Výzkum možností minimalizace obsahů organických škodlivin ve zdrojích pitných vod v Krušných horách
Stanovení obsahů volných a vázaných fenolických kyselin v půdě a v rostlinném materiálu (kořeny, listy, jehlice) dřevin rostoucích v zájmové lokalitě Fláje a v kontrolních podmínkách (nádobové pokusy a hydroponie)
RNDr. Milena Cvikrová Září 2013
Ústav experimentální botaniky AVČR, v.v.i. ; e-mail:
[email protected]
Autor: RNDr. Milena Cvikrová Ústav experimentální botaniky AVČR, v.v.i. Rozvojová 263, 165 02 Praha 6 - Lysolaje, Česká republika E-mail:
[email protected]
© Foto: M.Krtička
Obsah Cíl práce 3 Úvod 3 Metodika 4 Výsledky 6 Stanovení fenolických látek v půdě lokality 6 Stanovení fenolických látek v rostlinném materiálu z lokality 6 Stanovení fenolických látek v půdě a rostlinném materiálu v nádobových experimentech 8 Stanovení fenolických látek v kořenech dřevin v hydroponii Závěr Literatura
2
12 21 22
linami není jednoduchý. Fenoly mohou významně ovlivnit fyziologické procesy vyšších rostlin. Známé jsou jejich inhibiční účinky na vývoj a růst kořene, vliv na vodní hospodářství rostlin, příjem živin kořenovým systémem a stabilizaci dusíku. V mnoha případech působí fenolické látky jako alelopatické inhibitory. Míra těchto účinků závisí jednak na jejich koncentraci v půdě a dostupnosti kořenovému systému rostliny. Bylo zjištěno, že některé fenolické kyseliny v koncentraci vyšší než 10-5 - 10-4 se stávají pro určité rostliny a mikroorganismy toxické. Biologicky dostupné jsou hlavně volné fenolické kyseliny, reverzibilně vázané fenoly jsou příležitostně dostupné a vázané fenoly se považují za biologicky nedostupné. Kvalitativní i kvantitativní rozdíly v obsahu fenolických látek jsou významně ovlivněny rostlinným pokryvem a půdním typem. Extrakce fenolických látek z půdy poskytuje přehled o jejich složení, zastoupení v půdním horizontu a vazbě na součásti půdy. Volné fenolické látky jsou extrahovatelné vodou a extrakce louhem sodným v různé koncentraci zahrnuje také část fenolických látek vázaných na humifikovanou organickou hmotu.
Cíl práce Stanovit vliv různého rostlinného porostu (vrby, jeřáb ptačí, modřín opadavý a smrk ztepilý) na dynamiku fenolických kyselin v půdě ze zájmové lokality Fláje. Ve vzorcích rostlinného materiálu (kořeny, listy, jehlice) stanovit obsahy fenolických kyselin a porovnat je s obsahy těchto látek v kontrolních vzorcích půd a rostlin pěstovaných v definovaných podmínkách (nádobové experimenty). Současně sledovat vliv huminových kyselin na dynamiku fenolických kyselin v kořenech vrb a osiky rostoucích v kontrolovaných podmínkách hydroponie Úvod
Fenolické sloučeniny v půdě Fenolické látky představují důležitou složku půdní organické hmoty. Vyznačují se chemickou reaktivitou, schopností tvořit komplexy a jejich sloučeniny jsou důležité intermediáty při tvorbě humusu. Hlavním zdrojem fenolických kyselin v půdě jsou rostlinné zbytky, lignin, kořenové exudáty a aktivita půdních mikroorganismů. V půdě se vyskytují volné fenolické kyseliny jen v malé míře, většinou jsou vázané jak na minerální tak i na půdní organickou hmotu. K jejich vazbě na minerální složky přispívají zejména jílové minerály v nižších vrstvách půdy. Fenolické kyseliny vázané na organickou půdní hmotu ve formě esterů, éterů a glykosidů tvoří součást funkčních skupin organické molekuly. Fenolické kyseliny se vyznačují značnou reaktivitou a snadno podléhají oxidaci. Výsledkem oxidace je tvorba fenoxy radikálů a chinonů, které mohou dále reagovat s aminokyselinami i vzájemně mezi sebou v reakcích, které vedou ke tvorbě polymerů a humusových látek (syntetická polyfenolová teorie). Nejčastěji se v půdě vyskytují kyseliny vanilová, p-hydroxybenzoová, p-kumarová, ferulová a protokatechová, v menší míře kyselina syringová. Vztah mezi půdními vlastnostmi, biologickou dostupností fenolických kyselin a rost-
Chlorfenoly jako vedlejší produkt dezinfekce pitné vody Zásadní význam z hlediska technologie úpravy vody mají především rozpustné organické látky. Jedná se o složitou směs aromatických a alifatických uhlovodíkových struktur s mnoha typy funkčních skupin (např. amidové, karboxylové, hydroxylové, ketonické). Ze studia již publikovaných materiálů vyplývá, že kontaminace zdrojů pitné vody huminovými látkami je poměrně častým a studovaným problémem. Z vodohospodářského hlediska jsou závadné tím, že při chlorování vody tvoří toxické sloučeniny, tzv. haloformy (trihalogenmethany). Vedle haloformů se vyskytuje celá řada dalších toxických látek, např. chlorfenoly. Chlorfenoly vznikají jako reakční produkt působení chlornanu na fenolické kyseliny. Přestože 3
ve srovnání s huminovými látkami je tvorba těchto produktů daleko nižší, ve vodě přítomné stopy fenolických látek se snadno chlorují a tyto produkty jsou většinou silné kancerogeny.
Obr. 1.: Schéma extrakce volných fenolických kyselin z půdy. 10 g vzduchosuché půdy + 20 ml destilované vody
Metodika stanovení
suspenze intenzivně třepána 16 h ve tmě při 15° C
Extrakce a stanovení fenolických látek v půdě Extrakce fenolických kyselin volných a částečně vázaných na půdní organickou hmotu byla provedena podle metodiky Bruckert et al. (1967), jak je znázorněno na obr. 1 a 2.
centrifugace 5000 x g 15 min
filtrace supernatantu
Extrakce a stanovení fenolických látek v rostlinném materiálu Extrakce fenolických kyselin volných, rozpustných forem estericky a glykosidicky vázaných fenolických kyselin a esterů vázaných v buněčné stěně je podrobně popsána v práci Cvikrová et al. (2006) a znázorněna na obr. 3. Před HPLC stanovením jsou z frakcí volných a stěnově vázaných fenolických kyselin odstraněny lipofilní látky (ve schématu uvedeno jako přečištění). DBK – 2,6-di-tert-butyl-p-kresol byl přidáván pro zabránění autooxidace fenolických kyselin v průběhu extrakce.
sediment odstraněn
čirý supernatant okyselen 4N HCl na pH 2 a 2x extrahován éterem v poměru 1 : 2
éterová fáze vysušena bezvodým Na 2 SO 4 , po oddestilování éteru odparek obsahuje volné fenolické kyseliny
rozpuštění odparku ve 40% metanolu HPLC analýza
Analýza fenolických kyselin Stanovení fenolických kyselin bylo provedeno metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s reverzní fází (RP-HPLC) s UV detekcí, jak je uvedeno v práci Cvikrová et al. (2006). K měření bude použita kolona Waters Spherisorb ODS-2 5µm C18, 250 mm x 4.6 mm. Identifikace a kvantifikace fenolických kyselin bude provedena porovnáním retenčních časů a absorpčních spekter se směsným standardem fenolických kyselin a odečtením koncentrace z kalibrační křivky.
4
Obr. 2.: Schéma extrakce fenolických kyselin částečně vázaných na humifikovanou organickou hmotu.
Obr. 3.: Schéma extrakce fenolických látek z rostlinného materiálu. homogenizace tekutým dusíkem: č.hm. + 80% metanol +DBK 1 : 20
2 g vzduchosuché půdy + 5 ml 1N NaOH + DBK
třepání přes noc (4°C, tma)
sediment promyt 2x10ml 80% metanolu (+DBK)
supernatant I.
půdní suspenze probublána dusíkem, intenzivní třepání 18 h ve tmě při 15°C
centrifugace (18000 RPM)
supernatant II. 1h třepání (4°C, tma)
centrifugace 5000 x g 15 min
centrifugace (18000 RPM)
spojené supernatanty odpařeny na vakuové odparce (50°C) do vodného podílu
supernatant I.
sediment promyt dest. H2O, centrifugace 5000 x g 15 min
sediment
vodný podíl rozpuštěn ve 40 ml H2O, centrifugace (18000 RPM), postupné zamražování, následuje centrifugace k odstranění chlorofylu
supernatant II.
supernatant okyselen 6N HCl na pH 2 a extrahován 2x éterem, éterová fáze vysušena bezv. Na2SO4
vodná kyselá fáze, neutralizace (pH 5.5-6.5), rozdělení na poloviny
spojené supernatanty probublány dusíkem a inkubovány 2 h při 90°C
odparek = frakce 1 volné fenolické kyseliny
přečištění
alkalická hydrolýza 4 h v N2 atmosféře při labor. teplotě (2N NaOH+DBK)
centrifugace (18000 RPM)
supernatant okyselen 6N HCl na pH 2 popř. opět centrifugace
čirý supernatant 2x extrahován éterem, éterová fáze vysušena bezv. Na2SO4
alkalická hydrolýza: 4 h v N2 atmosféře, dále postup jako u sedimentu
extrakt po ochlazení okyselen 4N HCl na pH 2 a 2x extrahován éterem v poměru 1:2
kyselá hydrolýza: 1 h 6N HCl ve vodní lázni pod zpětným chladičem, úprava pH na 2, následuje extrakce éterem
éter oddestilován
odparek = frakce 3 nerozpustné estericky vázané fenolické kyseliny
éterová fáze vysušena bezv. Na 2 SO 4 , po oddestilování éteru odparek obsahuje - vázané fenolické kyseliny -
odparek = frakce 2 rozpustné estericky vázané fenolické kyseliny
rozpuštění odparku ve 40% metanolu HPLC analýza
5
odparek = frakce 4 glykosidicky vázané fenolické kyseliny
přečištění
Výsledky
PA – kys. protokatechová; p-HBA – kys. p-hydroxybenzoová; VA – kys. vanilová; p-CA – kys. p-kumarová; FA – kys. ferulová, AA – kys. anisová; Ø – průměrné hodnoty kyselin ze 4 stanovení
Stanovení obsahu fenolických látek ve vzorcích půd v zájmové oblasti Ve 4 vzorcích půd odebraných ze zájmových lokalit byly stanoveny volné fenolické kyseliny (extrakce H2O) a fenolické kyseliny vázané na půdní organickou hmotu. Ve vodném výluhu byly detegovány v nízké koncentraci kyseliny vanilová, p-hydroxybenzoová a protokatechová (Tab. 1). Tab. 1.: Volné fenolické kyseliny extrahované vodou z povrchové půdní vrstvy uvedené v µg.g-1 suché půdy. PA
p-HBA
VA
1
0,011
0,027
0,073
2
0,020
0,029
0,074
vzorek
3
0,008
0,024
0,070
4
0,005
0,025
0,070
Ø
0,011
0,026
0,072
PA – kys. protokatechová; p-HBA – kys. p-hydroxybenzoová; VA – kys.vanilová; Ø – průměrné hodnoty kyselin ze 4 stanovení
Obsah fenolických kyselin vázaných na půdní organickou hmotu, stanovený ve 4 vzorcích povrchové vrstvy půdy (extrakce 1 N NaOH), byl ve srovnání s obsahem fenolických kyselin ve vodním výluhu výrazně vyšší. V alkalickém extraktu bylo detegováno 6 fenolických kyselin. V nejvyšší koncentraci se vyskytovaly kyselina vanilová a p-hydroxybenzoová (deriváty kyseliny benzoové), v nižší koncentraci následovaly kys. ferulová, p-kumarová, protokatechová a kys. anisová (Tab. 2, Obr. 4).
Obr. 4.: Záznam HPLC analýzy fenolických kyselin v půdních extraktech. A - směsný standard; B, C, D - půdní vzorky
Stanovení obsahů volných a estericky a glykosidicky vázaných fenolických kyselin v rostlinném materiálu (kořeny, listy, jehlice) z dřevin rostoucích v zájmových lokalitách. Charakter rostlinného pokryvu a jeho následný opad (listy, jehlice) ovlivňuje spektrum fenolických kyselin vyskytujících se v půdním substrátu. Z tohoto důvodu jsme provedli analýzu rozpustných fenolických kyselin v jehlicích smrku ztepilého a modřínu opadavého a v listech jeřábu ptačího a vrby jívy. Hodnoty obsahů fenolických kyselin volných, estericky a glykosidicky vázaných jsou uvedeny v tabulkách 3 - 6. V jehlicích smrku ztepilého rostoucího na sledovaném stanovišti bylo v metanolovém extraktu detegováno volných (F1), estericky
Tab. 2.: Vázané fenolické kyseliny extrahované 1N NaOH z povrchové půdní vrstvy uvedené v µg.g-1 suché půdy. vzorek
PA
p-HBA
VA
p-CA
FA
AA
1
23,54
137,69 453,42
46,23
58,38
2,61
2
19,17
165,77 510,20
57,87
62,64
2,87
3
26,88
115,47 398,50
48,94
62,61
2,58
4
15,33
143,47 455,40
60,27
69,08
1,92
Ø
21,23
140,60 454,38
53,33
63,18
2,50
6
(F2) a glykosidicky (F4) vázaných 7 fenolických kyselin - 3 deriváty kys. benzoové (galová, p-hydroxybenzoová, vanilová) a 4 deriváty kys. skořicové (skořicová, p-kumarová, ferulová a kávová) (Tab. 3). V jehlicích modřínu opadavého se ve frakci volných kyselin vyskytovala vedle těchto fenolických látek i kys. chlorogenová (Tab. 4). V listech jeřábu ptačího byla ve velmi vy-sokých koncentracích nalezena ve frakci fenolických esterů kys. kávová, ferulová a p-kumarová
(Tab. 5). V listech vrby jívy bylo stanoveno širší spektrum fenolických kyselin. Bylo detegováno 11 fenolických kyselin (7 derivátů kys. benzoové a 5 derivátů kys. skořicové; Tab. 6). V listech vrby byl zjištěný vysoký podíl estericky vázané kyseliny kávové a kyseliny p-kumarové. Ve frakci glykosidů (F4) byl dominantni obsah kyseliny salicylové a ve snižujících se koncentracích následovaly kys. kávová, gentisová, p-kumarová, p-hydroxybenzoová a vanilová.
Tab. 3.: Obsahy fenolických kyselin volných (F1), estericky (F2) a glykosidicky (F4) vázaných v jehlicích smrku ztepilého. Zkratky kyselin viz tabulka 6. GA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
CA [µg/g]
F1 smrk ztepilý
nd
0,20
0,15
nd
nd
1,44
nd
F1 smrk ztepilý
nd
0,24
0,16
nd
nd
1,43
nd
F1 smrk ztepilý
nd
0,24
0,16
nd
nd
1,45
nd
F1 smrk ztepilý
nd
0,23
0,17
nd
nd
1,46
nd
F2 smrk ztepilý
1,84
2,50
0,34
nd
55,79
7,44
2,80
F2 smrk ztepilý
0,75
2,76
0,45
nd
56,60
7,45
2,78
F2 smrk ztepilý
0,86
2,42
0,47
nd
55,59
7,31
2,73
F2 smrk ztepilý
0,85
1,93
0,40
nd
53,35
7,31
2,75
F4 smrk ztepilý
1,90
48,95
9,40
1,84
2,13
0,94
3,40
F4 smrk ztepilý
2,12
50,70
9,44
1,66
1,98
0,93
3,46
F4 smrk ztepilý
2,35
47,10
9,81
1,40
1,07
0,95
3,44
Vzorek
Tab. 4.: Obsahy fenolických kyselin volných (F1), estericky (F2) a glykosidicky (F4) vázaných v jehlicích modřínu opadavého. Zkratky kyselin viz tabulka 6. Vzorek
GA [µl/g]
PA [µl/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
ChA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1 modřín
3,07
0,09
0,36
0,33
nd
5,68
18,36
nd
F1 modřín
2,07
0,09
0,36
0,33
nd
5,63
15,68
nd
F1 modřín
4,90
nd
2,08
2,53
6,11
3,25
24,53
3,64
F1 modřín
4,88
nd
2,32
2,30
5,69
3,56
24,45
3,57
F2 modřín
19,90
nd
33,68
39,34
3,58
nd
13,21
8,24
F2 modřín
19,93
nd
34,21
39,80
3,46
nd
13,01
8,24
F2 modřín
19,80
nd
35,41
39,90
3,19
nd
13,01
8,24
F2 modřín
16,08
0,12
30,34
40,36
nd
1,47
nd
nd
F4 modřín
15,08
0,11
40,35
40,37
2,86
1,59
nd
nd
F4 modřín
16,60
nd
32,89
42,91
3,87
nd
26,51
4,67
F4 modřín
16,65
nd
33,45
42,95
4,18
nd
27,98
5,37
F4 modřín
19,23
nd
39,27
41,01
2,32
nd
18,92
7,81
F4 modřín
19,24
nd
39,26
41,37
2,27
nd
18,71
7,85
7
Tab. 5.: Obsahy fenolických kyselin volných (F1), estericky (F2) a glykosidicky (F4) vázaných v listech jeřábu ptačího. Zkratky kyselin viz tabulka 6. Vzorek
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
ChA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1 jeřáb
0,12
0,36
0,17
0,56
26,32
2,54
nd
F1 jeřáb
0,12
0,35
0,17
0,56
27,46
2,54
nd
F1 jeřáb
0,13
0,35
0,17
0,56
28,35
2,49
nd
F1 jeřáb
0,13
0,45
0,23
0,74
34,36
2,99
nd
F1 jeřáb
0,13
0,47
0,25
0,73
34,22
2,99
nd
F2 jeřáb
nd
16,20
nd
842,11
nd
440,29
204,94
F2 jeřáb
nd
16,12
nd
840,22
nd
436,73
203,54
F2 jeřáb
nd
17,33
nd
764,83
nd
448,50
203,06
F2 jeřáb
nd
18,92
nd
809,46
nd
457,57
218,83
F2 jeřáb
nd
14,34
nd
739,54
nd
393,77
182,33
F4 jeřáb
nd
24,93
0,58
250,81
50,54
62,49
1,59
F4 jeřáb
nd
24,58
0,60
247,52
50,39
62,41
1,56
F4 jeřáb
nd
32,75
0,59
229,22
45,70
60,42
1,58
F4 jeřáb
nd
32,39
0,89
300,38
53,08
70,71
2,39
F4 jeřáb
nd
30,09
0,89
286,13
50,81
71,37
2,54
Tab. 6.: Obsahy fenolických kyselin volných (F1), estericky (F2) a glykosidicky (F4) vázaných v listech vrby jívy. Vzorek
GA [µg/g]
PA [µg/g]
2,5HBA [µg/g]
p-HBA [µg/g]
2,3HBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
ChA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
p-CA [µg/g]
FA [µg/g]
F1 vrba
0,02
0,33
nd
0,40
nd
0,26
0,06
12,31
nd
nd
0,19
nd
F1 vrba
0,02
0,34
nd
0,40
nd
0,27
0,06
12,33
nd
nd
0,17
nd
F1 vrba
0,01
0,38
nd
0,40
nd
0,28
0,07
12,27
nd
nd
0,19
nd
F2 vrba
9,43
nd
nd
8,53
nd
5,78
230,01
nd
nd
nd
164,63
19,69
F2 vrba
9,43
nd
nd
9,28
nd
6,29
251,95
nd
nd
nd
175,01
21,08
F2 vrba
9,43
nd
nd
9,29
nd
6,14
246,78
nd
nd
nd
172,03
20,30
F4 vrba
9,61
nd
59,30
18,22
4,81
15,30
71,05
nd
nd
522,39
29,97
3,01
F4 vrba
9,68
nd
59,31
19,60
4,83
17,07
73,95
nd
nd
516,19
30,03
3,04
F4 vrba
9,67
nd
46,19
19,59
4,95
17,13
73,95
nd
nd
480,66
30,01
3,03
Stanovení obsahů volných a vázaných fenolických kyselin v půdním substrátu z nádobových pokusů po prvním roce kultivace jeřábu ptačího, modřínu opadavého a smrku ztepilého a po dvou letech kultivace 4 druhů vrb a jejich porovnání s hodnotami v půdním substrátu ze zájmové lokality před započetím pokusu.
Zkratky kyselin: GA – kys. galová; PA – kys. protokatechová; 2,5-HBA – kys. 2,5 di- hydroxybenzoová (gentisová); p-HBA – kys. p-hydroxybenzoová; 2,3-HBA – kys. 2,3 di-hydroxybenzoová; VA – kys. vanilová; CaA – kys. kávová; SyA – kys. syringová; SA – kys. salicylová; p-CA – kys. p-kumarová; FA – kys. ferulová; CA – kys. skořicová; ChA – kys. chlorogenová.
Výsledky obsahu fenolických látek v půdě. Ve vzorcích půd odebraných z nádobových 8
experimentů po pěstování 4 druhů vrb, jeřábů, modřínů a smrků byly stanoveny volné fenolické kyseliny (extrakce H2O) a fenolické kyseliny vázané na půdní organickou hmotu (extrakce NaOH).
Vodní výluhy půdy. Ve vodném výluhu 5 kontrolních vzorků půd před započetím pokusu byly detegovány v nízké koncentraci kyseliny galová, protokatechová, p-hydroxybenzoová, vanilová, syringová, p-kumarová a ferulová (Tab. 7). (i)
Po ročním pěstování smrku, modřínu a jeřábu nebyly v půdních vzorcích detegovány snadno oxidovatelné kyseliny galová a protokatechová a nevyskytovala se kys. syringová (Tab. 8,9,10).
Spektrum vodou extrahovatelných fenolických kyselin v půdním substrátu z nádobových pokusů po prvním roce kultivace jeřábu, modřínu a smrku bylo rozšířeno o kyselinu kávovou a skořicovou a v případě smrku též o kyselinu salicylovou. Koncentrace fenolických kyselin ve vodném výluhu vzorků půd z nádobových pokusů po dvou letech pěstování vrb jsou velmi nízké, téměř na hranici měřitelnosti (Tab. 11). Vzhledem k velmi nízkým koncentracím fenolických kyselin ve vodných výluzích půdního substrátu před i po kultivaci vybraných dřevin je jejich možné riziko ve zdrojích pitných vod v Krušných horách nevýznamné.
Tab. 7.: Volné fenolické kyseliny extrahované vodou z povrchové půdní vrstvy před kultivací dřevin jsou uvedené v µg.g-1 suché půdy z 5 nezávislých stanovení. Vzorek
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
SyA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
půda 1
0,004
0,008
0,016
0,023
0,064
0,019
0,003
půda 2
0,004
0,006
0,017
0,024
0,067
0,019
0,003
půda 3
0,004
0,006
0,017
0,024
0,067
0,020
0,003
půda 4
0,003
n.d.
0,018
0,025
0,040
0,012
0,002
půda 5
0,004
n.d.
0,018
0,025
0,040
0,012
0,002
GA – kys. galová; PA – kys. protokatechová; p-HBA – kys. p-hydroxybenzoová; VA – kys. vanilová; SyA – kys. syringová; p-CA – kys. p-kumarová; FA – kys. ferulová.
Tab. 8.: Volné fenolické kyseliny extrahované vodou z povrchové půdní vrstvy po roční kultivací smrku (hodnoty stanovení ze 4 nádob). pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
CA [µg/g]
smrk
0,017
0,017
0,005
0,015
0,019
0,003
0,012
smrk
0,017
0,016
0,004
0,015
0,018
0,002
0,012
smrk
0,020
0,015
0,003
0,012
0,035
0,001
0,014
smrk
0,020
0,015
0,002
0,011
0,036
0,001
0,014
Vzorek
CaA – kys. kávová; SA – kys. salicylová; CA – kys. skořicová a další zkratky viz Tab. 7.
9
Tab. 9.: Volné fenolické kyseliny extrahované vodou z povrchové půdní vrstvy po roční kultivací jeřábu (hodnoty stanovení ze 4 nádob). pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
CA [µg/g]
jeřáb
0,031
0,034
0,002
n.d.
0,018
0,001
0,014
jeřáb
0,031
0,035
0,002
n.d.
0,018
0,001
0,013
Vzorek
jeřáb
0,014
0,022
0,002
n.d.
0,014
0,002
0,010
jeřáb
0,014
0,022
0,002
n.d.
0,014
0,002
0,010
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
CA [µg/g]
Tab. 10.: Volné fenolické kyseliny extrahované vodou z povrchové půdní vrstvy po roční kultivací modřínu (hodnoty stanovení ze 4 nádob). Vzorek
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
modřín
0,024
0,021
0,001
n.d.
0,011
n.d.
0,005
modřín
0,024
0,020
0,001
n.d.
0,011
n.d.
0,005
modřín
0,014
0,010
0,001
n.d.
0,010
n.d.
0,004
modřín
0,014
0,010
0,001
n.d.
0,011
n.d.
0,004
Tab. 11.: Volné fenolické kyseliny extrahované vodou z povrchové půdní vrstvy po 2 letech kultivace vrb (Salix sp.) (hodnoty stanovení z 15 nádob). pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
pCA [µg/g]
CA [µg/g]
Salix rubra
0,011
0,013
0,011
0,007
0,002
Salix rubra
0,011
0,013
0,011
0,007
0,002
Salix rubra
0,011
0,013
0,011
0,007
0,002
Salix rubra
0,016
0,016
0,002
0,009
0,002
Salix rubra
0,016
0,016
0,002
0,009
0,002
Salix aurita
0,009
0,018
0,001
0,002
0,002
Salix aurita
0,009
0,017
0,001
0,002
0,002
Salix aurita
0,015
0,013
0,001
0,002
0,001
Salix aurita
0,015
0,014
0,001
0,002
0,001
Salix purpurea
0,011
0,008
0,001
0,005
0,001
Salix purpurea
0,012
0,008
0,001
0,005
0,001
Salix purpurea
0,006
0,006
0,001
0,000
0,001
Salix purpurea
0,007
0,006
0,001
0,000
0,001
Salix pentadra
0,010
0,011
n.d.
0,001
n.d.
Salix pentadra
0,010
0,011
n.d.
0,001
n.d.
Vzorek
10
Alkalické výluhy půdy. Obsah fenolických kyselin vázaných na půdní organickou hmotu, stanovený před započetím experimentu ve 4 vzorcích povrchové vrstvy půdy (extrakce 1 N NaOH), byl ve srovnání s obsahem fenolických kyselin ve vodním výluhu výrazně vyšší. V alkalic-
kém extraktu bylo detegováno 6 fenolických kyselin. V nejvyšší koncentraci se vyskytovaly kyselina vanilová a v nižší koncentraci následovaly kys. p-hydroxybenzoová, p-kumarová, ferulová, protokatechová a galová (Tab. 12).
Tab. 12.: Vázané fenolické kyseliny extrahované 1N NaOH z povrchové půdní vrstvy uvedené v µg.g-1 suché půdy ze 6 nezávislých stanovení. Původní vzorek
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
1
0,56
8,91
126,17
150,47
133,35
35,47
2
0,65
8,95
136,43
151,68
128,60
33,45
3
0,67
9,81
148,95
165,15
138,10
35,41
4
0,47
8,43
98,36
122,48
99,216
33,87
5
0,61
9,95
127,99
134,74
122,15
31,26
6
0,56
8,92
122,68
122,98
110,66
28,65
zaznamenán pokles kys. p-kumarové a mírný pokles kys. p-hydroxybenzoové a ferulové oproti kontrolním vzorkům půdy před vysázením (Tab. 15). V alkalickém výluhu vzorků půd z nádobových pokusů po dvou letech kultivace různých druhů vrby byl zjištěný výrazný pokles všech detegovaných fenolických kyselin (Tab. 16).
Po roční kultivaci smrku byly v půdních vzorcích z nádobových pokusů detegovány nižší hladiny fenolických kyselin (Tab. 13). V půdním substrátu po kultivaci modřínu byly nalezeny vyšší hodnoty obsahů fenolických kyselin, které mohou být důsledkem masivního spadu jehlic (Tab. 14). V půdním substrátu po roční kultivaci jeřábu byl Tab. 13.: Fenolické kyseliny extrahované 1N NaOH z povrchové půdní vrstvy po roční kultivaci smrku (hodnoty stanovení ze 4 nádob). GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
1 smrk
0,31
5,92
74,04
86,35
71,20
27,84
2 smrk
0,30
6,25
76,84
88,47
73,22
28,94
3 smrk
0,31
6,25
76,55
87,63
68,31
26,73
4 smrk
0,32
6,24
74,84
86,10
68,71
26,82
Původní vzorek
Tab. 14.: Fenolické kyseliny extrahované 1N NaOH z povrchové půdní vrstvy po roční kultivaci modřínu (hodnoty stanovení ze 7 nádob). GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
1 modřín
0,70
13,94
117,20
189,62
88,12
34,43
2 modřín
0,69
13,91
118,44
190,41
88,98
34,34
3 modřín
0,76
14,12
123,63
172,66
102,29
33,27
4 modřín
0,76
14,07
123,45
173,41
102,27
33,28
5 modřín
0,72
11,55
110,70
135,72
103,31
27,83
6 modřín
0,77
12,79
118,50
156,57
116,03
31,00
7 modřín
0,69
10,35
94,84
113,54
90,01
24,09
Původní vzorek
11
Tab. 15.: Fenolické kyseliny extrahované 1N NaOH z povrchové půdní vrstvy po roční kultivaci jeřábu (hodnoty stanovení ze 6 nádob). GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
1 jeřáb
0,44
8,66
74,16
126,16
60,80
26,63
2 jeřáb
0,43
7,72
64,42
113,99
59,11
25,51
3 jeřáb
0,49
10,02
101,38
171,19
70,37
35,90
4 jeřáb
0,49
10,24
103,86
178,01
72,43
36,54
5 jeřáb
0,77
11,28
107,49
174,78
82,46
37,19
6 jeřáb
0,79
11,29
108,64
180,22
84,29
37,20
Původní vzorek
Tab. 16.: Fenolické kyseliny extrahované 1N NaOH z povrchové půdní vrstvy dvou letech kultivace různých druhů vrby (hodnoty stanovení z 20 nádob). Původní vzorek
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
1 Salix rubra
0,44
7,47
108,24
113,79
108,47
29,00
2 Salix rubra
0,51
7,64
109,59
116,72
107,80
30,42
3 Salix rubra
0,63
6,96
96,62
104,67
86,88
30,13
4 Salix rubra
0,31
5,78
87,61
94,30
81,47
28,53
5 Salix rubra
0,38
6,83
99,51
109,08
90,87
30,74
6 Salix rubra
0,33
6,17
91,53
99,69
91,56
30,25
7 Salix rubra
0,32
6,17
91,51
99,67
91,55
30,56
1 Salix aurita
0,35
4,00
63,89
70,00
66,29
21,61
2 Salix aurita
0,37
3,94
58,13
67,01
62,80
21,42
3 Salix aurita
0,34
3,99
54,73
62,85
59,07
20,53
4 Salix aurita
0,52
7,21
98,50
92,35
85,58
27,26
5 Salix aurita
0,51
7,04
87,73
84,77
80,73
27,36
6 Salix aurita
0,52
7,21
88,42
85,62
81,02
27,25
1 Salix purpurea
0,38
6,08
89,19
89,00
83,52
28,60
2 Salix purpurea
0,38
6,01
91,70
97,26
83,68
30,65
3 Salix purpurea
0,42
6,98
93,34
99,08
95,42
30,44
4 Salix purpurea
0,42
7,20
104,43
112,49
102,13
31,71
5 Salix purpurea
0,37
5,81
80,66
83,84
80,51
27,79
1 Salix pentadra
0,52
7,53
112,07
108,60
102,11
30,12
2 Salix pentadra
0,53
7,57
112,04
108,63
102,12
30,14
Vliv huminových kyselin na dynamiku fenolických látek v kořenech vrby a osiky Stanovení obsahů volných a vázaných fenolických látek v kořenech vrb (Salix aurita, S. purpurea, S. pentadra) pěstovaných v hydroponii s přidáním huminových kyselin v koncentracích 30 a 60 mg.l-1 a topolu osiky (Populus tremula) pěstované v koncentraci HK 60 mg.l-1. Huminové kyseliny byly extrahovány ze vzduchosuché rašeliny z ložiska Branná.
(i)
12
Volné fenolické kyseliny (označené jako frakce F1) byly stanoveny z metanolového extraktu kořenů rozdrcených v tekutém dusíku (tab. 17 – 20).
Tab. 17-20.: Obsahy volných fenolických kyselin v kořenech vrb (Salix aurita, S. pentadra, S. purpurea) pěstovaných v hydroponii s přidáním huminových kyselin (HK) v koncentracích 30 a 60 mg.l-1 a topolu osiky (Populus tremula) pěstované v koncentraci HK 60 mg.l-1. Salix aurita kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
2,5741
1,6485
56,354
15,3388
3,0398
6,2946
nd
6,4158
8,2166
F1
2,5005
1,244
54,7375
14,4931
2,0829
5,1475
nd
5,3881
6,811
ø
2,54±0,05
1,45±0,29
55,55±1,14
14,92±0,60
2,56±0,68
5,72±0,81
nd
5,90±0,73
7,51±0,99
Salix aurita 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
1,3568
23,1619
53,6815
13,2743
nd
1,076
nd
1,3766
5,445
F1
1,3284
23,3792
53,9256
13,3293
nd
1,0479
nd
1,3969
5,5055
ø
1,34±0,02
23,27±0,15
53,80±0,17
13,30±0,04
nd
1,06±0,02
nd
1,39±0,01
5,48±0,04
Salix aurita 60 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
1,3167
17,6589
39,1415
12,375
nd
0,9761
nd
1,0031
4,2076
F1
1,2314
17,3915
38,7075
12,127
nd
0,915
nd
1,0614
4,1769
F1
1,3578
17,7599
38,8296
12,2622
nd
1,0544
nd
1,1778
4,3707
1,30±0,06
17,60±0,19
38,89±0,22
12,25±0,12
nd
0,98±0,07
nd
1,08±0,09
4,25±0,10
Salix pentadra kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
0,1518
1,6718
40,7966
9,735
nd
1,2272
nd
0,9756
5,5911
ø
F1
0,1596
1,5868
40,1648
9,3903
nd
1,4098
nd
1,3926
5,8293
0,16±0,01
1,63±0,06
40,48±0,45
9,56±0,24
nd
1,32±0,13
nd
1,18±0,29
5,71±0,17
Salix pentadra 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
0,8766
20,5511
58,7247
9,0331
nd
0,8956
nd
1,4351
7,8555
F1
0,893
20,609
59,1386
9,0555
nd
0,8938
nd
1,3653
7,7591
0,88±0,01
20,58±0,04
58,93±0,29
9,04±0,02
nd
0,89±0,001
nd
1,40±0,05
7,81±0,07
F1
0,6355
21,6094
49,702
7,9113
nd
0,7153
nd
2,3623
5,8108
F1
0,6343
21,5393
55,6809
8,1328
nd
0,7099
nd
2,3483
5,7994
ø
ø
ø
0,63±0,001
21,57±0,05
53,69±1,43
8,02±0,16
nd
0,71±0,004
nd
2,36±0,01
5,81±0,01
Salix pentadra 60 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
0,5526
18,7823
67,3081
12,1625
nd
1,1047
nd
1,2583
8,3225
F1 ø
0,607
18,3483
65,7444
11,8534
nd
1,1095
nd
1,1947
8,0746
0,58±0,04
18,57±0,31
66,53±1,11
12,01±0,22
nd
1,11±0,003
nd
1,23±0,04
8,20±0,18
13
Salix purpurea kontrola F1 F1
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
0,654
3,992
23,497
18,366
4,910
0,417
nd
4,536
6,768
0,639
5,116
22,988
17,717
4,234
0,369
nd
4,339
6,769
0,65±0,01
4,56±0,79
23,24±0,36
18,04±0,46
4,57±0,48
0,39±0,03
nd
4,44±0,14
6,77±0,001
Salix purpurea 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
0,1935
37,5335
96,0056
17,671
nd
0,4637
nd
1,8231
6,4818
F1
0,1924
37,4388
94,9097
17,751
nd
0,4778
nd
1,8039
6,3799
0,19±0,001
37,49±0,07
95,46±0,77
17,71±0,06
nd
0,47±0,01
nd
1,81±0,01
6,43±0,07
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
0,681
24,078
43,931
33,506
5,577
0,734
nd
5,616
5,306
F1
0,688
23,288
43,571
33,037
5,558
0,776
nd
5,554
5,065
F1
0,512
27,323
44,266
34,808
3,416
1,007
nd
4,228
5,144
F1
0,502
27,463
44,474
35,115
3,484
1,053
nd
4,254
5,273
0,60±0,10
25,54±2,17
44,06±0,40
34,12±1,00
4,51±1,22
0,89±0,16
nd
4,91±0,78
5,20±0,11
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
0,174
nd
20,081
2,422
nd
nd
nd
0,486
3,241
F1
0,176
nd
21,006
2,643
nd
nd
nd
0,515
3,195
F1
0,185
nd
16,892
2,237
nd
nd
nd
0,512
3,213
0,123
nd
nd
nd
nd
ø
ø
Salix purpurea 60 mg HK/l
ø
Populus tremula kontrola
F1 ø
0,160±0,02
Populus tremula 60 mg HK/l
18,646
2,095
19,15±1,55
2,35±0,20
0,506
3,345
0,504±0,01
3,25±0,06
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F1
0,326
nd
29,372
5,291
nd
nd
nd
0,524
3,364
F1
0,298
nd
29,373
5,295
nd
nd
nd
0,529
4,021
F1
0,341
nd
28,408
4,497
nd
nd
nd
0,498
3,684
F1
0,298
nd
27,824
4,878
nd
nd
nd
0,578
3,856
28,74±0,66
4,99±0,33
0,53±0,028
3,73±0,245
ø
(ii)
0,31±0,018
V metanolu rozpustné estericky vázané fenolické kyseliny (označené jako frakce F2) byly stanoveny po alkalické hydrolýze metanolového extraktu kořenů (2 N NaOH v atmosféře dusíku, Tab. 21 - 25). 14
Tab. 21-25.: Obsahy v metanolu rozpustných estericky vázaných fenolických kyselin v kořenech vrb (Salix aurita, S. pentadra, Salix purpurea) pěstovaných v hydroponii s přidáním huminových kyselin (HK) v koncentracích 30 a 60 mg.l-1 a topolu osiky (Populus tremula) pěstované v koncentraci HK 60 mg.l-1. Salix aurita kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
0,2127
6,2382
129,2183
19,1539
nd
2,2244
nd
3,8029
5,7122
F2
0,2352
5,6612
129,0745
19,1736
nd
2,389
nd
3,9384
5,7498
ø
0,22±0,02
5,95±0,41
129,15±0,10
19,16±0,01
nd
2,31±0,12
nd
3,87±0,10
5,73±0,03
Salix aurita 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
6,1591
20,9172
204,8113
16,7916
3,3189
2,6424
nd
4,6632
8,8833
F2
7,2599
23,4637
226,823
19,3542
3,28
3,6693
nd
5,7348
9,0793
6,71±0,78
22,19±1,80
215,82±15,56
18,07±1,81
3,30±0,03
3,16±0,73
nd
5,20±0,76
8,98±0,14
Salix aurita 60 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
12,9915
19,4278
70,5568
19,2483
3,3969
1,6618
nd
1,6223
3,8803
F2
13,1578
22,3372
66,6272
18,3948
3,606
1,7863
nd
1,7207
3,848
13,07±0,12
20,88±2,06
68,59±2,78
18,82±0,60
3,50±0,15
1,72±0,09
nd
1,67±0,07
3,86±0,02
Salix pentadra kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
0,0264
4,0897
100,9742
8,7078
nd
2,1247
nd
5,5718
4,69
F2
0,0248
2,3191
99,0188
8,5163
nd
2,1158
nd
5,4293
4,6187
0,03±0,001
3,20±1,25
100,00±1,38
8,61±0,14
nd
2,12±0,01
nd
5,50±0,10
4,65±0,05
Salix pentadra 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
1,0215
25,8479
116,5238
12,4004
14,4976
4,0827
nd
7,687
5,2392
F2
1,4116
22,6006
102,6669
10,8316
13,1049
3,9894
nd
6,8342
4,7988
1,22±0,28
24,22±2,30
109,60±9,80
11,62±1,11
13,80±0,98
4,04±0,07
nd
7,26±0,60
5,02±0,31
2,1684
17,8636
140,2154
10,1286
10,6834
2,8205
nd
7,5888
4,9305
ø
ø
ø
ø F2 F2
2,1779
17,8266
138,6165
9,9847
10,7462
2,7791
nd
7,4475
4,9393
2,17±0,01
17,85±0,03
139,42±1,13
10,06±0,10
10,71±0,04
2,80±0,03
nd
7,52±0,10
4,93±0,01
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
0,453
14,7428
89,9931
12,1918
1,9791
2,5666
nd
6,0767
4,1794
F2
0,3211
14,2589
95,8717
12,4508
1,1993
2,3853
nd
6,0304
4,1641
0,39±0,09
14,50±0,34
92,93±4,16
12,32±0,18
1,59±0,55
2,48±0,13
nd
6,05±0,03
4,17±0,01
ø
Salix pentadra 60 mg HK/l
ø
15
Salix purpurea kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
nd
8,4346
67,454
31,243
11,027
0,602
nd
9,793
18,230
F2
nd
7,2892
69,911
30,810
10,951
0,622
nd
9,688
18,601
ø
nd
7,86±0,81
68,68±1,74
31,03±0,31
10,99±0,05
0,61±0,01
nd
9,74±0,07
18,42±0,26
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
nd
43,308
147,4256
19,6462
3,7306
0,6701
nd
15,2163
20,969
F2
nd
42,085
146,2335
19,5747
3,8155
0,771
nd
15,1006
21,0289
ø
nd
42,70±0,87
146,83±0,84
19,61±0,05
3,77±0,06
0,72±0,07
nd
15,16±0,08
21,00±0,04
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
nd
98,891
139,832
22,255
11,476
0,854
nd
14,131
18,769
F2
nd
96,756
139,915
21,853
11,594
0,797
nd
14,024
18,599
F2
nd
95,316
118,354
19,979
9,854
0,532
nd
13,813
18,448
F2
nd
97,525
119,956
19,988
9,711
0,509
nd
13,683
18,123
ø
nd
97,12±1,49
129,51±11,98
21,02±1,21
10,66±1,02
0,67±0,18
nd
13,91±0,20
18,49±0,27
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
nd
nd
19,854
7,247
3,166
4,22
nd
5,682
3,642
F2
nd
nd
18,759
7,471
3,425
4,25
nd
5,909
3,771
F2
nd
nd
19,536
7,265
3,424
4,23
nd
5,895
3,785
F2
nd
nd
nd
Salix purpurea 30 mg HK/l
Salix purpurea 60 mg HK/l
Populus tremula kontrola
ø
Populus tremula 60 mg HK/l
20,652
7,470
3,324
4,31
19,70±0,677
7,36±0,105
3,33±0,104
4,25±0,035
5,642
3,824
5,78±0,123
3,75±0,069
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F2
nd
nd
32,983
8,746
10,356
2,586
nd
9,235
4,972
F2
nd
nd
28,812
8,657
10,548
2,385
nd
8,978
5,034
F2
nd
nd
33,461
7,698
9,652
2,100
nd
9,246
5,048
F2
nd
nd
31,451
7,579
8,957
3,010
nd
9,894
5,231
31,67±1,81
8,17±0,53
9,88±0,63
2,52±0,34
9,34±0,34
5,07±0,096
ø
(iii)
V metanolu nerozpustné fenolické kyseliny (vázané esterickou vazbou v buněčných stěnách, označené jako frakce F3) byly stanoveny po alkalické hydrolýze (2 N NaOH v atmosféře dusíku) sedimentu kořenů po extrakci metanolem (Tab. 26 - 29). 16
Tab. 26-29.: Obsahy estericky vázaných fenolických kyselin v buněčných stěnách kořenů vrb (Salix aurita, S. pentadra, S. purpurea) pěstovaných v hydroponii s přidáním huminových kyselin (HK) v koncentracích 30 a 60 mg.l-1 a osiky (Populus tremula) pěstované v koncentraci HK 60 mg.l-1. Salix aurita kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
0,3036
14,014
796,1269
35,7796
nd
2,3691
nd
1,652
8,426
F3
0,5327
14,4314
796,1304
35,6123
nd
2,5006
nd
1,9787
8,515
F3
0,6386
13,8505
793,3101
35,3431
nd
2,36
nd
1,9313
8,464
0,59±0,07
14,14±0,41
794,72±1,99
35,48±0,19
nd
2,43±0,10
nd
1,96±0,03
8,49±0,04
Salix aurita 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
1,8111
35,3017
1423,5904
32,0267
nd
2,6983
nd
12,5477
14,670
ø
F3
1,0734
32,3537
1417,6193
32,0747
nd
2,2554
nd
12,2548
13,623
1,44±0,52
33,83±2,08
1420,60±4,22
32,05±0,03
nd
2,48±0,31
nd
12,40±0,21
14,15±0,74
Salix aurita 60 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
10,1557
40,1007
1267,2094
26,4705
0,0599
2,1931
nd
3,4861
6,3167
ø
F3
11,5298
39,1724
1175,106
24,8197
0,0452
2,7364
nd
3,987
7,8209
10,84±0,97
39,64±0,66
1221,16±65,13
25,65±1,17
0,05±0,01
2,46±0,38
nd
3,74±0,35
7,07±1,06
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
nd
16,1499
1002,4821
21,6247
nd
1,8218
nd
16,2021
9,6411
F3
nd
16,2206
1019,3132
24,0172
nd
1,705
nd
15,995
9,6482
ø
nd
16,19±0,05
1010,90±11,90
22,82±1,69
nd
1,76±0,08
nd
16,10±0,15
9,64±0,01
F3
nd
12,1691
842,235
17,4552
nd
1,1402
nd
11,5695
6,0934
F3
nd
16,4773
1138,843
24,335
nd
1,378
nd
15,7577
8,3282
ø
nd
14,32±3,05
990,54±209,73
20,90±4,86
nd
1,26±0,17
nd
13,66±2,96
7,21±1,58
Salix pentadra 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
4,8713
29,7033
1980,9026
22,2665
nd
1,5879
nd
35,3231
8,8674
ø
Salix pentadra kontrola
F3
4,994
26,4373
1614,208
19,7732
nd
2,1716
nd
30,4949
7,953
4,93±0,09
28,07±2,31
1797,56±259,29
21,02±1,76
nd
1,88±0,41
nd
32,91±3,41
8,41±0,65
F3
6,9905
34,3816
2091,9296
22,7241
nd
1,0517
nd
35,1675
8,631
F3
7,2807
34,9239
1747,3571
23,4988
nd
1,2584
nd
36,6668
9,1753
F3
7,3499
32,9977
1977,1823
21,7068
nd
n.a.
nd
33,2067
nd
7,21±0,19
34,10±0,99
1938,82±175,46
22,64±0,90
nd
1,16±0,15
nd
35,01±1,74
8,90±0,38
Salix pentadra 60 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
1,4111
20,3259
2284,2107
28,2417
nd
1,5394
nd
43,119
9,3604
F3
1,4346
21,8152
2132,3151
26,3033
nd
1,7402
nd
43,7106
11,2093
1,42±0,02
21,07±1,05
2208,26±107,41
27,27±1,37
nd
1,64±0,14
nd
43,41±0,42
10,28±1,31
ø
ø
ø
17
Salix purpurea kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
0,212
21,335
757,833
23,620
0,816
0,477
nd
1,859
9,066
F3
0,222
24,252
797,473
24,065
0,854
0,487
nd
1,927
9,307
F3
0,381
23,433
763,253
24,215
0,752
0,516
nd
1,981
9,282
0,27±0,10
23,01±1,51
772,85±21,49
23,97±0,31
0,81±0,05
0,49±0,02
nd
1,92±0,06
9,22±0,13
Salix purpurea 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
0,5801
105,2642
884,9415
26,6275
nd
1,1044
nd
9,6925
8,952
ø
F3 ø F3 F3
0,5837
104,4671
851,6694
33,3886
nd
1,1113
nd
9,5969
8,8936
0,58±0,003
104,87±0,56
868,31±23,53
30,01±4,78
nd
1,11±0,005
nd
9,64±0,07
8,92±0,04
1,3556
98,8895
1561,9011
23,0846
nd
1,1332
nd
9,5312
8,6785
1,238
94,9615
1344,2665
20,4654
nd
0,9624
nd
9,0282
7,5103
1,30±0,08
96,93±2,78
1453,08±153,89
21,78±1,85
nd
1,02±0,12
nd
9,28±0,36
8,09±0,83
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
nd
81,891
1697,405
21,165
2,650
nd
nd
4,160
10,308
F3
nd
85,757
1520,210
21,070
1,596
nd
nd
4,003
10,292
F3
nd
86,555
1675,861
21,779
2,336
nd
nd
4,058
10,547
F3
nd
100,279
2118,971
25,876
1,876
nd
nd
4,146
12,688
F3
nd
101,660
2104,033
25,638
1,834
nd
nd
4,065
12,469
ø
nd
91,23±9,08
1823,30±271,88
23,115±2,44
2,06±0,43
nd
nd
4,09±0,07
11,26±1,21
ø
Salix purpurea 60 mg HK/l
Populus tremula kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
nd
nd
1267,235
17,095
nd
nd
nd
1,303
14,161
F3
nd
nd
1125,931
16,827
nd
nd
nd
1,305
12,131
F3
nd
nd
1094,785
18,010
nd
nd
nd
1,297
13,245
F3
nd
nd
1189,754
16,531
nd
nd
nd
1,185
12,541
ø
nd
1169,43±66,03
17,11±0,55
1,27±0,049
13,02±0,77
Populus tremula 60 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F3
nd
nd
1838,958
22,294
nd
nd
nd
5,392
13,245
F3
nd
nd
1898,569
21,362
nd
nd
nd
5,384
13,257
F3
nd
nd
1731,152
21,872
nd
nd
nd
4,673
13,123
F3
nd
nd
1789,725
22,050
nd
nd
nd
4,711
14,489
ø
nd
1814,60±61,69
21,89±0,34
5,03±0,347
13,53±0,557
(iv)
V metanolu rozpustné glykosidicky vázané fenolické kyseliny (označené jako frakce F4) byly stanoveny po kyselé hydrolýze metanolového extraktu kořenů (6 N HCl, Tab. 30 - 33). 18
Tab. 30 - 33.: Obsahy v metanolu rozpustných glykosidicky vázaných fenolických kyselin v kořenech vrb (Salix aurita, S. pentadra, S. purpurea) pěstovaných v hydroponii s přidáním huminových kyselin (HK) v koncentracích 30 a 60 mg.l-1 a osiky (Populus tremula) pěstované v koncentraci HK 60 mg.l-1. Salix aurita kontrola
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
15,9467
nd
314,6769
159,0988
22,1098
5,9659
nd
1,4228
2,1301
F4
15,6968
nd
313,6248
159,6842
27,9674
5,8519
nd
1,4246
2,068
ø
15,82±0,18
nd
314,15±0,74
159,39±0,41
25,04±4,14
5,91±0,08
nd
1,42±0,001
2,10±0,04
Salix aurita 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
6,6613
nd
174,4256
74,5667
nd
5,2424
nd
0,7692
2,5586
F4
6,1219
nd
175,082
65,4362
nd
4,0573
nd
0,2947
1,4021
6,39±0,38
nd
174,75±0,46
70,00±6,46
nd
4,65±0,84
nd
0,53±0,34
1,98±0,82
Salix aurita 60 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
10,8131
55,7973
75,506
47,8567
0,1915
4,839
nd
1,7629
1,1581
F4
9,5405
56,2741
67,0745
53,0828
0,2382
4,661
nd
1,176
1,1185
10,18±0,90
56,04±0,34
71,29±5,96
50,47±3,70
0,21±0,03
4,75±0,13
nd
1,47±0,42
1,14±0,03
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
5,92
nd
F4
5,9034
nd
5,91±0,01
Salix pentadra 30 mg HK/l
ø
ø
Salix pentadra kontrola
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
97,7962
96,9069
12,0103
8,3636
nd
1,6589
2,98
99,8604
104,9088
12,0431
8,4396
nd
1,7682
3,0319
nd
98,33±0,66
99,91±1,41
12,03±0,02
8,40±0,05
nd
1,71±0,08
3,01±0,04
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
6,1445
nd
111,6993
119,099
nd
7,024
nd
0,2961
1,3642
F4
5,3519
nd
116,6477
113,401
nd
3,2462
nd
0,3099
0,9896
5,75±0,56
nd
114,17±3,50
116,25±2,31
nd
5,14±2,67
nd
0,30±0,01
1,18±0,26
7,5774
nd
115,146
111,1374
19,9329
6,823
nd
0,4923
2,029
ø
ø F4 F4 ø
Salix pentadra 60 mg HK/l
7,6593
nd
112,627
112,4508
21,9635
6,928
nd
0,4973
2,1176
7,62±0,06
nd
113,89±1,78
111,79±1,90
20,95±1,44
6,88±0,07
nd
0,79±0,004
2,07±0,06
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
0,885
52,865
52,9421
50,0032
nd
5,1983
nd
0,6343
2,512
F4
1,0005
63,1183
61,2243
40,5228
nd
4,8412
nd
0,4581
2,2304
0,94±0,08
57,99±7,25
57,08±5,86
45,26±6,70
nd
5,02±0,25
nd
0,55±0,12
2,37±0,20
ø
19
Salix purpurea kontrola F4 F4
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
1,078
nd
99,998
116,8259
4,580
1,155
339,507
3,312
8,975
1,055
nd
102,089
113,4561
4,824
1,178
341,584
3,359
9,423
1,07±0,02
nd
101,04±1,48
115,14±2,38
4,70±0,17
1,17±0,02
340,55±1,47
3,34±0,03
9,20±0,32
Salix purpurea 30 mg HK/l
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
2,9525
nd
102,9469
102,367
2,78866
3,2922
458,214
1,6641
0,3934
F4
2,965
nd
98,5855
102,149
2,55219
3,3606
455,448
1,6421
0,3188
2,96±0,01
nd
100,77±3,08
103,73±1,70
26,70±1,67
3,33±0,05
456,83±1,96
1,65±0,02
0,36±0,05
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
2,111
46,661
95,745
95,241
1,293
2,899
500,316
3,621
0,200
F4
2,216
47,010
95,836
84,125
1,382
2,928
471,513
3,558
0,204
F4
2,647
48,024
83,027
78,759
1,448
2,931
561,750
3,641
0,120
F4
2,633
45,290
82,880
80,386
1,454
2,933
622,446
3,622
0,108
2,40±0,28
46,66±1,93
89,37±7,41
84,57±1,15
1,39±0,08
2,92±,0,02
539,01±67,16
3,61±0,04
0,16±0,05
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
0,390
nd
45,926
56,645
nd
nd
nd
5,392
1,491
F4
0,394
nd
46,257
58,810
nd
nd
nd
5,385
1,483
F4
0,356
nd
36,879
49,263
nd
nd
nd
4,673
1,487
0,348
nd
nd
nd
nd
ø
ø
Salix purpurea 60 mg HK/l
ø
Populus tremula kontrola
F4 ø
Populus tremula 60 mg HK/l
0,372±0,020
38,964
50,984
42,00±4,15
53,92±3,928
4,718
1,652
5,042±0,348
1,527±0,07
GA [µg/g]
PA [µg/g]
pHBA [µg/g]
VA [µg/g]
CaA [µg/g]
SyA [µg/g]
SA [µg/g]
pCA [µg/g]
FA [µg/g]
F4
nd
nd
21,635
36,824
nd
nd
nd
3,071
0,3986
F4
nd
nd
22,487
38,121
nd
nd
nd
3,294
0,3036
F4
nd
nd
26,610
33,312
nd
nd
nd
3,303
0,5327
F4
nd
nd
27,250
35,550
nd
nd
nd
3,561
0,6386
24,50±2,46
35,95±1,77
3,305±0,17
0,468±0,12
ø
Zkratky kyselin: GA – kys. galová; PA – kys. protokatechová; 2,5-HBA – kys. 2,5 di-hydroxybenzoová (gentisová); p-HBA – kys. p-hydroxybenzoová; VA – kys. vanilová; CaA – kys. kávová; SyA – kys. syringová; SA – kys. salicylová; p-CA – kys. p-kumarová; FA – kys. ferulová 20
kyseliny p-hydroxybenzoové bylo zjištěno ve frakci extrahované z buněčných stěn. Ve shodě se SHEIN et al. (2001) můžeme předpokládat, že akumulace hydroxybenzoových kyselin má úlohu v ochraně buněk vůči biotickému i abiotickému stresu.
V tomto experimentu jsme sledovali změny v obsazích volných a vázaných fenolických kyselin v kořenech 3 druhů vrb (Salix aurita, S. pentadra, S. purpurea) a topolu osiky pěstovaných v hydroponii s přidáním huminových kyselin v koncentracích 30 a 60 mg.l-1. Huminové látky vedle fyzikálně-chemické funkce a biologické funkce v půdě jsou rostlinami využívány jako nutriční zdroj dusíku, fosforu a síry (Arslan a Pehlivan 2008). Předpokladem účinku huminových látek (HL) na metabolismus rostlin je příjem kořenovým systémem. Kompletní mechanismus integrace HL s kořenovou buňkou není dosud přesně známý, ale předpokládá se jejich příjem a sorpce na buněčné membrány. Podle některých autorů mohou být zejména nízkomolekulární huminové látky adsorbovány kořeny přímo, i když zcela kompletní mechanismus, jak interagují s kořenovou buňkou, není dosud znám (Vaughan a Ord 1981, Nardi et al. 2002, Trevisan et al. 2010a). Heterogenní a komplexní molekuly huminových látek mají na rostliny různé morfologické, fyziologické a biochemické účinky. Vedle ovlivnění růstu kořenového systému i celkového růstu rostliny bylo prokázáno, že huminové nízkomolekulární látky přímo ovlivňují expresi genů a signální dráhy (Quaggiotti et al. 2004; Trevisan et al. 2010b). Stimulací metabolismu uhlíku a dusíku mohou huminové látky přímo nebo nepřímo aktivovat fenylalaninamoniaklyázu (klíčový enzym v biosyntéze fenylpropanových látek) a v důsledku toho měnit kvalitativně i kvantitativně hladinu fenolických kyselin v rostlině (Quaggiotti et al. 2004; Nardi et al. 2007). První studie, která se zabývá vztahem mezi huminovými látkami a fenylpropany byla publikována v roce 2010 (Schiavon et al. 2010). Významný nárůst především volné kyseliny protokatechové a p-hydroxybenzoové a v metanolu rozpustných esterech a glykosidech těchto kyselin byl stanovený v kořenech u všech sledovaných dřevin po aplikaci huminových kyselin. Výrazné zvýšení
Závěr V povrchové vrstvě půdy v zájmové lokalitě Fláje byly zjištěny nízké koncentrace fenolických látek. Stejně tak byly stanoveny i velmi nízké koncentrace fenolických kyselin ve vodných výluzích půdního substrátu před i po kultivaci vybraných dřevin. Lze proto předpokládat, že vodou extrahovatelné volné fenolické kyseliny nepředstavují větší riziko pro kvalitu pitné vody ve sledované oblasti. Analýzy rostlinného materiálu (listy, kořeny, jehlice) prokázaly rozdíly v obsahu fenolických látek u vybraných dřevin. Charakter rostlinného porostu může ovlivnit kvalitativní a kvantitativní rozdíly v obsazích fenolických látek v půdě. Stimulační účinek huminových látek na sekundární metabolismus fenolických látek rozšiřuje poznatky o fyziologických účincích huminových látek na rostliny. Lze předpokládat, že nárůst obsahu benzoových kyselin v kořenech dřevin kultivovaných v hydroponii s huminovými látkami se může podílet na zvýšení rezistence ke stresovým podmínkám. Výsledky byly částečně publikovány v odborném recenzovaném časopise Journal of Forest Science.
21
interface. Plant Signal. Behav. 5-6: 635 643. TREVISAN, S., PIZZGHELLO, D., RUPERTI, B., FRANCIOSO, O., SASSI, A., PALME, K., 2010b. Humic substances induce lateral root formation and expression of the early auxin-reponsive IAA19 gene and DR5 synthtic elementin Arabidopsis. Plant Biol. 12: 604-614. VAUGHAN, D., ORD, B.G., 1981. Uptake and incorporation of 14C-labelled soil organic matter by roots of Pisum sativum L. J. Exp. Bot. 32: 679-687.
Literatura ARSLAN, G., PEHLIVAN, E., 2008. Uptake of Cr3+ from aqueous sulit by lignine-based Humic acid. Bioresour. Technol. 99: 7597-7605. BRUCKERT, S., JACQUIN, F., METCHE, M., 1967. Bull. Écol. Nat. Agron., Nancy, 9: 73-92. CVIKROVÁ, M., MALÁ, J., HRUBCOVÁ, M., EDER, J., 2006. Soluble and cell wall-bound phenolics and lignin in Ascocalyx abietina infected Norway spruces. Plant Sci. 170: 563-570. NARDI, S., PIZZEGHELLO, D., MUSCOLO, A., VIANELLO, A., 2002. Physiological effects of humic substances on higher plants. Soil Biol. Biochem. 34: 1527 -1536. NARDI, S., MUSCOLO, A., VACCARO, S., BAIANO, S., SPACCINI, R., PICCOLO, A., 2007. Relationship between molecular characteristics of soil humic fractions and glycolytic pathway and Krebs cycle in maize seedlings. Soil Biol. Biochem. 39: 3138–3146. QUAGGIOTTI, S., RUPERTI, B., PIZZE GHELLO, D., FRANCIOSO, O., TUGNALI, V., NARDI, S., 2004. Effect of low molecular size humic substances on nitrate uptake and expression of genes involved in nitrate transport in maize (Zea mays L.). J. Exp. Bot. 55: 803–813. SCHIAVON M., PIZZEGHELLO, D., MUSCOLO, A., VACCARO, S., FRANCIOSO, O., NARDI, S., 2010. High Molecular Size Humic Substances Enhance Phenyl propanoid Metabolism in Maize (Zea mays L.). J Chem Ecol 36: 662–669. SHEIN, I.V., POLYAKOVA, G. G., ZRAZHEVS KAYA, G. K., PASHENOVA, N. V., VETRO VA, V.P., 2001. Accumulation of phenolic compounds in conifer callus cultures in response to wood blue-stain fungi. Russian J. Plant Physiol. 48: 251-256. TREVISAN, S., FRANCIOSO, O., QUAGGIOTTI, S., NARDI S., 2010a. Humic substances biological activity at the plant-soil 22
POZNÁMKY
23
POZNÁMKY
24
POZNÁMKY
25
Práce byla provedena v rámci expertních činností projektu č. 100018967 „Výzkum možností minimalizace obsahů organických škodlivin ve zdrojích pitných vod v Krušných horách“ (OP Přeshraniční spolupráce ČR/Sasko - Ziel3/Cíl3)
