ELISA-VIDITEST PAU ve vodě č.š. xxx Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA s r.o., Nad Safinou II č.365, Vestec, 252 42 Jesenice, ČR, tel/fax.: +420 261 090 566 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST PAU ve vodě – ELISA souprava pro detekci Benzo(a)pyrenu (B(a)P) (polycyklických aromatických uhlovodíků, PAU) ve vodě. 2. POUŽITÍ: ELISA-VIDITEST PAU ve vodě slouží pro stanovení koncentrace B(a)P (PAU) ve vodě i mořské vodě. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST PAU ve vodě je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je imobilizována polyklonální králičí protilátka anti-benzo(a)pyren (anti-B(a)P). Na tuto protilátku se během první inkubace naváží molekuly B(a)P (PAU) přítomné v kalibračních standardech (Standard A až F) a ve vzorku. V dalším kroku je provedena druhá inkubace s enzymovým konjungátem B(a)P-Px. Po druhé inkubaci jsou jamky promyty promývacím roztokem, aby se odstranily nenavázané molekuly B(a)P (PAU) a B(a)P-Px. Množství navázaných konjugátů B(a)P-Px se stanoví barevnou enzymatickou reakcí přidáním chromogensubstrátového roztoku (TMB). Pokud jsou ve vzorcích nízké koncentrace B(a)P (PAU), umožní to navázaní většího množství molekul konjungátu B(a)P-Px na protilátky antiB(a)P a tím výraznější (tmavší) zabarvení jamek. Pokud jsou ve vzorcích vysoké koncentrace B(a)P (PAU), naváže se menší množství molekul konjungátu B(a)P-Px na protilátky anti-B(a)P a zabarvení jamek je světlejší. Intenzita barevné reakce je tedy nepřímo úměrná koncentraci B(a)P (PAU) ve vzorcích. Stanovení hladiny B(a)P (PAU) v neznámých vzorcích se provede pomocí kalibrační křivky – B(a)P Standardy A až F. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA 8-jamkové stripy v manipulačním rámečku, potažené polyklonální protilátkou anti-B(a)P 1,3 ml B(a)P Standardu A (koncentrace B(a)P = 0 ng/ml), r.t.u.1 1,3 ml B(a)P Standardu B (koncentrace B(a)P = 1 ng/ml), r.t.u. 1 1,3 ml B(a)P Standardu C (koncentrace B(a)P = 5 ng/ml), r.t.u. 1 1,3 ml B(a)P Standardu D (koncentrace B(a)P = 25 ng/ml), r.t.u. 1 0,240 ml enzymového konjungátu B(a)P -Px 50 x konc. 125 ml promývacího roztoku 10 x konc. 35 ml reakčního pufru r.t.u. 1 12 ml roztoku pro ředění konjugátu r.t.u. 1 12 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. 1 6 ml stop roztoku r.t.u. 1 1 lahvička pro ředění konjugátu B(a)P-Px Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci)
1
12 ks 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 1 lahvička 2 lahvičky 1 lahvička 1 ks 1 ks
5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ A VZORKŮ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Důkladně zamíchejte všechny roztoky c. Těsně před testem důkladně zamíchejte testované vzorky životního prostředí a Standardy. Pokud potřebujete vzorky naředit, řeďte je v destilované vodě. Standardy neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). d. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho ve vodní lázni +32°C až +37°C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 měsíc při laboratorní teplotě. e. Těsně před použitím nařeďte enzymový konjungátu B(a)P-Px 50x ředicím roztokem pro ředění konjugátu, např. 0,12 ml B(a)P-Px + 6 ml ředicího roztoku. (Pozn.: Pro zpracování 12 stripů (tj. 1 rámečku) je zapotřebí cca 10 ml ředěného B(a)P-Px.) f.
Standardy, reakční pufr, roztok pro ředění konjugátu, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.).
g. Vzorek vody se analyzuje přímo bez jakékoliv extrakce, pouze je nutné vzorek zbavit hrubých mechanických nečistot filtrací přes vhodný filtr. 7. PRACOVNÍ POSTUP: a.
Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy důkladně uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte.
b.
Jamky stripů naplňte 300 µl reakčního pufru. Po 20 vteřinách obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty.
c.
Naplňte příslušné jamky po 100 µl Standardy a testovanými vzorky životního prostředí podle následujícího schématu (viz Obr. 1): Nejdříve naplňte jamky Standardy (ST A až D) a zbývající jamky naplňte testovanými vzorky (S1,S2,…). Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, Standardy a testované vzorky aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 5 minut při laboratorní teplotě.
d.
Napipetujte do všech jamek 100 µl ředěného B(a)P-Px konjugátu. Inkubujte 120 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě.
e.
Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve (viz BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY). Jamky poté 4 x promyjte 350 µl promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty.
f.
Napipetujte do jamek po 200 µl chromogensubstrátového roztoku (TMB). Inkubujte 10 minut (+/- 5 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy víčkem s alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo.
g.
Zastavte reakci přidáním 50 µl stop roztoku. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou
2
dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h.
Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut od zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 690 nm.
Obr. 1: Schéma aplikace vzorků: 1 a
ST A
b
ST B
c
ST C
d
ST D
e
S1
f
S2
g
S3
h
S…
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
8. HODNOCENÍ TESTU: Stanovte koncentraci pro jednotlivé testované vzorky: 1. Sestrojte kalibrační křivku tak, že na osu x vyneste koncentrace Standardů (uvedeny v bodě 4. Obsah soupravy). Na osu y vyneste jejich absorbance (OD). Je možné použít logaritmické osy x. 2. Z rovnice kalibrační křivky vypočítejte koncentraci B(a)P (PAU) tak, že místo hodnoty y dosaďte hodnotu OD testovaného vzorku. Hodnoty x představují koncentraci B(a)P (PAU) v testovaném vzorku. Při výpočtu koncentrací je zapotřebí brát v úvahu i ředění vzorků (např.: pokud ředíte vzorek 2x, výslednou (vypočtenou) koncentraci musíte násobit 2x). 9. LIMITY TESTU: Analytická citlivost: 0,16 ng/mL. Funkční citlivost: 0,60 ng/mL (C.V. = 20%). Specificita: - Benzo(a)pyrene – 100% - Indone(1,2,3-cd)pyrene – 108% - Benzo(k)fluoranthene – 34.5% - Benzo(g,h,i)perylene – 31.2% - Benzo(a)antracene – 23.5% - Benzo(b)fluoranthene – 19.9% - Chrysene – 10.3% - Pyridine – 5.6% - Fluoranthene – 5.3%
3
10. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. S obsahem pojistné sběrné láhve, použitými stripy a nespotřebovanými B(a)P Standardy a enzymovým konjugátem B(a)P-Px nakládejte jako s nebezpečným odpadem. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Testované vzorky životního prostředí mohou obsahovat stopy karcinogenů a mutagenů 2. a 3. třídy, nakládejte s nimi proto jako s nebezpečným odpadem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 11. UPOZORNĚNÍ: Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci reagencií. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. Chromogensubstrátový roztok (TMB) je konzervován ProClinem 300. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 12. SKLADOVÁNÍ A EXSPIRACE: Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 °C v originálních obalech. Chraňte před mrazem. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, exspirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na exspiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. Roztok konjugátu B(a)P-Px v pracovní koncentraci nelze skladovat, připravujte jej vždy čerstvý.
4
13. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1.
Připravte reagencie a testované vzorky v pracovním ředění ↓
Krok 2.
Aplikujte 300 μl/ jamku promývacího pufru, po 20 vteřinách vyklepněte ↓ Aplikujte 100 μl/ jamku Standardů a testovaných vzorků ↓ Inkubujte 5 minut při laboratorní teplotě ↓
Krok 3.
Aplikujte 100 μl/ jamku naředěného konjugátu B(a)P-Px ↓ Inkubujte 120 minut při laboratorní teplotě ↓ 4x promyjte (350 μl/ jamku), vyklepněte ↓
Krok 4.
Aplikujte 200 μl/ jamku chromogensubstrátového roztoku ↓ Inkubujte 10 minut při laboratorní teplotě ve tmě ↓
Krok 5.
Aplikujte 50μl/ jamku stop roztoku ↓
Krok 6.
Změřte absorbanci při 450 nm (ref. filtr 690 nm) do 20 minut
5
