Využití afinitních interakcí při separaci makromolekul
komplex bílkovina-ligand
specifický
stabilní
reverzibilní
Interakce mezi DNA a endonukleasou
základní typy interakcí (iontová,hydrofilní a hydrofobní)
+
prostorové uspořádání (3D struktura aktivního centra)
Elektrostatické interakce
CH2
NH3+
-OOC
CH2
F = 1/d2 F … přitažlivá síla d … vzdálenost
Polární interakce
NH CH2
O
H
O C CH
Hydrofobní interakce
Využití afinitní interakce
• afinitní chromatografie • afinitní srážení • afinitní elektroforesa • afinitní rozdělování
studium aktivního místa enzymu, modifikace, kinetická měření atd.
Afinitní chromatografie
Ideální nosič (matrice)
¾Neměl by interagovat s proteiny (separovanou látkou) ¾Velké množství funkčních skupin (připojení ligandu) ¾Mechanická a chemická stálost ¾Volná, pórovitá struktura ¾Částice stejnorodé, kulového tvaru s dobrými průtokovými vlastnostmi
celulosa
Celulosa je lineární polymer D-glukosových zbytků (až 15000) spojených β(1,4)- glykosidovými vazbami.
Vláknitý, nestejnorodý charakter Mikroheterogenita ( uspořádané x neuspořádané oblasti)
dextran
CH2 O OH
OH
CH2
O
O
O CH2
OH
CHOH
OH O OH
CH2 O OH
OH O
O CH2
Málo pórovitý
O
stabilita 0,2 M NaOH (60 oC) 0,02 M HCl 40 min 110 oC
polyakrylamid NH2 NH2
C O
C O
CH CH2
CH2 CH CH2 CH CH2 CH C O
C O
NH
NH2
CH2
akrylamid
CH CH2
NH
C O
C O
NH
CH2 CH CH2 CH CH2 CH
CH2
C O
C O
NH
NH
NH2
C O
CH2
CH CH2
N,N’-methylen-bis(akrylamid)
Změny objemu náplně sloupců změnou iontové síly
agarosa
OH O
CH2OH
O
OH
O O
CH2 O
O
n
D-galaktosa
3,6-anhydrogalaktosa
Vyšší teploty (nad 40 oC) a vysoké koncentrace látek rušících vodíkové můstky (močovina, guanidin) gel „taje“
spheron CH2 CH3
CH2 CH3
CH2
CH2
C CO O CH2 CH2OH CH3 C CO O CH2 CH2OH CH2
CH3
CH2
C CO O CH2 CH2OH CH3 C CO O CH2 CH2OH CH2
CH3
C CO O CH2 CH2 O CO C CH3
etylendimetakrylát
C CO O CH2 CH2 O CO C CH3 CH2
CH3
CH2
CH2
CH3
CH2
hydroxyetylmetakrylát
C CO O CH2 CH2 O CO C CH3
částečně hydrofobní charakter
C CO O CH2 CH2OH
Velikost částic
5 – 100 µm
Velikost pórů
25 – 50 nm
Povrch
40 – 200 m2/g
Nosiče na bázi SiO2 Merckogel ( velikost částic 0,4 – 0,063 mm) Silasorb (LACHEMA) Merckogel Si (Merck)
vodní sklo
velikost póru
m2/g
exkluzní limit (D)
15 nm
150
50 000
50 nm
50
400 000
100 nm
15
1 000 000
(COOH)2 mlýn
síta upravení povrchu (~ 2% NH4F)
Oddalující článek (ramínko)
přiklady
NH2
CH2
NH2
CH2
NH2
CH2
NH2
CH2
n n 3 3
NH2 COOH NH NH
hydrofilnější články Gly-Gly-Gly Gly-Gly-Tyr Gly-Gly-Cys
n = 4 - 12
CH2 CH2
3 3
NH2 NH CO CH2 CH2 COOH
4 a méně sterické zábrany
8 a více zvlnění „zapletení“ ramínek s ligandy nespecifické (hydrofobní interakce)
nebezpečí denaturace
Ligand
Substrát analog substrátu allosterický efektor kofaktor inhibitor analog inhibitoru Nukleová kyselina nukleotid t-RNA Protilátka antigen Protein inhibitory proteas enzymy Hydrofobní ligandy Chromofory
1. příklad CH3
CH3
CH OH
+
+
C O
NAD
COOH
NH2 C O
+
NADH
COOH
oxamát – akompetitivní inhibitor
AC pomocí ternárních komplexů
COOH
až po nasycení NAD+ studium mechanismu reakce (uspořádaný x náhodný) AMP, NAD+, NADH
stabilita ligandů
laktát, pyruvát
imobilizace malých molekul
2. příklad
využití AC při separaci proteas
1. navázání bílkoviny
hemoglobin – sepharose albumin - sepharose
2. využití přirozených inhibitorů
ovomukoid x trypsin STI x karboxypeptidasy trypsin chymotrypsin
3. cílený výběr proteinů nebo peptidů s aminokyselinovou sekvencí odpovídající specifitě dané proteasy
Chemie afinitní chromatografie
Bromkyanová metoda
OH OH
BrCN
O C N
O
OH
O
kyanát
P NH2 C NH
NH O C NH
P
OH
imidokarbonát O O
C N
P
aktivace: 20 ml agarosy 20 ml dest. vody 2-5 g BrCN
pH 11 (autotitrátor) T 20 oC doba aktivace 8 – 12 min
další postup:
aktivovaný gel se promyje (1 -5 l 0,1 mol/l NaHCO3) ekvilibrace na pH následné reakce (0,1 mol/l NaHCO3) přidá se ligand míchání 16 – 20 hod promytí sorbentu velkým objemem vody a 2 mol/l NaCl
karbodiimídová metoda R1 O C
N
O
pH 4-5
OH
NH
C
C
O
N
R1
P
SH O
P NH2 C
C
NH
N
R2
R2 R1 N C O N CH3CH2
N C N
( CH2) 3
N
CH3 CH3
1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimíd
R2
P
aldehydová metoda -
O O
OH
O
J O4 O
O
O
CHO
CHO OH
P NH2
O O
O
OH
„schiffova base“
OH
N P
NaBH4
podmínky: 0,1 mol/l jodistan, aktivace 24 hod použití:
aktivace nosičů na bázi sacharidů nebo aktivace glykoproteinů
O O
O
N P
stálejší alkylamid odstranění možnosti další vazby
epoxidová metoda
OH
Cl
CH2 CH
CH2
O
CH2
CH
O
O
O
CH2
CH OH
podmínky:
zvýšená teplota silně alkalické prostředí
CH2
CH2 NH P
silanizace
O CH2CH3
O O
Si OH O
CH3CH2
O
Si
O
( CH2) 3 NH2
metanol 24 oC O
Si O
O CH2CH3
γ-aminopropyl trietoxysilan
O CH2CH3
O O
Si
O
( CH2) 3 NH2
O CH2CH3
Průběh chromatografické separace
1. 2. 3. 4.
příprava sorbentu (viz. výše) naplnění sorbentu do kolony příprava vzorku a ekvilibrace kolony eluce a jímání separovaných proteinů
Imobilizovaná reaktivní barviva z chemického hlediska čtyři druhy: 1. dichlortriaziny (studená barviva)
chromofor
N H
N N
Cl N
Cl
2. monochlortriaziny (horká barviva)
chromofor
N H
N N
Cl N
NHR
3. sulfoetery
chromofor
4. trichlorpyrimidiny
SO2CH2CH2OSO3H chromofor
N
Cl
N
H
N
Cl Cl
historie: 50-léta barvivo 68. značka pro GPC 71. první imobilizované barvivo
O
NH2
O
SO3H
NH2 SO3H
Cl O
NH
NH
N
N N
SO3H
Cl
SO3H O
NH
NH
SO3H
Cibacronová modř
Procionová modř
HO3S
HO3S
SO3H N
N
N
N OH
NH N
N Cl
SO3H
HO
NH HO3S
NH
N NH
N
NH
N N Cl
Procionová červeň
SO3H
N
N N
Cl
Imunoafinitní chromatografie
antigen (protilátka)
+
protilátka (antigen)
problémy: 1. při navázání příliš velkého množství ligandu (protilátky popř. antigenu) můžou vznikat problémy při eluci (nemůže dojít ke konformačním změnám)
2. pozměnění vazebného místa pro antigen (protilátku) při imobilizaci na matrici lze řešit vhodnou imobilizační technikou nebo imobilizací komplexu antigen-protilátka
3. disociace adsorbované látky může být velmi obtížná
eluce často za „drastických“ podmínek
Orientovaná imobilizace
Orientovaná imobilizace
eluce 1. specifická desorpce (nadbytkem haptenu)
2. nespecifická desorpce a) změna pH b) snížení hydrofobních interakcí c) denaturační činidla d) chaotropní ionty
typické eluční fáze: glycin/HCl pH 2,5 fosfát/citrát pH 2,8 1 M kys. propionová 50% etylénglykol 8 M močovina 4,5 M MgCl2 pH 7,0 SCN-, I-
hydrofobní afinitní chromatografie
hydrofobní ligand
+
imunoglobuliny ovalbumin BSA β−laktoglobulin
hydrofobní x iontové interakce
1. nosič: imobilizovaný 4-fenylbutylamin (PBA) izolovaný protein: α-chymotrypsin eluce: 50% etylénglykol
NH CH2
2. nosič: imobilizovaný 4-aminobutan izolovaný protein: glykogenfosforylasa b eluce: deformující tlumivé roztoky
NH CH2
3. nosič: imobilizovaný N-(3-karboxypropionyl) aminodecyl izolovaný protein: BSA eluce: 0,5 M NaCl 1,5% SDS 10 % butanol
CH2
4
4
NH2
NH CH2 COO 10 2
-
Kovalentní afinitní chromatografie 1. příklad: imobilizovaný p-chlormerkuribenzoát
NHCO
..... Hg
HgCl
S
+
HS
protein
eluce nadbytkem cysteinu nebo HgCl2
2. příklad: aktivace dipyridyldisulfidem S
+
SH
S
N
N
ekvilibrace nosiče
S
S
HS
S
N
N
N H
HS
S
S
protein
protein
eluce nadbytkem SH-látky
SH
+
HS
protein
ligand: 2-amino- p-nitrofenylmethylfosfonát O NH CH2 CH2 O
P
NO 2
+
Enzym
CH3
enzym: acetylcholinesterasa nanášení vzorku O NH CH2 CH2 O
P
Enzym
+
2PAM
CH3
eluční činidlo: 2-(hydroxyiminomethyl)-1-methylpyridinium jodid
eluce (min. 16 hod) O NH CH2 CH2 O
P CH3
2PAM
+
Enzym
Chelatační afinitní chromatografie
Zn2+ < Cu2+ > Ni2+ > Co2+ > Fe2+ > Mn2+ > Mg2+
Chelatační sorbent
kovový ion
N-(2-pyridylmethyl) glycin Tris (karboxymethyl) ethylendiamin Karboxymethyl aspartát Iminodiacetát
separovaná látka
aminokyseliny, peptidy a proteiny s His, COO- zbytkem
O
N
O
-
OH2
N
OH2
O O
N
N
2+
Cu
2+
Cu O
OH2
O
O
-
O
OH2
N-(2-pyridylmethyl) glycin
Tris(karboxymethyl) ethylendiamin
O
O O
-
O
N
OH2
OH2
N
2+
2+
Cu O
-
Cu
OH2
O
O O
-
O
OH2
O
Karboxymethyl aspartát
Iminodiacetát
OH2
Komplexy s chelatačně vázaným kovovým iontem HN
O O
-
N NH
n+
Me
Me
O NH
NH
n+
O NH
R
O
R
O
komplex peptidu s COO- zbytkem
komplex peptidu s His zbytkem
OH2 n+
Me
NH2
O
-
komplex aminokyseliny
R
O
provedení
1. imobilizace kovového iontu
2. navázaní separované látky ekvilibrace pufrem se zvýšenou iontovou silou 3. eluce a) snížení pH b) kompetitivní ligand (histidin, imidazol) c) kovový iont
sorbent: iminodiacetát-Sepharosa nasycená příslušným kovovým iontem pufry: 0.2 mol/l NaAc + 0.5 mol/l NaCl pH 7.0, 6.0, 5.0, 4,0 vzorek: hrachový homogenát sledovaný protein: diaminoxidasa (šipka)
purifikace rekombinantních proteinů pomocí His tagu refolding
ekvilibrace kolony: promývání: refolding: purifikace:
20 mM TRIS, 0,5 M NaCl, 5mM imidazol, 6 M urea, pH 8,0 20 mM TRIS, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol, 6 M urea, pH 8,0 lin. gradient močoviny z 6 M na 0 M při průtoku 0,1 až 1 ml/min 20 mM TRIS, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0 lineární gradient imidazolu do 0,5 M
výhody -využití nosiče pro imobilizaci různých kovových iontů -vysoká odolnost nosiče vůči bakteriální kontaminaci -vysoká vacebná kapacitapro bílkoviny (0,1 – 10 µM/ml gelu) -možnost HP-IMAC a tandemové chromatografie
nevýhody -možnost nespecifických (iontových) interakcí -možnost uvolňování kovových iontů ze sorbentu
Boronátová afinitní chromatografie
B
+
OH
2 H2O
B
OH
OH
B
HO +
O
R2 B
HO
OH
R3
R4
H3O
+
OH
R1
OH OH
+
OH
R1
OH
R2
O
R3 R4
R1 HO B OH
OH
O
R2
R2
B HO
R3
O
R4
R1
R3 R4
O B
R1
OH
R2
O
R3 R4
OH NH
B
OH OH
+
bílkovina
bílkovina
NH
NH
HO H HO HO
CH2 C H C OH C H C H CH2OH
NH
B OH
ekvilibrace: 250mmol/l acetát amonný + 50 mmol/l MgCl2 pH 8,0 eluce: 100 mmol/l TRIS + 200 mmol/l sorbitol
CH2 HO C H H C OH O C H O
C H CH2OH
L (ligand) NAD+,NADP+
dehydrogenasy
ATP, AMP
dehydrogenasy kinasy
Afinitní srážení (afinitní precipitace)
O
1."semi" afinitní precipitace
O
F S O
NH2
H
N
C O C H
N3
N
N N
O H OH
OH
5-p-(fluorosulfonyl) benzoyl-8-azidoadenosin
2. precipitace dehydrogenas a kinas a/ bis NAD [N2-adipodihydrazido-bis (N6-carbonylmethyl-NAD)] b/ bis Cibacron blue
3. precipitace využívající interakce "kov-protein" O
C CH2
H H H H N C C O C C N H H H H H O C CH n 2 O
H O
CH2
CH2
O C O H
C
O H O
Afinitní elektroforéza gel bez afinitního ligandu
gel s ligandem x'
x
-metoda vhodná pro kvantitativní studium interakce mezi proteinem a imobilizovaným popř. volným ligandem -získané disociační konstanty komplexu protein - ligand jsou srovnatelné s hodnotami získanými kinetickým měřením
gel bez ligandu
gel s koncentrací ligandu L
Stanovení disociační konstanty x' x
3 x-vzdálenost, kterou protein urazí v gelu bez ligandu x'-vzdálenost, kterou protein urazí za stejnou dobu v gelu o koncentraci ligandu L K-disociační konstanta komplexu protein volný ligand
1/x-x'
2 1 -1/K
0 -0,2
0,3
6
1/L (10 l/mol)
0,8
Fázové separace
rozdělení směsi proteinů mezi dvě fáze (nejčastěji dextran 500000 x PEG 8000)
využití: 1. dělení podle ligandu 2. dělení celých buněk
afinitní rozdělování
Postup: 1. příprava zásobních roztoků (20% dextran, 40% PEG, 0,1 M fosfátový pufr, fáze s ligandem) 2. namíchání fází (nejčastěji 2g) 3. přidání vzorku 4. promíchání na třepačce ( cca. 5 min) 5. centrifugace (urychlení rozdělení fází) 2000g 2 min 6. odebrání frakcí a proměření aktivity
Fázový diagram PEG8000/Dx500 10
PEG (% w/w) 5
0 0
5
10 Dextran (% w/w)
15
20
Fázový diagram PEG8000/Dx500 Vliv teploty 10
PEG (% w/w) 5
0 0
5
10 Dextran (% w/w)
15
20
Fázový diagram PEG8000/Dx500 Vliv iontové síly 10
PEG (% w/w) 5
0 0
5
10 Dextran (% w/w)
15
20
