.
ENTEROBACTER SAKAZAKII IN ONTBIJTGRANEN, POEDERS EN RAUW VLEES
A.E. Heuvelink C. van Heerwaarden J.J.H.C. Tilburg J.T.M. Zwartkruis-Nahuis E. de Boer
Voedsel en Waren Autoriteit, regio Oost Afdeling Laboratorium Postbus 202 7200 AE Zutphen tel: 0575 - 588100 fax: 0575 - 588200 E-mail:
[email protected] Project nr: OT05L005-13 Februari 2006
OT 05L005-13
pagina 1 van 10
INHOUD
SAMENVATTING.................................................................................................................................... 3 SUMMARY .............................................................................................................................................. 3 TREFWOORDEN………………………………………………………………………………………………...3 1
INLEIDING ....................................................................................................................................... 4
2
MATERIAAL EN METHODEN ........................................................................................................ 4 2.1 MONSTERS ................................................................................................................................. 4 2.2 MICROBIOLOGISCH ONDERZOEK ................................................................................................... 4 2.2.1 Enterobacter sakazakii ...................................................................................................... 4 2.2.2 Enterobacteriaceae............................................................................................................ 5 2.2.3 Real-time PCR ................................................................................................................... 5
3
RESULTATEN ................................................................................................................................. 6 3.1 3.2
ISOLATIE E. SAKAZAKII ................................................................................................................. 6 REAL-TIME PCR.......................................................................................................................... 7
4
DISCUSSIE ...................................................................................................................................... 7
5
CONCLUSIE .................................................................................................................................... 8
6
LITERATUUR .................................................................................................................................. 8
BIJLAGE I
OT 05L005-13
pagina 2 van 10
SAMENVATTING Enterobacter sakazakii is een zeldzame, maar bekende oorzaak van neonatale sepsis en een ernstig verlopende vorm van meningitis. Tot nu toe zijn E. sakazakii infecties uitsluitend in verband gebracht met babymelkpoeder. Voor het opstellen van effectieve maatregelen ter voorkoming van infecties is het van belang informatie te verzamelen over de ecologie van E. sakazakii. In dit rapport worden de resultaten beschreven van een studie naar het voorkomen van deze bacterie in diverse producten verzameld in de detailhandel. E. sakazakii blijkt vrij algemeen voor te komen en werd geïsoleerd uit 6 (4,9%) monsters ontbijtgranen, 1 (4,0%) puddingpoeder, 5 monsters (10,0%) gemengd, gemalen runder-/varkensvlees en 2 (1,4%) monsters gemalen rundvlees. Er werd geen verband aangetoond tussen het voorkomen van E. sakazakii en het aantal kweekbare Enterobacteriaceae. Verder werd een real-time PCR opgezet voor het bevestigen van de E. sakazakii isolaten. Deze PCR, gebaseerd op het “E. sakazakii major outer membrane protein OmpA”, is een geschikte aanvulling gebleken op de biochemische bevestigingsreacties. SUMMARY Enterobacter sakazakii is a rare but important cause of life-threatening neonatal sepsis and meningitis. So far, E. sakazakii infections have only been linked with powdered infant formula. To be able to formulate effective measures to prevent human infections, it is important to collect information on the ecology of E. sakazakii. In this report, we describe the results of a survey on the occurrence of this bacterium in different products collected from retailers. E. sakazakii was found to be quite commonly present and was isolated from 6 (4.9%) samples of dry cereals, 1 (4.0%) instant pudding powder, 5 (10.0%) samples of mixed, minced beef/pork, and 2 (1.4%) samples of minced beef. The presence of E. sakazakii appeared not to be related with the number of Enterobacteriaceae. In addition, a real-time PCR was designed for the confirmation of E. sakazakii isolates. This PCR, based on the “E. sakazakii major outer membrane protein OmpA”, turned out to be a good completion of the biochemical confirmation tests.
TREFWOORDEN: Enterobacter sakazakii, ontbijtgranen, poeders, rauw vlees, real-time PCR
OT 05L005-13
pagina 3 van 10
1
INLEIDING Enterobacter sakazakii is een Gram-negatieve, staafvormige, beweeglijke bacterie die geen sporen vormt en is geclassificeerd in de familie van de Enterobacteriaceae. De bacterie is pas in 1980 als aparte species beschreven (6.12). Tevoren werden E. sakazakii isolaten beschouwd als varianten van Enterobacter cloacae en, naar de gele kolonies, “geelgepigmenteerde E. cloacae” genoemd. E. sakazakii is een opportunistische pathogeen (6.8; 6.11; 6.13; 6.22). Ziekte veroorzaakt door deze bacterie is beschreven voor alle leeftijdsgroepen, maar de meeste gevallen betroffen jonge kinderen (< 1 jaar). Pasgeborenen (≤ 28 dagen), in het bijzonder baby’s die te vroeg zijn geboren, ondergewicht hebben of een verzwakte afweer, lopen het grootste risico. Infecties veroorzaakt door E. sakazakii zijn weliswaar zeldzaam, maar kunnen resulteren in levensbedreigende vormen van neonatale meningitis, sepsis en necrotiserende enterocolitis. Voorheen werden mortaliteitspercentages gerapporteerd van 40 tot 80%. De afgelopen jaren is dit percentage gedaald tot beneden 20%. Verschillende patiëntjes die de infectie hebben overleefd kampen met blijvende neurologische complicaties. Brononderzoek naar aanleiding van zowel individuele gevallen als explosies van E. sakazakii infectie heeft verschillende malen besmette zuigelingenvoeding als oorzaak van de infecties geïdentificeerd (6.1-6.5; 6.7; 6.31; 6.35; 6.37; RASFF 2002/190; RASFF 2004/658). Melkpoeders bedoeld als vervanging van moedermelk kunnen lage aantallen E. sakazakii bevatten (6.18-6.19; 6.21; 6.23; 6.29; 6.30; 6.33). De aanwezigheid van deze bacterie kan het gevolg zijn van het toevoegen van besmette, droge ingrediënten die tijdens de productie van zuigelingenvoeding geen hittebehandeling meer ondergaan en van herbesmetting in de productieruimten, met name in de droog- en uitvulruimten. Onderzoek heeft aangetoond dat E. sakazakii beter in staat is te overleven in een droge omgeving dan andere Enterobacteriaceae (6.6). Als gevolg van de vorming van biofilms is de bacterie in staat goed te hechten aan verschillende oppervlakken (6.27). Bovendien zou het vermogen cellulose te produceren, de cellen binnenin de biofilmmassa beschermen tegen schoonmaakmiddelen (6.27). Recent Nederlands onderzoek indiceert een wijd verspreid voorkomen van E. sakazakii (6.24). Behalve uit omgevingsmonsters verzameld in melkpoederfabrieken, werd deze bacterie geïsoleerd uit omgevingsmonsters verzameld in fabrieken waar graanproducten, chocolade, aardappelzetmeel en pasta’s worden geproduceerd. Ook werd de bacterie geïsoleerd uit stofzuigerzakken verzameld in verschillende huishoudens (6.24). Data over het voorkomen van de bacterie in eindproducten anders dan zuigelingenvoeding zijn echter schaars. Om meer inzicht te verkrijgen in het voorkomen van E. sakazakii, besmettingsroutes en mogelijkheden voor maatregelen om E. sakazakii infecties te voorkomen is in 2005 een studie verricht naar het voorkomen van deze bacterie in diverse producten verzameld in de detailhandel, zoals ontbijtgranen, verschillende poeders en rauw vlees. Bovendien werd een real-time PCR opgezet voor het bevestigen van de E. sakazakii isolaten.
2
MATERIAAL EN METHODEN
2.1
Monsters In totaal werden 450 monsters in onderzoek genomen, verzameld in de detailhandel: 222 monsters rauw, gemalen vlees, 123 monsters ontbijtgranen, 33 oplospoeders voor koude dranken zoals chocolade - en aardbeienmelk, 25 instant puddingpoeders, 19 monsters dipsaus, 14 monsters zuigelingenvoeding, 4 monsters poedervormige opvolg-/groeimelk voor gezonde kinderen ouder dan 12 maanden, 4 monsters melkpoeder, 4 monsters koffie creamer en 2 monsters ijsmixpoeder.
2.2
Microbiologisch onderzoek
2.2.1
Enterobacter sakazakii
OT 05L005-13
pagina 4 van 10
Voor het aantonen van E. sakazakii (in 50 g monster) werd gebruik gemaakt van een methode recent beschreven door Guillaume-Gentil et al. (6.16). De methode is gebaseerd op een nietselectieve voorophoping in gebufferd peptonwater (BPW), een selectieve ophoping bij 45±0,5°C in lauryl sulfaat tryptose bouillon waaraan extra zout (0,5 M) en 10 mg/l vancomycine (mLST) is toegevoegd, gevolgd door afenten op trypton soja agar (TSA). In afwijking van de gerefereerde methode werden echter geen galzouten aan TSA toegevoegd. Geel-gepigmenteerde kolonies werden getest op α-glucosidase activiteit (≤ 4 uur) (6.25), geïdentificeerd met behulp van het API 20E systeem (bioMérieux), bevestigd met een E. sakazakii-specifieke real-time PCR (paragraaf 2.2.3) en tenslotte gesubtypeerd met behulp van pulsed-field gel electroforese (6.39). Clusteranalyse van de fingerprints wordt uitgevoerd met Bionumerics® (Dendrogram type=UPGMA, Similarity coëfficient=Dice). Isolaten die meer dan 95% overeenkomstige fragmenten hebben worden benoemd als “nauw gerelateerd“. Isolaten worden als niet te onderscheiden beschouwd als 100% van de fragmenten overeenkomt. In geval van monsters vlees werd vanuit de mLST ophoping eerst afgeënt op Enterobacter sakazakii isolatie medium (ESIA™) (AES Laboratoire, Bruz cedex, Frankrijk) (22-26 uur, 44±0,5°C), waarna typische kolonies, groen tot blauw-groen van kleur, werden getest op de vorming van een geel pigment op TSA en vervolgens verder bevestigd zoals hierboven beschreven. 2.2.2
Enterobacteriaceae Als indicatie van de hygiënische bereiding van de producten werd tevens het aantal kweekbare Enterobacteriaceae (kve/g) bepaald. De telling werd verricht volgens de gietplaatmethode met als telmedium Violet Rood Gal Glucose (VRBG) agar (voorschrift MIC01-WV106). Typische kolonies, minimaal 5 van elke geselecteerde telbare plaat, werden bevestigd middels het testen van de fermentatie van glucose en de aanwezigheid van oxidase.
2.2.3
Real-time PCR Met behulp van Primer Express software (PE-Applied Biosystems) werden primers en een probe geselecteerd voor het specifiek aantonen van E. sakazakii DNA (Tabel 1). De probe werd gelabeld met FAM (6-carboxy-fluoresceïne) als reporter en BHQ (black-hole quencer) als quencher. Behalve middels een theoretische evaluatie werd de specificiteit van de primers/probe set empirisch vastgesteld. Hiertoe werden 54 E. sakazakii en 44 niet-E. sakazakii stammen getest. De stammen werden gekweekt op trypton soja agar (18-24 uur bij 37°C) en daarna werd een entoog koloniemateriaal gesuspendeerd in 200 µl steriel demi-water. Hieruit (100 µl) werd automatisch DNA geëxtraheerd met behulp van het MagNA Pure Compact® systeem (Roche Diagnostics) en de MagNA Pure Compact® Nucleic Acid Isolation kit I (Roche Diagnostics). Voor de amplificatie en detectie werd gebruik gemaakt van de LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics). De PCR testen werden uitgevoerd in een reactiemengsel (20 µl) van de volgende samenstelling: 2,5 µl monster DNA, 500 nM van elke primer, 250 nM probe en de LightCycler TaqMan Master mix kit (4 µl) (Roche Diagnostics). Na een initiële denaturatie stap (10 min 95°C) om het FastStart Taq DNA polymerase te activeren volgden 40 cycli van 10 s 95°C en 15 s 60°C. Tijdens iedere run werden de volgende controles meegenomen: een blanco (demiwater), negatieve controle (geen template DNA) en een positieve controle (template DNA). De resultaten werden automatisch opgeslagen in het systeem en geanalyseerd volgens de instructies van de fabrikant. Tabel 1. Overzicht primers en probe Primers & probe Sequentie (5’ → 3’) a Esak ompA-F ggt gaa gga ttt aac cgt gaa ctt Esak ompA-R b gcg cct cgt tat cat cca aa Esak ompA-probe ccc gga aaa gcg cat ggc c a
Positie c 319-342 388-369 348-366
F, forward primer R, reverse primer C = De posities refereren aan het “E. sakazakii major outer membrane protein OmpA” (Catalogus nummer GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov): DQ000206). b
OT 05L005-13
pagina 5 van 10
3
RESULTATEN
3.1
Isolatie E. sakazakii Uit 6 (4,9%) monsters ontbijtgranen, 1 (4,0%) puddingpoeder, 5 monsters (10,0%) gemengd, gemalen runder-/varkensvlees en 2 (1,4%) monsters gemalen rundvlees werden E. sakazakii stammen geïsoleerd (Tabel 2). Als gevolg van degradatie van het genomisch DNA konden 3 van de 14 isolaten niet worden getypeerd met PFGE; 1 van de 6 isolaten uit ontbijtgranen, het isolaat uit de puddingpoeder en 1 van de 2 rundvleesisolaten. Van de overige 11 isolaten genereerden er 9 elk een uniek XbaI restrictiepatroon en bleken er 2 niet van elkaar te onderscheiden (Figuur 1). De monsters gemengd rund/varkensvlees waar deze laatste 2 isolaten uit waren geïsoleerd, waren verzameld bij 2 verschillende vestigingen van dezelfde supermarktketen, beiden gevestigd in het noorden van het land, een maand na elkaar bezocht. Tabel 2. Isolatie E. sakazakii Producten Droge producten Ontbijtgranen Instant dranken Instant puddingpoeders Dipsauzen Zuigelingenvoeding Opvolg-/groeimelk, >12 mnd Melkpoeders Koffie creamers IJsmixpoeders Rauw(e), gemalen vlees(producten) Rundvlees Gemengd rund/varken Varkensvlees Kalfsvlees Gevogelte
Aantal positief / aantal onderzocht (%) 6 / 123 (4,9) 0 / 33 1 / 25 (4,0) 0 / 19 0 / 14 0/4 0/4 0/4 0 /2 2 / 141 (1,4) 5 / 50 (10,0) 0 / 16 0 / 10 0/5
De resultaten van de Enterobacteriaceae tellingen zijn samengevat in Tabel 3. In vijf van de zes ontbijtgranen positief voor E. sakazakii was het kiemgetal van Enterobacteriaceae ≤ 101 kve/g en in het zesde monster 15 kve/g. Ook in de puddingpoeder waaruit E. sakazakii werd geïsoleerd was het aantal Enterobacteriaceae ≤ 101 kve/g. Voor de E. sakazakii-positieve vleesmonsters werden de volgende kiemgetallen van Enterobacteriaceae bepaald: 101 kve/g, 5,5 x 101 kve/g, 9,1 x 101 kve/g, 1,1 x 102 kve/g, 2,5 x 102 kve/g, 6,8 x 102 kve/g en 2,0 x 103 kve/g. Tabel 3. Resultaten tellingen Enterobacteriaceae Telling Enterobacteriaceae Droge producten (kve/g) 1 ≤ 10 223 101 - 102 1 102 - 103 0 103 - 104 0 > 104 1a a Tarwezemelen
OT 05L005-13
Rauw, gemalen vlees 28 47 80 43 24
pagina 6 van 10
Dice (Opt:0 .50 %) (To l 1 .5%-1.5%) (H>0.0 % S>0.0 %) [0 .0%-1 00 .0%]
100
pfge
80
60
p fge
gemengd rund/varken 44322846 Rauw vlees, gemengd rund/varken, nr. 1 gemengd rund/varken 44338041 Rauw vlees, gemengd rund/varken, nr. 2 gemengd rund/varken 58332569 Rauw vlees, gemengd rund/varken, nr. 3 ontbijtgranen Ontbijtgranen, nr. 44254522 1 rundvlees Rundvlees, nr. 48088854 1 ontbijtgranen 48733077 Ontbijtgranen nr. 2 ontbijtgranen 48688802 Ontbijtgranen nr. 3 gemengd rund/varken 58260657 4 Rauw vlees, gemengd rund/varken gemengd rund/varken 44337851 5 Rauw vlees, gemengd rund/varken ontbijtgranen 44254379 Ontbijtgranen nr. 4 Ontbijtgranen nr. 5 ontbijtgranen 48709346
Figuur 1. Clusteranalyse PFGE patronen E. sakazakii isolaten.
3.2
Real-time PCR Alle 54 E. sakazakii stammen gaven een positieve reactie (Ct waarden 15-22; Ct waarde = cycle threshold, de cyclus waarbij het fluorescentiesignaal voor het eerst significant afwijkt van (hoger is dan) de basislijn) en de overige teststammen gaven alle een negatief signaal (Bijlage I).
4
DISCUSSIE In dit rapport zijn de resultaten beschreven van een studie naar het voorkomen van E. sakazakii in diverse producten verzameld in de detailhandel en is een real-time PCR beschreven die werd opgezet voor het bevestigen van de E. sakazakii isolaten. Uit de resultaten verkregen met de 54 teststammen blijkt dat deze real-time PCR een geschikte aanvulling is op de biochemische bevestigingsreacties. In 2003 werd een real-time PCR opgezet waarbij de specifieke target sequentie was gelegen op het “E. sakazakii partial macromolecular synthesis (MMS)” operon (6.20). Ook met deze eerder ontwikkelde PCR test gaven alle E. sakazakii stammen een duidelijk fluorescentiesignaal. Echter ook Escherichia coli O157 NCTC12900 gaf een positief signaal (Ct waarde 25) en 1 van de 2 Klebsiella oxytoca isolaten evenals de 5 Shigella stammen genereerden aan het einde van het PCR programma een zwak fluorescentiesignaal (Ct waarden >36). Wanneer deze PCR wordt gebruikt als bevestiging van biochemisch verdachte isolaten zijn niet direct vals-positieve resultaten te verwachten, omdat al deze 7 negatieve teststammen eenvoudig van E. sakazakii stammen zijn te onderscheiden op grond van bijvoorbeeld pigmentvorming. Wanneer de PCR wordt aangewend als snelle screeningsmethode van producten op de aanwezigheid van E. sakazakii verdient echter de in deze studie ontwikkelde real-time PCR gebaseerd op het “E. sakazakii major outer membrane protein OmpA” de voorkeur, omdat deze 100% specifiek is gebleken. De methode dient hiertoe echter eerst te worden gevalideerd met behulp van zowel kunstmatig als natuurlijk besmette monsters. In totaal werden uit 14 monsters E. sakazakii stammen geïsoleerd: 6 (4,9%) monsters ontbijtgranen, 1 (4,0%) puddingpoeder, 5 monsters (10,0%) gemengd, gemalen runder/varkensvlees en 2 (1,4%) monsters gemalen rundvlees. Uitgezonderd een tweetal vleesisolaten, vertoonden de isolaten onderling geen genetische verwantschap (<95% overeenkomst in XbaI restrictiepatronen). Verder bleek er geen verband te zijn tussen het voorkomen van E. sakazakii en het aantal kweekbare Enterobacteriaceae. Het is zeer wel
OT 05L005-13
pagina 7 van 10
mogelijk dat de 2 vleesisolaten die op basis van hun XbaI restrictiepatroon niet van elkaar onderscheiden konden worden, afkomstig waren van eenzelfde partij vlees. Tot op heden richtten de meeste studies zich op het voorkomen van E. sakazakii in zuigelingenvoeding en is beperkt inzicht in het voorkomen ervan in andere producten. Iversen en Forsythe (6.23) isoleerden E. sakazakii behalve uit zuigelingenvoeding uit 5 (10,2%) monsters gedroogde kindervoeding, 3 (4,1%) melkpoeders, 2 (3,2%) kaasproducten en verschillende droge ingrediënten, met name kruiden en specerijen (37,8%)). Daarnaast zijn er een aantal studies naar de algemene microbiologische gesteldheid van producten, waarbij bij nadere identificatie van de bacteriële flora E. sakazakii werd aangetoond. Voorbeelden van producten die E. sakazakii bleken te bevatten zijn: gefermenteerd brood (6.14), gefermenteerde drank (6.15), drank op basis van een wortelextract (6.32), rauwe sla (6.38), rijstzaden (6.9), thee (6.40), kaas, vlees en groenten (6.26), ontkiemde zaden (6.10; 6.36), tofu (6.34), rijstebloem en eieren (6.17). In deze laatste studies is dus niet gericht gezocht naar E. sakazakii en geen gebruik gemaakt van detectie- en isolatiemethoden selectief voor deze bacterie. Alhoewel E. sakazakii is aangetoond in verschillende voedingsmiddelen en omgevingsmonsters verzameld in fabrieken waar voedingsmiddelen worden geproduceerd, is ziekte veroorzaakt door E. sakazakii tot dusverre uitsluitend in verband gebracht met babymelkpoeder. Water, aarde en plantenmateriaal worden verondersteld de belangrijkste natuurlijke reservoirs van E. sakazakii te zijn, naast dat van andere coliformen als Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae, E. cloacae en Citrobacter species (6.17). Vliegen en knaagdieren spelen mogelijk een belangrijke rol bij de verspreiding van de bacterie (6.28). 5
CONCLUSIE Informatie betreffende de ecologie van E. sakazakii is van belang voor het opstellen van effectieve maatregelen om infecties bij de mens te voorkomen. De resultaten van deze studie laten zien dat E. sakazakii behalve in babymelkpoeder ook voorkomt in verschillende andere producten, zoals ontbijtgranen, puddingpoeder en rauw vlees. Er werd geen verband aangetoond tussen het voorkomen van E. sakazakii en het aantal kweekbare Enterobacteriaceae. Deze bevindingen onderschrijven eerdere aanwijzingen voor het wijd verspreid voorkomen van E. sakazakii; de bacterie blijkt vrij algemeen voor te komen in productieomgevingen, maar ook in diverse eindproducten. De real-time PCR die werd opgezet, gebaseerd op het “E. sakazakii major outer membrane protein OmpA”, is een geschikte aanvulling op de biochemische bevestigingsreacties. Nader onderzoek zal moeten uitwijzen of deze PCR behalve voor het bevestigen van isolaten ook geschikt is voor het screenen van ophopingscultures. Om uiteindelijk te komen tot de juiste beheersmaatregelen is het van belang naast informatie over de ecologie meer inzicht te verkrijgen in de taxonomie, virulentie en andere karakteristieken van E. sakazakii.
6
LITERATUUR
6.1
Acker J van, Smet F de, Muyldermans G, Bougatef A, Naessens A, Lauwers S. Outbreak of necrotizing enterocolitis associated with Enterobacter sakazakii in powdered milk formula. J Clin Microbiol 2001;39:293-297. Anonymous. Enterobacter sakazakii infections associated with the use of powdered infant formula – Tennessee, 2001. MMWR 2002;51:297-300. Bar-Oz B, Preminger A, Peleg O, Block C, Arad I. Enterobacter sakazakii infection in the newborn. Acta Paediatr 2001;90:356-358. Biering G, Karlsson S, Clark NC, Jonsdottir KE, Ludvigsson P, Steingrimsson O. Three cases of neonatal meningitis caused by Enterobacter sakazakii in powdered milk. J Clin Microbiol 1989;27:2054-2056. Block C, Peleg O, Minster N, Bar-Oz B, Simhon A, Arad I, Shapiro M. Cluster of neonatal infections in Jerusalem due to unusual biochemical variant of Enterobacter sakazakii. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002;21:613-616.
6.2 6.3 6.4 6.5
OT 05L005-13
pagina 8 van 10
6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 6.12 6.13 6.14 6.15 6.16 6.17 6.18 6.19 6.20 6.21 6.22 6.23 6.24 6.25 6.26 6.27 6.28 6.29
Breeuwer P, Lardeau A, Peterz M, Joosten HM. Desiccation and heat tolerance of Enterobacter sakazakii. J Appl Microbiol 2003;95:967-973. Clark NC, Hill BC, O'Hara CM, Steingrimsson O, Cooksey RC. Epidemiologic typing of Enterobacter sakazakii in two neonatal nosocomial outbreaks. Diagn Microbiol Infect Dis 1990;13:467-472. Codex Alimentarius Commission. Risk profile of Enterobacter sakazakii in powdered infant formula. Thirty-fifth session of the Codex Committee on Food Hygiene, Orlando, 2003. Cottyn B, Regalado E, Lanoot B, Cleene M de, Mew TW, Swings J. Bacteria populations associated with rice seed in the tropical environment. Phytopathology, 2001;91:282-292. Cruz AC, Fernandez E, Salinas E, Ramirez P, Montiel C, Eslava CA. Characterization of Enterobacter sakazakii isolated from different sources. Abstract Q-051, 104th Gen Mtg, Am Soc Microbiol, 23-27 May 2004, New Orleans, LA, USA. European Food Safety Authority. Opinion of the Scientific Panel on Biological Hazards on a request from the Commission related to the microbiological risks in baby formulae and followup formulae. The EFSA Journal 2004;113:1-34. Farmer JJ 3rd, Asbury MA, Hickman FW, Brenner DJ & The Enterobacteriaceae study group. Enterobacter sakazakii: a new species of “Enterobacteriaceae” isolated from clinical specimens. Int J Syst Bacteriol 1980;30:569-584. Food and Agriculture Organization of the United Nations-World Health Organization. Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powdered infant formula, Meeting Report, Genève, 2-5 February 2004. Gassem MAA. Study of the micro-organisms associated with fermented bread (khamir) produced from sorghum in Gizan region, Saudi Arabia. J Appl Microbiol 1999;86:221-225. Gassem MAA. A microbiological study of sobia: a fermented beverage in the Western province of Saudi Arabia. World J Microbiol Biotechnol 2002;18:173-177. Guillaume-Gentil O, Sonnard V, Kandhai MC, Marugg JD, Joosten H. A simple and rapid cultural method for detection of Enterobacter sakazakii in environmental samples. J Food Prot 2005;68:64-69. Gurtler JB, Kornacki JL, Beuchat LR. Enterobacter sakazakii: a coliform of increased concern to infant health. Int J Food Microbiol 2005;104(1):1-34. Heuvelink AE, Ahmed M, Kodde FD, Zwartkruis-Nahuis JTM, Boer E de. Enterobacter sakazakii in melkpoeder. De Ware(n)-Chemicus 2002;1:17-29. Heuvelink AE, Heerwaarden C van, Zwartkruis-Nahuis JTM, Boer E de. Handhavingsactie Enterobacter sakazakii in zuigelingenvoeding 2004. Rapport VWA, Zutphen, 2005. Heuvelink AE, Moes H, Tilburg JJHC, Boer E de. Handhavingsactie Enterobacter sakazakii in poedervormige producten. Rapport VWA, Zutphen, 2004. Heuvelink AE, Zwartkruis-Nahuis JTM, A H van der, Wit B, Oosterom R van, Boer E de. Handhavingsactie Enterobacter sakazakii in zuigelingenvoeding. De Ware(n)-Chemicus 2003;4:207-213. Iversen C, Forsythe SJ. Risk profile of Enterobacter sakazakii, an emergent pathogen associated with infant milk formula. Trends in Food Science & Technology 2003;14:443-454. Iversen C, Forsythe S. Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae from powdered infant formula milk and related products. Food Microbiology 2004;21:771-777. Kandhai MC, Reij MW, Gorris LGM, Guillaume-Gentil O, Schothorst M van. Occurrence of Enterobacter sakazakii in food production environments and households. The Lancet 2004;363:39-40. Kandhai MC, Reij MW, Puyvelde K van, Guillaume-Gentil O, Beumer RR, Schothorst M van. A new protocol for the detection of Enterobacter sakazakii applied to environmental samples. J Food Prot 2004;67:1267-1270. Leclercq A, Wanegue C, Baylac P. Comparison of fecal coliform agar and violet red bile lactose agar for fecal coliform enumeration in foods. Appl Environ Microbiol. 2002;68(4):16311638. Lehner A, Riedel K, Eberl L, Breeuwer P, Diep B, Stephan R. Biofilm formation, extracellular polysaccharide production, and cell-to-cell signaling in various Enterobacter sakazakii strains: aspects promoting environmental persistence. J Food Prot 2005;68(11):2287-2294. Lehner A, Stephan R. Microbiological, epidemiological, and food safety aspects of Enterobacter sakazakii. J Food Prot. 2004;67(12):2850-2857. Leuschner RGK, Baird F, Donald B, Cox LJ. A medium for the presumptive detection of Enterobacter sakazakii in infant formula. Food microbiol 2004;21:527-533.
OT 05L005-13
pagina 9 van 10
6.30 6.31 6.32 6.33 6.34 6.35 6.36 6.37 6.38 6.39 6.40
Muytjens HL, Roelofs-Willemse H, Jaspar GHJ. Quality of powdered substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 1988;26:743-746. Muytjens HL, Zanen HC, Sonderkamp HJ, Kollée LA, Wachsmuth IK, Farmer JJ 3rd. Analysis of eight cases of neonatal meningitis and sepsis due to Enterobacter sakazakii. J Clin Microbiol 1983;18:115-120. Nassereddin RA, Yamani MI. Microbiological quality of sous and tamarind, traditional drinks consumed in Jordan. J Food Prot 2005;68(4):773-777. Nazarowec-White M, Farber JM. Incidence, survival, and growth of Enterobacter sakazakii in infant formula. J Food Prot 1997;60:226-230. No HK, Park NY, Lee SH, Hwang HJ, Meyers SP. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights. Int J Food Microbiol 2002;74(1-2):65-72. Noriega FR, Kotloff KL, Martin MA, Schwalbe RS. Nosocomial bacteremia caused by Enterobacter sakazakii and Leuconostoc mesenteroides resulting from extrinsic contamination of infant formula. Pediatr Infect Dis J 1990;9:447-449. Robertson LF, Johannessen GS, Gjerde BK, Loncarevic S. Microbiological analysis of seed sprouts in Norway. Int J Food Microbiol 2002;75(1-2):119-126. Simmons BP, Gelfand MS, Haas M, Metts L, Ferguson J. Enterobacter sakazakii infections in neonates associated with intrinsic contamination of a powdered infant formula. Infect Control Hosp Epidemiol 1989;10:398-401. Soriano JM, Rico H, Molto JC, Manes J. Incidence of microbial flora in lettuce, meat and Spanish potato omelette from restaurants. Food Microbiol 2001;18:159-163. Smeets LC, Voss A, Muytjens HL, Meis JFGM, Melchers WJG. Genetische karakterisatie van Enterobacter sakazakii isolaten van Nederlandse patiënten met neonatale meningitis. Ned. Tijdschr Med Microbiol 1998;6:113-115. Tamura A, Kato M, Omori M, Nanba A, Miyagawa K, Wang CR, Zhou WH. Flavor components and micro-organisms isolated from Suancha (sour tea, Takeutsu-sancha in Japanese). Nippon Kasei Gakkaishi 1995;46:759-764.
OT 05L005-13
pagina 10 van 10
RESULTATEN REAL-TIME PCR VAN 98 TESTSTAMMEN Stam
BIJLAGE I Resultaat real-time PCRa + + + + + +
Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii
Herkomst NCTC8155 NCTC9238 NCTC9529 NCTC9844 NCTC9846 NCTC11467
Enterobacter sakazakii (n=26)
isolaten VWA regio Oost
+
Enterobacter sakazakii (n=22)
isolaten Wageningen Universiteit
+
Aeromonas hydrophila Citrobacter Citrobacter freundii Citrobacter freundii Enterobacter amnigenus Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae (n=5) Enterococcus faecium Escherichia coli Escherichia coli O157 Hafnia alveii Klebsiella pneumoniae Klebsiella Klebsiella oxytoca Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Listeria innocua Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Proteus mirabilis Proteus mirabilis Proteus vulgaris Salmonella Enteritidis Salmonella Typhimurium Salmonella Typhimurium Serratia marcescens Shigella flexneri Shigella flexneri Shigella sonnei Shigella sonnei Shigella sonnei Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica O3 Yersinia enterocolitica O9
M800 PHLS 073-177 ATCC8090 NCTC6272 Isolaat VWA regio Oost Isolaat VWA regio Oost ATCC23355 Isolaten VWA regio Oost ATCC29212 ATCC25922 NCTC12900 NCTC8105 ATCC33495 Isolaat VWA regio Oost ATCC49131 Isolaat VWA regio Oost ATCC13883 Isolaat VWA regio Oost NCTC11288 SLCC2479 NCTC5348 ALM32 ATCC27853 NCTC10662 Isolaat VWA regio Oost ALM29 NCTC11938 ATCC13315 ALM36 ALM40 ATCC13311 ATCC13880 ALM60 Isolaat VWA regio Oost ATCC11060 Isolaat GG&GD Haarlem Isolaat VWA regio Oost ALM5 Isolaat UMC St. Radboud CCUG8239A
-
a
+, positief; -, negatief
OT 05L005-13
09-02-07
Bijlage I, pagina 1 van 1
