LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Efek Potensiasi Teh Hijau
(CameUa sinensis L.) dalam
Meningkatkan Daya Antimalaria Artemisinin
Nama Penyusun �poran:
1. dr. Fanny Rahardja1MSi
2. dr. Adrian Suhendra1SpPK1MKes 3. dr. Rita Tjokropranoto1MSc
FAKULTAS KEDOKTER.\N UNIVERSITAS KRISTEN MARANATHA
JL. Prof.drg.Suria Sumantri,I\IPH,65 Bandung 2012
LAPORAN AKHm PENELITIAN
Efek Potensiasf Teh Hfjau
(Cornelia sinensis L.) dalam
Meningkatkan Daya Antimalaria Artemisinin
Tan g�:tl
Xo.·. T UJdlt k ;lh. Klass
�
q� --:.-\= - t):-;:;: 2.:----
------
:
--· ::::== == � - : -�
==
�...... -=-
Nama Penyusun Laporan:
1. dr. Fanny Rahardja,MSi
2. dr. Adrian Suhendra,SpPK,MKes 3. dr. Rita Tjokropranoto,MSc
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS KRISTEN MARANATHA JL. Prof.drg.Suria Sumantri,MPH,65 Bandung
2012
--=-I -·
··;.;-.=...
HALAMAN PENGESABAN
LAPORAN AKHIR BASIL PENELITIAN RISBIN IPTEKDOK
I
Judul Penelitian
Ketua Peneliti Nama Lengkap b. Bidang keahlian c. Jabatan struktural d Jabatan fungsional e. Unit kerja b. Alamat surat 1. Telpon I Faks k. Email 3. Anggota Peneliti
Efek Potensiasi Teh Hijau (Camelia sinensis L.) dalam Meningkatkan Daya Antirnalaria Artemisinin
2.
a
Fanny Rahardja, dr., M.Si. Mikrobiologi
Asisten Ahh Pusat Penelitian Ilmu Kedokteran FK -UK Maranatha Jl. Prof. Drg. Suria Sumantri 65 Bandung 40164 (022)2017621«022)2015154
[email protected]
No
Nama dan gelar akademik
l.
FannyRahardja, dr., M.Si. Adrian Suhendra, dr., SpPK.,
2.
3.
M.Kes Rita Tjokropranoto, dr., M.Sc.
4.Jangka Waktu Penelitian
Bidang keahlian Mikrobiologi Patologi KJinik Parasitologi
Instansi FK-UKM FK-UKM FK-UKM
Alokasi waktu jam/mg bulan 25 10 10 20 20
10
: 1 tahun
Bandung, 11 Februari 2012 Ketua Peneliti
Fanny Rahardja, dr., M.Si.
NIK. 110281
1
RINGKASAN EKSEKUTIF Efek Potensiasi Teh Hijau
(Camelia sinensis L.) dalam Meningkatkan Daya Antimalaria Artemisinin Oleh:
*Fanny Rahardja, *Adrian Suhendra, *Rita Tjokropranoto *Pusat Penelitian Ilmu Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Kristen Maranatha Bandung
Penelitian ini bertujuan mengetahui aktivitas antimalaria (nilai IC50)
ekstrak,
in vitro pada kultur P. falciparum dibandingkan senyawa dan mengetahui senyawa flavonoid yang terdapat dalam ekstrak, farksi
fraksi-fraksi teh hijau secara :flavonoid teh fraksi teh.
Penelitian ini diawali dengan determinasi tanaman teh hijau PT.Walini Garut, sumber teh hijau sebagai bahan ekstrak dan fraksi. Analisis proksimat teh hijau meliputi kadar air, protein, karbohidrat, lemak, serat kasar, dilanjutkan ekstraksi menggunakan pelarut etanol 96% dan fraksionasi menggunakan pelarut heksan, etil asetat, butanol dan air. Untuk mengetahui kadar senyawa flavonoid teh menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Berdasarkan hasil analisis proksimat teh hijau dari Teh Walini memiliki kadar air 7,15%; abu 5,13%, protein 22%, serat kasar 14,33%, lemak kasar 1,33%, karbohidrat 57,31%. Hasil rendemen ekstrak teh hijau sebesar 25,44%, fraksi heksan 3,11%; fraksi etil asetat 6,63%, fraksi butanol 14,12%, fraksi air teh hijau sebesar 25,28%. Berdasarkan hasil penelitian ekstrak teh hijau, fraksi air, fraksi etil asetat, fraksi butanol memiliki aktivitas antimalaria yang tinggi. Nilai IC50 ekstrak teh hijau sebesar 6,38 �g/ml; fraksi etil asetat teh hijau 3,26 �g/ml, fraksi butanol teh hijau 10,72 �g/ml, fraksi air teh hijau 0,000 IJg/ml. Senyawa flavonoid teh yang memiliki aktivitas antimalaria adalah GC, kuersetin, kaempferol, asam galat. Nilai IC50 EGC sebesar 98,14 JlM!ml; CG sebesar 188,09 IJM/ml, GC 0,319 lJM/ml; kuersetin 0,058 �M/ml; kaempferol 0,018 �M/ml, GA sebesar 0,085 �Mimi dan artemesinin sebesar 0,000 JlM!ml. Kombinasi fraksi teh, senyawa flavonoid dan artemesinin meningkatkan daya antimalaria. Nilai IC50 kombinasi artemesinin + fraksi etil asetat sebesar 0,036 �M/ml, kombinasi GC+ artemesinin dan EC+artemesinin sangat aktif, tidak bisa ditentukan nilai IC50, sehingga dilakukan pengulangan menggunakan konsentrasi yang lebih rendah dan diperoleh
nilai
IC50
GC+artemesinin
sebesar
0,005
�g/ml
dan
nilai
IC50
EC+artemesinin sebesar 0,000244 �g/ml. Ekstrak teh hijau paling lengkap mengandung senyawa standar Epikatekin (EC), Gallic Acid (GA), Gallocatechin (GC), Catechin Gallate (CG), Gallocatechin gallate (GCG), Epigallocatechin (EGC), Epicatechin gallate (ECG), Epicatechin gallate (EGCG), Catechin (C), kaempferol, mirisetin, kuersetin). Fraksi air tidak mengandung senyawa-senyawa standar (EC, GA, GC, CG, GCG, EGC, ECG, EGCG, C, kaempferol, mirisetin, kuersetin).
Kata kunci: teh hijau, antimalaria, flavonoid,
Kata Pengantar
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmatNya sehingga penelitian dan laporan RISBIN IPTEKDOK 2011 dapat diselesaikan. Berdasarkan basil analisis proksimat teh hijau dari Teh Walini memiliki kadar air 7J5%; abu 5,13%, protein 22%, serat kasar 14,33%, lemak kasar 1,33%, karbohidrat 57,31%. Hasil rendemen ekstrak teh hijau sebesar 25,44%, fraksi heksan 3,11%; fraksi etil asetat 6,63%, fraksi butanol 14,12%, fraksi air teh hijau sebesar 25,28%. Berdasarkan hasil penelitian ekstrak teh hijau, fraksi air, fraksi etil asetat, fraksi Outa.nol memiliki aktivitas antimalaria yang tinggi. Nilai IC50 ekstrak teh hijau sebesar 6,38 !Jg/ml; fraksi etil asetat teh hijau 3,26 !Jg/ml, fraksi butanol teh hijau 10,72 !Jg/ml, fiaksi air teh hijau 0,000 IJg/ml.
Senyawa flavonoid teh yang memiliki aktivitas
anfunalaria adalah GC, kuersetin, kaempferol, asam galat. Nilai IC50 EGC sebesar 98,14 pM/ml; CG sebesar 188,09 IJM/ml, GC 0,319 IJM/ml; kuersetin 0,058 IJM/ml; kaempferol 0,018 !JMiml, GA sebesar 0,085 IJM/ml dan artemesinin sebesar 0,000 pM/ml. Kombinasi fraksi teh, senyawa flavonoid dan artemesinin meningkatkan daya antimalaria. Nilai IC50 kombinasi artemesinin + fraksi etil asetat sebesar 0,036 IJM/ml, kombinasi GC+ artemesinin dan EC+artemesinin sangat aktif, tahap I tidak bisa ditentukan nilai IC50 sehingga perlu pengulangan menggunakan konsentrasi tahap II sebingga diperoleh nilai IC50 GC+artemesinin sebesar 0,005 llg/ml dan nilai IC50 EC+artemesinin sebesar 0,000244 11g/ml. Ekstrak teh hijau paling lengkap mengandung senyawa standar Epikatekin (EC), Gallic Acid (GA), Gallocatechin (GC), Catechin Gallate (CG), Gallocatechin gallate (GCG), Epigallocatechin (EGC), Epicatechin gallate {ECG), Epicatechin gallate (EGCG), Catechin (C), kaempferol, mirisetin, kuersetin). Fraksi air tidak mengandung senyawa-senyawa standar (EC, GA, GC, CG, GCG, EGC, ECG, EGCG, C, kaempferol, mirisetin, kuersetin). Terima kasih dan rasa hormat
tim
peneliti sampaikan kepada Risbin Iptekdok
20 l lDepartemen Kesehatan RI, Kepala Lembaga Penelitian, Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha Bandung yang telah memberikan pembinaan selama ini. Akhimya tim peneliti sampaikan ucapan terima kasih kepada para peneliti yang terlibat dalam penelitian ini. Kiranya penelitian ini dapat memberikan manfaat yang besar terhadap perkembangan ilmu di Indonesia serta dapat bermanfaat dalam pencegahan dan penghambatan penyakit malaria.
11
DAFTARISI �GKASAN EKSEKUTIF ................ .................................................................. ............. i
'X:3ta Pengantar·...................................................................................................................... ii
:t.\FfAR ISI ...................................................................................................................... iii ::l.AFTAR GAMBAR............................ .................................................................. .. .............v
::::>AFTAR TABEL ............................................................................................................. vi
::::>AFTAR LAMPJRAN ................................................................................................... vii
3AB I
.......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .......... . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .
I
.:?Et-lDAHULU AN ................................................................................................................1 1.1. Latar belakang ...........................................................................................................1 �JAUAN PUSTAKA ......................................................................................................5 3.1. Malaria ......................................................................................................................5 3.3 Siklus llidup Plasmodium ..........................................................................................8 3.4 Siklus pada manusia ................................................................................................... 9 3.5 Siklus pada Nyamuk Anopheles Betina ...................................................................9 3.6 Patogenesis Malaria ................................................................................................ lO 3.7 Stres Oksidatif pada Malaria .................................................................................. 12
3.8 Pe nurunan konsentrasi antioksidan pada malaria .................................................... 13 3AB III ................. ..... ........................... .............................................................................. 15 -=unJAN DAN MANFAAT PENELITIAN ..................................................................... 15 2.1. Tujuan umumpenelitian ........................................................................................... 15 2.2. Tujuan khusus penelitian: ....................................................................................... 15
3AB IV .................................................. ............................................................................. 17 �ODE PENELITIAN ..................... .......... .................................................................... 17 4.1. Bahan dan alat penelitian ........... ............................................................... ............... 17 4.2. Tempat penelitian ........................................................................................ .. .......... 18 4.3. Tahap penelitian....................................................................... ...............................18 4.3. 1.
Determinasi tanaman teh
............
. .. ..
...
. ..... ... ..
..
...
. .. . . .... .... .
.
.
.
.
....
... . .. ..... . ..18 ..
..
.
..
..
4.3.2. Analisis proksimat ............................................................................................18 4.3.3. Ekstraksi, fraksionasi teh hijau ........................................................................ 20 3.3.4. Analisis ekstrak:, fraksi-fraksi teh hijau menggunakan HPLC..........................22 3.3.5. Uji fitokimia..................................................................................................... 23 4.3.6. Uji antimalaria secara
in vitro
..
.
. . . . . . . . . . . .................
..
............
.
..........................
..25
4.3.6.1. Pembuatan Medium untuk Kepentingan Kultur Plasrnodium .................. 25 4.3.6.2. Penyediaan Serum ................................................................................... 26 4.3.6.3. Penyediaan Eritrosit Segar untuk Kultur .................................................. 26 4.3.6.4. Pembuatan Larutan NaC1 3,5% (NaCl llipertonik) ................................. 27 4.3.6.5.
Thawing Kultur P. falciparum Beku ........................................................27
4.3.6.6. Pemeliharaan Kultur P. falciparum . .... ... . . . ..
..
..
..
.
.......
..
.....
.
. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
. 28 .
4.3.6.7. Menentukan IC50 Artemisinin..................................................................28 4.4. Diagram penelitian.................................................................................................. 29 4.4.1. Diagram alir ekstraksi maserasi ....................................................................... 29 4.4.2. Diagram alir fraksionasi ..................................................................................30 4.4 .3. Diagram alir uji antimalaria ............................................................................. 31 BAB V ......................... ....................................................................... .................... ........... 32 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................................32 5.1. Hasil penelitian .................... ...................................................................................32 5. 1. 1 Determinasi tanaman ........... ............................................................................32 l1l
5.1.2. Analisis proksimat ·teh
............
.
.
.....
.................................
5.1.3. Rendemen ekstrak, fraksi -fraksi teh 5 .1.4. Uj i aktivitas antimalaria
.
.................... .. . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .............. . ....
..32 33
. ...... . . . .
34
. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. ... . . . . . . . . . . . . . . . ............ . . . . . . . . . . . . . .
5. 1.5. Uji kadar senyawa menggunakan HPLC
..............
.
. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
5.1.6. Uji fitokimia
. . ............ . .................................. . ....... . . . . . . . . . . .. ........... . ......... . ..........
:abe1 5.10. Data uji fitokimia ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau 52. Pembahasan
........... . ... . ......... . . . . . . . . .. .........
5.2.1. Analisis proksimat 5.2.2. Aktivitas antimalaria
. .. . . . . . . . .. . . ..
......
3...413 VI :KESIMPULAN DAN SARAN 6.1. Kesimpulan . 6.2. Saran XAPAN 1'ERIMAKASIH ::JAFTAR PUSTAKA . 3AB VIII . .
.
.
.. ....... .. . . . . ... . .
.
. . . . . . . . . .......................
...... . ... . . . . . .. . . .......
. .. .
..
............ . ............................................ . . . . . .
. . . . . . . .. . . . .
37 37
.. . . . . . . . . .
.. . . . . . . .
. .
38
..
38
..........
..........
.
...................... . . . . . . . . . . . . . . . . ... .......... . .... . . . . . . . . . . .
38 39 41
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . .
. . ..........
................. . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . .. ......... . ..... ......
. .............
. . . .. . . . . . . . . . . . . .
::::...AMPIRAN
.
.
.. .
..
.
..
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... ... . ......... . . . . . . . .
.
. . . . ............. ... ... .
............. .....
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. ..............
.. ............... . .. . ... . . ......................... . ...
.......
....
. ..... . ...
. ...... . ... ............ .
. .. ..
. . . . . . . . ... .. . . ........
...
.
. ..
.
. . . . . . . . . . .. .
. . . . . .. ...... . . .. .....
....... ...............
................... . . . . . . . . . . . .
.. . . . . .
41
41 41
......... . ..........
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . .... ..... ........
. . . . . . ... ....... ........ . .. . . . . ... . . . . . . . . . . . .. . . .. ... . ........... . ... ........
HALAMAN PENGESAHAN
.. .... ..
.
.. . ...... .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . ..
. ..
.
..
.
.
..
................
42 44
. . . ........
47
.
..........
.
.... .. . . . .
.. . . . . . . . . .
47
63
IV
' .
DAFTAR GAMBAR . &.unbar 3.1 Ring trophozoites ofP. falciparum 3ambar 3.2. Macrogametocyte ofP. falciparum Gambar 3.3 Siklus hidup Plasmodium (CDC, 2009) .. . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..........................
............
..
.......
........
...
.
. . . . . . . . . . ..................... . . . . . . . . . . . .
�. . . . . . . . .
...........
.
...................
.. 8 .
..
Gambar 4.1. Metode fraksionasi
........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..................
3ambar 4.2. Diagram alir pembuatan ekstrak teh hijau metode maserasi . Gambar 4.3. Diagram alir fraksionasi teh hijau 3ambar 4 .4 . Diagram alir uji antimalaria
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .
.....................
.
....
. ..... .
.. .
6 7
22
29 30 . 31
. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . .............
.
..............
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
v
DAFTAR TABEL abel5.1. Analisis proksimat teh hijau dan teh hitam ......................................................32 :'abel5.2. Hasil destilasi pelarut ........................................................................................33 -:abel5.3. Rendemen ekstrak etanol teh hijau .................................................................. .33 :'abel 5.4. Rendemen fraksi-fraksi teh hijau . . . .. . �. ,34 :'abel5.5. Penghambatan Paracetimia ekstrak, fraksi, senyawa-senyawa teh ...............34 :'abel 5.6. Penghambatan Paracetimia senyawa-senyawa teh ........................................35 :'abel5.7a. Penghambatan Paracetimia kombinasi senyawa teh dan artemesinin .......... 35 :-abel 5.7b. Penghambatan Paracetimia kombinasi senyawa teh dan artemesinin (%) 35 :'abel5.8a. Aktivitas antimalaria kombinasi fraksi/senyawa aktif dan artemisinin ..........36 Tabel5.8b. Aktivitas antimalaria kombinasi fraksi/senyawa aktif dan artemisinin .......... 36 abel 5.9. Hasil uji High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ........................37 :-abel8.1. Gambar hasil koromatogram senyawa standar .................................................4 7 :'abel8.2. Penghambatan senyawa flavonoid teh, ekstrak, fraksi-fraksi teh terhadap P l1/ciparum 55 :'abel 8.3. Penghambatan kombinasi Artemisinin + Fraksi etil asetat Teh hijau terhadap58 i?. falciparum ...................................................................................................................... 58 �abel8.4. Penghambatan kombinasi Artemisinin + gallocatechin (GC) terhadap ...........58 ?. falciparum ...................................................................................................................... 58 :'abel8.5. Penghambatan kombinasi Artemisinin + Epicatechin (EC) terhadap .............. 58 ?. falciparum ...................................................................................................................... 58 :'abel8.6. Penghambatan kombinasi Artemisinin + Gallocatechin (GC) terhadap ..........59 P. f:alciparum pada konsentrasi lebih rendah ..................................................................... 59 :'abel8.7. Penghambatan kombinasi Artemisinin + Epicatechin (EC) terhadap ..............59 ';). falciparum pada konsentrasi lebih rendah ..................................................................... 59 ..
.....
...
...............
.........
................ . . . . . . . . . . .
..
.
. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .......
Vl
DAFTAR LAMPIRAN IL:mpiran 1 . Data kromatogram senyawa standar teh .
. .. . . .47 L.:IIlpiran 2 . Data kromatogram ekstrak etanol teh hijau (4,2 mg)...................................50 l::mpiran 3. Data kromatogram fraksi heksan teh hijau (7,2 mg) � . . . 51 .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...........
...
.
...
...
......
....................
....
.....
...
Lzmpiran 4. Data kromatogram fraksi etil asetat teh hijau (22,6 mg).............................. 5 2 L!mpiran 5 . Data kromatogram fraksi butanol teh hijau (38,8 mg) ................................ .53 !...mlpiran 7 . Data kromatogram fraksi air teh hijau (38,8 mg).........................................54 . -L.:IBlptran 55 as1·1 UJI aktiVItas antlm . alana 8 H ..
.
.
.
. . . . . . . . . . . ............ . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
::.mnpiran 9 : Hasil uji aktivitas antimalaria kombinasi.................................................... 58 :.mnpiran 10: Permasalahan dan penyelesaian telmis selama penelitian..........................59
Vll
BABI PENDAHULUAN 1.1. Latar belakang Malaria merupakan penyakit infeksi parasitik yang penting di dunia (Na Bangchiang and Congpuong, 2007) karena 2/3 penduduk dunia tinggal di daerah endemik malaria dan diperkirakan dengan adanya dampak pemanasan global, proporsi ini akan meningkat menjadi
%
pada tahun 2010 (CIFOR, 2006).
Penyakit malaria hingga saat ini masih merupakan masalah di negara-negara tropis, negara yang sedang berkembang termasuk Indonesia . Penyakit malaria menewaskan lebih dari sejuta orang di seluruh dunia setiap tahun, Berdasarkan Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) Departemen Kesehatan tahun 200 1, setiap tahun di Indonesia terdapat sekitar 15 juta penderita malaria klinis yang mengakibatkan 30.000 orang meninggal dunia. Di Indonesia malaria merupakan penyakit endemik di berbagai daerah. Di seluruh dunia terdapat kasus-kasus malaria sebanyak 300 sampai 500 juta per tahun dengan angka kematian mencapai 1,5-2,7 juta per tahun (Trigg and Kondrachine, 1998) dan terdapat hampir di 100 negara terutama negara tropik yang merupakan 40 % penduduk dunia. Malaria membunuh 1 anak setiap 30 detik serta membunuh 3000 anak usia
<
5 tahun per
hari (Gordi, 2001; WHO, 2008). Malaria ditularkan melalui gigitan nyamuk Anopheles betina. Dari sekitar 400 spesies nyamuk Anopheles telah ditemukan 67 spesies yang dapat menularkan malaria dan 24 diantaranya ditemukan di Indonesia. Selain oleh gigitan nyamuk, malaria dapat ditularkan secara langsung melalui transfus.i darah, transplantasi organ, atau jarum suntik yang telah terkontaminasi Plasmodium atau dari ibu hamil yang sedang menderita malaria kepada bayinya (Gunawan, 2000). Pada
waktu nyamuk Anopheles infektif menghisap darah manusta,
sporozoit yang berada dalam kelenjar liur nyamuk akan masuk ke dalam peredaran darah selama lebih kurang 30 menit Setelah itu sporozoit akan masuk ke dalam sel hati dan menjadi tropozoit hati. Kemudian berkembang menjadi skizon hati yang terdiri dari 10.000 sampai 30.000 merozoit hati. Siklus ini disebut siklus eksoeritrositer yang berlangsung selama lebih kurang 2 minggu. 1
Pada
Plasmodium vivax dan Plasmodium ovate, sebagian tropozoit hati tidak
langsoog berkembang menjadi skizon, tetapi ada yang menjadi bentuk donnan yang disebut hipnozoit. Hipnozoit tersebut dapat tinggal di dalam sel hati selama berbulan-bulan sampai bertahun-tahun. Pada suatu saat hila imunitas tubuh menurun, akan menjadi aktif sehingga dapat menimbulkan relaps/ kambuh
2000). Patogenesis malaria akibat dari interaksi kompleks antara
(Nugroho,
parasit, inang dan lingkungan. sehingga
menyebabkan anemia.
parasitemia,
hal
ini
Skizogoni
menyebabkan kerusakan eritrosit
Beratnya
menunjukkan
anemia
adanya
tidak sebanding
kelainan
eritrosit
dengan
selain
yang
mengandung parasit. Diduga terdapat toksin malaria yang menyebabkan gangguan fungsi eritrosit
dan sebagian eritrosit pecah saat melalui limpa sehingga parasit
keluar. Faktor lain yang menyebabkan anemia mungkin karena terbentuknya antibodi terhadap eritrosit. Sel darah merah yang terinfeksi parasit atau parasitized
red blood cell
(pRBC) akan menstimulasi respon imun tubuh manusia sehingga set (Thl) memproduksi menghasilkan
T helper 1
Interferon-y (IFN-y). IFN-y menstimulasi makrofag untuk
Tumor Necrosis Factor-a (TNF-a).
meningkatkan ekspresi reseptor sel endotel otak
Produksi
TNF-a
akan
(brain endothelial cell) seperti
intercellular adhesion mo/ecu/e-1 (IC AM-1 ). ICAM-1 akan berikatan dengan Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein-] (PtEMP-1) yang terdapat pada permukaan pRBC dan menyebabkan cytoadherence pRBC dengan sel endotel otak.
Cytoadherence tersebut dapat menyebabkan obstruksi pembuluh
darah otak, iskemia, dan malaria otak (Lou et pembentukan radikal bebas
a/., 2001 ). TNF-a juga menstimulasi
nitric oxide (N O ) dengan bantuan enzim inducible
nitric oxide synthase atau iNOS (Wiser, 2008). P. falciparum, sebagai penyebab morbiditas dan mortalitas pada malaria, yang
resisten
terhadap
banyak
obat
antimalaria
selain
klorokuin
seperti:
sulfadoksin-pirimetamin, meflokuin, halofantin, dan kinin juga berlangsung terus dan menjadi ekstensif tennasuk di Indonesia yang memiliki banyak daerah endemik malaria (CDC, Syafmddin
2004; Bangun et al.., 2006; Syafruddin et a!.., 2005;
et a/.., 2007). Untuk mengatasi kasus resistensi ini, WHO
2
menganjurkan pemakaian ACT
(artemisinin based combination therapy) (WHO,
2006). Akan tetapi artem isinin merupakan suatu free karena
artemisinin
adalah
senyawa
radical producing antimalaria
endoperoksida
endoperoksida) (Bruneton, 1999; Tommunphean
siklik
(seskuisterpen
et al . , 2000). Radikal bebas .
yang juga diproduksi oleh respon imun inang dan oleh parasitnya, akan menyebabkan pen urunan konsentrasi antioksidan dalam plasma (Metzger 2001; Akpotuzor
et a/
..
et al . , 2007) dan mengakibatkan kelainan patologik jaringan .
inang misalnya kerusakan pada permukaan endotel pembuluh darah selama menderita malaria seperti pada malaria otak (Postma et al., 1996). Pada masa eradikasi malaria setengah abad yang lalu, malaria berhasil dieliminasi atau ditekan dengan efektif pada banyak bagian di dunia te rutama pada daerah subtropik. Sekarang penyakit ini muncul lagi pada daerah yang tadinya sudah bebas malaria. Hal ini terjadi karena adanya resistensi parasitnya terhadap obat malaria (Na-Bangchiang and Congpuong, 2007). Oleh karena itu perlu dicari obat lain dengan bahan yang murah dan mudah didapatkan.
Teh
epikatekin
hijau
(EC),
merupakan
sumber
epikatekin3-galat
epigalokatekin3-galat (EGCG) (Sarro
senyawa
(ECG),
flavonoid
antara lain
epigalokatekin
(EGC),
et al.; 2001; USDA, 2003; Henning et al. , .
2004; Wolfram, 2007), ekstrak teh hijau memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi (Widowati et al., 20 10), golongan katekin galat yaitu epikatekin galat (ECG) dan epigalokatekin galat (EGCG) dapat menghambat
P. falciparum strain
NF54, Kl dan 3D7 dengan IC50 sebesar 10-40 � sedangkan golongan katekin non galat kurang aktif dalam menghambat 100-300 f.1M
(Slavic
P. falciparum dengan IC50 sebesar
et a! . , 2009). EGCG bekerja dengan menginhibisi .
transportasi D-glukosa oleh GLUT I dan PfliT
(Plasmodium falciparum hexose
transporter) dan transportasi D-fruktosa oleh GLUTS.
(Slavic
et a/ . ,2009). .
Golongan senyawa katekin galat (EGCG, EGC, ECG) dan katekin non galat (EC, katekin) termasuk kelompok senyawa flavan-3-ol , golongan senyawa flavonoid (Harbome, 1997; USDA, 2003).
3
Golongan katekin galat maupun katekin non-galat terdapat dalam teh hijau. Golongan senyawa flavonoid terdapat pada berbagai fraksi-fraksi yaitu fraksi etil asetat, fraksi butanol dan fraksi air. Golongan senyawa yang terdapat pada fraksi heksana adalah
senyawa-senyawa non-polar
yang
mengandung
senyawa
hidrokarbon (CH), senyawa pada fraksi etil asetat bersifat semi-polar adalah senyawa yang mengandung unsur hidrokarbon (CH) dan mengandung unsur oksigen (0), sedangkan senyawa yang terdapat pada fraksi butanol bersifat polar adalah senyawa yang mengandung unsur hidrokarbon (CH) dan mengandung unsur oksigen (0) semakin banyak, senyawa yang terdapat pada fraksi air bersifat sangat polar adalah senyawa yang mengandung unsur hidrokarbon (CH) dan mengandung unsur oksigen (0) sangat banyak serta sangat sulit diuapkan karena
merniliki ikatan dengan hidrogen yang sangat kuat (Harborne, 1987). Golongan senyawa dapat dikelompokkan berdasarkan tingkat polaritasnya yaitu dari non
polar sampai sangat polar, sehingga akan mempengaruhi sifat bioaktivitas. Berdasarkan polaritas senyawa
yang dapat mempengaruhi aktivitas senyawa
tersebut maka penelitian pencarian golongan senyawa aktif antimalariadari teh hijau perlu dilakukan pada ekstrak etanol dan fraksi-fraksi teh hijau meliputi fraksi heksana, etil asetat, butanol dan air. Sehingga penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak dan fraksi-fraksi (heksana, etil asetat, butanol dan air) teh hijau dalam mangatasi penyakit malaria secara in vitro dibandingkan obat antimalaria artemisinin serta senyawa murni asal teh EGCG yang telah terbukti memiliki al'tivitas antimalaria dengan menentukan nilai IC so pada kultur P. fa/ciparum. Diharapkan pada penelitian ini dapat ditentukan ekstrak atau fraksi aktif yang memiliki aktivitas antimalaria secara in vitro yang dapat dilanjutkan pengujian aktivitas antimalaria secara in vivo dan artemisinin dalam mengobati penyakit malaria
4
BABll TINJAUAN PUSTAKA 3.1. Malaria Malaria adalah intraseluler dari
suatu penyakit yang disebabkan oleh protozoa obligat
kingdom Protista, phylum Apicomplexa, class Aconoidasida,
order Haemosporida, family Plasmodiidae, genus Plasmodium. Malaria pada manusia dapat disebabkan oleh
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,
Plasmodium malariae, dan Plasmodium ova/e. Dari keempat jenis Plasmodium tersebut,
Plasmodium
falciparum
adalah
penyebab
malaria
yang
mematikan (WHO, 2007). Malaria ditularkan melalui gigitan nyamuk betina. Dari sekitar 400 spesies nyamuk
paling
Anopheles
Anopheles telah ditemukan 67 spesies
yang dapat menularkan malaria dan 24 diantaranya ditemukan di Indonesia. Selain oleh gigitan nyamuk, malaria dapat ditularkan secara langsung melalui transfusi darah,
transplantasi
organ,
atau jarum
suntik
yang
telah
terkontaminasi
Plasmodium atau dari ibu hamil yang sedang menderita malaria kepada bayinya (Gunawan, 2000). Penyebaran malaria ditentukan oleh faktor iklim kelembaban, dan
seperti temperatur,
curah hujan. Malaria ditularkan di daerah tropis dan subtropis
dimana nyamuk anopheles dapat bertahan hidup
dan berkembang biak sehingga
parasit malaria dapat melengkapi siklus hidupnya di dalam tubuh nyamuk (masa inkubasi intrinsik). Temperatur merupakan faktor terpenting. Pada suhu di bawah 20°C, masa inkubasi ekstrinsik dari P. Falciparum terganggu sehingga tidak dapat ditransmisikan. Transmisi tertinggi ditemukan di Afrika subSahara (CDC, 2004). Kurang lebih 40% populasi dunia hidup di daerah endemis malaria, misalnya Afrika, Asia, Tirnur Tengah, Amerika Tengah dan Selatan. Setiap tahun Iebih
dari
500 juta orang terkena malaria (WHO, 2008) dan lebih dari satu juta orang meninggal karena malaria terutama anak-anak di daerah Afrika sub-Sahara. Pada tahun 2002, malaria merupakan penyebab kematian anak nomor
4 di negara
berkembang. Malaria menyebabkan 10,7% dari total kematian anak di negara berkembang (CDC, 2007).
5
Penyakit malaria hingga saat ini masih merupakan masalah di negara-negara tropis, negara yang sedang berkembang termasuk Indonesia. Penyakit malaria telah menewaskan lebih dari sejuta orang di seluruh dunia setiap tahun,
Berdasarkan Sutvei_ Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) Departemen Kesehatan tahun 2001, setiap tahun di Indonesia terdapat sekitar 15 juta penderita malaria klinis yang mengakibatkan 30.000 orang meninggal dunia, mengenai tingginya kasus penyakit yang disebabkan oleh Malaria tersebut, manjadi bagian dari isu strategis yang 'perlu dicari solusinya (DepKes 2001).
2.2 Plasmodium falciparum Pada sediaan darah tepi sering ditemukan stadium ring dan gametosit, karena stadium yang lain melekat di endotel alat dalam. Pada sediaan darah tipis terlihat eritrosit yang terinfeksi Plasmodiwn falciparum tidak membesar. Dalam eritrosit terdapat titik kasar berwarna merah yaitu titik Maurer. Stadium trofozoit muda terdapat gumpalan pigmen be rwama hitam. Sedangkan pada sediaan darah tebal sekitar Plasmodium tidak ada zona merah.
A
B
Gambar 3.1 Ring trophozoites ofP.falciparum A.Ring-form trophozoites of P. falciparum in a thin blood smear. (CDC,2009) B.Ring-form trophozoites in a thin blood smear, exhibiting Maurer's clefts.
6
c
D
Gambar 3.2. Macrogametocyte of P. falciparum C.Macrogametocyte of P.falciparum in a thin blood smear. D. Microgametocyte of P. falciparum in a thin blood smear. Pada sediaan darah tipis Plasmodium falcip arum stadium makrogametosit muda bentuk eritrosit oval dan lancip pada kedua ujung, inti merah kompak di tengah, sitoplasma berwarna merah kebiruan dan banyak pigmen tersebar di sekitar inti, sedngkan sediaan
darah tipis Plasmodium falciparum stadium
makrogametosit tua bentuk eritrosit mengikuti bentuk parasite seperti 'sosis', sitoplasma berwama keboiruan, inti merah kompak di tengah dan banyak pigmen tersebar di sekitar inti. Pada sediaan darah tipis Plasmodium falciparum stadium mikrogametosit muda bentuk eritrosit memanjang mengikuti bentuk parasit, yaitu oval dan lancip pada kedua ujung. Inti merah difus ditengah, sitoplasma berwarna biru kemerahan dan banyak pigmen tersebar sekitar inti, sedangkan stadium mikrogametosit tua bentuk eritrosit mengikuti bentuk parasite seperti "sosis". Inti merah difus di tengah, sitoplasma berwarna kemerahan dan banyak pigmen tersebar di sekitar inti
7
3.3
Siklus Hidup Plasmodium Siklus hidup Plasmodium terdiri dari siklus seksual (sporogoni) yang
berlangsung pada nyamuk Anopheles dan siklus aseksual ( skizogoni) yang berlangsung pada manusia. Siklus aseksual dibagi menjadi 2 stadium: stadium eritrositer dalam eritrosit (erythrocytic schizogony) dan stadium ekso-eritrositer dalam
hepatosit
(exo-erythrocytic
schizogony).
Plasmodium
vivax
dan
Plasmodium ovale mempunyai 2 stadium ekso-eritrositer yaitu stadium ekso eritrositer primer (pra-eritrositik dini) dan stadium ekso-eritrositer sekunder (pra eritrositik lambat atau hipnozoit), sedangkan Plasmodium falciparum dan Plasmodium malariae hanya mempunyai 1 stadium ekso-eritrositer (Nugroho, 2000). A" rnredrvc s� A� Oi&giiOSIC SUtge
Gam bar 3.3 Siklus hidup Plasmodium (CDC, 2009)
8
3.4 Siklus pada manusia Pada
waktu
nyamuk
Anopheles infektif menghi sap darah manusia,
sporozoit yang berada dalam kelenjar liur nyamuk akan masuk ke dalam peredaran
darah selama lebih kurang 30 menit. Setelah itu sporozoit akan masuk
ke dalam sel hati dan menjadi tropozoit hati. Kemudian berkembang menjadi
skizon hati yang terdiri dari 10.000 sampai 30.000 merozoit hati. Siklus
ini
disebut siklus eksoeritrositer yang berlangsung selama lebih kurang 2 minggu.
Pada Plasmodium vivax dan Plasmodium ovate, sebagian tropozoit hati tidak langsung berkembang menjadi skizon, tetapi
ada yang menjadi bentuk dorman
yang disebut hipnozoit. Hipnozoit tersebut dapat tinggal di dalam sel hati selama berbulan-bulan sampai bertahun-tahun. Pada suatu saat hila imunitas tubuh menurun, akan menjadi
aktif sehingga dapat menimbulkan relaps/ kambuh
(Nugroho, 2000). Merozoit yang berasal dari skizon hati yang pecah akan masuk ke dalam peredaran darah
dan menginfeksi sel darah merah. Di dalam sel darah merah,
parasit tersebut berkembang dari stadium tropozoit sampai skizon
(8 sampai 30
merozoit). Proses perkembangan aseksual ini disebut skizogoni. Selanjutnya eritrosit yang terinfeksi
(skizon) pecah
menginfeksi sel darah merah lainnya.
dan merozoit yang
keluar
akan
Siklus ini disebut siklus eritrositer
(Nugroho, 2000). Setelah 2 sampai 3 siklus skizogoni darah, sebagian merozoit yang menginfeksi sel darah merah
dan membentuk stadium seksual yaitu gametosit
jantan dan betina (Nugroho, 2000).
3.5 Siklus pada Nyamuk Anopheles Betina Apabila nyamuk Anopheles betina menghisap darah yang mengandung gametosit, pembuahan
di
dalam tubuh nyamuk,
menjadi
zigot.
garnet jantan dan betina melakukan
Zigot berkembang
menjadi
ookinet
kemudian
menembus dinding lambung nyamuk. Pada dinding luar lambung nyamuk ookinet akan menjadi ookista
dan selanjutnya menjadi sporozoit. Sporozoit ini akan
bersifat infektif dan siap ditularkan ke manusia (Nugroho, 2000).
9
Masa inkubasi adalah rentang waktu sejak sporozoit masuk sampai timbulnya gejala klinis yang ditandai dengan demam. Masa·inkubasi bervariasi tergantung spesies Plasmodium. Sedangkan masa prepaten adalah rentang waktu sejak sporozoit masuk sampai parasit dapat dideteksi dalam darah dengan pemeriksaan mikroskopik (Nugroho, 2000). 3.6
Patogenesis Malaria
Patogenesis malaria akibat dari interaksi kompleks antara parasit, inang dan lingkungan. Skizogoni menyebabkan kerusakan eritrosit sehingga menyebabkan anemia. Beratnya anemia tidak sebanding dengan parasitemia,
hal
ini
menunjukkan adanya kelainan eritrosit selain y3:ng mengandung parasit. Diduga terdapat toksin malaria yang menyebabkan gangguan fungsi eritrosit dan sebagian eritrosit pecah saat melalui limpa sehingga parasit keluar. Faktor lain yang menyebabkan anemia mungkin karena terbentuknya antibodi terhadap eritrosit. Limpa mengalami pembesaran dan pembendungan serta pigmentasi sehingga mudah pecah. Dalam lirnpa dijumpai banyak parasit dalam makrofag dan
sering terjadi fagositosis dari eritrosit yang terinfeksi maupun yang tidak
terinfeksi. Pada malaria kronis teljadi hiperplasi dari retikulum disertai peningkatan makrofag (Rarnpengan., 2000). Pada malaria berat, mekanisme patogenesisnya berkaitan dengan invasi merozoit ke dalam eritrosit sehingga menyebabkan eritrosit yang mengandung parasit
mengalami
perubahan
struktur
dan
biomolekuler
sel
untuk
mempertahankan kehidupan parasit. Perubahan tersebut meliputi mekanisme transpor membran sel, penurunan deformabilitas, pembentukan knob, ekspresi varian non antigen di permukaan sel, cytoadherence, sekuestrasi dan rosetting, peranan sitokin dan nitric oxide atau NO. Cytoadherence adalah peristiwa perlekatan eritrosit yang telah terinfeksi
Plasmodium falciparum pada reseptor di bagian endotelium venula dan kapiler. Selain itu eritrosit juga dapat melekat pada eritrosit yang tidak terinfeksi sehingga terbentuk rosette.
10
Cyto adherence menyebabkan eritrosit matur tidak beredar kembali dalam sirkulasi. Parasit dalam eritrosit matur yang tinggal dalam jaringan mikrovaskuler disebut eritrosit matur yang mengalami sekuestrasi. Hanya Plasmodium
falciparum yang mengalami sekuestrasi, karena pada Plasmodium lainnya seluruh siklus terjadi pada pembuluh darah perifer. Sekuestrasi terjadi pada orgarr-organ vital dan hampir semua jaringan dalam tubuh. Sekustrasi tertinggi terdapat di otak, diikuti dengan hepar dan ginjal, paru, jantung dan usus. Sekuestrasi ini memegang peranan utama dalam patofisiologi malaria berat.
Rosseting adalah suatu fenomena perlekatan antara satu buah eritrosit yang mengandung merozoit matang yang di selubungi oleh sekitar 10 atau lebih eritrosit non parasit sehingga berbentuk: seperti bunga Rosseting menyebabkan obstruksi aliran darah lokal atau dalam jaringan sehingga mempermudah terjadinya cytoadherence (Harijanto, 2000). Sel darah merah yang terinfeksi parasit atau parasitized red blood cell (pRBC) akan menstimulasi respon imun tubuh manusia sehingga sel T helper 1 (Th1) memproduks.i Interferon-"{ (IFN-y). . IFN-y menstimulasi makrofag untuk menghasilkan Tumor Necrosis Factor-a. (TNF-a.). Produksi TNF-a. akan meningkatkan ekspresi reseptor se] endotel otak (brain endothelial cell) seperti
intercellular adhesion molecule-] (ICAM-1). ICAM-1 akan berikatan dengan Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein-] (PtEMP-1) yang terdapat pada permukaan pRBC dan menyebabkan cytoadherence pRBC dengan sel endotel otak. Cytoadherence tersebut dapat menyebabkan obstruksi pembuluh darah otak, iskemia, dan malaria otak (Lou et al., 2001). TNF-a.juga menstimulasi pembentukan radikal bebas nitric oxide (NO) dengan bantuan enzim inducible nitric oxide synthase atau iNOS (Wiser, 2008). Radikal bebas dapat menyebabkan
cytoadherence bertambah banyak sehi ngga akan memicu makrofag untuk: menghasilkan TNF-a.. Peningkatan kadar TNF-a. ini akan meningkatkan kadar ICAM-1 (Pino et a!., 2003).
11
3.7
Stres Oksidatif pada Malaria Penderita malaria akan mengalami stress oksidatif. Overproduksi radikal
bebas disebabkan karena proses yang terjadi dalam parasit maupun dalam inang (manusia). Dalam vakuola makanan parasit
:
oksi-ferro-Hb bereaksi dengan 02
menjadi anion superoksida dan methHb. Anion superoksida diubah oleh SOD menjadi H202. H202 diubah tioredoksin peroksidase menjadi air. Sebagaian H202 lolos dari peroksidasi ini dan akan rnasuk ke dalam sitosol parasit. Di lain pihak methHb dicema oleh enzim parasit menjadi globin (digunakan sebagai sumber asam amino untuk pertumbuhan parasit) dan heme yang toksik dan perlu dipolimerisasi menjadi hemozoin. Sebagian heme ini juga lotos dari polirnerisasi dan masuk ke dalarn sitosol parasit yang akhimya perlu didetoksifikasi dengan mengkonsurnsi GSH sehingga GSH dalam sitosol turun (Muller, 2004). Dalam mitokondria parasit : parasit mempunyai rantai respirasi yang aktif dalarn
mitokondria yang akan menghasilkan anion
superoksida.
Anion
superoksida diubah oleh SOD2 menjadi H202. H202 diubah oleh tioredoksin peroksidase menjadi air dengan ko-enzim Trx-red (tioredoksin treseduksi). Untuk mereduksi Trx-ox kembali diperlukan kompleks KADH [mitochondrial
c t
ketoacid dehydrogenase complexes (KADH)]. Sebagian H202 juga lolos dari peroksidasi ini dan masuk ke dalam sitosol parasit (MUller, 2004). Dalam sitosol parasit : terjadi penurnpukan H202 baik yang berasal dari vakuola makanan parasit maupun dari mitokondria parasit. H202 perlu diubah oleh enzim glutation S transferase dengan ko-enzim GSH (sehingga GSH berubah menjadi GSSG) menjadi air. Heme yang dieksport dari vakuola rnakanan parasit Juga
memerlukan GSH (yang kemudian berubah menjadi GSSG) untuk
didetoksifikasi sehingga dalam sitosol parasit terjadi penurnpukan GSSG. GSSG yang berlebih akan diekspor ke dalam sitosol eritrosit inang sehingga sekarang eritrosit inang akan mengalami ketidakseimbangan ratio GSH:GSSG dan terjadi mess oksidatifdalam eritrosit inang tersebut (Bozdechand and Ginsburg, 2004).
12
Obat
artemesinin
mempunyai struktur seskuiterpen laktdh yang di
dalamnya mengandung endoperoxide trioxane yang berkhasiat
H
Jl �timalaria
il "·
:� .
(Woodrow et a!.., 2005).
Stres oksidatif pada pemakaian artemisinin dapat disebabkan oleh karena: 1). Pemecahan gugus jembatan endoperoksida dalam reaksi yang dikatalisis oleh 2 Fe + pada heme yang menghasilkan suatu spesies radikal reaktif yang dapat memodifikasi bermacam-macam protein parasit serta merusak bermacam-macam membran parasit termasuk mitokondria, retikulum endoplasmik kasar, serta membran plasma sehingga membunuh parasit tersebut (Gordi, 2001); 2). Reaksi antara artemisinin dengan heme dalam hemoglobin lebih cepat dibandingkan dengan reaksi antara artemisinin dengan heme bebas. Setelah teijadi ikatan heme dalam hemoglobin dengan artemisinin akan terbentuk derivat artemisinin heme monoalkitasi (HA) atau derivat artemisinin heme dialkilasi (HAA) yang keduanya ini disebut dengan hemarts. Hemarts akan berkompetisi dengan heme bebas untuk berikatan dengan Plasmodium falciparum histidine rich protein II (PfHRP sehingga pembentukan hemozoin dihambat
dan
II)
parasit mati. Kematian parasit
juga disebabkan karena terciptanya lingkungan yang lebih bersifat reduktor sebagai akibat reaksi tersebut dan lingkungan tersebut bersifat tidak kondusif untuk terbentuknya hemozoin (Karman et al. ., 2005); 3). Artemisinin dalam
sitosol
berikatan dan menghambat SERCA (sarcoplasmic/ 2+ endoplasmic reticulum Ca -ATPase) sehingga mengganggu keseimbangan Plasmodium
konsentrasi ion kalsium yang mengakibatkan terhambatnya endositosis sitosol eritrosit oleh parasit tersebut. Selain itu, ikatan tersebut kemudian bergabung dengan heme termasuk heme yang terdapat dalam enzim rantai respirasi di m.itokondria parasit sehingga menyebabkan timbulnya radikal bebas Karbon yang akan merusak membran mitokondria, endoplasmik retikulum, serta membran pa.rasit (Golenser et al.. , 2006).
3'.8 Penurunan konsentrasi antioksidan pada malaria
Akhir-akhir ini penanganan malaria dilakukan dengan tanpa atau sedikit sekali pemberian antioksidan. Berdasarkan hasil studi yang mendapatkan keadaan
13
rendahnya kadar antioksidan pada anak-anak penderita malaria dibandingkan dengan anak-anak yang sehat, pemberian suplementasi mikronutrien seperti vitamin A, vitamin C, P. falciparum (Nmorsi
dan vitamin
E perlu diikutsertakan pada pengobatan infeksi
et al . , 2007). .
ROS juga terlibat dalam patologik jaringan inang misalnya kerusakan pada permukaan endotel pembuluh darah selama menderita malaria seperti pada malaria serebral (Postma et
al., 1996) dan
terjadinya sekuestrasi eritrosit yang
terinfeksi oleh stadium aseksual lanjut dalam kapiler dan venula jaringan-jaringan pada berbagai organ yang menyebabkan kerusakan organ tersebut (Becker
et al.,
2004). Neuropati toksik yang berupa neurodegenerasi batang otak sebagai akibat pemakaian artemisinin juga dapat disebabkan oleh stres oksidatif serta defisiensi antioksidan (Bowling and Beal,
1995� Schmuck et al., 2002).
Pemberian artemeter, derivat artemisinin yang lain, secara parenteral pada anak-anak Gambia penderita malaria serebral akan menyebabkan pemulihan koma
dan kejang yang lebih lama setelah terapi dibandingkan dengan kina (Manta,
1999).
14
BAB ID
TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
Penelitian selama 1 tahun meliputi
ekstraksi, fraksionasi teh hijau
dilanjutkan analisis HPLC menggunakan standard senyawa flavonoid teh meliputi Epigalokatekin galat (EGCG), katekin (C), katekin galat (CG), galokatekin (GC), epikatekin (EC), galokatekin galat (GCG), kaempferol, kuersetin, mirisetin.
3.1. Tujuan umum penelitian : 1). Mengetahui aktivitas antimalaria ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau secara in vitro dibandingkan senyawa flavonoid teh 2). Mengetahui efek potensiasi kombinasi ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau, senyawa flavonoid dan artemesinin dalam meningkatkan daya antimalaria 3). Mengetahui kadar senyawa flavonoid dalam ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau
3.2. Tujuan
khusus penelitian :
l) Memperoleh konsentrasi aktif ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau sebagai antimalaria secara in vitro (IC50) 2) Memperoleh konsentrasi aktif senyawa flavonoid teh hijau sebagai antimalaria secara in vitro (IC50) 3) Memperoleh
konsentrasi aktif kombinasi ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau,
senyawa flavonoid dan artemesinin sebagai antimalaria secara in vitro (IC50) 4) Mengetahui kandungan senyawa flavonoid dalam ekstrak, fraksi-fraksi teh
hijau.
15
3..3. Manfaat Teoritis Penelitian : Untuk menambah pengetahuan ekstrak, fraksi-fraksi dan senyawa flavonoid
teh hijau dan kombinasi
ekstrak, fraksi-fraksi , senyawa flavonoid teh hijau
dengan artemisiniil sebagai antimalaria secara invitro.
3.4. Manfaat Praktis Penelitian : Untuk. memberi infonnasi kepada masyarakat bahwa kombinasi teh hijau dan obat artemisinin dapat meningkatkan daya antimalaria.
16
BAB IV METODE PENELITIAN 4.1. Bahan dan alat penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian untuk bahan ekstrak, fraksi-fraksi
reb hijau adalah Teh produksi PT. Walini PTPN VIII yang diproduksi di Garut, Jawa Barat. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 96%, etanol 70%, aquadest, metanol HPLC grade, Dimethyl Sulfoksida (DMSO), butanol, heksan, etil asetat, -)-Epigallocatechin gallate (EGCG) (Biopurifyphytochemical), (-)-Epicatechin (ECG)
gallate
Cathecin
(Biopurifyphytochemical),
gallate
(CG)
(Biopurifyphytochemical), (-)-Epigallocatechin (EGC) (Biopurifyphytochemical), Epicatechin
(EC) (Biopurifyphytochemical),
(Biopurifyphytochemical),
Gallocathecin
Gallocatechin
(GC)
gallate
(GCG)
(Biopurifyphytochemical),
Cathecin (C) (Biopurifyphytochemical), Kaempferol (Sigma), Myricetin (Sigma), Quercetin (Sigma), Sodium phosphate dibasic (Na2HP04·7H20), Potassium phosphate monobasic (KH2P04), Sodium Chloride (NaCl), Potasium Chloride (KCl),
Gentamicin
(NaHC03),
Natrium
solution, korbonat
RPMI-1640 (Na2C03),
Medium,
Natrium
bikorbonat
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane
N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA), Artemisinin, asam sulfat pekat (Merck®), asarn
klorida 0,1 N (Merck®), kalium sulfat (Merck®), tembaga sulfat (Merck®),
asam
oksalat (Merck®), natrium hidroksida (Merck®), indikator bromkresol hijau
(Merck®) dan metil merah (Merck®), boraks (Merck®), aquadest, n-heksan (Merck®), aseton (Merck®), petroleum eter (Merck®) magnesium karbonat (Bratachem®), natrium sulfat (Bratachem®), Magnesium oksida (Merck®), hyflosupercel (Merck®), magnesium (Mg), HCl, Fe (liD klorida, asam
asetat
a.nlUdrat, vanilin, amil alkohol, kloroform, amonia, pereaksi Meyer, pereaksi Dragendorf. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, maserator, inkubator,
milcro plate 96-sumur, plate 24 well, plate 12 well, mikro-pipet,
stopwatch, thermometer, spektrofotometer, water-bath, beaker glass, botol kaca
17
steril, timbangan
analitik, spuit, tabung eppendorf, tabung vial 50 ml, penanggas
air, corong, labu ukur, batang pengaduk, gelas piala, mikroskop, Kjeldahl 150 mL; alat pemanas, Kj eldahl; alat distilasi Kjeldahl, alat soxhlet; pemanas listrik; oven; corong kaca; penangas air; kui; tanur listrik; eksikator; corong buchner, blender.
4.2. Tempat penelitian Penelitian dilaksanakan di
:
1 ).
Laboratorium Pusat Penelitian Ilmu
Kedokteran, Universitas Kristen Maranatha Bandung; 2). Lembaga Eijkman, Jakarta; 3). Laboratorium Herbarium, Biologi, Sekolah Tinggi llmu Hayati, Institut Teknologi Bandung;
4). Laboratorium Teknologi Pakan
.dan Nutrisi,
Universitas Padjadjaran, Jatinangor-Sumedang; Laboratorium Kimia Instrumen, Fak
MIPA, Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung; 5). Laboratorium
Farmakognosi
dan
Fitofarmaka,
Fakultas
Farmasi,
Universitas
Airlangga
Surabaya.
4.3. Tahap penelitian Penelitian diawali dengan ekstraksi , fraksionasi tanaman teh hijau.
4.3.1. Determinasi tanaman teh Untuk mengetahui secara jelas tanaman teh sebagai bahan baku teh hijau yang digunakan sebagai bahan ekstrak, fraksi teh hijau. Tanaman teh PTPN VIII di Garut yang memproduksi teh hijau. Determinasi
dari kebtm tanaman di
Laboratorium Herbarium-Biologi, Sekolah Tinggi llmu Hayati, Institur Teknologi Bandung.
4.3.2. Analisis
proksimat
Untuk mengetahui tingkat kekeringan teh hijau, serta kandungan metabolit primer yang terkandung dalam tanaman teh hijau
maka dilakukan analisis
proksimat teh hijau.
18
Kadar Abu Total ( Dry Ashing ) Penguk:uran kadar abu total dilakukan dengan metode drying ash. Sampel sebanyak
3
g ditimbang pada cawan yang sudah diketahui bobotnya. Lalu
diarangkan di atas nyala pembakaran dan diabukan dalam tanur pada suhu 550° C hingga pengabuan sempuma. Setelah itu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Perhitungan kadar abu dilakukan dengan membandingkan berat abu dan berat sampel dikali 100%.
Kadar Air Total ( Termogravimetri ) Pengukuran
kadar
air total dilakukan dengan metode termogravimetri
metode oven). Sampel sebanyak 2 g ditimbang pada cawan yang sudah diketahui bobotnya lalu dikeringkan pada oven suhu 105° C selama
3
jam. Setelah itu
didinginkan dalarn eksikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Perhitungan kadar air diperoleh dengan membandingkan bobot sarnpel sebelum dikeringkan dan bobot yang hilang setelah dikeringkan dikali 100%.
Kadar Lemak Total ( Soxhletasi ) Pengukuran kadar lemak total dilakukan dengan metode Soxhl etasi. Sampel ditimbang sebanyak 2 g, lalu dimasukkan ke dalam kertas saring
yang
dialasi
kapas. Kertas saring yang berisi sampel disurnbat dengan kapas, lalu dikeringkan. dalam oven pada suhu tidak lebih dari 80° C, ± 1 jam dan dimasukkan ke dalam alat Sokhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak berisi batu didih yang telah dikeringkan dan telah diketahui bobotnya. Setelah itu, diekstrak dengan pelarut petroleum eter selama lebih kurang 6 jam. Petroleum eter disulingkan dan ekstrak lemak dikeringkan dal am oven pada suhu l05°C. lalu didinginkan dan ditimbang hingga bobot tetap. Perhitungan kadar lemak dilakukan dengan membandingkan berat lemak dan berat sampel dikali 100%.
19
dar Protein Total ( Kjeldahl ) Pengukuran kadar abu total dilakukan dengan metod� Kjehdahl. Sampel g telah dihalusk an ditimbang 200-500 mg lalu dimasukkan ke dalam labu J:jeldahl. Ditambahkan I 0 mL asam sulfat pekat padat dan 5 g katalis (campuran TIS04 dan CuS04.5H20
8
:
1) lalu dilakukan destruksi (dalam lemari asam)
.:ingga cairan berwarna hijau jemih. Setelah dingin larutan tersebut diencerkan :.engan aquadest hingga 100 mL dalam labu ukur. Larutan tersebut dipipet 10 mL
=.an dimasukkan ke dalarn alat dist1lasi Kjeldahl lalu ditambah 10
mL NaOH 30%
:-ang telah dibakukan oleh larutan asam oksalat. Distilasi dijalankan selama lirakira 20 menit dan distilatnya
�
t ampung
::&utan HCl 0,1 N yang telah dtbakukan
�
��
la m erlenme er yang berisi 25 mL
�d, b
h boraks (uJung kondensor harus
tercelup ke dalam larutan HCl). Lalu kele ilian HCI dititrasi dengan larutan '"aOH 0,1 N dengan indikator campuran bromkresol hijau dan metil rnerah. Perhitungan kadar protein total dilakukan dengan perhitungan :
Kadar nitrogen (%) =
( V a . N a - Vb. Nb) x 1 4 x IOOi! O
w
x 1 00 %
Kadar Karbohidrat Total Pengukuran
kadar
karbohidrat
total
dalam
sampel
dihitung
berdasarkan
perhitungan (dalam %) :
% karbohidrat
=
100% - %(protein + lemak + abu + air)
4.3.3. Ekstraksi, fraksionasi teh hijau Teh hijau produksi Walini-PTPN VIII, Jawa barat dihaluskan menggunakan food precessor, teh diekstraksi
dengan etanol 96%, menggunakan metode
maserasi. Ekstraksi menggunakan teknik maserasi dengan pelarut etanol 96 % setiap 24 jam
filtrat etanol ditampung, sampai filtrat etanol tidak berwarna
20
.temudian filtrat etanol dilakukan evaporasi sampai diperoleh ekstrak etanol pekat xmentuk pasta. Ekstrak etanol
hasil
maserasi difrkasionasi menggunakan antara air dan n
.:.eksan (1 : 1). Filtrat fraksi n-heksan dikumpulkan, sedangkan fraksi air selanjutnya dipartisi dengan etil asetat (1 : 1), dan dengan n-butanol (1 : 1) dan :erakhir diperoleh filtrat fraksi air. Masing-masing filtrat dievaporasi diperoleh filtrat heksan, etil asetat, butanol dan fraksi air.
21
Ekstrak ethanol teh hijau n-heksana : air
1:1 :--.i.Jrs 1 l.:etsana
etil asetat :air
1:1
Fraksi :2 F. etil asetat
�-
Fraksi 3 F. butanol
Fraksi 4 F,. air
Gambar 4.1. Metode fraksionasi 4.3.4. Analisis ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau menggunakan HPLC Pertama-tama
dilakukan
persiapan
menggunakan milipore dengan membran merk WHAT�
fasa
gerak.
Metanol
Poly Tetra Fluoro Ethylene
disaring (PTFE,
dan air disaring menggunakan membran selulosa nitrat.
Didegasing selama 15 menit dengan maksud meniadakan gelembung udara yang mungkin mengganggu proses HPLC. Diletakkan dalam reservoir eluen HPLC. Alat HPLC disetimbangkan dalam kondisi analisis yang paling sesuai (kondisi optimum): fasa gerak metanol : air = mL/menit. Sesudah didapat standar
baseline
1
:1, fasa diam C-18 dengan laju alir 0,75
yang lurus, barn dapat diinjeksikan zat
dan sampel yang akan diperiksa. Sesudah didapat baseline yang lurus,
barn dapat diinjeksikan zat standar dan sampel yang akan diperiksa.Persiapan atau preparas1
zat
standar
zat
murm
meliputi
Epicatechin
(EC)
(Biopurifyphytochemical), Gallic Acid (GA) (Sigma Aldrich), Gallocatechin (GC) (Biopurifyphytochemical),
Catechin
gallate
(GC)
(Biopurifyphytochemical),
22
Gallocatechin gallate (GCG) (Biopurifyphytochemical), Epigallo catechin (ECG) (Biopurifyphytochemical), Epicatechin gallate (ECG) (Biopurifyphytochemical), Catechin (C) (Sigma Aldrich), Kaempferol (Sigma Aldrich), Myricetin (Sigma Aldrich), Quercetin (Sigma Aldrich). Timbang EC sejumlah mg; GC mg; C
mg; CG
0,1
11,8
0,15
mg; GCG
mg; Kaempferol
0,4
0,4
mg; EGC
mg, Myricetin
10,6
mg; GA
4,21
2 mg; ECG 0,9 mg; EGCG 2,2 0,25
mg; Quercetin
kemudian larutkan dalam metanol dan air perbandingan
1 : 1 (5 ml)
158,8
mg
sesuai kondisi
analisis fase gerak. Saring menggunakan membran PTFE. Degasing selama 5 menit selanjutnya diinjeksikan sebanyak
20
!J.l ke dalam kolom HPLC
dan
diperoleh hasil kromatogram yang dideteksi menggunakan UV dengan panjang gelombang
240 nm.
terbaik (Lampiran
Pemeriksaan dilakukan
3
kali (triplo) lalu diambil basil yang
1., Tabel 8.1 ).
Prosedur Preparasi Sampel Timbang berat sampel ekstrak etanol heksan hijau
7,2
(96%)
teh hijau sebanyak
mg; fraksi etil asetat 22,6 mg, fraksi butanol
1 1,4 mg dilarutkan dalam pelarut kloroform 5 mL.
PTFE lalu didegasing selama
5 menit.
38,8
4,2
mg ; fraksi
mg; fraksi air teh
Saring dengan membran
Injeksikan sebanyak
20 111 ke dalam
kolom
HPLC dan didapatkan basil kromatogram yang dideteksi menggunakan UV dengan panj ang gelombang
240 run (Lampiran 2.; Tabel 8.2).
4.3.5. Uji fitokimia (modifikasi cara Farnsworth) Uj i flavonoid Sebanyak kurang lebih
10
mg
ekstrak atau fraksi (sampel) dimasukkan
dalam tabung reaksi berisi butiran magnesium (Mg) kemudian ditambahkan HCI
2N dan dipansakan selama 5
-
10 menit . Setelah
dingin, disaring kemudian filtrat
ditambah amil alkohol. Dilihat perubahan warna, apabila warna merahljingga menunjukkan adanya kandungan flavonoid.
23
Uji fenol Sebanyak kurang lebih 10 mg ekstrak atau fraksi (sampell ditambahkan Fe 'III) klorida
1
%, bila terjadi perubahan wama
hijau/merahlungufbiru/hitam
menunjukkan adanya kandungan feno l
Uji saponin Sebanyak kurang lebih 10 mg ekstrak atau fraksi (sampel) ditambah air kemudian dididihkan dalam penanggas air selama 5 menit kemudian dikocok kuat/ Apabila terbentuk busa stabil
selama ± 30 menit menunjukkan adanya
kandungan saponin
Uji triterpenoid dan steroid Sebanyak kurang lebih 10 mg ekstrak atau fraksi ditambah asam asetat anhidrat sampai terendam, dibiarkan selama 15 menit, kemudian ditambahkan 1 tetes asam sulfat pekat. Apabila terdapat endapan hijau!biru menunjukkan adanya kandungan
steroid,
adanya
endapan
merahljingga
menunjukkan
adanya
kandungan triterpenoid.
Uji terpenoid Sebanyak kurang lebih 10 · mg ekstrak atau fraksi dalam plat tetes ditambahkan vanilin dan asam sulfat, adanya wama ungu menunjukkan adanya kandungan terpenoid
Uji tanin Sebanyak kurang lebih 10 mg ekstrak atau fraksi ditambahkan 2 mL HCI 2N dipanaskan selama 30 menit kemudian didinginkan dan disaring, filtrat ditambah amil alkohol apabila terbentuk warna ungu menunjukkan adanya kandungan tanin.
24
ji alkaloid Sebanyak kurang lebih 1 0 mg ekstrak atau fraksi ditambah amnonia 1 0 % kemudian diekstraksi dengan klorofonn dan ditambah HCI IN. Hasil ekstraksi akan
terbagi 2 lapisan, lapisan bagian atas (lapisan asam) dibagi dalam 2 tabung.
Tabung satunya ditambah pereaksi Meyer, tabung yang lain ditambah pereaksi .Jragendorf, bila terbentuk warna kuning menunjukkan adanya kandungan alkaloid.
4.3.6.
Uji antimalaria secara in vitro
4.3.6.1. Pembuatan Medium untuk Kepentingan Kultur Plasmodium Medium-medium yang dipakai untuk kepentingan kultur P. falciparum, yaitu: Medium Dasar, Medium Komplit, dan Medium Kultur. Medium Dasar, terdiri atas: •
Medium RPMI 1640
•
Dapar Hepes
10,40 gJ L 5,94 gJ L
Cara pembuatan Medium Dasar: RPMI dilarutkan dalarn 900 mL akuabides steril, kemudian ditambahk:an dapar Hepes dan akhirnya ditambahkan akuabides steril sampai volume 960 mL.
Larutan diaduk dengan vorteks. Ditambahkan gentamisin sulfat (Sigma
culture grade) 50 flg/ mL kemudian larutan tersebut disterilisasi melalui milipor 0,22
ll
steril. Masing-masing 100 mL larutan disimpan dalam botol
steril di lemari es. Medium Komplit, terdiri atas: Medium Dasar + Natrium bikarbonat 5 % b/ v Cara pembuatan larutan Natrium bikarbonat (NaBic): Sebanyak 5 gram NaHC03 dilarutkan dalam 100 mL akuabides steril kemudian larutan tersebut disterilisasi melalui milipor 0,22
fl.
Masing
masing 10 mL larutan ini disimpan dalam botol kecil steril di lemari es. Cara pembuatan Medium Komplit: Ke dalam 100 mL Medium dasar ditambahkan 4,2 mL larutan Nabic 5% b/v. Penambahan Nabic akan mengubah warna Medium dasar dari kuning
25
menjadi oranye. Medium
ini
digunakan untuk menyiapkan ertrosit nonnal
untuk kultur. Medium Kultur, terdiri atas: Medium Komplit + serum manusia Cara pembuatan Medium Kultur: Ke dalam 104,2 mL Medium Komplit ditambahkan 1 1,5 mL serum manusia yang sudah diinaktivasi. Medium ini yang selanjutnya dipakai untuk kultur.
4.3.6.2. Penyediaan Serum
Darah diambil dari orang sehat yang tidak sedang makan obat apapun 2 hari sebelumnya. Darah ditampung dalam tabung 15 mL atau 50
mL
steril bertutup
tanpa antikoagulan. Tabung diletakkan dalam posisi miring (60°) dan dibiarkan membeku pada suhu kamar atau disimpan pada suhu 37°C selama 3-4 jam. Serum dipisahkan dari sel-sel
darah dengan
menggunakan pipet pastur steril. Sisa serum
yang masih tercampur sel-sel darah disentrifuga pada 2000 rpm selama 8-10
menit, kemudian dipisahkan lagi sisa serum tersebut. Serum tersebut kemudian diinaktivasi pada suhu steril pada suhu
20 °C
-
56°C
selama 1 jam dan selanjutnya disimpan dalam botol
.
4.3.6.3. Penyediaan Eritrosit Segar untuk Kultur
Darah manusia ditampung dalam tabung yang berisi antikoagulan EDTA steril kernudian disentrifugasi 2.000 rpm selama 10 menit, supematan
dan
huf fY
coat dibuang. Eritrosit kemudian dicuci dengan penambahan medium serumfree
RPMI dengan volume yang sama kemudian disentrifugasi lagi pada 2.000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang, supernatan dan huffy coat dibuang. Pencucian dilakukan 2-3 kali sehingga eritrosit sekarang sudah siap untuk digunakan dalam kultur.
26
4.3.6.4. Pembuatao Larutao NaCI 3,5
o/o
(NaCI Hipertooik)
Sebanyak 3,5 gram NaCI dilarutkan dalam 100
mL
akuabides kemudian
larutan disterilisasi dalam otoklaf pada suhu 1 1 5 °C selama 20 menit.
4.3.6.5. Thawing Kultur P. falciparum Beku •
NaCl 3,5 %, Medium Komplit, dan Medium Kultur ditaruh dalam inkubator 37°C
•
Diambil tabung kultur dari tangki nitrogen dan ditaruh di suhu ruang sampai mencair, kira-kira selama 2 menit.
•
lsi kultur dimasukkan ke dalam tabung bertutup k:uning steril.
•
Ditambahkan NaCl 3,5 % ke dalam tabung tadi sampai 5 mL kemudian tabung dibolak-balik dengan hati-hati untuk kemudian disentrifuga pada 1 .500 rpm selama 5 menit.
•
•
Supematan dibuang memakai pipet besar steril. Ke dalam tabung tadi dimasukkan Meditun Komplit sampai 5 mL kemudian disentrifuga Iagi pada 1.500 rpm selama 5 menit.
•
Supematan dibuang lagi (proses pencucian dilakukan sampru supernatan berwarna oranye seperti wama medium komplit).
•
Pellet (endapan) dimasukkan ke dalam cawan petri diameter 4 em/ culture flask steril.
•
Ditambahkan 2 mL Medium Kultur ke dalam tabung bertutup kuning bekas pellet tadi untuk kemudian seluruh isi tabung ini dimasukkan ke dalam cawan petri! cultureflask tadi.
•
Ke dalam cawan! culture flask tadi ditambahkan 100 IlL RBC (red blood cell) kemudian diinkubasikan dalam inkubator 3 7°C dalam candle jar yang berisi kadar C02 5% (candle jar yang berisi kultur P. falciparum diberi nyala lilin kemudian ditutup sampai lilinnya mati dan setelah Jilin mati, candle jar dimasukkan ke dalam inkubator tersebut)
•
Semua prosedur di atas harus dilakukan dalam laminair airflow secara steril.
•
Jadi sekarang didapatkan kultur P. falciparum dengan hematokrit 5 %.
27
4.3.6.6. Pemelibaraan Kultur P. falcparum i •
Medium kultur setiap hari harus diganti dengan medium kultur yang baru dengan menggunakan pipet steril setelah cawan petri sedikit dimiringkan.
•
•
Tiap hari dibuat apusan darah tipis untuk melihat parasitemia. Setelah dibuat apusan dan medium kultur diganti, kultur P. falciparum tadi
dimasukkan lagi ke dalam inkubator 37°C dalam candle jar dengan kadar C02 S %. •
Untuk pemberian perlakuan, yang dipakai adalah kultur dengan parasitemia 1 - 2 %. Kalau parasitemia melebihi persentasi tersebut, ke dalam cawan tersebut ditambahkan lagi RBC.
•
Kalau parasitemia lebih dari 10 %, dilakukan subkultur.
•
Prosedur ini dilakukan juga dalam laminair airflow secara steril.
4.3.6.7. Menentukan IC50 Artemisinin •
Parasitemia diperiksa pada awal penelitian yang disebut dengan Do (day 0).
•
Ke dalrun 6 sumur di atas dan 6 sumur di bawah pada lempeng mikro
(micro plate) yang bersumur 6x4 dimasukkan masing-masing 1 mL kultur dengan parasitemia
±
1 % yang mengandung artemisinin dengan
konsentrasi 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M, dan kultur yang tidak mengandung obat sebagai kontrol. •
Inkubasi dilakukan selama 72 jam dalam inkubator 37°C dengan kadar C02 5% dan setiap hari mediwn kultur diganti dengan medium yang baru setelah sebelumnya dibuat apusan darah pewarnaan Giemsa untuk mengetahui parasitemianya.
•
Konsentrasi artemisinin yang menghambat pertumbuhan Plasmodium sebesar 50 % (IC5o) dipakai sebagai konsentrasi efektif untuk pengujian selanjutnya.
•
Data dianalisis secara statistik dengan memakai metode analisis probit. 7
28
4.4. Diagram penelitian 4.4.1. Diagram alir ekstraksi maserasi
1.
2.
3.
4.
Teh hijau Teh hijau direndam etanol, air dalam maserator Etanol ditampung Filtrat etanol, air dievaporasi
5. Ekstrak etanol 96% teh hijau
Gam bar 4.2. Diagram alir pembuatan ekstrak teh hijau metode maserasi
29
4.4.2. Diagram alir fraksionasi
1.
2.
Ekstrak etanol Teh bijau Fraksionasi menggunakan pelarut heksant etil asetat, butanol, air
3. 4. 5.
Filtrat ditampung Filtrat dievaporasi Fraksi beksan, etil asetat, butanol, air
Gam bar 4.3. Diagram alir fraksiooasi teh hijau
30
4.4.3. Diagram alir uji antimalaria
1. Serum untuk membuat medium kultur 2. Cultureflask ditambahkan 100 p.tL RBC (red blood cell) kemudian diinkubasikan dalam inkubator 37°C dalam candlejar 3. Apusan darah tipis untuk melihat
parasitemia.
Gambar 4.4. Diagram alir uji antimalaria
31
BAB V
BASIL DAN PEMBAHASAN 5.1. Basil penelitian 5.1.1 Determinasi tanaman Berdasarkan hasil determinasi tanaman yang diperoleh dari PT Perkebunan Cisaruni, Garut sebagai bahan baku untuk pembuatan teh hijau Walini adalah : Namaumum Divisi Kelas Anak kelas Bangsa Familia Spesies Sinonim
Tea (Inggris), teh (Indonesia) Magnoliophyta Magnoliopsida (Dicots) Dilleniidae Theales Theaceae Camellia sinenss i L. Kuntze Thea sinensis (L.) Camellia theifera Griff
5.1.2. Analisis proksimat teh Untuk mengetahui tingkat kekeringan dan nilai gizi teh hijau dilakukan analisis proksimat meliputi kadar air, abu, protein, serat kasar, lemak kasar, karbohidrat pada sampel kulit manggis yang akan diekstraksi (Table 5. 1) Tabel S.l. Analisis proksimat teh hijau dan teh hitam No
Analisis
Teh hijau
Tehhitam
proksimat
(%) 1.
Air
7,15
10,49
2.
Abu
5,13
7.69
3.
Protein
22,00
25,31
4.
Serat kasar
14,33
14,16
5.
Lemak kasar
1,33
1,32
6.
Karbohidrat
57,31
5 1 ,52
32
5.1.3. Rendemen ekstrak, fraksi -fraksi teh Sebelum dilakukan ekstraksi terlebih dahulu bahan. pelarut meliputi etanol 96%, heksan, etil asetat dan butanol didestilasi. Tabel 5.2. Basil destilasi pelarut
Jenis pelarut
Volume total awal
Volume total akhir
Etanol 96% Hekan Etil asetat Butanol
55,65 42,25 27,3 33 00
44.15 33,9 21,6 23,70
Persentase basil akhir (%) 79,34 80,24 79,12 71,82
Ekstraksi menggunakan teknik maserasi dengan pelarut etanol 96 % , etanol 70% dan air setiap 24 jam filtrat ditampung, sampai filtrat etanol tidak
berwarna kemudian filtrat etanol 96% dievaporasi sampai diperoleh ekstrak etanol 96%, (Tabel 5.3) .
Tabel 5.3. Rendemen ekstrak etanol teh hijau
Volume filtrat etanol (I)
17,5 16 16
15,65 14,9 13,85
125 149 237
25,40 21,29 29,63
16.5
12
14,8
170,33
25,44
Berat Kering (g)
Volume etanol untuk maseras1 (I)
Teh hij au
500 700 800
Rata-rata
666,67
Berat rendemen ekstrak (g)
Rendemen ekstrak (%)
Waktu maserasi sampru tidak berwarna an 14 12 10
Sampel
Ekstrak etanol hasil maserasi difrakasionasi menggunakan pelarut dengan perbandingan antara air dan n-heksan ( 1
:
1 ). Filtrat fraksi n-heksan dikumpulkan,
sedangkan fraksi air selanjutnya dipartisi dengan etil asetat (1
:
1), dan dengan n
butanol (1 : 1) dan terakhir diperoleh filtrat fraksi air. Masing-masing filtrat dievaporasi diperoleh filtrat heksan, etil asetat, butanol dan fraksi air (Tabel 5.4).
33
Tabel 5.4. Rendemen fraksi-fraksi teh hi jau
Ekstrak teh hijau (g)
Hasil fraksi heksan (g)
Hasil fraksi etil asetat
150 Persen Persen
4,66 6,28% 3,11
9,95 13,42% 6,63
)
Hasil fraksi butanol (g)
Hasil fraksi air (g)
Jumlah
21.18 28,56% 14,12
74,16 5 1,74% 25,58
74,16 100,00 49A4
5.1.4. Uji aktivitas antimalaria Uji aktivitas antimalaria secara in vitro dari ekstrak, fraksi heksan, aetil asetat, butanol, air menggunakan pembanding senyawa falvonoid teh yaitu EGCG, EGC, ECG, CG, GC, EC, GCG, C, Kaempferol, mirisetin, kuersetin.
Untuk mengetahui aktivitas antimalaria data dianalisis menggunakan analisis probit (Lampiran 3, Tabel 5.5). Tabel 5.5. Penghambatan Paracetimia ekstrak, fraksi, senyawa-senyawa teh
Sampel EGCG me
ECG ro 3C EC
GCG t:;
f.heksan F. Air Ekstrak. Teh f. Etil f. Butan Artemesinin
0.0000001 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Konsentrasi (!lg/ml) 0.01 0.1 0.001 17.39 21 .74 4.35 0.00 -31.82 -13.64 -44.00 44.80 -28.00 46.43 46.43 28.57 50.00 34.38 46.88 -7. 14 -7. 14 -21.43 16.00 24.00 0.00 38.46 46. 1 5 1 1 .54 12.50 12.50 0.00 50.00 50.00 50.00 33.33 33.33 33.33 21.88 37.50 18.75 16.67 33.33 1 1. 1 1 75.00 87.50 99.00
IC5 0 1 17.39 22.73 24.00 39.29 53.13 -7. 14 8.00 15.38 12.50 50.00 40.00 37.50 38.89 100.00
10 8.70 22.73 16.00 17.86 53.13 64.29 16.00 23.08 12.50 62.50 46.67 56.25 44.44 100.00
98,141 1 88,009 0,319
0,000 6,38 3,26 10,72 0,000
Berdasarkan basil uji aktivitas antimalaria ditemukan 1 fraksi etil asetat yang aktif dan 2 senyawa yang aktif sehingga dilanjutkan untuk mengetahui efek antimalaria kombinasi dari fraksi etil asetat dan artemesinin ( Lampiran 4.; Tabel 5.6)
34
Tabel 5.6. Penghambatan Paracetimia senyawa-senyawa teh
Sampel
Koosentrasi (JLg/ml)
ICSO
0.0000001
0.000001
0.00001
0.0001
0.001
0.01
---=-tin
0.00
1.25
1 .25
3.75
1 1 .25
36.25
0,058
..:c::Ipfero1
0.00
0.00
2.53
29. 1 1
29. 1 1
36.71
0,018
Acid
0.00
0.00
2.47
4.94
24.69
25.93
0,085
0.00
0.00
14.29
7. 14 .
2.86
14.29
�
Tabel 5.7a. Penghambatan Paracetimia kombinasi senyawa teh dan artemesinin
:...:l:::pe
Konsentrasi (Jlg/ml} 1E-10
0,000001
0,00001
0,0001
-:;c .::-
�
*'f'510injn
0
75
87,5
99,00
IC50
0,001
0,01
0,1
23,96
43,40
61,81
68,06
100.00
0,036
86,76
100.00
100.00
100.00
100.00
Sangat aktif
100.00
100.00
100.00
100.00
100.00
100
100
10
(�tg/ml)
Sangat aktif 0,000
Tabel 5.7b. Penghambatan Paracetimia kombinasi senyawa teh dan artemesinin (%)
Konsentrasi (J.lg/ml) IE-10
0
0,000001
0,00001
0,0001
IC50
0,001
0,01
0,1
23,96
43,40
6 1 ,8 1
10 68,06
100.00
(�g/ml)
5,613
8,586
16,038
35,409
100,00
0,005
0
l l ,075
34,216
72,199
100,00
0,000244
99,00
1 00,00
100,00
0,0000000006
75
87,5
35
Tabel 5 .Sa. Aktivitas antimalaria kombinasi fraksi/senyawa aktif dan artemisinin
No
Sample
Hasil
1
Artemesinin+Fraksi etil
IC50=0,036 �g/ml
Keterangan
asetat 2
(50%+ 50%) Artemesinin+GC
Terlalu aktif
Dosis perlu
(50%+50%)
(tidak bisa ditentukan
diperkecil
Artemesinin+EC
Terlalu aktif
Dosis perlu
(50%+ 50%)
(tidak bisa ditentukan
diperkecil
IC50) 3
IC50
Berdasarkan hasil penelitian (Tabel 5.5; Table 5.6)menunjukkan bahwa
dari ekstrak, fraksi-fraksi teh berpotensi sebagai antimalaria yaitu fraksi air (0,000 llg/ml), fraksi etil asetat (3,26 !lg/ml), esktrak teh (6,38 llg/ml), fraksi butanol (1 0,72 !lg/rnl), sedangkan senyawa teh yang aktif adalah GC (0,319 J.LM), kuersetin (0,058 �. kaempferol (0,018 �. gallic acid (0,085 �M). Berdasarkan hasil penelitian (Tabel 5.7) bahwa kombinasi fraksi etil asetat, senyawa EC, GC dapat meningkatkan aktivitas antimalaria lebih aktif dibanding dosis tunggal ekstrak atau senyawa. Berdasarkan basil pengujian tahap ke 2 untuk menentukan nilai IC50 dari kombinasi GC+artemesinin dan EC+artemesinin diperoleh nilai IC50 seperti tercantum dalam Tabel 5.8b.
Tabel 5.8b. Aktivitas antimalaria kombinasi fraksilsenyawa aktifdan artemisinin
No
Sample
Hasil
1
Artemesinin+Fraksi etil
IC50=0,036 �g/ml
Keterangan
asetat (50%+50%) 2
Artemesinin+GC (50%+ 50%)
3
Artemesinin+EC
IC50=0,005 llg/ml IC50=0,000244 �g/ml
(50%+50%)
36
fraksi air dengan
RT
0,79 yang bukan termasuk
RT
senyawa-senyawa flavono id
standard. Fraksi air memiliki aktivitas antimalaria yang tinggi dengan IC50 (0,09 f.Lg/ml) diduga senyawa yang berperan senyawa-senyawa flavonoid yang lain.
5.1.6. Uji fitokimia
Uji fitokimia untuk mengetahui golongan senyawa yang terdapat dalam ekstrak, fraksi-frkasi teh hijau secara kualitatif (Tabel 5.10)
37
Tabel 5.10. Data uji fitokimia ekstrak, fraksi-fra �i teh hijau Fitokimia
Sampel Fenol +++
Ekstrak etanol THj Fraksi heksan Fraksi etil asetat Fraksi butanol Fraksi air
+++
Triterpenoid ++
+++
+++
+++
+++
++
+++
++
Steroid
Terpenoid
Saponin
+++
+
+++
+
+++
+
+++
+++
+++
Alkaloid ++ +
:
+++
+++
+
kadar sangat tinggi
+++
: kadar tinggi
++
: kadar sedang
+
: kadar rendah : tidak mengandung Berdasarkan uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak; farksi-fraksi teh
hijau mengandung fenol dan terpenoid dalam kadar tinggi (+++), alkaloid dalam kadar tinggi (+++) terdapat dalam fraksi butanol dan fraksi air, sedangkan farksi etiula asetat mengndung flavonoid dalam kadar tinggi (+++ ) Fraksi heksan dan .
fraksi aetil asetat mengandung triterpenoid dalam kadar tinggi (+++ ) Farksi air .
mengandung saponin dalam kadar tinggi (+++)
.
5.2. Pembahasan 5.2.1.
Analisis proksimat Uji proksimat dilakukan untuk mengetahui tingkat kekeringan bahan,
apabila b�an belum memiliki kadar air yang stabil, maka bahan tidak tahan dsimpan lama dan akan rusak dalam masa penyimpanan. Metoda analisis kimia untuk mengidentifikasi kandungan nutrisi seperti protein, karbohidrat, lemak dan serat pada suatu zat makanan dari bahan. Kadar air maksimum dalam bahan sekitar 10%, bila kadar air melebihi 16% maka bahan akan cepat rusak dalam penyirnpanan serta mernicu turnbuhnya jamur. Berdasarkan hasil penelitian teh hijau Walini
+
++
+++
Keterangan : ++++
Flavonoid
memiliki kadar air sebesar 7,15 % (Tabel 5.1), sehingga teh
38
+
mengandung kadar lemak kasar yang sangat rendah sehingga akan mempengaruhi hasil metabolit sekunder berupa steroid dalam ekstrak dan fraksi-fraksi teh hijau (Tabel 5.10), tidak mengandung steroid (-) pada ekstrak, fraski-fraksi teh hijau kecuali pada frak:si etil asetat dalam kadar rendah (+), serta rendemen paling rendah dalam fraksi heksan dibanding fraksi-fraksi lainnya (Tabel 5.4).
5.2.2. Aktivitas antimalaria Berdasarkan basil uji aktivitas penghambatan pertumbuhan P. falciparum secara in vitro (Lampiran 2.) menunjukkan bahwa tidak semua senyawa golongan katekin teh aktif sebagai antimalaria, hanya GC yang aktif sebagai antimalaria dengan nilai IC50 sebesar 0) 19 �M sedangkan EGC dengan nilai IC50 sebesar 98,141 pM dan CG sebesar 188,09 �M, sedangkan golongan nonkatekin yaitu kuersetin, kaempferol, gallic acid justru memiliki aktivitas antimalaria yang jauh lebih tinggi dibanding senyawa golongan katekin berturut-turut dengan nilai IC50 sebesar 0,058 �M; 0,018 �M; 0,085 �Mimi dan mirisetin tidak memiliki aktivitas antimalaria. Hal ini tidak sesuai dengan penelitian sebelumnya bahwa golongan senyawa katekin memiliki ak:tivitas antimalaria yang tinggi yaitu golongan katekin galat yaitu epikatekin galat (ECG) dan epigalokatekin galat (EGCG) dapat menghambat P. falciparum strain NF54, K l dan 3D7 dengan IC50 sebesar 10-40 ,.LM sedangkan golongan katekin non galat kurang aktif dalam menghambat P.
falciparum dengan IC50 sebesar 100-300 !1M (Slavic et al., 2009). Perbedaan aktivitas antimalaria senyawa-senyawa teh diduga karena perbedaan strain P.
falciparum sehingga menghasilkan aktivitas antimalaria yang berbeda. Penelitian ini menggunak:an P.falciparum strain 3D7. Berdasarkan hasil penelitian
(Tabel 5.5) ,menunjukkan bahwa ekstrak,
fraksi-fraksi teh hijau memiliki aktivitas antimalaria keculai frak:si heksan tidak aktif menghambat pertumbuhan P. falciparum. Paling aktif sebagai antimaria adalah fraksi air,
berdasarkan basil penelitian uji HPLC menunjukkan bahwa
fraksi air tidak mengandung senyawa flavonoid (Tabel 5.9), sehingga aktivitas antimalria diduga bukan karena peran senyawa flavonoid teh tetapi karena senyawa alkaloid
(Tabel 5.10), fraksi air mengandung alkaloid dalam kadar 39
tinggi (+++), Saxena et a!. (2003)menyebutkan bahwa goIongan senyawa alkaloid memiliki aktivitas antimalaria. Semua alkaloid dari Stephania erecta memiliki aktiv itas antimalrai terhadap terhadap P. Falciparum yang resisten terhadap klorokuin. Berdasarkan basil penelitian (Tabel 5.10) menunjukkan bahwa, hanya ekstrak etanol teh hijau yang mengandung flavonoid non katekin (kaempferol, mirisetin, kuersetin) sehingga cukup aktif sebagai antimalaria karena adanya senyawa kaempferol dan kuersetin yang aktif sebagai antimalria (Tabel 5. 6). Fraksi etil asetat aktif sebagai antimalria lebih aktif dibanding fraksi-fraksi teh hijau dan ekstrak teh hijau hal ini dikarenakn fraksi etil asetat paling tinggi mengandung senyawa flavonoid� triterpenoid, hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya bahwa senyawa flavonoid, triterpenoid memuluk aktivitas antimalaria (Saxena et a!., 2003). Berdasarkan basil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi senyawa, fraksi dan artemesinin dapat meningk:atkan daya antimalaria dibanding dosis tunggal. (Tabel 5.6 dan 5.7a, 5.7b, 5.8a, 5.8b).
40
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1. Kesimpulan 1. Ekstrak teh hijau, fraksi air, fraksi etil asetat, fraksi butanol memiliki aktivitas antimalaria yang tinggi dengan nilai IC50 berturut-turut 6,38 1-Jg/ml; 0,000 1-Jg/ml;
3,26 !Jg/ml dan 10,72 !Jg/ml,
2. Senyawa flavonoid EGC memiliki aktivitas antimalaria dengan nilai IC50 sebesar
98,14 JJM; senyawa C G memiliki nilai IC50 sebesar 188,09 IJM,
senyawa GC memiliki nilai IC50 sebesar 0,319 1-JM; senyawa kuersetin memiliki nilai IC50 sebesar 0,058 !JM; senyawa kaempferol memiliki nilai IC50 sebesar 0,018
1-JM, senyawa GA memiliki nilai IC50 sebesar 0,085 IJM/ml
dan artemesinin memilik.i nilai IC50 sebesar 0,000 !JM. 3.
Kombinasi fraksi etil asetat teh hijau fdan artemesinin meningkatkan daya antimalaria dengan nilai IC50
sebesar 0,036 !Jg/ml, kombinasi GC dan
artemesisnin sebesar 0,005 !Jg/ml, kombinasi EC dan artemesinin sebesar 0,000244 1Jg/ml, 4. Ekstrak teh hijau paling lengkap mengandung senyawa flavonoid standar (EC, GA, GC, CG, GCG, EGC, ECG, EGCG, C, kaempferol, mirisetin, kuersetin), fraksi air tidak mengandung senyawa-senyawa standar.
6.2. Saran
l .Perlu penelitian lebih lanjut efek kombinasi ekstrak, fraksi teh, senyawa flavonoid dan artemisinin secara 2.Perlu
penelitian lebih lanjut
artem isinin secara
invivo
efek kombinasi
senyawa
non-katekin
dan
invitro dan invivo
41
UCAPAN TERIMAKASffi Puji sykur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmatNya sehingga penelitian dan laporan akhir Risbin IPTEKDOK Tahun Anggaran 2011 dengan judul
"Efek Potensiasi
Teh Hijau (Camelia sinensi L.) Dalam
Meningkatkan Daya Antimalaria Artemesinin dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih dan rasa hormat pada Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan, atas dana dan bimbingan yang telah diberikan. Pada kesempatan ini penulis telah menyelesaikan penelitian Risbin IPTEKDOK anggran tahun 201 1 . Kami team peneliti juga mengucapkan terima kasih kepada :
1 . Lembaga Eijkman, Jakarta yang telah membantu dan menyediakan fasilitas Laboratorium Kultur Sel untuk pengujian aktivitas antimalaria secara in vitro
2. Laboratorium Kultur Sel, Departemen Farmakognosi dan Fitofarmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya yang telah membantu dan menyediakan fasilitas Laboratorium Kultur Sel untuk pengujian aktivitas antimalaria secara in vitro 3.
Laboratoriwn Medik, Pramitha Bandung yang telah membantu dan menyediakan fasilitas untuk proses penyediaan serwn
4. Laboratorium Medik, Pramitha Bandung yang telah membantu dan menyediakan fasilitas untuk proses penyediaan serum
5. PTPN
VIII, Perkebunan & Pabrik Teh Walini Cisaruni-Garut yang telah
menerima kami team peneliti
untuk mempelajari dan melakukan
pengamatan langsung proses pembuatan pengolahan teh
6. Laboratorium Kimia Instrumen, Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung yang telah membantu dan menyediakan fasilitas untuk uji HPLC
7. Laboratorium Nutrisi ·Makanan dan Kimia Makanan Fakultas Peternakan Universitas Padjajaran, Jatinangor-Sumedang yang telah membantu dan menyediakan fasilitas untuk uji analisis proksimat
42
8. Laboratorium Herbarium, Sekolah Tinggi llmu Hayati, Institut Teknologi ·
Bandung
yang telah membantu dan menyediakan .fasilitas untuk
melakukan determinasi tanaman teh. 9. Dekan Fakultas Kedokeran, Universitas Kristen Maranatha Bandung yang
telah membimbing
dan membantu
proses
adiministrasi
pengerja.an
penelitian
10. Dekan Fakultas Kedokeran, Universitas Kristen Maranatha Bandung yang telah membimbing dan membantu proses adiministrasi pengerja.an penelitian
1 1 . Ketua
Lembaga
Pusat
Penelitian
dan
Pengabdian
Masyarakat,
Universitas Kristen Maranatha Bandung yang telah mernbimbing dan membantu proses adiministrasi pengerjaan penelitian 12. Semua pihak yang telah membantu selarna proses penelitian
Akhir k:ata tim peneliti menyampaikan ucapan terima kasih kepada para peneliti
yang terlibat dalam penelitian ini. Kiranya penelitian ini dapat
memberik:an rnanfaat yang besar terhadap perkembangan ilmu di Indonesia serta dapat bennanfaat dalam pengobatan penyakit malaria.
Bandung, Februari 2012
43
BAB Vll DAFTAR PUSTAKA Ayda Rahmad dan Purnomo, 2011, Atlas Diagnostik Malaria, Penerbit EGC, Jakarta, him Banerjee,
17-25. T.
and
Sarma,
S.
2008.Epigallocathecin Gallate Is A Slow Tight Binding Inhibitor Of Enoyl-ACP Reductase From Plasmodium falciparum. Biochemical and Biophysical Research Communication, Vol 377 (4): 1238-1242.
Becker, K., Tilley, L., Vennerstrom,J.L., Roberts, D., Rogerson, S., and Ginsburg, H.
2004.0xidative Stress In Malaria Parasite-Infected Erythrocytes: Host Parasite Interactions. Int JParasitol ;34(2): 163-89 Bowling, A.C., and Beat, M.F. 1995. Bioenergetic And Oxidative Stress In Neurodegenerative Diseases. Life Sci; 56: 1 15 1 - 1 1 71 Bozdech, Z. and Ginsburg, H. 2004. Antioxidant Defense In Plasmodium falciparum - Data Mining of The Transcriptome. Malaria Journal; 3:23. Bnmeton. 1999. Sesquisterpenoid Lactones. Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants. Second edition. Intercept Ltd UK, Lavoisier Publishing Inc. New York. 1999. 624-25. CDC. 2004. Malaria. Drug Resistance. http://www.cdc.gov/malaria/ drug resi stance htm [16/12/2006] CDC. 2009. Malaria Facts. http://www.cdc.gov/malaria/facts.htm [31/7/2008] CIFOR (Center For International Forestry Research). 2006. http://www. cifor. cgiar. org/ [1 1/3/2007] Golenser, J., Waknine, J.H., Krugliak, M., Hunt, N.H., and Grau, G.E. 2006. Current Perspectives on The Mechanism of Action of Artemisinins. International Journal ofParasitology; 36(14): 1427-41 Gordi, T. 2001 Clinical Pharmacokinetics of The Antimalarial Artemisinin Based on Saliva Sampling. Comprehensive summaries of Uppsalla dissertations .
from The Faculty of Pharmacy. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Penerbit ITB, Bandung Harijanto, P.N., Langi, J., Richie, T.L. 2000. Patogenesa Malaria Berat. Dalam: Harijanto PN (ed.). Malaria, E pidemiologi, Patogenesis, Manifestasi Klinis Dan Penanganan. Jakarta: EGC. Haugland, R .P. 2002. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products.
Harborne, J.B.
Molecular Probes. Janina K Hellman, Sylvia Munter.20 10.
Synergistic and Additive Effects ofEGCG and Digitonin on Plasmodium Sporozoite Survival and Motility. www.plusone org Vol 5 Issue 1 Kannan, R., Kumar,K., Sahal, D., Kukreti, S., and Chauhan, V.S. 2005. Reaction of Artemisinin With Hemoglobin: Implications for Antimalarial Activity. Biochemical Journal. ;385(Pt 2):409-4 18 Manta, C. 1999. Artemisinin: Is This The Relacementfor Chloroquine In Malaria Chemotherapy. http://homepages.uel.ac.uk/4474p/info.htm. [4/3/2006] .
44
MUller, S. 2004. Redox and Antioxidant Systems of The Malaria Parasite Plasmodiumfalciparum. Molecular Microbiology; 53 (5): 1291. Na-Bangchiang, K. and Congpuong, K. 2007. Current Mctlaria Status and
Distribution of Drug Resstance i in East and Southeast Asia with Special Focus to Thailand. Tohok:uJ. Exp. Med. ; 2 1 1 : 99-113. Nmorsi, O.P.G., Ukwandu, N.C.D., and Egwunyenga A.O. 2007. Antioxidant Status of Nigerian Children with Plasmodium falciparum Malaria. African Journal ofMicrobiology Research; 061-064
Nugroho, A dan Tumewu-Wagey, M. 2000. Siklus Hidup Plasmodium Malaria. Dalam: Harijanto PN (ed.). Malaria, Epidemiologi, Patogenesis, Manifestasi Klinis Dan Penanganan. Jakarta: EGC. Sannella, A.R., Messori, L .2006. Antimalarial Properties of Green Tea.Biochemical and Biophysical Research Communication, Vol 353 issue 1 ;177-181 Sano, M., Tabata, M., Suzuki, M., Degawa, M. , Miyase, T, Maeda-Yamamoto M .. 2001. Simultaneous Determination of Twelve Tea Catechins by High
Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection Analyst.126:816-820, 2001. Slavic, K., Derbyshire, E.T., Naftalin, R.J., Krishnaa, S. and Staines, HM 2009.
Comparison of Effects of Green Tea Catechins on Apicomplexan Hexose Transporters and Mammalian Orthologues. Mol Biochem Parasitol 168(110): 1 1 3-116. Sclunuck, G, Roehrdanz, E., Hayes ,R.K, and Kahl.R. 2002. Neurotoxic Mode of Action of Artemisinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy; 46 (3): 821-827.
Syafruddin, D., Asih, P.B.S, Wahid, I., Dewi, R.M., Tuti, S., Laowo, I. 2007.
Malaria Prevalence in Nias District, North Sumatra Province, Indonesia. Malar J ; 6: 1 16. Tonmunphean, S., Parasuk V., and Kokpol S. 2000. QSAR Study of Antimalarial Activities and Artemisinin-Heme Binding Properties Obtained From Docking Calculations. Quant. Struct.-Act. Relat., 19. Trigg, P. I., and Kondrachine, AV. 1998. The Current Global Malaria Situation. Malaria: parasite biology, pathogenesis, and protection, edited by Sherman IW. Washington, DC: Am Soc Microbiol. p. 1 1-22. USDA 2003. USDA Database for the Flavonoid Contents of Selected Foods. Beltsville: US Department of Agriculture. 2007. Malaria. http://W\vw.who.int/mediacentre/factsheets/ WHO. fs094/enlindex.html. 9 Desember 2008. WHO. Malaria fact sheet. 2008. (http://www.who.int/inf-fs/en/fact094.html) In:
[2/4/2008].
t
Surabaya-Indonesia on 21-22 h July 2010. WHO. Facts on ACTs (artemisinin-base combination therapies). 2006. http://W\vw.rbm.who.int/cmc upload/0/000/0 15/364/RBMinfosheet 9.htm [12 Maret 20081
45
Wiser, Mark F. 2008. Malaria. Tulane http:/wv / .vw tulane.edu/-wiser/protozoology/notes/malaria.html.
University
11
Desember 2008. Woodrow CJ, Haynes RK, and Krishna S. Review. Artemisinins. Postgraduate Medical Journal. 2005;81:71-78 Wolfram, S, 2007. Effects of Green Tea and EGCG on Cardiovascular and Metabolic Health. Journal of the American College of Nutrition, 26, 4, 373S-388S. Steel, RA., and Torrie, J.H. 1993. Prinsip Dan Prosedur Statistika suatu pendekatan biometric. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
46
BAB Vlll LAMPIRAN Lampiran 1 . Data kromatogram senyawa standar teh Tabel 8.1. Oambar hasil koromatogram senyawa standar Sampel
Gambar hasil kromatogram
�
···� �
•
i
u� j M '"t
u lJ
.,
J
1
•.•
j
.
I; -·' ·�
. --· . I
!JA
I
1.!} U j�
!
Konsen trasi
0,93
897107
2.120
0.91
16440092
842
4,21
0.92
9 1 7588
20
0,1
0,91
2043673
30
0,15
Berat stand ar
(mg/5 ml) 10,6
J.O -!
:i I'.1
-
.
�... - -.�-
.
.
'
.
..
i
u.;
I
LS 1 1.0
· · - - . - -·
- . ' .
---
1
! :
Area
'
•.• , •.•
Rt
;
�
... �
1
i;
j
i �
tA �- -� I
•
-
·-·�.
'
·�"��r· 't� .. ' ' ' • I • • " o.au. !W jolol
GC
1.0
..,
... 1
··'; ; IM ,; i
.., t
�-'
0.�
, ·, • '
--
---.._, ..,... --:-- .�-
.
.
'
'
-�-
.
'
.
'
� , .. .. ..
CG
...�
I .I
· ---. •
...,.
:0
--.
... i 0 , ,
. _
""";""'
,
1
�· I j n :
... t; _ · ·� · -_ •
I
.
I
'
! --..-.
•
I.Nnd• rw.
.
lW}
.
--
,
'
"
47
GCG
J.t;
u� t
u.� uj uj "'J
t
I
•
..
_ ...
I
- -. .
.
' • ..,.-.--
.
'
.
.
•
180
0,9
0,91
3687878
440
2,2
0,92
885147
2.360
1 1 ,8
1,32
8568696
80
0,4
..
___.,_
...�
<
u�
... �
,_,j ··j u ·i
•..
•; !'
,' :'-
�·�,. ;._��.-"��
-�-
1
a
I
s
t
'
.��--.,.,
1
•
t
tnm.. tla c.;..a
EGCG
1 880798
-- �.--�:
.
-- -
t.l �
i
0,91
;,, j
.... t t-2 1
-� .
!
2
..
j
•.•
.
�
400
.,.._,_
'-U.O... U.. j�
.
u�
ECG
1292851
0,4
.
.: \ . � .,......,__...,__,..., "'-.or-r ---.-:' I I l • I . , I
... ...:
g
0,92
80
.,
,
'--' f
EGC
13847808
't
u-.1 i
,.
0,91
n
'
J.Q..;
u.;
·
1.1
j
t
··
I
!
I
1
u�
i
u{-
.. ,
l
c
i
. . .. ,·
"
-· ..
..
I
I
-
�·
J
-
-
I
�
I
l
'
I
I
..
.. -. .....
•., .
.... ..;:
I �! •
tl!'·
_ .
t.I
�
.. �
.
.
·' .... ... ;:
.
-
.
-
--
· ·- ·. -
'
-- -
.
1
-
-
·-.
.
� N
.
Kaempferol ..
-
-.
•I '·
-
.
,
� - .-
'
,
' .
-
--
-
---
-..-· '
.
.
_
u
48
Myricetin
1 ,05
..
i •
f
� ·�
; '
10504682
50
0,25
.
... .. ...
.. --
- -·
'
;
--.
-- -- ·. " .
_ ...._ _ ...
49
Lampiran 2 . Data kromatogram ekstrak etanol teh hijau (4,2 mg)
Chrom Type :
1
HPLC Channel
1 .4 i -�
1 . 2 -'-�
-��
1.0
-3
�
0.8
� 0 . 6 --3
i
-�
0.4
.=.
0.2
p I\
J
1 o
\J\ �
'
- -1 L
-�
0.0
' I .,
!
)
\ \-
fIt
'"t I'
I'
iII'
1
Acquisition Metho d : Column Type:
--
--·
.
.
-
-
.•! . .,..,., -,- ,... _, ,,.,. � ,.,.,-_,...,. , '"'"' : ,..,.. _ ,,..,. 1 ..,... .,.,. r:,.,.. , •• ,.,.., , ,..,. , 1,..,.. . ._.,.., .... . .... 1 .� _.., ,..,. ,.,.. , ,, ,.,. ,..,. , , _ ,, . ..,.., �;·:-,.., i.I• _.., r-:.,"'!'it tII' t!'II . ijI .,...
2
3
4.
s
Retentioxt Time (min)
7
antioksidan sampel 1-8 Developed b y :
?urnp A Type : L - 7 1 0 0 Solvent A : metanol
�ethod Description:
6
antioksidan sarnpel 1 - 8
Chrom Type :
solvent B :
HPLC Channel
:
a
9
10
Wahyu Maranatha Air
1
;eak Quant itation: AREA calculation Method : AREA%
No .
-----
1 2 L_ s 6 7
Area
RT
,
-- --- -------·
0 . 66
266813
4 . 874
0 . 92 1 . 13 4 . 51
3592890
65 . 62 7
6 . 97 7 . 87 9 . 40
1523272 5498 41132
27 . 82 4 0 . 1 00 0 . 751
36666
0 . 67 0
8464 . .
BC
Cone 1
·-· --------------- ------- ___ _ .___________
-
----
BV
vv
VB BB BB BB BB
0 . 155
- ·----- ---------·------··· . -- ----
5474735
100 . 0 00
50
Lampiran 3 . Data kromatogram fraksi heksan teh hijau (7,2 mg)
1
HPLC Channel
Chrom Type :
1 . 0 --:
0.8 -1
-
0.2 -::
:\
0.0 --=---
. i
. \'\
.J
-.....
I
0
Retention
II . ,
.
9
8
7
6
s
3
2
1
· � .·-r-- ..----"" � · .
op---
Tilll8 (Jilin)
10
an sampel 1-8 Maranatha Developed b y : Wahyu
antioksid Acquisition Method: : e Column Typ Pump A Type : L-7 100 Solvent A: metanol
Solvent B : Air:
1-8 antioksidan sampel Method Description:
HPLC Channel
Chrom Type :
:
1
AREA Peak Quanti tat ion : : AREA% hod Met on ati cul Cal - --- - ---- ·- -··--
----- --
--·
2 3 4
1 . 13 2 . 48
5 6
4 . 39
··-- --·
...- ---
-- -
----� -
0 . 043 0 . 210 5 . 54 9 0 . 227 0 . 069
2154
25.198
788539
7 . 79 -------
5 . 647
7094
6 . 34 - - -
--- ---
·-·
-
-
,.
____
--
- ·- ---
-
------�
3129387
·- ··--
,...
.
---· ...1
-�-
.: - ... ""' - ....
-· -
1
----- - -
60 . 72 9 2 . 32 8
656 3 17 366 5
5 . 19
8 9
-·- - - -
1354
3 . 22
7
- --
17 67 10 190 045 7 72851
0 . 67 0 .92
1
Cone 1
Area
RT
No .
I
_..,._
- -·
----
--- - -
--�-
10 0 . 00 0 - - ------- -
- --"-
C..
- ----�
........ .
51
Lampiran 4 . Data kromatogram frak:si etil asetat teh hijau (22,6 mg)
Chrom Type : HPLC Channel
1
'i . . . '
tI
.
!\
� 0 -: ..
i.
0
.
\
\
�p
· · ; · ·'T"' t '" l ' " "i'· · 1"· 1
2
3
:· ·
1""1" ,.�..:1''1 ·
4
Retention
s
Time
6
·
· : · ..;. . . .' · ·: · ' 7
8
, . --:� 10
(min)
Acquisition Method : antioksidan sampel 1-8 Column Type: Developed by: Wahyu Pump A Type: L-7100 Solvent A: metanol Solvent B : Air Hethod Description: antioksidan sampel 1-9
Maranatha
Chrom Type: HPLC Channel : 1 Peak Quantitation: AREA
Calculation Me thod : AREA% No.
RT
Area
1
0 . 95
29745994
94 . 62 6
2
1.12
1699432
5.374
31435316
100.000
Peak
rejection level:
BC
Cone 1
BV TBB
0
52
Lampiran 5 . Data kromatogram fraksi butanol teh hijau (38,8 mg)
Chrom Type :
4
3
::-
�
�
2
i
"1 �
{i
-�
[i
!\
1
/ \,
-j-
' l -
r� \
I
\
i
0
1
� � .., '1
--
....
HPL C Channel
"l
�
-
-t ,
;
\
-
0
' !
?urop A Type : Solvent A :
--
-
..
2
1
dcquisition Method: Column Type :
·---
-
--I
3
--
·�·""t
J
Retention Time (min)
' I
7
·
. :�'
: 8
9
'
10
antioksidan sampel 1-8 Developed b y :
L- 7 1 0 0
metanol antioks idan sampel
Method Description:
6
5
4
Chrom Typ e :
1�8
Wahyu Maranatha
Solvent B :
HPLC Channel
:
Air
1
Peak Quantitation: AREA Calculation Method : AREA%
No . -- -·· ·
1 2 3
4 5
RT
Area -
· --------
·---·" -
Cone
-
·
1
-- --
0 . 75 0 . 93
5268434
1 6 . 2 11
263 14939
8 0 . 972
1 . 12
911292
2 . 22
2241
2 . 804 0 . 007
0 . 006
2029
4 . 43 ·----
___ ...
·-- ---
32498935 --
Peak rejection level :
---
.
___ .
..------------·
100.000
·-----
0
53
Lampiran 7 . Data kromatogram fraksi air teh hijau (38,8 mg)
1
Chrom Type: HPLC Channel
o.s ] 0.
�
:;
4
:J
0.3
I
""1
I; .;
·
i
I� i !\
_.: � ·• -t ,
0.2
0. 1
I
l ·
�.
1
0.0
··
:
I
I
I
\
;
\.......
j
'
-
-,-..-r-:- ... _
1
0
-
-
-
--·
' T n. I' 'l" '
- 'I.
-
·
2
, .
5
4
3
6
8
7
10
9
Retention Time (min) Acquisition Method: Column Type:
antioksidan sampel 1 - 8
Developed by: VJahyu Maranatha
Pump A Type : L - 7 1 0 0 Solvent A: metanol
Method Description: antioksidan sampel 1 - 8
Chrom Type:
Solvent B : Air
HPLC Channel
:
1
Peak Quantitation: AREA Calculation Hethod: AREA% RT
No. - --·-
-
1 2 ··-
0.79 7 . 89 ---- -
- -
-
-
--
---
---
-
- -
2333197 -
- -
-
-
-
-
-
- --
-
-
---
--
2327273 5924.
- --
- - -- -
-···
-·
BC
Cone 1
Area
- - - - - - -- -- --- -
-
-
- --
-
--·
--- -
- ---·
·
-··- -
BB BB
99.746 0 . 2 54 -··
----·---
--
100.000
-·-·
- -- -- --- -----
··--
Peak rejection leve l : 0
54
--·---
Lampiran 8. Hasil uji aktivitas antimalaria Tabel 8.2. Penghambatan senyawa flavonoid teh, ekstrak, fraksi-fraksi teh terhadap P.
falctparum
I Do sa 2C
l. EGCG
0.000000 1 0.001
I
0.01 0.1 1
2. EGC
10
0.0000001 0.001 0.01 0.1 1 10
J. ECG 0.0000001
II
0.001 0.01
�
0.1
,,
I
10
4.CG 0.0000001
� • I
0.001 0.01 0.1
1
I
10
5.GC 0.000000 1
L � II
0.001
O.ot 0.1
1
10
6.EC 0.000000 1 0.001 0.01 0.1
I
10
7.GCG 0.0000001 0.001 0.01 0.1
I
s.c
10 0.0000001 0.001 0.01 0.1 I
Average
(%)
Parasitemia
%) 5 5 5.5
6 3 .5 3 .5 5
7.5
5.5 4.5 6 3.5
8 8
9 3.4
4
6
8
4.5 4 3 5 5
8.5 5 7 5
4
4
8
8.5 7.5 7.5
7. 5 2
6.5 5.5 7 3.5 6.5 7
6.5 6.5 4
3.5 5.5
Growth rate
Growth Average
Rate
Total
Inhibition
7
96.5 96.5 94 93
5.75 5.5 4.5 4.75 4.75 5.25
100.00 95.65 78.26 82.61 82.61 91.30
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 4.35 21.74 17.39 17.39 8.70
95 92 .5 94.5 95.5 94 96.5
6 7 7 6.5 2.5 5
94 93 93 93.5 97.5 95
5.5 7.25 6.25 5.5 4.25 4.25
100.00 131.82 113.64 100.00 77.27 77.27
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 -31.82 -13.64 0.00 22.73 22.73
92 92 91 96.6 96 94
4.5 8 9 3.5 5.5 4.5
92 91 96.5 94.5 95.5
6.25 8 9 3.45 4.75 5.25
100.00 128.00 144.00 55.20 76.00 84.00
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 -28.00 -44.00 44.80 24.00 16.00
6 5.5 3.5 4.5 3.5 6.5
94 94.5 96.5 95.5 96.5 93.5
7 5 3.75 3.75 4.25 5.75
100.00 71.43 53.57 53.57 60.71 82.14
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 28.57 46.43 46.43 39.29
3 3.5 3.5
92.5 96.5 96.5 97 96.5 96.5
8 4.25 5.25 4 3.75 3.75
100.00 53.13 65.63 50.00 46.88 46.88
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 46.88 34.38 50.00 53.13 53.13
6 8.5
94 9 1 .5
100.00 121.43 107.14 107.14 107.14 35.71
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 -21.43 -7.14 -7.14 -7.14 64.29
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 0.00 16.00 24.00 8.00 16.00
100.00 100.0() 100.00
0.00 11.54 38.46 46.15 15.38
Gro1\1h rate 95 95 94.5
94
96.5 96.5
92 95.5 96 97 95 95
9 1. 5 95 93 95 96 96 92 9 1 .5
Parasitemia
(%) 6.5 6 3.5 3.5 6
7.5
3.5 3.5
93.5 94
95.5
(%)
('V•)
92.5 92.5 92.5
7.5 7.5 7.5 3
92.5 92.5 92.5 97
7 8.5 7.5 7.5 7.5 2.5
93.5 94.5 93
6
6.2.'i 6.25 5.25 4.75 5.75 5.25
100.00 100.00 84.00 76.00
3.5
94 93 96.5 94 95 96.5
6.5 5
93.5 95
3 .5 5.5
94.5
6.5 5.75 4 3.5 5.5
100.00 88.46 61.54 53.85 84.62
98
96.5 93.5 93
93.5 93.5 96 96.5 94.5
7
3.5 6 5
4
96 96.5
92.00
84.00
17.86
JOO.OO
100.00
55
10
5
95
5
0.0000001
4
96
0.001
97
0.01
3 5
0.1
5 5
10
5
'- F.hexan
I I
1
10. F.air
4
96
4
5
95
4
95
2
98
95
2
98
95
2
98
95
2
98
8
92
8
92
0.00 I
4
96
4
96
0.01
4
96
4
96
0.1
4
96
4
96
1
4
96
4
96
10
3
97
3
97
7.5
92.5
7.5
92.5
5
95
5
95
0.01
5
95
5
95
0.1
5
95
5
95
1
4.5
95.5
4.5
95.5
10
4
96
4
96
lL E.Teh hi jau
0.0000001 0.001
12. F.etil
8
92
8
92
0.001
6.5
93.5
6.5
93.5
0.01
6
94
6.5
93.5
0.1
5
95
5
95
1
5
95
5
95
3.5
96.5
3.5
96.5
0.0000001
� I.
5
0.0000001
.
I
95
lO
13. F.Buta
76.92
100.00
23.08
3.5 3.5 3.5 3.5
100.00 100.00 87 50 87.50 87.50 87.50
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 0.00 12.50 12.50 12.50 12.50
8 4 4 4 4 3
100.00 50.00 50.00 50.00 50.00 37.50
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 50.00 50.00 50.00 50.00 62.50
7.5 5 5 5 4.5 4
100.00 66.67 66.67 66.67 60.00 53.33
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 33.33 33.33 33.33 40.00 46.67
8 6.5 6.25 5 5 3.5
100.00 81.25 78.13 62.50 62.50 43.75
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 18.75 21.88 37.50 37.50 56.25
100.00 88.89 83.33 66.67 61.11 55.56
100.00 ]00.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 11.11 16.67 33.33 38.89 44.44
100.00 25.00 12.50 1.00 0.00 0.00
100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
0.00 75.00 87.50 99.00 100.00 100.00
0.0000001
9
91
9
91
0.001
O.QJ
8
92
8
92
7.5
92.5
7.5
92.5
I
6
94
6
94
5.5
94.5
5.5
94.5
5
95
5
95
9 8 7.5 6 5.5 5
8
92
8
92
8
0.1 10
Artemisinin 0.0000001
0.001 0.01 0.1
2
98
2
98
1
99
I
99
0.8
99.2
0.8
99.2
1
0
100
0
1 00
10
0
100
0
100
2 1 0.8 0 0
.
•.
56
r>osage (mg/rnl)
Growth Rate
{%)
Inhibition
4
100
0
4
3.95
99
1.25
3.9
4
3.95
99
1.25
3.9
3.8
3.85
96
3.75
Average(%)
Parasitemia(%)
Parasitemia(%)
Average (%)
DO
A 02
B,D2
D2
0.000000 1
1.75
4
4
0.00000 1
1.75
3.9
0.00001
1.75
o:ooo1
1.75
Quersetin 2,lgr
0.001
1.75
3.6
3.5
3.55
89
11.25
0.01
1.75
2.6
2.5
2.55
64
36.25
0.0000001
1.75
3.9
4
3.95
100
0.00
0.00000 1
1.75
3.9
4
3.95
100
0.00
0.00001
1.75
3.9
3.8
3.85
97
2.53
0.000 1
1.75
2.9
2.7
2.8
71
29. 1 1
0.001
1.75
2.9
2.7
2.8
71
29.11
0.01
1.75
2.4
2.6
2.5
63
36.71
0.0000001
1.75
4
4.1
4.05
100
0.00
0.00000 1
1.75
4
4.1
4.05
100
0.00
0.00001
1.75
4
3.9
3.95
98
2.47
0.0001
1.75
3.9
3.8
3.85
95
4.94
0.001
1.75
3.1
3
3.05
75
24.69
O.Dl
1.7 5
3
3
3
74
25.93
0.0000001
2.83
3.7
3.6
3.5
100
0
0.000001
2.83
3.5
3.5
3.5
100
0
0.00001
2.83
3.4
3.4
3.4
85.71
14.29
0.0001
2.83
3.2
3.3
3.25
92.86
7.14
0.001
2.83
3.2
3.5
3.35
97.14
2.86
0.01
2.83
3.3
3.5
3.4
85.71
14.29
ICaeiiiJlferol 2gr
Gallic Acid 2.7 gr
Miricetin 2.1gr
57
Lampiran 9 : Hasil uj i aktivitas antimalaria kombinasi Persen Pertumbuhan dan persen penghambatan dari
Kombinasi Artemisinin +
Fraksi Etil Asetat teh hijau terhadap P.falciparum. ( Persen parasitemia dihitung dalam 5000 eritrosit) Tabel 8.3. Penghambatan kombinasi Artemisinin + Fraksi etil asetat Teh hijau terhadap P. falciparum Konsentrasi
(!!glmL)
% Parasitemia
%
% Penghambatan
ICso
-
0,036
O Jam
48jam
Pertumbuhan
Kontrol neg
0,254
0,542
0,288
10
0,254
0,046
-0,208
1
0 254
0,346
0,092
68,06 61,81
100
0,1
0 254
0,364
0, 1 1 0
0,01
0,254
0,417
0,163
43,40
0,001
0,254
0,473
0,219
23,96
Tabel 8.4. Penghambatan kombinasi Artemisinin + gallocatechin {GC) terhadap P. falciparum
( Persen parasitemia dihitung dalarn 5000 eritrosit) Konsentrasi
% Parasitemia
(!J.g/mL)
O Jam
48jam
Kontrol neg
0,254
0,609
%
%
Pertumbuhan
Penghambatan
0,355
-
ICso Tdk
dpt
ditentukan,
10
0,254
0�030
-0 224
100
1
0 _1_ 2 54
0 044
-0,210
100
konsentrasi
0,1
0,254
0,138
-0, 1 16
100
hrs
0,01
0,254
0,162
-0,092
100
0,001
0,254
0,301
0,047
diperkecil
86,76
Tabel 8.5. Penghambatan kombinasi Artemisinin + Epicatechin (EC) terhadap
P. falciparum
( Persen parasitemia dihitung dalam 5000 eritrosit) Konsentrasi
% Parasitemia
(!!glmL)
O Jam
48jam
%
%
Pertumbuhan
Penghambatan
ICso
Kontrol neg
..1. 0 254
0,553
0 299
10
0,254
0,038
-0,2 1 6
100
ditentukan,
1
0,254
0,058
-0 196
100
konsentrasi
0,1
0,254
0,072
-0, 182
100
0,01
0 254
0, 1 1 7
-0, 137
100
-0,087
100
0,001
0,254
0,167
-
Tdk
dpt
hrs diperkecil
58
Tabel 8.6. Penghambatan kombinasi Artemisinin + Gallocatechin (GC) terhadap P. falciparwn pada konsentrasi lebih rendah ( Persen parasitemia dihitung dalam 5000 eritrosit)
Konsentrasi (�g/mL) Kontrol neg
% Parasitemia 48jam O Jam
% Pertumbuhan
% Penghambatar.
8,538 0,192
7,501 -0,845
-
0,01
1,037 1,037
0.001 0,0001
1,037 1,037
5,882
4,845 6,298
0,00001 0,000001
1,037 1,037
35,409 16,038 8,586
7 335
7,894
8, 1 1 7
ICso
( �g ml / l 0.005
100
6,857 7,080
5,613
Tabel 8.7. Penghambatan kombinasi Artemisinin + Epicatechin (EC) terhadap P. falciparum pada konsentrasi lebih rendah ( Persen parasitemia dihitung dalam 5000 eritrosit)
% Parasitemia 48jam O Jam
% Pertumbuhan
% Penghambatan
ICso
0,01
1,037 1,037
8,098 0, 1 1 5
7,061 -0,922
-
100
(0,000244)
0.001 0,0001
1 ,037 1,037
3
1 ,963 4,645
72, 199
0,00001 0,000001
1,037 1 ,037
7,316 8,956
Konsentrasi
(�g/mL)
Kontrol neg
5,682
(�g/ml)
34,2 1 6
6,279
1 1 ,075
7,919
0
59
Lampi ran 10 : Permasalahan dan penyelesaian teknis selama penelitian .
!.Parameter penelitian yang dalam proposal tidak dapat dilakukan dalam penelitian yaitu paramater antimalaria resisten klorokuin pada P. dikarenakan Fitofarmasi
di
Laboratoriwn
Universitas Airlangga Surabaya sudah tidak
berdasarkan saran 3
Lembaga Ejkman-Jakarta,
falciparom
serta journal
galur FCR-3
Fannakognosi
dan
mengerj akan,
dan
tidak perlu menggunakan P. falciparum galur FCR-
resisten klorokuin , yang terpenting memperoleh ekstrak, fraksi atau senyawa
yang aktif terhadap P. falciparum dibandingkan artemesinin sebagai kontrol positif. Untuk mengatasi kekurangan parameter daya antimalaria resisten klorokuin maka penelitian ditambah daya antimalaria senyawa-senyawa flavonoid teh, yang semula dalam proposal Jtanya 1 pembanding yaitu EGCG maka dalam pelaksanaan ditambah ECG, EGC, EC, GCG, CG, GC, C, kaempferol, mirisetin, kuersetin. Pada awalnya dalam proposal daya antimalaria ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau (5 sampel), EGCG, artemesinin sehingga jumlah 7 sampel pada 2 galur resisten klorokuin dan resisten klorokuin sehingga jumlah
sampel keseluruhan
13
sampel.
Pada
pelaksanaan penelitian tanpa dilakukan. penelitian daya antimalaria resisten klorokuin
maka jumlah keseluruhan ekstrak teh hijau, fraksi heksan, fraksi etil
asetat, fraksi butanol, fraksi air teh hijau, ECG, EGC, EC, GCG, CG, GC, C, kaempferol, mirisetin, kuersetin, dan artemesinin sehingga jumlah sampel sebanyak 16 sampel. 1.
Beberapa parameter penelitian yang tidak
ada dalam proposal penelitian
namun dilakukan dalam penelitian dikarenakan merupakan rangkaian tahap penelitian yang sangat penting yaitu : 1 . 1 . Analisis proksimat meliputi kadar air,
abu, karbohidrat, serat kasar,
lemak kasar, protein. Analisis proksimat bahan ekstrak yaitu teh hijau ditujukan untuk mengetahui tingkat kekeringan dan kadar metabolit primer (protein, lemak, karbohidrat) kulit manggis. Kadar air yang stabil agar tidak rusak dalam penyimpanan berkisar 10%, dikarenakan bila melebihi 13-16% maka bahan tidak tahan dalam penyimpanan dan akan mengalami kerusakan terutama akibat mikotoksin. Selain untuk mengetahui tingkat kekeringan agar teh hijau dapat disimpan pada suhu kamar, anal isis proksimat (protein, karbohidrat, lemak) juga berpengaruh terhadap hasil
60
metabolit sekunder (senyawa aktif) apabila dilanjutkan untuk isolasi senyawa, akan diketahui asal-usul senyawa yang dihasilkan (isolat). Kadar .
metabolit primer akan mempengaruhi kadar senya.wa dan bioa.ktivitas ekstrak. Teh hijau Walini yang diproduksi oleh PTPN Vlll mengandung air 7,15% sehingga sangat aman disimpan pada suhu kama.r dalam jangka waktu lama.
1.2.
Determina.si tanaman ditujukan untuk mengetahui dengan jelas jenis spesies dan varietas tan aman� dikarenakan setiap species dan varietas
tanaman memiliki kadar metabolit primer yang berbeda, kadar dan jenis senyawa yang berbeda sehingga akan memepengaruhi bioaktivitas ekstrak Tanaman teh diambil langsung dari Garut, perkebunan teh dimana teh hijau Walini diproduksi. 1.3. Destilasi etanol, heksan, etil asetat, butanol ditujukan untuk mendapatkan
etanol , heksan, etil asetat, butanol yang murni terbebas dari senyawa toksik terutama bebas dari logam berat sehingga aka.n diperoleh ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau yang aman dan terbebas dari senyawa toksik 1.4. Uji
fitokimia
untuk mengetahui kadar golongan
kualitatif, untuk mengetahui golongan senyawa
senyawa secara
dominan dan golongan
senyawa aktif, serta untuk mengetahui bahwa polaritas pelarutlsolvent menghasilkan kadar fitokimia yang berbeda dan bioaktivitas yang berbeda. 1 . 5 . Uji HPLC ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau menggunakan senyawa senyawa flavonoid teh meliputi ECG, EGC, EC, GCG, CG, GC, C, kaempferol, mirisetin, kuerseti.n
sehingga dapat diketahui kadar senyawa
senyawa flavonoid dalam ekstrak, fraksi-fraksi teh, sehingga dapat diketahui peran setiap senyawa sebagai antimalaria.
1 .6. Uj i antimalaria kombinasi ekstrak, fraksi-fraksi teh hijau, senyawa flavonoid dan artemesinin, didalam proposal tidak dicantumkan · namun judul adalah efek potensiasi, sehingga saran reviewer pada saat dilakukan monitoring evaluasi di Makasar perlu ditambahkan efek kombinasi fraksi teh hijau dan artemesinin. Hasil penelitian (Tabel menunjukkan
bahwa kombinasi
fraksi
etil
asetat
5.6, 5.7, dan
5.8)
artemesinin
61
meningkatkan
daya
antimalaria,
GC+artemesinin,
EC+artemesinin
meningkatkan daya antimalria bahkan sampai tidak bisa dihitung nilai IC50 sehingga konsentrasi perlu diturunkan lagi.
62
