PENGARUH PENAMBAHAN ZAT-ZAT ADITIF PADA AKTIVITAS PROTEASE OLEH Bacillus megaterium DSM 319 Sumaryanto 1,2), Deden RW 3), Mahyudin AR 3) 1) PPKIT BPPT 2) FFUP 3)P3TB,TAB BPPT
[email protected] Abstract Bacillus megaterium DSM 319 is a microbial neutral protease producer, which is usually used for food and non food (especially for dehairing and bating processes) industries. It was shown in this experiment, that the addition of some additif substances such as sodium benzoat, ammonium quarterner, calcium chloride and zeolite tested as a stabilizer of the ability for protease enzyme activities maintain comparing with control, the application for the leather process was sign the difference performance By using Anova and Duncan methode analysis at the 4 additif substances above from 0%, 0,5% 1% and 2% can be seen that the highest activity of protease reached at 0,862 U with sodium benzoat and the lowest activity at 0,636 U with zeolite. Kata kunci: Bacillus megaterium, protease, zat aditif, anova.
I.
PENDAHULUAN
Akhir-akhir ini banyak industri pangan dan non-pangan menggunakan enzim-enzim seperti protease, lipase, amilase, silanase glukosa isomerase, dll. Nilai ekonomis perdagangan mencapai 18 triliun rupiah di Indonesia, pengguna utama enzim adalah industri pangan (45 %), deterjen dan kulit (34 %), tekstil (11 %), diagnostik dan biomedis (5,5%), pulp dan kertas (1,5 %) (Suhartono, 1992). Penggunaan di industri kulit sudah mulai berkembang dan bisa menggantikan fungsi bahan kimia misal: Na2S, Krom heksavalen dll dan aplikasinyapun dapat digunakan untuk proses pencabutan bulu (dehairing) dan pengkikisan lemak (bating) Protein merupakan komponen utama dalam semua sel hidup, sedangkan enzim adalah kelompok protein majemuk (holoenzim yang terdiri dari protein (apoenzim)) dan suatu gugus bukan protein (kofaktor) yang merupakan bagian enzim yang aktif (active site) (Poedjadi, 1994). Protein yang berfungsi secara biologis, sangat penting memiliki struktur khusus yang dapat didefinisikan dengan baik, adanya gangguan pada struktur ini mungkin menghasilkan denaturasi yang dapat mengurangi aktivitasnya (Baas, 1990). Enzim adalah protein yang terdapat di dalam sel hidup, berfungsi sebagai katalisator dalam sel dan memiliki sifat sangat khas. Proteolitik enzim berperan sebagai biokatalisator untuk reaksi pemecahan protein menjadi molekul lebih sederhana (Wirahadikusuma, 1989). Enzim protease dihasilkan oleh hewan, tumbuhan dan
mikroba. Dibanding dengan hewan dan tumbuhan, mikroba lebih cepat tumbuh sehingga diharapkan produksi enzim berlangsung dalam waktu yang singkat dan dikembangkan dengan pengembangan dan eksplorasi galur. Enzim membutuhkan kofaktor, yaitu senyawa non protein yang dengan protein inaktif (apoenzim) secara kombinasi untuk membentuk kompleks katalitik yang aktif. Bailey dan Ollis (1988), menyatakan bahwa salah satu karakteristik pembeda enzim dengan katalis sintetik adalah seringnya enzim memerlukan kofaktor. Kofaktor bisa berupa molekul organik, seperti ion Fe2+, Mn2+, Zn2+, Na+, Mg2+, Cu2+, Ca2+ atau juga suatu molekul organik komplek yang disebut koenzim seperti tiamin pirofosfat, FAD, serta koenzim A. Beberapa enzim membutuhkan koenzim maupun satu atau lebih ion logam bagi aktivitasnya (Lehninger, 1993). Jenis kation yang telah diketahui dapat mengaktifkan enzim adalah Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Cd2+, Cr3+, Cu3+, Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Al3+, dan H+ (Richardson dan Hyslop, 1985). Ion Mg2+ dan Ca2+ sedikit meningkatkan aktivitas enzim protease dari B. stearothermopillus. Ion logam seperti Ca2+, Co2+, Mg2+, Sr2+, dan Zn2+, dapat melindungi protease asam dari Paecilomyces terhadap inaktivasi oleh panas. Amino peptidase dari E. coli memerlukan Mg2+ dan Mn2+ untuk memperoleh aktivitas maksimumnya, sedangkan aminopeptidase dari B. subtillis di stimulasi oleh ion Co2+ (Suhartono, 1989). O’brien dan Cambell (1975), menyatakan bahwa penambahan
ion Ca2+ dan Mn2+ akan meningkatkan aktivitas protease B. stearothermopillus yang telah di dialisis. Ion logam melakukan peranan yang penting dalam menjaga kestabilan enzim dan berperan sebagai pengatur aktivitas enzim (Harper et al, 1979), sedangkan (Sukarno et al., 1995), menyatakan bahwa pengaruh ion logam terhadap enzim protease sangat bervariasi tergantung dari jenis logam yang bersangkutan. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim protease dapat diurutkan dari yang kecil ke yang besar sebagai berikut: Hg+< Ag+< Fe2+< Li+< Ca2+< Mg2+< Zn2=< NH4+< Na+< K+< Ba2+. Penentuan daya tahan enzim dilakukan pada waktu penyimpanan. Semakin lama penyimpanan dilakukan, aktivitas enzim akan berkurang, karena adanya denaturasi protein dan perubahan substrat (Suhartono, 1989), oleh sebab itu penambahan senyawa kimia dibutuhkan untuk mempertahankan aktivitas enzim semaksimal mungkin dengan bertambahnya waktu penyimpanan. Menurut Peraturan Menteri Kesehatan R. I No. 329/MenKes/PER/XII/76, zat aditif adalah suatu bahan yang ditambahkan dan untuk mempertahankan mutu suatu produk sebelum dilempar ke konsumen. Hal ini yang sering menjadi permasalahan timbulnya bau busuk apalagi proses pemisahan sel-sel dengan ekstraselular enzim pada proses filtrasi, sehingga umur waktu penyimpanan menjadi lebih pendek. Penentuan jenis zat aditif yang tepat bagi enzim didasarkan pada pendekatan empiris total, karena belum ada hipotesis yang mendukung mekanisme stabilisasi enzim oleh zat aditif. Stabilisasi enzim diduga terjadi jika interaksi zat aditif lebih kuat dengan molekul air daripada dengan enzim (Monsan et. al. 1984), sehingga terbentuk klaster yang mencegah unfolding. Sebaliknya jika interaksi zat aditif lebih kuat dengan enzim maka terbentuk ikatan molekul aditif – enzim yang dapat menyebabkan terjadinya denaturasi enzim. Bertitik tolak dari permasalahan di atas pada penelitian ini dikaji zat aditif yang lebih efektif, konsentrasi optimal dan efek penambahan zat aditif terhadap aktivitas protease. II. BAHAN DAN METODE II.1 Bahan dan Alat Mikroba yang digunakan adalah Bacillus megaterium DSM 319 yang berasal dari Laboratorium Bioindustri, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. Untuk pertumbuhan
bakteri ini digunakan media cair. Sedangkan media pertumbuhan adalah molases 3 % dan urea 0,6 %, suplemen dan penunjang analisis adalah Natrium hidroksida, Asam borat, Di-natrium tetra botrat, Asam klorida, Kasein, L-Tirosin, Kalsium klorida, Asam Tri Kloroasetat, Minyak Ikan, Pepton, Folin Ciocalteau, Yeast ekstrak, Natrium benzoat, Amonium Kuartener, Zeolit, dll.. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah lengas penggoyang fermentor, sentrifuga, Spektrofotometer. II.2. Metode Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan percobaan faktorial 5 x 3 (Gaspersz, 1991), dengan dua kali ulangan perlakuan, Sebagai berikut: AO : Tanpa Zat Aditif A1 : Zat Aditif Natrium Benzoat A2: Zat Aditif Ammonium Kuartener A3 : Zat Aditif Kalsium Klorida A4 : Zat Aditif Zeolit Faktor ke dua : Konsentrasi dalam satuan persen di antara 0,05 % - 1%, dengan rancangan percobaan sbb: Yijk = U + i + j + ( )ij + ijk , i = 1, 2, 3, 4, 5 j = 1, 2, 3 k = 1, 2, 3, 4, 5, 6 dimana : Yijk: Nilai respons pengamatan dari faktor zat aditif pada taraf ke-i, faktor pemberian konsentrasi pada taraf ke-j pada perlakuan ke-k. U : Nilai rata – rata yang sesungguhnya i : Pengaruh faktor zat aditif pada -i j : Pengaruh faktor konsentrasi -j ij : Pengaruh interaksi antara faktor zat aditif pada taraf ke-i dan faktor pemberian konsentrasi pada -j ijk : Pengaruh galat percobaan Hipotesis yang diujikan adalah dengan metoda Anova Ho : Tidak ada pengaruh perlakuan H1 : Adanya Pengaruh perlakuan Kriteria uji yang digunakan adalah : F hitung < F tabel, maka Ho diterima F hitung > F tabel, maka H1 ditolak Jika F nyata, maka dilanjutkan dengan uji Duncan II.3 Fermentasi Produksi Enzim Protease dan analisis Isolat bakteri B. megaterium DSM 319 inokulasi secara aseptik sebanyak satu ose ke
dalam medium LB cair 100 ml (terdiri dari pepton, natrium klorida, yeast ekstrak). Inkubasi medium secara bergoyang dengan water bath suhu inkubasi 37oC dengan lama inkubasi 25 jam, biakan bakteri dari media LB cair 100 ml dipindahkan ke media stater 800 ml (terdiri dari molase 3 % dan urea 0,6). Diinkubasi lagi pada fermentor dengan volume kerja 8 l pada suhu yang sama selama 18 jam, agitasi 200 rpm. Produk yang dipanen diseparasi antara sel dengan supernatan. Sedangkan ekstra selular berupa filtrat ditambahkan zat aditif natrium benzoat, ammonium kuartener, kalsium klorida, zeolit, serta secara berkala aktivitasnya diamati. Uji aktivitas enzim dengan metode Bergmeyer dan Grassl (1983). III, HASIL DAN KESIMPULAN.
0,35 0,3
Tabel 1. Pengaruh penambahan natrium benzoat pada aktifitas enzim protease B. megaterium DSM 319. Sumber
Db
Jumh
F.
F tabel
Kuadr
hitung
14
0,3618
8,82
Zat Aditif
4
0,0615
0 ,41tn
Konsentrasi
2
0,0014
22,00**
Konsentrasi
8
0,2989
Galat
60
0,1028
Total
74
0,4646
Zat
0,05
0,01
1,86
2,40
**
Perlakuan
Aditif
Keterangan : tn : Tidak Berbeda Nyata pada taraf 0,05 ** : Sangat Berbeda Nyata Pada Taraf 0,01 Analisis sidik ragam menunjukkan zat aditif natrium benzoat dengan konsentrasi berbeda memberikan respons terbesar terhadap aktivitas enzim protease dari B. megaterium DSM 319. Perbedaan konsentrasi tidak memberikan hasil yang nyata terhadap aktivitas enzim protease dari B. megaterium DSM 319. Kedua perlakuan antara zat aditif natrium benzoat dengan konsentrasi tertentu memperlihatkan hasil sangat nyata terhadap aktivitas enzim protease.
0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0
1
2
3
4
5
Waktu Pengamatan (Minggu) Kontrol
Konsentrasi 0,1%
Konsentrasi 0,5 %
Konsentrasi 1 %
Gambar 1. Hubungan pengaruh Penambahan Zat Aditif Natrium Benzoat dengan berbagai Konsentrasi terhadap Aktivitas Enzim Sebagai kontrol tanpa penambahan zat aditif natrium benzoat, aktivitas protease 0,264 U/ml. Nampak efektivitas natrium benzoat setelah penyimpanan sampai minggu keempat untuk konsentrasi 0,1, 0,5 dan 1%, sebaliknya pada minggu kelima akan terjadi penurunan drastis. Berdasarkan analisis sidik ragam memperlihatkan bahwa perlakuan zat aditif
Rata-rata Aktivitas Enzim Protease (U)
Aktivitas Enzim Protease (U/ml.menit))
III.1. Pengaruh Zat Aditif Natrium Benzoat Terhadap Aktivitas Enzim Protease Pada gambar 1 tertera hubungan antara penambahan zat aditif natrium benzoat minggu pertama sampai minggu keempat. Setelah penyimpanan pada suhu ruang 30 0C dan pH 8, terlihat bahwa perlakuan dengan beberapa jenis konsentrasi menghasilkan aktivitas enzim protease yang berbeda.
natrium benzoat dan konsentrasi menunjukkan pengaruh sangat nyata terhadap aktivitas enzim protease dari B. megaterium DSM 319 (Tabel 1.).
Kontrol
0,25
Konsentrasi 0,05 % 0,2
Konsentrasi 0,5 % Konsentrasi 1 %
0,15 0,1 0,05 0 Kontrol
Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi 0,05 % 0,5 % 1%
Perlakuan
III.2.
Pengaruh kuarternair
penambahan
amonium
Gambar 2. Hubungan pengaruh Penambahan Zat Aditif Natrium Benzoat dengan berbagai Konsentrasi terhadap Aktivitas Enzim
Kombinasi konsentrasi dengan zat aditif amonium kuarterner menghasilkan rata – rata aktivitas enzim protease berbeda dengan kontrol 0,146 U/ml, pada konsentrasi 0,05 % aktivitas enzim protease 0,239 U/ml, konsentrasi 0,5 persen aktivitas enzim protease 0,115 U dan pada konsentrasi 1 % aktivitas enzim protease 0,041 U/ml, terjadinya perbedaan aktivitas enzim protease disebabkan karena sifat dari zat aditif amonium kuartener sebagai stabilisator dan aktivator terhadap aktivitas enzim protease sehingga dengan konsentrasi berbeda menghasilkan aktivitas enzim protease yang berbeda. Pada konsentrasi 0,05 % terlihat bahwa aktivitas enzim protease lebih tinggi dibandingkan dengan konsentrasi 0,5 % dan 1 %.
Rata-rata Aktivitas Enzim (U/ml)
III.3. Pengaruh penambahan kalsium klorida 0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0 Kontrol
Konsentrasi 0,05 %
Konsentrasi 0,5 %
Konsentrasi 1 %
Perlakuan
Gambar 3. Aktivitas Enzim Protease dengan Kombinasi Konsentrasi dari Zat Aditif Kalsium Klorida. Dari grafik 3, terlihat bahwa sebelum ditambahkan zat aditif kalsium klorida enzim aktivitas protease adalah 0,246 U/ml, tetapi setelah ditambahkan zat aditif kalsium klorida mengalami penurunan untuk setiap konsentrasi, pada konsentrasi 0,05 % aktivitas enzim protease 0,142 U/ml, konsentrasi 0,5 % aktivitas enzim protease 0,161 U/ml dan konsentrasi 1 % aktivitas enzim protease 0,204 U/ml. Peningkatan aktivitas enzim protease dengan penambahan zat aditif kalsium klorida itu disebabkan oleh ikatan yang terbentuk antara ion kalsium dengan molekul enzim, sehingga terbentuk molekul enzim termolisin mengandung
empat atom kalsium yang sangat penting untuk meningkatkan aktivitas enzim protease. Pada minggu ketiga sampai minggu keempat aktivitas enzim protease dengan konsentrasi 0,05 % dan konsentrasi 0,5 % mengalami penurunan. Konsentrasi 0,05 % aktivitas enzim protease 0,107 U/ml dan pada konsentrasi 0,5 % aktivitas enzim protease 0,095 U/ml, terjadinya penurunan disebabkan karena enzim protease sudah mulai tidak aktif atau mungkin waktu penyimpanan dapat mempengaruhi aktivitas enzim protease, sehingga aktivitas dari B. megaterium DSM 319 menurun. Aktivitas enzim menjadi terhambat oleh senyawa atau gugus senyawa yang digunakan atau disebut efek inhibitor. III. 4. Pengaruh Zat Zeolit Benzoat Terhadap Aktivitas Enzim Protease Terlihat bahwa pada penambahan zat aditif zeolit aktivitas enzim protease dari minggu pertama sampai dengan minggu kelima sudah di bawah kontrol itu disebabkan karena pengaruh sifat zeolit sebagai penukar kation yang terlalu tinggi sehingga enzim menjadi rusak. Menurut Harper (1979), bahwa ion logam melakukan peranan yang penting dalam menjaga kestabilan enzim dan berperan sebagai pengatur aktivitas enzim. Penurunan aktivitas enzim itu mungkin disebabkan karena kandungan zat aditif zeolit yang terlalu komplek. Hasil sidik ragam memperlihatkan bahwa perlakuan zat aditif zeolit terhadap aktivitas enzim protease pada Tabel 2 menunjukkan hasil yang tidak nyata. Tabel 2. Pengaruh penambahan zeolit pada aktifitas enzim protease B. megaterium DSM 319. Sumber
Db
Juml
F.
F tabel
Kuad
hitung
0,05
0,01
1,86
2,40
Perlakuan
14
0,0399
Zat Aditif
4
0,0097
1tn
Konsentrasi
2
0,0037
0,75tn
Konsentrasi
8
0,0265
1,37tn
Galat
60
0,1468
Total
74
0,1867
Zat Aditif
Keterangan : tn : Tidak Berbeda Nyata pada Taraf 0,05
Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian di simpulkan sebagai berikut : 1. Zat aditif natrium benzoat dapat menstabilkan aktivitas enzim protease dan zat aditif kalsium klorida dapat meningkatkan aktivitas enzim protease. 2. Pada konsentrasi 0,5 persen zat aditif natrium benzoat dapat mempertahankan aktivitas enzim protease, serta pada konsentrasi 0,5 persen zat aditif kalsium klorida meningkatkan aktivitas protease. 3. Zat aditif natrium benzoat memiliki karakteristik sebagai stabilisator serta aktivator dan zat aditif kalsium klorida memiliki karakteristik sebagai aktivator dalam mempertahankan aktivitas enzim protease. DAFTAR PUSTAKA 1.
2.
3.
Baas,J.E. Enzyme. Their Application and Biochemical Characterization. Surfactant Science. Series. Library of Conggress Cataloging in Publication Data; 1990. Bailey,J.E dan D.F Ollis. Biochemical Engineering Fundamental. 2nd Edition, Mc Graw-Hill Book Company, New York; 1988. Bergmeyer,H.V, dan M. Grassl. Methods of Enzymatic Analysis. Vol II. Verleg chemi. Weinhein.; 1983.
4.
Darwis, A.A dan Sukara, E. Isolasi, Purifikasi, dan Karakterisasi Enzim. Depdikbib Dirjen Dikti. IPB; 1988. 5. Forgaty,W.M dan Kelly. Development in Microbial Extracellular Enzyme. Di dalam: A. Wiseman (ed). Topics in Enzyme and Fermentation. Biotechnology. Vol III. John Willey and Sons Ltd, New York; 1979. 7. Monsan dan Combess. Stabilization of Enzyme Activity. The Process of Biotech: 84 Europe . Online Publication Ltd. London; 1984. 8. O’brien, R.T dan L.L.Campbell. Purification and Properties of A Proteolytic Enzyme From Bacillus Stearothermophillus. J.Archieves of Biochemistry and Biophysic; 1975. 9. Poedjadi, A. Dasar-Dasar Biokimia . Universitas Indonesia; 1988. 10. Suhartono, M.T. Pengantar Biokimia. PAU Bioteknologi dan Lembaga Sumber Daya Informasi IPB, Bogor; 1988. 11. Sukarno, K. Takahashi, M. Hatano, D. Sakurai. Proteinase from the Liver of Neon Flying Squid: Purification and Properties. Bull. Fac. Hokkaido University; 1995.
