda van de meeste nationale overheden evenals de Europese Unie. De term ‘biobased economie’ slaat op een economie waar de belangrijkste grondstoffen voor producten afkomstig zijn van duurzame biologische bronnen (zoals planten) in plaats van fossiele bronnen. Het omvat ook onderzoek gericht op het in detail begrijpen van biologische mechanismen en processen die toegepast kunnen worden in de industrie. Dus waar het op neer komt is dat in een biobased economie veel van de processen die nu gebaseerd zijn op fossiele bronnen en chemische omzettingen vervangen worden door biologische productie processen, zoals fermentatie, die door de wetenschap ontwikkeld worden. De biobased economie omvat veel aspecten, maar u zal begrijpen dat, gezien het onderwerp van mijn onderzoek, ik zal focussen op die aspecten gerelateerd aan schimmels. Biologische productie processen met behulp van schimmels zijn niet nieuw, maar bestaan al millennia, zoals in the prodcutie van bier, broos, wijn en soja saus. Het brouwen van bier, een fermentatie proces waarin gist, een subgroep van schimmels, gebruikt wordt, bestaat al minstens 5000 jaar in verschillende delen van de wereld. Een ander fermentatie proces, genaamd koji, is al gedocumenteerd in China sinds 300 BC en werd gebruikt voor de productie van gefermenteerd voedsel zoals soja saus en sake. Zelfs moderne producten zoals biobrandstoffen zijn niet zo nieuw als de meeste mensen denken. De diesel motor die Rudolf Diesel in 1890 ontwierp was oorspronkelijk bedoeld om pinda olie als brandstof te gebruiken, maar werd later omgebouwd voor petroleum gebaseerde brandstoffen. Hetzelfde geld voor de T-Ford die Henri Ford ontwierp rond 1900. Deze kon petroleum, alcohol en mengsels hiervan gebruiken als brandstof. Echter, later in de 20ste eeuw, vooral tijdens de tweede wereld oorlog, kwam de nadruk op het gebruik van fossiele grondstoffen en chemische processen te liggen. Gedurende verschillende decennia, de focus in de maatschappij was op industrialisatie en het verbeteren van de levenskwaliteit en biobased processen kregen minder aandacht in verschillende industriële sectoren. Echter, in sommige sectoren, zoals de productie van voedsel en papier, werd sterke vooruitgang geboekt gedurende de laatste 7 decennia en het gebruik van schimmels in die toepassingen kreeg een sterke positie. De wens om productie processen naar biologische processen om te zetten in een biobased economie is vooral gebaseerd op de afnemende reserves van fossiele grondstoffen. Planten biomassa is een aantrekkelijk alternatieve grondstof aangezien het grootschalig aanwezig en duurzaam is en infrastructuur voor het gebruik ervan reeds bestaat. Een tweede argument voor het veranderen van fossiele brandstoffen naar planten biomassa is gerelateerd aan opwarming van de aarde en veranderingen in ons klimaat. Het gebruik van fossiele grondstoffen verhoogd de CO2 concentraties in de atmosfeer, wat als één van de belangrijkste 4
redenen voor klimaatverandering wordt gezien. Bij de omzetting van planten materiaal ontstaat ook CO2, maar een deel daarvan wordt weer opgenomen door planten tijdens hun groei, zodat de netto CO2 uitstoot lager is. Deze positieve kant van de biobased economie wordt actief uitgedragen en op het internet kunnen ook veel artikelen hierover gevonden worden. Het gebruik van planten biomassa heft ook een aantal potentiele nadelen die nog niet volledig opgelost zijn en die vooral met de competitie met voedsel productie te maken hebben. Deze competitie kan direct zijn, zoals het gebruik van zetmeel uit mais of sucrose uit suikerriet of suikerbiet. Het gebruik van gewassen die niet voor voedselproductie gebruikt worden zou dan ook een betere optie zijn, echter dit levert nog steeds concurrentie met voedselproductie op met betrekking tot het gebruik van landbouwgrond. Hierdoor bestaat ook een actieve lobby tegen biobrandstoffen. Het gebruik van landbouw afval, zoals stro, of gewassen die kunnen groeien op arme grond die niet geschikt is voor voedselproductie, zijn daarom meer interessante alternatieven die wereldwijd bekeken worden. De uitdaging voor de biobased economie is om biologische processen in te zetten voor een breed scala aan producten, zoals brandstoffen, materialen, chemicaliën, en farmaceutische cosmetische producten. Deze processen moeten duurzaam zijn en geen competitie geven met voedselproductie.
Schimmel Biodiversiteit Ik wil nu graag eerst ingaan op schimmel biodiversiteit. Biodiversiteit is een algemene term die de variaties de bestaan bij organismen in de natuur omvat. Schimmel biodiversiteit omvat niet alleen de verschillende species die op aarde voorkomen, maar ook hun verschillenden biotopen, evenals de verschillen in hun fysiologie. Schimmels werden oorspronkelijk als verwanten van planten gezien, maar recenter onderzoek heeft aangetoond dat ze nauwer verwant zijn aan dieren, al staan ze hier nog steeds evolutionair ver vandaan (Figuur 1). Figuur 1. De boom van het leven. (Ricou, Joana; Pollock, John A. The Tree, The Spiral And The Web of Life: A Visual Exploration of Biological Evolution for Public Murals. Leonardo Journal, 1:45 2012)
Schattingen met betrekking tot het aantal schimmels lopen uiteen van 1,5 tot 15 miljoen species, maar slechts een fractie hiervan is bestudeerd. Ik kom later terug op de relevantie 5
hiervan. Schimmels worden in alle natuurlijke en door mensen gemaakte biotopen gevonden, van de poolcirkel tot de tropen en zowel op land als in het water. Zelfs de lucht bevat grote aantallen schimmel sporen die wij met elke ademtocht inademen. Schimmels hebben twee groeivormen: eencellige soorten die gisten genoemd worden, en meercellige soorten die filamenteuze schimmels genoemd worden. Sommige schimmels komen uitsluiten voor als gist of filamenteuze schimmels, terwijl anderen in beide vormen voorkomen, afhankelijk van de condities waaronder ze groeien. Veel schimmels gebruiken dood materiaal als voedsel (saprobe schimmel). Een paar voorbeelden hiervan (Figuur 2) zijn schimmels die we vinden in onze keuken op sinaasappelen, verschillende soorten paddenstoel vormende schimmels in het bos en soorten die we zelf als voedsel gebruiken.
Figuur 2. Voorbeelden van saprobe schimmels.
Andere schimmels vormen interacties met planten die voor beide organismen positief zijn, zoals mycorrhizae. Deze schimmels maken verbindingen met het wortelstelsel van de plant en vergroten dit daardoor. Zij leveren nutriënten aan de plant en krijgen in ruil daarvoor voedsel van de plant. Deze samenwerking heeft een groot effect op de groei van planten. Echter, niet alle schimmels hebben een positief effect. Veel plantenziekten worden veroorzaakt door schimmels. Al resulteren sommige in structuren die als een delicatesse worden beschouwd, zoals tumor groei van mais door de schimmel Ustilago, in de meeste gevallen is het resultaat een verlies in opbrengst of dood van de plant. Daarnaast kunnen ook dieren geïnfecteerd worden door schimmels, wat tot ernstige ziekten of dood van het dier tot gevolg kan hebben. Schimmel ziekten komen ook voor bij mensen, van huidziekten zoals roos tot meer ernstige ziekten die verminking of dood tot gevolg kunnen hebben. Van de voorbeelden zojuist genoemd mag het duidelijk zijn dat schimmels ons en ons milieu op vele manieren beïnvloeden. Zoals reeds aangegeven gebruiken de meeste schimmels planten biomassa als hun primaire koolstofbron en veel van deze schimmels zijn essentieel voor de koolstof cyclus. Zij zijn zeer 6
efficiënt in de afbraak van planten biomassa dat anders op zou hopen in de natuur. Het is daarom geen verrassing dat schimmels al een lange geschiedenis hebben in het gebruik voor het omzetten van planten biomassa en industriële toepassingen.
Planten biomassa afbraak door schimmels Planten biomassa is een zeer interessante grondstof voor de biobased economie, maar heeft een zeer complexe en moeilijk af te breken structuur. Planten biomassa bestaat voor een groot deel uit celwanden, die zijn opgebouwd uit polysacchariden (lange suikerketens), de aromatische polymeer lignine, en eiwitten. De polysacchariden zijn met elkaar en lignine verbonden waardoor een complex netwerk ontstaat dat structuur en sterkte geeft aan de plant (Figuur 3). The precieze structuur van de verschillende cel wand polymeren en hun relatieve hoeveelheid verschilt niet alleen per plant species, maar ook per plant weefsel, en verandert in de verschillende seizoenen.
Figuur 3. Schematische afbeelding van de planten celwand.
De rigide structuur en de sterke variatie in de samenstelling van de planten celwand zijn een significante uitdaging voor schimmels om dit als koolstofbron te gebruiken. Schimmels kunnen geen polymeren opnemen in de cel en moeten deze daarom buiten de cel afbreken tot kleinere verbindingen. Hiervoor produceren zij enzymen die de polysacchariden in kleine suikers knippen die in de cel opgenomen kunnen worden. Enzymen zijn eiwitten en vormen samen de gereedschapskist van de natuur. Het zijn katalysatoren die de omzetting van de ene verbinding in een andere mogelijk maken. Planten biomassa afbrekende enzymen zijn zeer specifiek voor de verschillende typen polysacchariden en daarom is voor de afbraak van het ene polysacharide een andere set enzymen nodig dan voor een ander.
Om geen energie te verspillen moeten schimmels kunnen waarnemen welk polysacharide aanwezig is, zodat zij alleen de noodzakelijke enzymen produceren. De methode die zij daarvoor gebruiken is versimpeld weergegeven in Figuur 4. De schimmel merkt de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid suiker op die gebruikt kan worden als koolstofbron. Als reactie hierop activeert de schimmel een regulator die de expressie van twee sets genen activeert. De eerste set zorgt voor de productie van metabole enzymen die de suiker om kunnen zetten. De tweede set zorgt voor de productie van extracellulaire enzymen die meer van dit suiker vrij kunnen maken uit planten biomassa.
7
Figuur 4. Afbraak van of polysacchariden door schimmels.
Het beschikbaar komen van schimmel genoom sequenties heeft onderzoek in dit en vele andere velden compleet verandert. Met een genoom sequentie is het mogelijk om alle potentiele enzymen te identificeren die een organisme kan produceren. De eerste schimmel genomen gaven direct aan dat de set enzymen die schimmels kunnen produceren veel groter is dat tot dan toe aangenomen werd. Naar mate meer genoom sequenties beschikbaar kwamen werd ook steeds duidelijker hoe groot de verschillen in deze enzym sets zijn tussen schimmels, zelfs tussen verwante species.
Traditionele en nieuwe toepassingen van schimmel enzymen Zoals reeds gezegd is het gebruik van schimmel enzymen in industriële processen niet nieuw en met namen in de tweede helft van de 20ste eeuw werden schimmels en schimmel enzymen op grote schaal toegepast voor verschillende processen. Het best bekende voorbeeld van schimmel fermentaties is de productie van brood en bier door de gist Saccharomyces cerevisiae, maar ook filamenteuze schimmels werden in verschillende processen toegepast. In sommige gevallen werd de schimmel zelf gebruikt, zoals in de productie van Franse kazen als brie en camembert. In andere toepassingen worden enzymen die geproduceerd zijn door schimmels gebruikt, vaak enzymen die planten biomassa af kunnen breken. Schimmel enzymen kunnen gebruikt worden voor het helder maken van appelsap dat normaal gesproken troebel is, terwijl tijdens het maken van brood schimmel enzymen aan het deeg worden toegevoegd om brood met een meer uniforme structuur te krijgen dat minder snel uitdroogt. Een belangrijke toepassing van schimmel enzymen is in het bleken van papier, een proces dat oorspronkelijk chemisch gedaan werd met behulp van chloor. Aangezien dit slecht voor het milieu is, is dit proces bijna volledig vervangen door enzymatische bleking. Een ander interessant voorbeeld waar schimmel enzymen het oorspronkelijke proces vervingen is de productie van stone-washed jeans. Dit werd oorspronkelijk inderdaad gedaan door de jeans met stenen te wassen, maar dit leverde schade aan de wasmachines aan wat leidde tot hoge productie kosten. Het bleek dat hetzelfde effect bereikt kon worden met bepaalde schimmel enzymen zonder negatieve effecten op de machines, zodat de meeste stone-washed jeans nu eigenlijk ‘enzyme-washed’ jeans zijn. Dt zijn slechts enkele voorbeelden van de toepassingen van schimmel enzymen. The enzym mengsels die hiervoor gebruikt worden meestal geproduceerd door een relatief klein aantal schimmels, vooral species van Aspergillus, Trichoderma reesei en Myceliophthora thermophila. De keus voor deze species is niet alleen gebaseerd op de enzym sets die zij produceren, maar ook op andere belangrijke eigenschappen voor industriële productie 8
processen. Dit zijn hoge productie van enzymen, goede groei in grootschalige fermentaties en eenvoudig gebruik en manipulatie van de schimmels. Verschillende bedrijven, zoals DSM, Dupont, Novozymes en Dyadic hebben uitgebreide stamverbeteringsprogramma’s uitgevoerd waardoor zij stammen ontwikkeld hebben die superieur zijn vergeleken met de oorspronkelijke stammen op deze aspecten. Ondanks de grote variatie in deze processen hebben ze één ding gemeen, namelijk dat ze de planten biomassa alleen willen modificeren en niet volledig willen afbreken. In meer recentere toepassingen van schimmel enzymen is dit heel anders. De monomere suikers die vrijgemaakt kunnen worden uit planten biomassa zijn zeer veelbelovende bouwstenen voor biobrandstoffen, biochemicaliën en bioplastics. Biobrandstoffen, in het bijzonder bioethanol, is het vlaggenschip van deze processen en was oorspronkelijk voornamelijk geproduceerd uit mais zetmeel en sucrose van suikerriet en suikerbiet. Deze eerste generatie biobrandstof levert daarom rechtstreeks competitie op met voedsel productie, wat een ongewenste situatie is aangezien dit kan leiden tot verlaagde voedsel productie en verhoogde voedsel prijzen. Daarom is de focus nu meer op tweede generatie bioethanol wat gebaseerd is op landbouw afval en geen directe competitie geeft met voedsel productie. Echter, de omzetting van deze substraten is aanzienlijk moeilijker dan zetmeel en sucrose. Daarom hebben de enzym mengsels die hiervoor gebruikt worden een uitgebreidere set enzymen nodig om een significant deel van het substraat om te zetten. Zoals reeds aangegeven waren de oorspronkelijke commerciële enzym mengsels alleen bedoeld voor modificatie van de polysacchariden en daarom niet erg geschikt voor volledige afbraak van de biomassa. Zowel in de academische wereld als de industrie zijn grote inspanningen geleverd om betere enzym mengsels te ontwikkelen, meestal door de productie van specifieke enzymen te verhogen en zo de mengsels te verrijken met nieuwe activiteiten. Dit leidde tot significante verbeteringen, maar de huidige mengsels zijn nog steeds niet efficiënt genoeg voor de volledige afbraak van planten biomassa. Daarnaast moet er zoveel van deze enzymen toegevoegd worden om significante hoeveelheden van de suikers vrij te maken, dat de productie kosten van de enzymen één van de belangrijkste onderdelen zijn van de totale productie kosten van biobrandstoffen. Een sterke toenamen in de efficiëntie of afname in de productie kosten van de enzym mengsels is noodzakelijk om tweede generatie biobrandstoffen en biochemicaliën een economische realiteit te maken.
Waarom zijn de beschikbare enzym mengsels niet voldoende efficiënt? Zoals jullie je waarschijnlijk kunnen voostellen hebben verschillende mensen hier verschillende meningen over, maar vandaag geef ik alleen mijn visie hierop. Naar mijn mening is het gebrek aan efficiëntie voornamelijk gebaseerd op vier factoren. Allereest is het naar mijn mening moeilijk voor te stellen date r een schimmel is die als doel heeft planten biomassa volledig af te breken. Het voornaamste doe van een schimmel is voldoende koolstof bron en energie vrij te maken om te kunnen groeien en zich voort te kunnen planten. Daarom zal een schimmel hoogstwaarschijnlijk die componenten van de biomassa negeren waarvoor hij niet de juiste gereedschappen (enzymen) heeft. In de natuur 9
gebeurt de volledige afbraak van planten biomassa door een gemengde populatie van schimmels samen met bacteriën en niet door een enkele schimmel (Figuur 5).
Figuur 5. Hout afbraak door verschillende schimmel species.
De afbraak van planten materiaal in de natuur is een proces waarin verschillende schimmels na elkaar een rol spelen. De eerste afbraak gebeurt door schimmels doe gespecialiseerd zijn in het eten van eenvoudig af te breken componenten terwijl daarna andere schimmels de wat lastigere componenten afbreken. De meest recalcitrante componenten van de biomassa worden afgebroken door de late kolonisten die de juiste enzymen voor dit deel van het substraat kunnen produceren. De meeste commerciële enzym cocktails worden gemaakt door één schimmel en bevatten daarom ook maar een fractie van de variatie aan enzymen die in de natuur bij de afbraak betrokken is. Hoewel de commerciële enzym producerende schimmels allen een breed scala aan enzymen kunnen produceren, zijn dit allemaal vroeg tot middel actieve schimmels, en zijn dus slecht geschikt voor de afbraak van de meer moeilijk af te breken componenten van de planten biomassa. Een commercieel enzym mengsel heeft dan ook naast de huidige enzymen ook enzymen nodig van late schimmels om de lastigere componenten af te kunnen breken. Ten tweede, gedurende het afbraak proces van planten biomassa verandert de samenstelling hiervan. In de natuur passen schimmels de enzym set die zij produceren hieraan aan om een optimale match te behouden met de samenstelling van het overgebleven substraat. Dit betekend waarschijnlijk dat initieel enzymen worden geproduceerd voor de makkelijkere componenten terwijl later enzymen geproduceerd worden die zich richten op de lastigere componenten, zoals aangegeven in Figuur 6. In industriële afbraak van planten materiaal wordt een statisch enzym mengsel gebruikt dat niet veranderd gedurende het proces. Dit betekend dat het mengsel maar gedurende een klein deel van het proces een goede match is met de samenstelling van het substraat, terwijl het de rest van de tijd hier slecht bij aansluit. Figuur 6. Sequentiële afbraak van componenten van planten biomassa. Verschillende enzym sets worden geproduceerd door de schimmel op verschillende momenten van het proces.
10
Ten derde, zoals reeds gezegd zijn er significante verschillen in de structuur van de biomassa van verschillende planten, zoals tarwe stro en bagasse van suikerriet. Daarnaast kan de locatie waar de plant gegroeid wordt een groot effect hebben op de samenstelling, evenals de tijd van het jaar. De productie van enzymen door schimmels hangt sterk af van de samenstelling van de biomassa waarop gegroeid wordt. In studies in mijn groep en met partners hebben we de enzym productie door verschillende schimmels op verschillende typen biomassa vergeleken en aangetoond dat deze sterk verschillen. We hebben laten zien dat de beste afbraak van een substraat bereikt wordt met enzym mengsels die geproduceerd zijn op het zelfde substraat. Dit geeft aan dat zelfs een heel actief enzym mengsel waarschijnlijk alleen efficiënt is op een beperkt aantal substraten. Ik betwijfel daarom ten zeerste of een algemeen enzym mengsel ontwikkeld kan worden dat een hoge efficiëntie heeft op een breed scala aan substraten. Ten slotte gebeurt de productie van enzym mengsels vooral in grote vloeistof cultures die gemixt worden om te zorgen dat er voldoende zuurstof aanwezig is. In de natuur groeien de meeste landschimmels op vaste substraten die variëren van relatief droog tot vochtig, maar niet in vloeistof. Het kweken in zulke onnatuurlijke condities zal hoogstwaarschijnlijk elk aspect van de fysiologie van de schimmel beïnvloeden, inclusief de set enzymen die geproduceerd wordt. Er is aangetoond dat kweek van schimmels op vaste substraten tot hogere enzym productie leidt en efficiëntere enzym mengsels. Echter deze worden door praktische problemen veel minder vaan in de industrie toegepast.
Het verbeteren van commerciële enzym mengsels Naar mijn mening is het echter zeker mogelijk om meer efficiënte enzym mengsels te maken, door de vier zojuist genoemde factoren mee te nemen in de ontwikkeling hiervan. Allereerst moeten we de verschillende manieren waarop schimmels planten biomassa afbreken bestuderen en ook kijken naar de gecombineerde activiteit van verschillende schimmels om inzicht te verkrijgen in de gecombineerde aanpak die nodig is voor volledige afbraak van planten biomassa. Ten tweede moeten we bestuderen welke veranderingen schimmels maken in de enzym set die zij produceren als reeds een deel van het substraat afgebroken is. Dit zal duidelijk maken welke enzym activiteiten in het begin van het proces nodig zijn en welke pas later. Aangezien het niet waarschijnlijk is da teen algemene enzym cocktail ontwikkeld kan worden die zeer efficiënt is op een breed scala aan substraten, moeten we daarnaast een meer flexibele aanpak ontwikkelen. Eén manier zou zijn om grootschalig een basis enzym mengsel te produceren waaraan substraat-specifieke enzymen toegevoegd kunnen worden. Echter, het is dan noodzakelijk om de algemene enzymen in kaart te brengen en de substraat-specifieke sets. Deze verschillende oplossing zijn allemaal afhankelijk van een grondig begrip van het natuurlijk planten biomassa afbraak proces. Dit was 10-15 jaar geleden moeilijk om in zeer groot detail te bestuderen, maar de moderne technologie heeft ons alle methoden gegeven om dit nu wel te doen. 11
Zoals ik reeds eerder aangaf hebben genoom sequenties het potentieel van schimmels met betrekking tot planten biomassa afbraak opgehelderd. Andere technieken, zoals transcriptomics en proteomics, gaan een stap verder door aan te tonen welke genen aan staan en welke enzymen geproduceerd worden door de schimmel op een specifiek moment en onder specifieke condities. Daarnaast zijn er geavanceerde methoden om de samenstelling van de planten biomassa te analyseren, waardoor we kunnen zien wat hiermee gebeurt tijdens de groei van de schimmel. De combinatie van deze methoden geeft een veel gedetailleerder beeld over hoe een specifieke schimmel planten biomassa afbreekt. Door dit op verschillende tijdstippen van de groei te analyseren kunnen we een tijdlijn van de afbraak reconstrueren, die ons kan vertellen welke componenten eerst afgebroken worden en door welke enzymen, en welke enzymen op een later moment worden geproduceerd voor de afbraak van de moeilijkere componenten. Het is een uitdaging om deze inzichten om te zetten in praktische toepassingen voor biomassa afbraak aangezien dit mogelijk een opeenvolgende toevoeging van verschillende sets enzymen zou vereisen om het maximale resultaat te bereiken. In mijn groep ligt de focus van het onderzoek op het betrekken van een groter deel van schimmel biodiversiteit bij de omzetting van planten biomassa (Fig. 7).
Figuur 7. Een fractie van de schimmel biodiversiteit.
Slechts een zeer klein aantal schimmels wordt gebruikt voor de industriële productie van enzym mengsels. Gezien de hoeveelheid tijd, geld en inspanningen die geïnvesteerd zijn in de ontwikkeling van de huidige productie stammen is het onwaarschijnlijk dat het aantal species dat in de industrie gebruikt wordt sterk toe zal nemen. Dit betekend niet dat het niet mogelijk is om een groter deel van de schimmel biodiversiteit te betrekken bij de verbetering van enzym mengsels. Al geruime tijd worden genen van andere schimmels tot expressie gebracht in de productie stammen om de enzym mengsels die zij produceren te verrijken met nieuwe activiteiten. Echter, het succes hiervan is variabel een één van de grootste uitdagingen is het selecteren van de juiste genen hiervoor. Een onderdeel van deze selectie is het kiezen welke schimmel de donor van het gen moet zijn. Een beter begrip van de fysiologie en biotopen van schimmels kan een belangrijke hulp zijn voor rationele selectie strategieën om de species te identificeren die hoogstwaarschijnlijk de enzymen bevat die de industrie nodig heeft. De tweede stap is dan het ontwikkelen van methoden om het potentieel van zulke kandidaat species te testen. Ik zal dit met een paar voorbeelden illustreren. Neem een situatie waar het niet afgebroken deel van de biomassa na een enzym behandeling in detail geanalyseerd is en een hoge concentratie lignine bevat verbinden aan cellulose en xylan. Eén van de methoden die dan gebruikt kan worden om de juiste donor schimmel te vinden is het groeien van een set schimmels op dit rest materiaal en die schimmels te 12
selecteren die goed groeien. Aangezien schimmels de polymere substraten niet op kunnen nemen, moet goede groei betekenen dat deze schimmel dit substraat kan afbreken tot kleinere componenten. Het lastige aspect zit in het selecteren van de set schimmels om te testen, aangezien het niet uitvoerbaar is om alle schimmels te testen. Informatie over de natuurlijke biotoop en fysiologie geeft ons de mogelijkheid om te voorspellen welk type substraat verschillende species waarschijnlijk af kunnen breken. Op basis hiervan kan een subset van schimmels geselecteerd worden dat een hoge kans heeft een goede ‘match’ te zijn met het rest-substraat. In sommige toepassingen is niet alleen het type substraat dat een enzym mengsel kan afbreken belangrijk, maar ook de temperatuur of de pH waarbij het dit kan doen of de tolerantie van de enzymen tegen bepaalde condities zoals hoge zout concentraties. Ook hier kan kennis van de fysiologie ons helpen om de juiste species te selecteren. Enzymen die actief zijn bij hoge temperaturen zijn waarschijnlijk te vinden in schimmels die in warme klimaten leven, zoals woestijnen of de tropen, terwijl enzymen die actief zijn bij lage temperaturen te verwachten zijn bij schimmels die in de poolstreken leven. Evenzo zullen schimmels die in biotopen met hoge zoutconcentraties leven, zoals de regio van de Dode Zee, waarschijnlijk enzymen produceren die tolerant zijn tegen hoge zoutconcentraties. Het gebruik van dit soort informatie samen met zeer selectieve test methoden stelt ons in staat een significant groter deel van de schimmel biodiversiteit toe te passen in industriële processen. De volgende stap is dan het identificeren van de genen die de gewenste enzymen coderen in deze schimmels, maar met de genoom technologieën die ik eerder noemde is dit veel eenvoudiger geworden en geen belangrijk obstakel meer. Het mijnen van schimmels voor nieuwe enzymen die in industriële productie stammen geproduceerd kunnen worden is daarom een belangrijk onderwerp in mijn groep, maar dit brengt ook nieuwe uitdagingen. De belangrijkste hiervan is het halen van goede productie niveaus van deze nieuwe enzymen, wat tot nu toe sterk variërende resultaten heeft gegeven. In het bijzonder twee problemen moet opgelost worden hiervoor. De eerste ius de variatie in gen structuur tussen subgroepen van schimmels. De industriële schimmels die gebruikt worden voor enzym productie komen allen uit het fylum Ascomycota, zoals Aspergillus, en kunnen daarom genen van andere ascomyceten meestal redelijk goed tot expressie brengen. Echter, genen van de Basidiomycota, zoals de paddenstoel vormende schimmels, zijn significant verschillend in structuur en komen vaak slecht tot expressie in ascomyceten, wat resulteert in geen of lage enzym productie. Het aanpassen van de gen structuur om deze meer te laten lijken op die van ascomyceten kan helpen, maar is een tijdrovende activiteit, vooral als het niet zeker is dat het een waardevol enzym op gaat leveren. Een beter begrip van de basis principes die ten grondslag liggen aan de verschillen in gen structuur en hun expressie is noodzakelijk om meer enzymen van deze schimmels succesvol te produceren. Een tweede probleem wordt veroorzaakt door het feit dat de meeste commerciële schimmel productie stammen die gebruikt worden voor de productie van polysacchariden afbrekende enzymen ook proteases produceren. Proteases kunnen andere enzymen in hetzelfde mengsel afbreken. Deze ongewenste afbraak gebeurt vooral als niet-eigen enzymen geïntroduceerd worden in de productie stam. Schimmels lijken een zelf-herkenningssysteem te hebben dat 13
hun in staat stelt hun eigen enzymen te onderscheiden van die van andere schimmels of bacteriën. Hun eigen enzymen zijn redelijk bestand tegen hun eigen proteases maar enzymen van andere schimmels zijn vaak erg gevoelig voor hen. Verbeteringen met betrekking tot proteases zijn gemaakt door de productie hiervan te verminderen in industriële stammen. Echter, een sterke afname in protease productie levert vaak problemen op met betrekking tot de fitheid van deze stammen omdat proteases ook een essentieel onderdeel zijn van het hergebruik van enzymen die niet meer actief of nodig zijn.
Het grotendeels ongebruikt potentieel van basidiomycete schimmels Door de zojuist genoemde problemen komen de meeste enzymen in industriële enzym cocktails uit ascomycete enzymen. Er echter een enorm potentieel voor betere enzymen in basidiomycete schimmels. Deze groep schimmels is het best bekend doordat de meeste paddenstoelen in de natuur in deze groep vallen. Zij hebben eigenschappen die ze onderscheiden van andere schimmels, zoals de afbraak van hout. Het zijn de enige schimmels die in staat zijn alle componenten van hout af te breken en daarom essentieel voor de globale koolstof cyclus. Deze unieke eigenschap is voornamelijk gebaseerd op de productie van enzymen die specifiek de aromatische polymeer lignine afbreken of modificeren. De meeste van deze enzymen komen niet voor in andere schimmels en pogingen om deze in industriële productie stammen te produceren zijn tot nu toe onsuccesvol geweest. Lignine afbrekende enzymen zijn waarschijnlijk ook cruciaal voor de volledige afbraak van andere planten biomassa die rijk is in lignine zoals stro of afval van suikerriet. Het is daarom belangrijk om methodes te ontwikkelen voor de grootschalige productie van deze enzymen en dit staat dan ook op de agenda bij academische onderzoeksgroepen en de industrie. Verschillende studies hebben ook gesuggereerd dat de enzymen die door basidiomycete schimmels geproduceerd worden soms betere activiteit hebben dan degene van ascomyceten die momenteel gebruikt worden. Echter, de problemen met gen structuur en afbraak van de enzymen door proteases hebben er voor gezorgd dat relatief weinig enzymen van deze schimmels succesvol toegevoegd zijn aan enzym mengsels voor de afbraak van planten biomassa. Als deze problemen opgelost kunnen worden zullen schimmels van deze groep waarschijnlijk een prominente positie krijgen in de ontwikkeling van betere enzym mengsels.
Het mijnen van schimmel biodiversiteit voor nieuwe biosynthetische routes Tot nu toe heb ik het alleen gehad over de afbraak van planten biomassa tot monomere suikers, maar dit is maar de helft van het proces. Deze suikers moeten vervolgens omgezet worden in ethanol of andere chemicaliën die de industrie nodig heeft. Het meest gebruikte organisme hiervoor in biologische processen is de gist Saccharomyces cerevisiae. Deze heeft reeds een lange geschiedenis van gebruik in het ballen van brood productie van bier en wijn en belangrijke verbeteringen in de gebruikte stammen zijn gedurende die jaren gemaakt. Ondanks dat deze gist zeer goed aangepast is aan industriële productie condities heeft hij ook een aantal beperkingen, zoals de beperkte groep van substraten die omgezet kunnen worden. 14
Terwijl de omzetting van glucose naar ethanol erg efficiënt is, kan xylose niet door natuurlijke stammen omgezet worden. Door de introductie van enzymen van andere schimmels is dat inmiddels opgelost en dit voorbeeld opent e deur voor een breed scala aan nieuwe toepassingen. Will de biobased economie een succes worden dan moet niet alleen ethanol uit biomassa geproduceerd worden, maar een grote verscheidenheid aan chemicaliën. Sommige van zulke processen zijn al ontwikkeld, zoals het gebruik van melkzuur voor de productie van bioplastics. Schimmels hebben niet alleen een grote variatie aan planten biomassa afbrekende enzymen maar ook metabole enzymen, wat er voor dat sommige species bepaalde verbindingen kunnen omzetten, terwijl andere schimmels zich op andere verbindingen richten. Bovendien verschillen de producten die door verschillende schimmels gemaakt worden. Het mijnen van deze metabole diversiteit gevolgd door het introduceren van de relevante enzymen in productie organismen, zoals gist, zal tot een enorme verbreding van de set aan producten leiden.
Een veranderende aanpak voor onderzoek in dit veld De ontwikkelingen de ik tot nu besproken heb zorgden ook voor een belangrijke wijziging in hoe onderzoek in dit veld wordt gedaan, De beschikbaarheid van genomics en andere technologieën hebben tot een beter begrip van de afbraak van planten biomassa geleidt, maar ook enorme datasets gegenereerd. Het begrijpen van al deze data is een uitdaging en raakt vaak onderwerpen waar de onderzoekers die het experiment deden geen expert op zijn. Om de volledige waarde van de data bloot te leggen zijn wetenschappers met verschillende achtergronden nodig. Bovendien zijn maar weinig laboratoria in staat de kosten voor alle verschillende technologieën te dragen, wat het samenwerken tussen labs die op verschillende aspecten focussen stimuleert. De beweging naar een biobased economie heeft voor een brede interesse in afbraak van planten biomassa gezorgd en een groot aantal academische groepen is dit veld ingestapt, Daarnaast worden een aantal goed bestudeerde schimmels nu ook in dit veld toegepast, wat zorgt voor nieuwe inzichten in geconserveerde en variabele mechanismen in schimmels. Samenwerkingen zijn daarom dominant geworden in dit onderzoeksveld en deze gaan vaak tussen verschillende onderzoeksvelden en expertises. Dit vergt een andere houding van en creëert een hogere uitdaging voor wetenschappers. Terwijl zijn experts in hun eigen veld moeten zijn, moeten zij ook voldoende kennis hebben van de omliggende velden om te beoordelen wanneer deze een bijdrage kunnen leveren aan het onderzoek en te begrijpen wat de resultaten van die velden toevoegen aan het totale plaatje. Dus naast een expertise in moleculaire biologie of biochemie moeten wetenschappers nu ook kennis en begrip hebben van bioinformatica, microscopie, analytische chemie en ecologie. In mijn ervaring zijn de samenwerkingen met onderzoekers die een interesse delen in het algemene onderwerp, in mijn geval de afbraak van planten biomassa door schimmels, maar een andere expertise hebben de meest succesvolle en deze gaan vaak vele jaren door. Veel va 15
de resultaten die mijn groep de laatste jaren behaald heeft zouden niet mogelijk zijn zonder de vele samenwerkingen met groepen overal in de wereld.
Van verleden naar toekomst Ik zou nu graag een wat persoonlijkere richting inslaan door te reflecteren hoe ik op dit punt aangekomen ben en vooruit te kijken naar waar mijn onderzoek de komende jaren heen zal gaan. Mijn onderzoek in de afbraak van planten biomassa door schimmels begon met mijn AIO project in Wageningen in 1994. In dit project was het belangrijkste doek het identificeren van de genen voor twee enzymen betrokken bij dit proces van de schimmel Aspergillus en vervolgens hun functie te karakteriseren. Gedurende dit project ontstond mijn interesse in de regulatie van hun productie en de totale enzym sets dies schimmels produceren en deze interesse heb ik nog steeds. Gedurende mijn VIDI project aan Utrecht Universiteit ben ik verder gegaan met dit onderwerp waarbij ik veel voordeel had van de net opgehelderde genoom sequentie van deze schimmel. Ik ben toen ook begonnen met het analyseren van de variatie in enzym productie tussen schimmels evenals de genomische verschillen die hier mee verband hielden. Na mijn verhuizing naar het CBS in 3009 kreeg het vergelijkende aspect van mijn onderzoek een enorme impuls. Een belangrijke factor hiervoor was de directe toegang tot de geweldige collectie van het CBS en de expertise van de andere wetenschappers in dit instituut. Een tweede factor was de exponentiele toename van het aantal schimmel genoom projecten, vooral via de JGI, waarbij ik vaak gevraagd werd de link tussen genoom en afbraak van planten biomassa te analyseren. Dit zou niet mogelijk geweest sijn zonder de CAZy database van Bernard Henrissat en Pedro Coutinho in Marseille, met wie ik al vele jaren een nauwe samenwerking heb. Ook proteomics is een belangrijke techniek geworden en de samenwerking met Adrian Tsang en Maarten Altelaar maakte het voor mijn groep mogelijk dit veld te betreden. Echter, voor goed vergelijkend onderzoek is een gedetailleerde analyse van referentie species noodzakelijk. Die studies hebben geleid tot de identificatie van verschillende regulatoren en enzymen die een belangrijke rol spelen in de afbraak van planten biomassa. De vergelijkende studies hebben vervolgens laten zien dat sommige hiervan geconserveerd zijn in de meeste schimmels terwijl andere uniek zijn voor een subgroep of een species. Deze resultaten helpen de verschillende aanpak die schimmels gebruiken voor de afbraak van planten biomassa te begrijpen. Gedurende meerdere jaren heeft mijn onderzoek zich vooral gericht op Aspergillus en vergelijking met andere ascomyceten, maar dit is verandert de laatste 5 jaar. Aspergillus blijft één van onze belangrijkste referentie schimmels, maar gedetailleerde studies worden nu ook gedaan aan andere ascomyceten en verschillende basidiomyceten. De vergelijkingsstudies met andere schimmels zijn sterk uitgebreid, zoals geïllustreerd wordt door de meer dan 400 species die nu in onze schimmel groei database staan.
16
Ik verwacht dat de komende jaren deze opzet grotendeels hetzelfde blijft met gedetailleerde studies aan referentie species die de basis zijn voor vergelijkingsstudies met species uit het hele schimmelrijk. Genomische aspecten zijn al een prominent onderdeel van ons onderzoek en dit zal zich verder ontwikkelen, maar we moeten ons ook realiseren dat we ook sterke biologische data en validatie nodig hebben om dit complexe biologische proces beter te begrijpen. Veel van de kandidaat enzymen die in schimmel genomen gevonden zijn, zijn nooit getest of ze de voorspelde functie hebben en het is belangrijk dat dit meer aandacht krijgt. Schimmels hebben in hun genoom soms meer dan 20 genen voor een bepaalde enzym activiteit. Deze genen worden vaak aangezet onder verschillende condities en naar mijn mening kunnen we aannemen dat ze ondanks een vergelijkbare algemene activiteit hoogstwaarschijnlijk zullen verschillen in substraat specificiteit of de condities waaronder ze actief zijn. Ik hoop dat wij een rol kunnen spelen in het verkrijgen van meer begrip over deze verschillen samen met onze partners. We staan nog maar aan het begin van het begrip van de regulatie van enzym productie in schimmels en veel regulatoren zijn nog niet geïdentificeerd. Dit is een belangrijk onderwerp geweest in mijn groep en zal dit blijven, aangezien dit zal leiden tot een betere begrip waarom verschillende schimmels verschillende enzym sets produceren onder dezelfde condities. Dit onderwerp staat ook sterk in de aandacht bij andere groepen wat dit onderwerp een impuls geeft als nooit tevoren. Het mijnen van het potentieel van basidiomycete schimmels is iets dat ik persoonlijk erg uitdagend vind and waarop we al verschillende onderzoekslijnen gestart hebben met de Universiteit van Helsinki. We hebben eveneens al een aantal lijnen gestart voor het mijnen van het metabole potentieel van schimmels. Ik hoop dat deze lijnen de komende jaren zullen leiden tot nieuwe inzichten en ons dichterbij toepassingen hiervoor zullen brengen.
Fundamenteel en toegepast onderzoek Gedurende mijn carrier heb ik gewerkt aan onderwerpen met relevantie voor industrie en/of samenleving, maar altijd van een meer fundamentele aanpak met een focus op de basis principes in plaats van de uiteindelijke toepassingen. Ik hoop de komende jaren door te gaan met zulk strategisch onderzoek, want zonder een goed begrip van het proces zullen echte doorbraken, zoel wetenschappelijk als wat betreft toepassingen niet gebeuren. Ik realiseer mij echter ook dat de richting van onderzoek voor een groot deel bepaald wordt door de financieringsmogelijkheden. Gedurende de laatste decennia is er in toenemende mate van onderzoekers verwacht de relevantie van hun onderzoek voor de samenleving aan te tonen en ik verwacht dat dit verder toe zal nemen. Deze druk uit de samenleving is begrijpelijk aangezien veel van het geld voor onderzoek bij de belastingbetaler vandaan komt en de samenleving recht heeft te zien wat dit oplevert. Dit omvat ook het verzoek om missie standpunten van academische groepen om een heldere visie en focus aan te tonen.
17
Met een teruglopend budget voor onderzoek is het begrijpelijk dan financieringsinstanties de voorkeur geven aan onderwerpen waar een duidelijke behoefte van de samenleving is end at deze aspecten een rol spleen bij de selectie van projecten voor financiering. Echter, een sterke rol voor de samenleving in het bepalen van de onderzoeksagenda heeft ook risico’s. Onderzoek dat dicht bij een toepassing staat zal relatief eenvoudig de relevantie aan kunnen tonen. Voor meer fundamenteel onderzoek, bijvoorbeeld gericht op het begrijpen van de basis principes onder de afbraak van planten biomassa door verschillende schimmels, is de relevantie minder eenvoudig aan te tonen. Voor de niet-expert kan dit mogelijk eerder overkomen als wetenschappelijke nieuwsgierigheid van de onderzoeker dan een directe behoefte van de samenleving. We moeten echter niet vergeten dat het vaak wetenschappelijke nieuwsgierigheid is dat aan de wieg van grote wetenschappelijke doorbraken stond die later tot een variatie aan toepassingen leidden. Het is ook belangrijk om te realiseren dat een significante wetenschappelijke stap vooruit geen kwestie van jaren, maar één van decennia is. Zulke perioden zullen ook nodig zijn voor de biobased economie en het is daarom essentieel dat de overheid en financieringsinstanties open blijven staan voor pionier onderzoek dat niet direct toepasbaar is. Ondanks dat verwacht ik dat het onderzoek waar ik de afgelopen 20 jaar bij betrokken ben geweest nu in een zeer spannende tijd gekomen is met toepassingen die zeer dicht bij de markt liggen. Schimmel genomen hebben een rijkdom aan nieuwe planten biomassa afbrekende en metabole enzymen blootgelegd die slechts wachten op karakterisering en het testen van hun potentieel voor toepassingen. Daarnaast kunnen dezelfde methodieken gebruikt worden voor het vinden van andere schimmel producten, zoals nieuwe antibiotica. Het CBS is goed gepositioneerd om hier een belangrijke rol te spelen, aangezien zij de grootste en best gekarakteriseerde publieke schimmel collectie beheren met meer dan 80000 stammen. Spannende tijden liggen voor ons en onze nauwe band met Utrecht Universiteit zal hier een belangrijke rol in spelen.
Dankwoord In de laatste minute wil ik verschillende personen bedank die het mogelijk gemaakt hebben dat ik deze oratie vandaag geef. Jaap, wie kon verwachten da teen gesprek tijden een danswedstrijd uiteindelijk zou leiden tot een bijzonder hoogleraarschap voor mij bij Utrecht Universiteit 21 jaar later. Ik waardeer enorm alles dat ik van je geleerd heb, al onze interacties en de steun die je me gegeven hebt bij het continueren van veel va de onderzoeksonderwerpen die al in jou groep bestudeerd werden toen ik AIO bij je was. Han en Pedro, bedankt dat jullie me de vrijheid gegeven hebben mijn eigen ideeën na te jagen en jullie steun bij het opzetten van mijn eigen onderzoekslijn. Sjef, jij hebt een essentiële rol gepeeld bij de totstandkoming van deze leerstoel bij het Departement Biologie en ik zie dit als een geweldige voortzetting van de plezierige discussies die we hadden gedurende de tijd dat ik bij Utrecht Universiteit werkte. Samen met Corné en 18
Rens initieerde jij deze leerstoel en ik wil jullie van harte danken voor jullie inzet hierin. Ik wil ook de besturen van Utrecht Universiteit, de Beta faculteit en het biologie departement bedanken dat zij mij op deze leerstoel benoemd hebben. Ik zie uit naar veel inspirerende interacties met jullie in de komende jaren. Het opbouwen van een onderzoeksgroep doe je niet alleen, maar vraagt om toegewijde mensen die een deel van de weg met je lopen. Ik ben gelukkig geweest om zoveel exceptionele postdocs, AIOs en analisten in mijn groep te hebben gehad zonder wie ik hier vandaag niet zou staan. Speciale dank gaat naar Ad en Isabelle aangezien zij een centrale rol hebben gehad in het bouwen van mijn huidige groep. Daarnaast wil ik alle collega’s en studenten uit het verleden en het heden bedanken voor de stimulerende interacties. Ik zou hier evenzo vandaag niet staan zonder de vele partners van over de hele wereld. Verschillende van jullie namen deel aan het symposium vanochtend en gaven daar een beeld van de onderwerpen wij onderzoeken en nog meer van jullie zijn hier vandaag om deze speciale dag met mij te vieren. Naast de wetenschappelijke interacties zijn verschillende van jullie goede vrienden geworden, wat zoveel meer plezier stopt in wetenschappelijke samenwerkingen. Ik zie uit naar nog vele jaren van interacties op deze manier. Ik waardeer jullie aanwezigheid enorm, vooral gezien de afstand die verschillende van jullie moesten reizen om hier te zijn. Ik wil ook graag mijn collega’s bij de verschillende bedrijven bedanken voor de steun die zij aan mijn onderzoek gegeven hebben in de afgelopen jaren. De interacties en bijdragen stimuleerden niet alleen mijn onderzoek, maar gaven ook een goede reflectie op de relevantie en opties voor toepassingen ervan. Deze ochtend hadden we een geweldig symposium, dat mogelijk werd gemaakt door ondersteuning door verschillende bedrijven, wat ik enorm waardeer. Toyt slot wil ik mijn familie bedanken voor al hun steun gedurende de afgelopen jaren. Zij, evenals mijn vrienden, zijn zich maar al te bewust van mijn afwezigheid op verjaardagen en andere activiteiten omdat ik weer weg was naar een congres of een andere werk bijeenkomst. Ik ben blij dat jullie mijn afwezigheid nooit tegen me gehouden hebben en dankbaar voor jullie begrip.
Dames en heren, dit beëindigd mijn oratie. Bedankt voor uw aandacht.
Ik heb gezegd
19
