Transzgenikus technikák a neurobiológiában általános fogalmak
Némi történeti áttekintés • 1865. Mendel genetikai törvényei – fajta-nemesítés már korábban is! • 1940’s- kémiai (ethyl methanesulfonate, methyl methane sulfate, methyl N-nitrosourea, ethyl N-nitrosourea) és fizikai (pl. radioaktivitás) mutagenezis • 1973: első rekombináns baktérium; 1978: E. coli insulin termelés (Genentech) • Rudolf Jaenisch (1976): első mesterséges vírusbevitel egér embrióba (SV40) • Gordon és Ruddle (1981): tisztított DNS injektálás egysejtes egér embrióba; csíravonal-transzmisszió • 1999: „Enviropig”: trágyában csökkentett foszfor-mennyiség (nyálban: fitáz) • 2000: spider goat • 2003: GloFish • 2009: transzgenikus – csíravonalban örökítő - főemlős (selyemmajom) E Sasaki et al. Nature 459, 523-527 (2009)
Transzgenezis és tenyésztés/keresztezés • GMO: Genetically modified organism - olyan tulajdonsággal rendelkezik, amely “idegen” DNS bevitel eredménye • tenyésztés: egy fajból származó két egyed keresztezése, hogy jobb/hasznosabb tulajdonságokkal rendelkező egyedeket kapjunk - csak a faj egyedeiben megtalálható gének (génvariánsok) kerülnek át egyik egyedből a másikba • transzgenezis: a fajokat a fajra nem jellemző tulajdonságokkal is felruházzuk - transzgén: más fajba/élőlénybe/egyedbe beviendő, génsebészeti eljárással előállított gén: lehet olyan mesterséges gén is, ami a természetben nem is fordul elő - transzgenikus (transgenic) élőlény: mesterségesen, nem tenyésztéssel bevitt gént tartalmaz: a transzgenikus élőlény olyan növény vagy állat, amely más sejtből vagy szervezetből származó genetikai állományt [gén(eke)t] stabil formában tartalmaz [és azokat a következő nemzedékekre átörökíti]. - növény, állat, gomba, baktérium, vírus, tenyésztett sejtek....
Transzgén állatok felhasználása • (alap)kutatási célok • humán betegség-modellek (Alzheimer, parkinson, AIDS, tumorok...) • táplálkozási célok: élelmezési szempontok alapján módosított állatok (GH, hús/zsír arány, stb) • „transpharmers”: humán fehérje, FIX, lactoferrin termelés (kecske, nyúl, disznó, marha) • „xenotransplanters”: humanizált szövetek, szervek transzplantációhoz
etikai és jogi problémák sokasága!
GMO állatok előállítása 1. a konstrukció in vitro előállítása - a gének működéséhez szükséges DNS elemek kellenek a transzgének megfelelő működéséhez is
GMO állatok előállítása 1. a konstrukció in vitro előállítása intron
(locus control region)
- a vektorok származhatnak vírusokból, pro- vagy eukarióta plazmidokból + YAC, BAC (yeast/bacterial artificial chromosome), minikromoszóma
GMO állatok előállítása 1. a konstrukció in vitro előállítása - a transzgén kódoló régió legyen a célnak megfelelő
GMO állatok előállítása 1. a konstrukció in vitro előállítása - a transzgén kódoló régió legyen a célnak megfelelő
GMO állatok előállítása 2. a konstrukció bejuttatása - vagy közvetlenül a sejtmagba, vagy a citoplazmába • fizikai módszerek: - Ca precipitáció - mikroinjekció - elektroporáció - génpuska - lipofekció - elektrofúzió
GMO állatok előállítása 2. a konstrukció bejuttatása - vagy közvetlenül a sejtmagba, vagy a citoplazmába • biológiai módszerek: - vírus-mediált: SV40, retrovírus, adenovírus, lentivírus
• sejtes módszerek: - spermium-közvetített génbevitel - blasztomer-embrió aggregáció (nem specifikus, multigén) - teratokarcinóma /ES sejt transzfer - sejtmag transzplantáció („klónozás”) - genetikailag módosított sejtek bevitele (sejtterápia)
GMO állatok előállítása 3. a konstrukció integrációja - öröklődő: a gén/genom módosítás érinti az ivarsejtet is (ivarsejtembrionális őssejt módosítás) - szomatikus: gén/genom módosítás csak a testi sejteket érinti (a módosítás testi sejtekben történik, a DNS integrálódhat a genomba, vagy lehet episzómális is ) - a genom-módosítás lehet térben és időben szabályozott és reverzibilis is • random: génaddíció - igen kis (<10-6) hatékonyság; pozitív szelekció; gyakori fejfarok konkatamer -> utólagos rekombinációs esély!! - a beépülés helyétől nagyban függ az expresszió - „igazi” transzgenikus állat • irányított: célzott génmódosítás - homológ rekombináció 2x - ált. pozitív és negatív szelekció egyszerre - knockout, knockin, knockdown
Transzgenikus modellek
Genetikailag módosított egér-típusok
Transzgenikus egerek előállítása
Az egér embriogenezis kezdeti lépései
Transzgenikus egér előállítási lépései
Transzgenikus egér leggyakoribb előállítási lehetőségei 1.
Megtermékenyített petesejtbe DNS mikroinjektálás
Transzgenikus egér leggyakoribb előállítási lehetőségei 2.
Pluripotens ES sejtvonalak
Transzgenikus ES sejtvonalak
ES kimérák készítése
Transzgenikus egér leggyakoribb előállítási lehetőségei 3. lentivírus / retrovírus injektálás
Transzgenikus egér leggyakoribb előállítási lehetőségei 4. transzpozon
Szomatikus sejtmag-transzfer - klónozás
Transzgenikus technológiák a neurobiológiában
Irányított mutációk • saját eredmény: NR2B/2C egértörzs - NR2C génbe NR2B cDNS integrálás -> NR2C knockout + NR2B knockin fenotípus
NR2B ISH
„Humanizált” egerek
Génaddíció
Szövet- és sejttípus-specifikus promóterek
Szövet- és sejttípus-specifikus promóterek
Általános, minden sejtben működő promoter
Sejttípus-specifikus promoter
BAC: az expresszió specifikusságának fokozása
BAC: az expresszió specifikusságának fokozása pl. parvalbumin (PV) gén kifejeződése agyban / izomban
A transzgén expresszió időbeli szabályozása indukálható promoterek - gyors és reverzibilis, magas szintű expresszió - alacsony szintű nem-indukált expresszió • indukálható endogén promoterek - endogén kontroll szekvenciák • metallothionein MAF kötődik a MRE-hez Cd/Zn jelenlétében • interferon aktiválható promoter • steroid regulált promoterek • GRE (glukokortikoid- MMTV)
- DE az indukálhatóság ált. nem túl magas + mellékhatások
• mesterséges indukálható promoterek
Indukálható transzgenezis – kettős transzgén rendszerek
Indukálható transzgenezis – kettős transzgén rendszerek
Transzaktivátor rendszerek Tet-off - Manfred Gossen, Hermann Bujard - effektor: VP16 (herpes simplex) transzaktivátor domén + E. coli tetraciklin represszor (TetR) - reszponder: tetraciklin operon 19 bp (tetO) + a kívánt gén - Dox -> transzkripció Tet-on - rtTA: reverz transzaktivátor - Dox -> transzkripció kettős génátírás - 2 minimál promóter: kívánt transzgén mellett pl. reporter gén átírását is szabályozza
Transzaktivátor rendszerek • saját eredmény: PKDkd-EGFP egértörzs - mutáns, EGFP-taggelt PKD (protein kináz D) forma indukálható, előagy-specifikus expresziója
Transzaktivátor rendszerek Gal4/UAS rendszer - élesztő: Gal4 az UAS (upstream activator sequence)-hez kötve indítja az expressziót • indukálható: GVLP - Gal4 + VP16 + LBD∆42 (mutált progeszteron receptor) - induktor nélkül a citoplazmában Hsp70/90-hez köt - induktor: RU486 (anti-progeszteron) - embrionális fejlődés alatt csak nagyon korlátozottan használható
Helyspecifikus rekombinációs rendszerek Cre: P1 bakteriofág rekombináz (LoxP) Flp: élesztő flipáz (FRT) - helyspecifikus rekombináció a „floxolt” vagy „flrted” helyek között -> cis inverzió / kivágódás; trans átrendezés - nem várt hatás: • maradék target hely (+ neo kazetta) hatása • emlős pseudosite-ok: DNS károsodás
34 bp
Helyspecifikus rekombinációs rendszerek - rengeteg szövet-specifikus „deleter” törzs ismert / vásárolható - sejtsors-térképezésre is alkalmas
Fate mapping the descendants of a gene-expression domain. In this example, a tissue-specific promoter (TSP) (for example, the Wnt1 promoter) controls the expression of a cre or FLP transgene. a | The cre (or FLP) transgene is not expressed outside the dorsal neural tube. A reporter transgene is transcribed from a ubiquitous promoter (UP), but no functional gene product is produced outside the dorsal neural tube because Cre (or Flp)-mediated recombination is required to remove the floxed (or flrted) Stop sequences that separate the promoter from the reporter coding sequences (red arrowheads, loxP or FRT sites). b | Cre activity in the dorsal neural tube (red) results in the removal of the Stop sequence and reporter activation (blue). c | Migrating neural-crest cells (blue arrow) no longer express cre or FLP, but the reporter remains activated (blue).
Helyspecifikus rekombinációs rendszerek - természetesen indukálható Cre rendszer is van... fúziós fehérje
Reporter fehérjék termeltetése
élő szövetben / állatban is!
Biolumineszcencia
A Brainbow egér • fluoreszcens fehérjék véletlenszerű rekombinációja / deléciója -> akár 90féle színárnyalat - 3 fluorokróm, egymással nem kompatibilis LoxP helyek
A Brainbow egér • fluoreszcens fehérjék véletlenszerű rekombinációja / deléciója -> akár 90féle színárnyalat - 2 / 4 fluorokróm, invertált elrendezés -> kivágódás és inverzió is lehetséges
A Brainbow egér • fluoreszcens fehérjék véletlenszerű rekombinációja / deléciója -> akár 90-féle színárnyalat - tandem kópiaszám csökkentése -> FRT hely
A Brainbow egér
