Evolution of Races within Fusarium oxysporum f.sp. Lycopersici B.V. Chellappan
University of Amsterdam
Evolution of races within Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici Biju Vadakkemukadiyil Chellappan
Samenvatting Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol), een asexuele bodemschimmel, is de veroorzaker van de Fusarium verwelkingsziekte van tomaat. Het pathogeen dringt de plant via de wortels binnen en koloniseert vervolgens het xyleem. Drie fysiologisch rassen van Fol worden onderscheiden op basis van het vermogen om cultivars van tomaat met verschillende, monogene resistenties te infecteren. Resistentie (R) genen van tomaat die zorg dragen voor ras-specifieke resistentie tegen Fol staan bekend als Immuniteit (I) genen. Tot nu toe zijn er in wilde tomaat drie I genen geïdentificeerd, namelijk I (of I-1), I-2 en I-3, en ingekruist in cultivars. Deze genen verschaffen resistentie tegen Fol isolaten die de avirulentie (AVR) genen bevatten die met deze drie I genen corresponderen, te weten AVR1, AVR2 en AVR3, respectievelijk. AVR1 is aanwezig in alle ras 1 isolaten, maar afwezig in ras 2 en ras 3. De afwezigheid van AVR1 maakt het mogelijk dat ras 2 en 3 isolaten cultivars van tomaat infecteren die het I gen bevatten. AVR2 is aanwezig in alle isolaten, zij het dat isolaten die I-2 planten kunnen infecteren (ras 3 isolaten) een puntmutatie bevatten in AVR2 die een aminozuur verandering in het eiwit tot gevolg heeft. Tot nu toe zijn er drie AVR2 allelen beschreven en wel met de volgende aminozuur veranderingen; V41>M, R45>H en R46>P. Al deze drie veranderingen leiden tot het verlies van de avirulentie functie van Avr2 (het product gecodeerd door AVR2), terwijl de virulentie functie in takt blijft. Twee AVR3 allelen zijn er beschreven, één coderend voor een eiwit met een glutaminezuur (E) residu op aminozuur positie 165 en één met een lysine (K) op deze positie (E165<>K165). Beide eiwitten fungeren als avirulentie factor, maar verschillen in de mate waarin zij bijdragen aan virulentie. Behalve als avirulentie factor, fungeert Avr1 (het product van AVR1) ook als suppressor van de I-2/Avr2 en I-3/Avr3 gemedieerde immuniteit. Het resistentieonderdrukkende vermogen van Avr1 maakt het mogelijk dat ras 1 isolaten cultivars van tomaat die I-2 en I-3 bevatten, kunnen infecteren zonder deletie van of mutatie in de avirulentie genen (Avr2 en Avr3) die corresponderen met deze resistentie genen. In Hoofdstuk 2 wordt getoond dat niet alle ras 1 isolaten cultivars van tomaat met I-2 en I-3 kunnen infecteren ook al beschikken ze over een functioneel AVR1 gen. De waargenomen verschillen in de resistentie-onderdrukkende aktiviteit kunnen niet
verklaard worden door één of meer mutaties in de Avr1 coderende sequentie of flankerende gebieden, die wel de suppresserende aktiviteit zouden aantasten maar niet de Avr1 avirulentie functie. Op basis van de resultaten uit deze studie wordt een model voorgesteld voor de suppressie van de I-2/Avr2 en I-3/Avr3 gemedieerde resistentie door Avr1. In verschillende studies is gesuggereerd dat deletie van AVR1 uit ras 1 geresulteerd heeft in het ontstaan van ras 2 (avirulentie genotype: –, AVR2, AVR3), en dat een puntmutatie in AVR2 van ras 2 vervolgens geleid heeft tot het ontstaan van ras 3 (–, avr2, AVR3). Echter, het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan het verlies van AVR1 is nooit beschreven. In Hoofdstuk 3 wordt dit mechanisme onderzocht. Hiertoe is de basenvolgorde bepaald van een AVR1 bevattend fragment van ongeveer 100 kb van het genoom van een ras 1 isolaat en is de verkregen sequentie vergeleken met die van het referentie genoom van een ras 2 isolaat waarin AVR1 niet aanwezig is. Het 100 kb fragment bleek met een sequentie identiteit van meer dan 99,9% overeen te komen met een deel van het referentie genoom, met uitzondering van een 31 kb gebied uit het genoom van ras 1 dat niet terug gevonden werd in het referentie genoom. Verdere analyses suggereerden dat ras 2 geëvolueerd is vanuit ras 1 door de deletie van dat AVR1 bevattend 31 kb fragment, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van homologe recombinatie tussen twee Helitron transposons. Een wereldwijde collectie van Fol isolaten is vervolgens onderworpen aan een PCR analyse van het AVR1 locus met inbegrip van de twee flankerende Helitrons. De verkregen resultaten toonden aan dat ras 2 geëvolueerd is vanuit ras 1 door de deletie van óf een 31 kb óf een 102 kb AVR1 bevattend genoom fragment als gevolg van homologe recombinatie tussen twee Helitrons die deze fragmenten flankeren. Dit suggereert dat gebaseerd op de deletie gebeurtenis die aanleiding geeft tot verlies van AVR1, Fol isolaten onderverdeeld kunnen worden in twee afzonderlijke evolutionaire lijnen. Het geeft ook aan dat Helitron transposons een belangrijke rol vervulden in de evolutie van rassen binnen Fol. Helitrons vormen een nieuw type DNA transposon die gevonden zijn, en nog steeds worden, in vele eukaryoten. Zij verschillen van andere transposons in de structurele karakteristieken van hun uiteinden, het vermogen om DNA fragmenten op te pikken en hun rolling-circle wijze van repliceren. In schimmels zijn de structurele
karakteristieken van Helitrons nog maar weinig bestudeerd. In Hoofdstuk 4 worden de kenmerken van Helitron
uiteinden in Fusarium oxysporum (Fo) geïdentificeerd en
beschreven. Zes Helitron groepen worden onderscheiden in Fo, aangeduid met FoHeli1 tot FoHeli6. Hun terminale karakteristieken suggereren dat FoHeli’s een nieuwe groep vormen binnen de Helitron familie. Voorts is er evidentie verkregen voor het bestaan van een circulaire vorm van Helitrons. Op basis van alle verkregen data wordt er een transpositie model voor Helitrons voorgesteld. In Hoofdstuk 5 wordt de evolutie van rassen verder onderzocht via een uitbreiding van het aantal isolaten betrokken bij de studie. Analyse van het AVR1 locus met inbegrip van de flankerende Helitrons in de nieuwe isolaten bevestigt het idee dat in de meeste gevallen ras 2 geëvolueerd is vanuit ras 1 via een homologe recombinatie gebeurtenis tussen twee Helitrons. Daarnaast is er één ras 2 isolaat geïdentificeerd dat AVR1 kwijt geraakt is waarschijnlijk als gevolg van een homologe recombinatie gebeurtenis tussen twee NHT2-achtige retro-transposons met als resultaat een deletie van ongeveer 457 kb. In twee andere ras 2 isolaten zijn geen duidelijke aanwijzingen gevonden ten aanzien van de wijze waarop het AVR1 locus verloren is gegaan. In AVR2 zijn vier puntmutaties gevonden die aanleiding geven tot het ontstaan van ras 3 vanuit ras 2. Eén van deze vier betreft een nieuwe mutatie. Alle vier mutaties zorgen ervoor dat de I-2 gemedieerde resistentie omzeild wordt in ras 3 isolaten. Op basis van fylogenetische analyses waarbij gebruik gemaakt is van de sequentie van het EF-1 alpha gen, kunnen Fol isolaten gegroepeerd worden in vijf evolutionaire lijnen. Vier van die lijnen correleren zeer goed met bekende VCGs van Fol, terwijl er één geassocieerd kan worden met een onbekende VCG van Fol. Alle verkregen resultaten in deze studie zijn gebruikt om een model voor te stellen om de evolutie van rassen binnen Fol te verklaren. In Hoofdstuk 6 wordt bediscussieerd hoe de nieuw verkregen kennis beschreven in dit proefschrift bijdraagt aan een beter begrip van de co-evolutionaire wapenwedloop tussen een pathogeen en zijn gastheer, met name onder agriculturele omstandigheden. Er wordt benadrukt dat het inkruisen in gewas cultivars van een monogene resistentie tegen een gegeven pathogeen én het wijdverbreide gebruik van deze cultivars, het pathogeen selectief kunnen forceren tot een snelle evolutionaire ontwikkeling van de omzeiling van die specifieke gastheer resistentie. Een model voor het ontstaan van formae speciales van
Fusarium oxysporum als ook de polyfyletisch aard van een forma specialis wordt gepresenteerd. Nieuwe onderzoeksvragen worden geponeerd en richtingen voor verder onderzoek worden voorgesteld, bedoeld om een beter begrip te krijgen van de evolutie van gastheer-pathogeen relaties.
