Egy vagy több nukleotid mutációja megváltoztathatja a fehérje szerkezetét és működését • Mutáció: egy sejt genetikai anyagában létrejövő hirtelen véletlenszerű változás, aminek hatására az a sejt és az abból származó összes sejt külső megjelenésben vagy viselkedésben a normál típushoz képest eltér. • pont mutáció esetén a kémiai változás a gén csak egy bázispárját érinti • DNS templát szálán egy nukleotid cseréje abnormális fehérje szintézisét eredményezheti
Pontmutáció hatása a hemoglobinban: Vad típusú hemoglobin
Sarló sejtes hemoglobin
Vad típusú hemoglobin DNS C T T 3ʹ 5ʹ G A A 5ʹ 3ʹ
Mutáns hemoglobin DNS C A T 3ʹ G T A 5ʹ
mRNS 5ʹ
5ʹ 3ʹ
mRNS G A A
Normál hemoglobin Glu
3ʹ
5ʹ
G U A
Sarló sejtes hemoglobin Val
3ʹ
Mutagének • Spontán mutációk előfordulhatnak a DNS replikációja, javítása alatt vagy rekombináció miatt • A mutagén olyan fizikai vagy kémiai hatás, melynek kövtkeztében nő a mutánsok száma egy populációban.
Kis szakaszt érintő mutációk típusai • A génen belüli pont mutációkat két általános csoportra oszthatjuk: – nukleotid-pár cserék/szubsztitúciók – Egy vagy több nukleotid-pár beékelése/inzerciója vagy kiesése/deléciója
Szubsztitúciók • A nukleotid-pár szubsztitúció esetén a nukleotid párt egy másik váltja fel • Silent - "csendes" mutáció az, amikor a kodon változik, de ugyanazt az aminosavat jelenti továbbra is • Neutral - semleges hatású mutáció, mivel a mutáció következtében egy aminosav egy másik, de hasonló tulajdonságú aminosavra változik • Missense - megváltozott értelmű mutáció következtében egy aminosavat jelentő kodon úgy változik meg, hogy az eredeti aminosavat helyettesíteni képtelen új aminosav beépülését eredményezi. • Nonsense "értelmetlen"mutáció az, amikor aminosavat nem jelentő kodon keletkezik, azaz egy kodon stop kodonra változik.
Vad típus DNS templát szál
3ʹ T A C T T C A A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T T G G C T A A 3ʹ
mRNS5ʹ A U G A A G U U U G G C U A A 3ʹ Protein Met Lys Phe Gly Stop Amino terminális Karboxil terminális
(a) nukleotid-pár szubsztitúció: silent (csendes) G helyett A 3ʹ T A C T T C A A A C C A A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T T G G T T A A 3ʹ
C helyett U 5ʹ A U G A A G U U U G G U U A A 3ʹ
Met
Lys
Phe
Gly
Stop
Vad típus DNS templát szál
3ʹ T A C T T C A A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T T G G C T A A 3ʹ
mRNS5ʹ A U G A A G U U U G G C U A A 3ʹ Protein Met Lys Phe Gly Stop Amino terminális Karboxil terminális
(a) nukleotid-pár szubsztitúció: missense C helyett T 3ʹ T A C T T C A A A T C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T T A G C T A A 3ʹ
G helyett A 5ʹ A U G A A G U U U A G C U A A 3ʹ
Met
Lys
Phe
Ser
Stop
Vad típus DNS templát szál
3ʹ T A C T T C A A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T T G G C T A A 3ʹ
mRNS5ʹ A U G A A G U U U G G C U A A 3ʹ Protein Met Lys Phe Gly Stop Amino terminális Karboxil terminális
(a) nukleotid-pár szubsztitúció: nonsense T helyett A 3ʹ T A C A T C A A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G T A G T T T G G C T A A 3ʹ
A helyett U 5ʹ A U G U A G U U U G G C U A A 3ʹ
Met
Stop
Inzerciók és deléciók • Inzerciók és deléciók nukleotid párok hozzáadódását vagy hiányát jelentik a gén szekvenciájában. Gyakrabban okozzák a fehérje hibáját, mint a szubsztitúciók. • Hatásuk gyakran ún. frameshift mutáció kereteltolódást okozó mutáció, ahol egy vagy több bázispár kiesés, beékelődés hatására a leolvasási keret a kódoló szekvencián belül eltolódik, így a mutáció helye után a DNS teljesen más aminosav sorrendet határoz meg.
Vad típus DNS templát szál
3ʹ T A C T T C A A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T T G G C T A A 3ʹ
mRNS5ʹ A U G A A G U U U G G C U A A 3ʹ Protein
Met
Amino terminális
Lys
Phe
Gly
Stop
Karboxil terminális
(b) nukleotid-pár inzerció vagy deléció: a kereteltolódás azonnal nonsense mutációt okoz Extra A 3ʹ T A C A T T C A A A C G G A T T 5ʹ 5ʹ A T G T A A G T T T G G C T A A 3ʹ
Extra U 5ʹ A U G U A A G U U U G G C U A A 3ʹ
Met
Stop
1 nukleotid-pár inzerciója
Vad típus DNS templát szál
3ʹ T A C T T C A A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T T G G C T A A 3ʹ
mRNS5ʹ A U G A A G U U U G G C U A A 3ʹ Protein
Met
Lys
Phe
Amino terminális
Gly
Stop
Karboxil terminális
(b) nukleotid-pár inzerció vagy deléció: kereteltolódás kiterjedt missense mutációt okoz A hiányzik 3ʹ T A C T T C A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T G G C T A A 3ʹ U hiányzik 5ʹ A U G A A G U U G G C U A A
Met
Lys
1 nukleotid-pár deléciója
Leu
Ala
3ʹ
Vad típus DNS templát szál
3ʹ T A C T T C A A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G A A G T T T G G C T A A 3ʹ
mRNS5ʹ A U G A A G U U U G G C U A A 3ʹ Protein Met Gly Lys Phe Stop
Karboxil terminális
Amino terminális
(b) nukleotid-pár inzerció vagy deléció: nincs kereteltolódás, de egy aminosav többlet vagy hiány van T T C hiányzik 3ʹ T A C A A A C C G A T T 5ʹ 5ʹ A T G T T T G G C T A A 3ʹ A A G hiányzik 5ʹ A U G
Met
U U U G G C U A A 3ʹ
Phe
3 nukleotid-pár deléciója
Gly
Stop
A prokarióta, archea és eukarióta génexpresszió összehasonlítása • A baktériumok és eukarióták az RNS polimerázukban, az átírás befejezésében és a riboszómáikban különböznek; az archaea-k ezekben a tulajdonságokban inkább az eukariótákra hasonlítanak • A baktériumok egyidejűleg tudnak egy gént átírni és transzlálni • Eukariótákban az átírás és a transzláció a sejtmaghártya miatt térben elkülönül • Archaea-kban az átirás és a transzláció gyakran kapcsolt
Kapcsolt génátírás és transzláció baktériumokban
RNS polimeráz
DNS
mRNS
Poliriboszóma átírás iránya RNS polimeráz
0.25 µm DNS
Poliriboszóma polipeptid (N terminális) Riboszóma mRNS (5ʹ vég)
A génexpresszió szabályozása • Az egysejtű pro- és eukarióták a környezet változásainak megfelelően folyamatosan változtatják a génexpressziójukat Soksejtű eukariótákban a génexpresszió szabályozza a fejlődés folyamatát és felelős az egyes sejttípusok kialakulásáért. Ezek zavara fejlődési rendellenességekhez vagy pl. teratómákhoz vezethet. Teratóma: olyan daganat, melyben a test többféle szövetére jellemző strukrúra képződik
Génkifejeződési mintázat egy fejlődő légyembrióban
A baktériumok környezetük megváltozására a transzkripciójuk szabályozásával reagálnak • A természetes szelekció azokat a baktériumokat részesítette előnyben, akik akkor állítottak elő termékeket, amikor a sejtnek arra szüksége volt. • A sejt képes szabályozi a termék termelését egy visszaható gátlással vagy az adott gén szabályozásával • A génexpresszió baktériumokban az operon modell szerint szabályozódik
Prekurzor Visszaható gátlás
trpE gén Enzim 1 trpD gén
Enzim 2
Génexpresszió szabályozása
trpC gén
− trpB gén −
Enzim 3 trpA gén Tryptophan (a) Enzim aktivitás szabályozása
(b) Az enzim termelésének szabályozása
Operonok: az alapmodell • Funkcionálisan rokon gének csoportját egyszerű “be-ki kapcsoló” segítségével lehet összehangoltan szabályozni • A szabályozó kapcsoló a DNS egy operátornak nevezett szakasza, mely leggyakrabban a promóter régióban található • Az operon a DNS olyan szakasza, mely magába foglalja az operátort, a promótert és az általuk szabályozott géneket.
• Az operont a represszornak nevezett fehérje tudja kikapcsolni • A represszor megakadályozza a gének átírását úgy, hogy köt a operátorhoz, és gátolja az RNS polimerázt • A represszor egy független ún. regulátor gén terméke • A represszor fehérje lehet aktív vagy inaktív állapotban attól függően, hogy más molekulák jelen vannak-e • A korepresszor olyan molekula, mely együttműködik a represszorral az operon szabályozásában
trp operon Promóter
Promóter Az operon génjei
DNS
trpE
trpR
trpD
trpC
trpB
trpA
C
B
A
Operator
Regulátor gén
3ʹ
RNS polimeráz
mRNS
Start kodon
Stop kodon
mRNS 5ʹ
5ʹ E Fehérje
Inactív represszor
D
Polipeptid alegységek,melyek a triptofán bioszintézis enzimjeit alkotják
(a) Triptofán hiányzik, represszor inaktív, operon bekapcsolva
• DNS Nem készül RNS mRNS
•
•
Fehérje
Aktív represszor Triptofán (korepresszor)
(b) Triptofán jelen van, represszor aktív, operon off
•
Például az E. coli képes a triptofán aminosav bioszintézisére Alapállapotban a trp operon “ON” állapotban van, és a triptofán szintézis génjei átíródnak Ha a triptofán jelen van, köt a trp represszorhoz, ami kikapcsolja a trp operont A represszot csak a korepresszor triptofán jelenlétében aktív
Regulátor gén DNS
Promóter
•
Operator
lacI
lacZ Nincs RNS képzés
3ʹ mRNS
•
RNS polimeráz
5ʹ
•
Aktív represszor
Protein
(a) laktóz hiányzik, represszor aktív, operon “off”
A lac (laktóz - tejcukor) operon egy indukálható operon és olyan géneket tartalmaz, melyek a laktóz metabolizmusához kellenek alapállapotban a lac represszor aktív és a lac operont kikapcsolt állapotban tartja Az induktornak nevezett molekula inaktiválja a represszort és a lac operont bekapcsolja
lac operon lacI
DNS
lacZ
lacY
lacA
RNS polimeráz 3ʹ
mRNS 5ʹ
mRNS 5ʹ
β-Galaktozidáz
Protein Allolaktóz (induktor)
Inaktív represszor
(b) laktóz jelen van, represszor inaktív, operon “on”
Permeáz
Transzacetiláz
Promóter
lacI
DNS
Pozitív génexpresszió szabályozás lacZ
CAP-kötőhely Aktív CAP
cAMP Inaktív CAP
•
Operator RNS polimeráz köt és a transzkripció fut Inaktív lac represszor
•
Allolaktóz (a) laktóz jelen van, glükóz kevés van (cAMP-szint magas): nagy mennyiségű lac mRNS szintetizálódik
•
Promóter DNS
lacI
CAP-kötőhely
Inaktív CAP
lacZ Operator
RNS polimeráz kevésbé tud kötődni
•
Inaktív lac represszor
(b) laktóz jelen van, glükóz jelen van (cAMP-szint alacsony): kevés lac mRNS szintetizálódik
•
Számos operon pozitív szabályozás alatt is áll; ez esetben transzkripciós aktivátorok segítik a gének átírását, ilyen a katabolit aktivátor fehérje (CAP) Ha a glükóz-szint (a baktérium inkább ezt szereti használni) alacsony, a CAP aktiválódik, mert köti a ciklikus AMP-t (cAMP) Az aktivált CAP a lac operon protóteréhez kapcsolódik és az RNS polimeráz kötési affinitását növeli, így gyorsítja a transzkripciót Ha a glükóz-szint emelkedik, a CAP lekapcsolódik a lac operonról, és a transzkripció visszatér a normál szintre CAP más katabólikus útvonalban részt vevő enzimek termelését is segíti
Szignal NUKLEUSZ kromatin kromatin midifikácó: DNS kicsomagolása Hiszton acetiláció és DNS demetiláció
DNS
Gén elérhető a transzkripcióra
Az eukarióta génexpresszió számos lépésen át szabályozott •
Gene Transzkripció RNS
Exon elsődleges átirat
•
Intron RNS processzálás Sapka
Farok mRNS a sejtmagban Transzport CITOPLAZMA mRNS a citoplazmában
Az mRNS lebomlása
Transzláció
Polipeptide Fehérje módosítás, pl. hasítás vagy kémiai modifikáció A fehérje lebonlása
Aktív fehérje A sejt megfelelő pontjára szállítás Sejtfunkció (pl. enzimatikus aktivitás, szerkezeti funkció)
•
Minden sejt a szervezetben genetikailag azonos A különböző sejttípusok között megfigyelhető különbség a differenciális génexpresszió eredménye, vagyis az azonos genomú sejtek eltérő géneket fejeznek ki. A gének expressziója számos ponton szabályozható
A kromatin struktúrájának módosítása A DNS a sejtmagban hiszton fehérjékhez kapcsolódik (kromatin) és különböző kondenzáltságú állapotban van
Nukleoszóma (10 nm átmérő) DNS kettős helix (2 nm átmérő)
Hiszton Hisztonok farok DNS, a kettős hélix
Hisztonok
H1
Nukleoszómák, gyöngysor szerkezet (10-nm szál)
Kromatida (700 nm)
30nm-es szál
Hurkok 30nm-es szál •
•
Az erősen csomagolt heterokromatikus régióban lévő gének általában nem fejeződnek ki A kromatin DNS-ének és hisztonjainak kémiai módosítása megváltoztatja a kromatin szerkezetét és így a génátíródást
Állvány 300-nm fiber
Replikált kromoszóma (1,400 nm) hurkolt szakaszok (300nm-es szál)
metafázisos kromoszóma
A HISZTON MÓDOSÍTÁSA
Nukleoszóma
hiszton farkak A kémiai modifikáció számára elérhető aminosavak
•
DNS kettős helix •
(a) hisztonok farki része kilóg a nukleoszómából •
Acetilált hisztonok Nem-acetilált hisztonok (b) A hisztonok farki részének acetilációja lazítja a kromatin szerkezetét
A hiszton acetiláció során acetil csoportok kapcsolódnak a hisztonok pozitívan töltött lizin oldalláncaihoz (a hisztonok farki részén) Ez fellazítja a kromatin szerkezetet, így elősegítii a transzkripció iniciációs szakaszát metil csoportok hozzáadása (metiláció) kondenzálja a kromatint; ugyanakkor a metilált aminosavak melletti foszforiláció lazítja a kromatint
DNS metiláció • A DNS metilációja, a bázisok metilcsoporttal való ellátása, a legtöbb fajban csökkenti a transzkripciót • A DNS metilációja az adott gén hosszú idejű inaktivációját okozhatja a fejlődés során • A szülői imprinting során metiláció szabályozza hogy az anyai vagy az apai allélok fejeződjenek-e ki a fejlődés kezdetén • Az X kromoszóma inaktivációját is részben metiláció okozza.
Epigenetikus öröklődés • Bár a kromatin módosítások nem változtatják meg a DNS szekvenciáját, de átadódhatnak a sejt utódaiba • Ezt az öröklődési formát epigenetikus öröklődésnek nevezzük
Egy tipikus eukarióta gén szerkezete Enhanszer (disztális szabályozó elemek) DNS Upstream
Proximális szabályozó Transzkripció elemek start helye Exon
Intron
Exon
Intron
Downstream Poli-A szignál Intron Exon Exon az elsődleges átirat levágott 3ʹ vége RNS processzálás
Promóter
Transzkripció
Exon
elsődleges RNS átirat 5ʹ (pre-mRNS)
Poli-A szignál Transzkripció szekvencia terminációs régiója Intron Exon
Intron RNS Kódoló szakasz mRNS
G
P
P P
5ʹ Sapka5ʹ UTR
AAA ⋅⋅⋅ AAA
Start Stop kodon kodon
3ʹ UTR Poli-A farok
3ʹ
A transzkripciós faktorok és az enhanszerek szerepe • A transzkripció elindulásához az eukarióta RNS polimeráz transzkripciós faktorok jelenlétét igényli • Az enhanszerek távoli (upstream) szabályozó elemek (gyakran intronban helyezkednek el) • Az aktivátor az enhanszerhez köt és segíti az adott gén átírását
Promóter
Aktivátorok DNS Disztális Enhancer szabályozó elemek
Gén
TATA box Általános transzkripciós faktorok
DNS-t hajlító fehérje Szabályozó fehérjék
RNS polimeráz II
RNS polimeráz II Transzkripciós iniciációs komplex
RNS szintézis
Adott aktivátorok jelenléte, sejtsorsra jellemző géneket aktivál.
Enhancer Szabályozó elemek
Promóter Albumin gén Crystallin gén LENS CELL NUCLEUS
LIVER CELL NUCLEUS Available activators
Available activators
Albumin gene not expressed
Albumin gene expressed
Crystallin gene not expressed (a) Liver cell
Crystallin gene expressed (b) Lens cell
RNS processzálás DNS
1
Exonok
3
2
4
5
Troponin T gén
elsődleges RNS transzkript
3
2
1
5
4
RNS splicing mRNS
1
2
3
5
vagy
1
2
4
5
Transzkripció
kromatin mósosítás • Az erősen kondenzált kromatinban található gének általában represszáltak • hiszton acetiláció lazítja a kromatin szerkezetét és segíti a traszkripciót
• A DNS metiláció általában gátolja a génexpressziót
• A transzkripció iniciációjának szabályozása: DNS szabályozó elemei az enhanszerekben specifikus transzkripciós faktorokat kötnek
A DNS meghajlása miatt az aktivátor fehérjék kölcsönhatásba lépnek a promóternél lévőkkel, elindítva a transzkripciót • Koordinált szabályozás: Máj specifikus gének lencse specifikus enhancere gének enhancere
kromatin módosítás
Transzkripció
RNS processzálás
RNS processzálás • Alernatív RNS splicing: elsődleges RNS átirat
mRNS degradáció
Transzláció
mRNS Protein processzálás és degradáció
mRNS degradáció • Minden mRNS jellemző életidővel rendelkezik, melyet részben az 5ʹ és 3ʹ UTR szekvenciák szabnak meg.
vagy Transzláció
• A transzláció iniciációját iniciációs faktorok szabályozzák. Protein processzálás és degradáció • Protein processzálás és proteoszómális degradáció a szabályozás alapja ezen a szinten.
A nem-kódoló RNSek sokrétű szerepet játszanak a génexpresszió szabályozásában • A DNS-nek csak egy kis része kódol fehérjéket, és a DNS nem fehérje kódoló részének egy nagyon kis része tartalmazza az RNSek (rRNS, tRNS) génjeit • A genom egy jelenzős része ún. nem-kódoló RNSekké íródik át (noncoding RNSs - ncRNSs) • A nem kódoló RNSek a génexpressziót két ponton szabályozzák: – mRNS transzláció – kromatin konfiguráció
Az mRNSeken a mikroRNSek és a kis interferáló RNSek hatnak • MikroRNSek (miRNS) kis egyszálú RNS molekulák, amik kötnek az mRNShez • elindíthatják az mRNS degradációját vagy blokkolhatják a transzlációt
Hairpin
Hidrogén kötés
miRNS
Dicer 5ʹ 3ʹ
(a) elsődleges miRNS átirat
miRNS
miRNSprotein komplex
mRNS degradált Transzláció blokkolt (b) miRNSek képződése és szerepe
• Az RNS molekulák segítségével megvalósított génexpresszió gátlás az RNS interferencia (RNSi) • RNSi-t kis interferáló RNSek (small interfering RNSs - siRNSs) okoznak • Az siRNSek és miRNSek hasonlóak, de különböző RNS prekurzorból képződnek
kromatin modifikáció
kromatin modifikáció • Kicsi vagy nagy nem-kódoló RNSek elősegíthetik a heterokromatin kialakulását, így blokkolva a transzkripciót.
Transzkripció
RNS processzálás
mRNS degradáció
Transzláció • miRNS vagy siRNS blokkolhatja az adott mRNS transzlációját.
Transzláció
Protein processzálás és degradáció
mRNS degradáció • miRNS vagy siRNS specifikusan kijelölhet egy mRNS-t a degradációra.
