Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 Spojené státy americké Tel: +1 (203) 328-9500 nebo volání bez poplatku ve Spojených státech amerických, Kanadě a Portoriku (888) 329-0255, Fax: +1 (203) 328-9599
WWW.IMMUCOR.COM
Dokumentace a další jazykové verze jsou k dispozici na: www.Immucor.com
PŘÍLOHA
K PRODUKTU
TYPIZAČNÍ SOUPRAVY LIFECODES ® HLA-SSO Test pro diagnostiku in vitro OBSAH Definice symbolů ………………...…………. Sady/činidla podle katalogového č. ..….
1 2
Návod k pouţití ...……………………………….. 4 A. Purifikace genomové DNA ……………….. 4
Úrčené pouţití .…………………………........ Shrnutí a vysvětlení …….………….....….… Postup ……………………..……………..…... Činidla ..…………………………….……… A. Identifikace ..………...………….…….… B. Varování a upozornění .……………….. C. Pokyny pro uskladnění ………………… D. Purifikace a aplikace …………..……..... E. Indikace nestability ………………..…… Poţadavky na nástroje ….………………….
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
B. Amplifikace DNA (PCR) .…………............. 4 C. Hybridizace ………………………………… 5 D. Analýza pomocí nástroje Luminex ……..... 6
Odběr a příprava vzorků ……………...…… Postup ……………………..……………...….. A. Dodávané materiály……………………. B. Poţadované, ale nedodávané materiály, činidla a vybavení….......…
3 4 4
C. Doplňující materiály, které dodá uţivatel…………………………………...
4
Výsledky ……………………………….………… Kontrola kvality ..……………………………….. Omezení postupu …………..…………………... Řešení problémů ……………………………….. Očekávané hodnoty ……………………………. Specifické funkční charakteristiky ………….. Literatura ………………………………………....
6 7 7 8 8 8 8
Omezené licence ………………….……………. Informace o výrobci ………………………........ Pouţité obchodní značky …………..……….... Příloha A……………………..………………….... Gelová elektroforéza …………………..……... Interpretace gelu …….………………………...
8 9 9 9 9 9
4
DEFINICE SYMBOLŮ (Označení výrobku a doplňující dokumentace) Číslo sady
Katalogové číslo
Teplotní omezení
Horní teplotní hranice
Pouţitelnost do
Chraňte před světlem
Mnoţství pro X testů
Nezmrazovat
Varování viz návod k pouţití
Viz návod k pouţití
Výrobce
Zástupce pro Evropu
Strana 1 z 9
EC REP
LC775TCECS.3 (08/13)
SADY/ČINIDLA PODLE KATALOGOVÉHO ČÍSLA
LCT-DQA Testovací sada LIFECODES pro SSO typizaci alel HLA-DQA1, katalogové č. 628931 Typizační sada LM-DQA LIFECODES HLA-DQA kompatibilní s technologií Luminex Činidlo
Výrobek č. 628061
Číslo výrobku
Plnicí objem
Uskladnění
20
MX-DQA
LIFECODES HLA-DQA Master Mix
628062
420 µl
2 aţ 8 °C
BM-DQB
LIFECODES HLA-DQA Probe Mix ‡
628063
360 µl
2 aţ 8 °C Chraňte před světlem
DS
Ředící roztok
628155
9,9 ml
18 aţ 30 ºC
TAQ
Taq polymeráza LIFECODES
628075
25 µl
-10 aţ -30 ºC
Mnoţství pro 20 vzorků
LCT-DPB Testovací sada LIFECODES pro SSO typizaci alel HLA-DPB1, katalogové č. 628935 Typizační sada LM-DPB LIFECODES HLA-DPB kompatibilní s technologií Luminex Činidlo
Výrobek č. 628910
Číslo výrobku
Plnicí objem
Uskladnění
MX-DPB
LIFECODES HLA-DPB Master Mix
628903
420 µl
2 aţ 8 °C
BM-DPB
LIFECODES HLA-DPB Probe Mix ‡
628902
360 µl
2 aţ 8 °C Chraňte před světlem
DS
Ředící roztok
628155
9,9 ml
18 aţ 30 ºC
TAQ
Taq polymeráza LIFECODES
628075
25 µl
-10 aţ -30 ºC
20 Mnoţství pro 20 vzorků
‡
Směsi Probe Mix jsou citlivé na světlo: zajistěte jejich minimální vystavení světlu. VAROVÁNÍ: Jednotlivé součásti sady nepouţívejte po překročení data exspirace. VAROVÁNÍ: Odchylky od doporučeného protokolu a požadovaných materiálů, včetně Taq polymerázy LIFECODES, nebyly schváleny.
Strana 2 z 9
LC775TCECS.3 (08/13)
URČENÉ POUŢITÍ Pouţití:Typizace DNA u alel HLA I. a II. třídy
SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Typizace HLA na základě amplifikace DNA pomocí metody PCR je běţný laboratorní postup. Metoda amplifikace (mnoţení) DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) je pouţívána k rozšíření zvolené oblasti DNA. V rámci typizace HLA je proveden následný rozbor, jehoţ cílem je stanovit vlastnosti zmnoţené DNA. Pro účely typizace HLA je moţné pouţít několik typů technologií, jako je SSP (1), SSOP (2), RFLP (3) a reverse dot blot (4). Stejně jako metody SSOP a reverse dot blot vyuţívají typizační soupravy LIFECODES HLA-SSO k identifikaci alel HLA přítomných ve vzorku po amplifikaci PCR sekvenčně specifické oligonukleotidové sondy (SSO). Schopnost rozlišení různých alel přítomných v amplifikovaném vzorku PCR je dána sadou pouţitých SSO, nikoli uplatněnou metodou. Zatímco metody reverse dot blot a SSOP pouţívají enzymy a kolorimetrické substráty vyţadující vytváření subsekvencí, metoda LIFECODES představuje homogenní systém umoţňující mnohonásobný rozbor. To znamená, ţe všechny SSO jsou analyzovány zároveň a celý test probíhá v jediné reakční nádobě pomocí jediného reakčního činidla.
POSTUP Proces typizace LIFECODES HLA-SSO je zaloţen na hybridizaci jednovláknového specifického PCR produktu se sondou SSO. Amplifikace DNA pomocí PCR vyuţívá ekvimolární dávky obou primerů (forward a reverse primer) k vytvoření dvouvláknové DNA. Pokud však dávka jednoho z primerů převýší druhý, bude výsledkem reakce kromě dvouvláknových produktů také několik jednovláknových DNA. Během prvních cyklů amplifikace LIFECODES je vytvořena dvouvláknová DNA. Jakmile dojde k vyčerpání limitujícího primeru, pouţije druhý primer dvouvláknový produkt jako templát pro vytvoření jednovláknové DNA. Touto metodou dojde k vytvoření dvou i jednovláknových produktů, které se po denaturaci budou společně podílet na hybridizační reakci. Kaţdá ze sond můţe být homologická s amplifikovanou DNA, která je jedinečná pro alelu nebo skupinu alel. Jinými slovy jsou tyto sondy vytvořeny tak, aby kaţdá z nich hybridizovala s upřednostňovanou komplementární oblastí, která můţe a nemusí být přítomna v amplifikované DNA. K tomu navíc amplifikovaná DNA hybridizuje s jednou nebo více sondami odpovídajícími sekvencím přítomným ve všech alelách lokusu. Typizace SSO můţe být ovlivněna typem biologického materiálu, metodou purifikace a mnoţstvím a integritou genomové DNA. Z toho důvodu můţe signál získaný pomocí sondy slouţit jako ukazatel úspěšnosti procesu amplifikace a hybridizace. Signál získaný pomocí konvenční sondy můţe být také pouţit k normalizaci signálu alelových sond a k úpravě odchylek v mnoţství amplifikovaného produktu v rámci hybridizační reakce. Rozbor výsledků získaných typizací SSO lze pouţít k určení přítomnosti či nepřítomnosti konkrétních sekvencí DNA v amplifikované DNA a k identifikaci moţných alel ve vzorku. V případě typizace LIFECODES HLA-SSO jsou sondy vázány na mikrokuličky Luminex určené k pouţití s nástrojem Luminex. Je moţné smíchat a pomocí nástroje Luminex provést rozbor aţ 100 různých populací mikrokuliček, neboť jednotlivé populace mikrokuliček se od sebe liší pro kaţdou populaci jedinečným fluorescenčním znakem nebo barvou. Na různé barvy mikrokuliček lze navázat různé sondy SSO. Jednotlivé promíchané sondy lze tedy od sebe odlišit na základě jejich spojení s konkrétní barvou mikrokuliček. Nástroj Luminex je také schopen určit mnoţství produktů PCR hybridizujících s mikrokuličkami Luminex. Z toho důvodu je moţné pouţít signál získaný pomocí sond SSO během rozboru LIFECODES, stejně jako s jinými metodami SSOP, k označení sond s kladnou nebo zápornou reaktivitou se vzorkem amplifikované DNA (viz Oddíl Výsledky). Budou tak získány informace potřebné k určení HLA-fenotypu vzorku.
ČINIDLA A. Identifikace Úplný seznam výrobků a katalogových čísel viz tabulky v části Sady/Činidla podle katalogového čísla.
B. Varování a upozornění 1. 2. 3. 4.
5.
Test pro diagnostiku in vitro. K manipulacím před PCR a po PCR pouţijte různé pipety. Biologické riziko: Se všemi biologickými a krevními vzorky zacházejte jako s potenciálními zdroji infekce. Při manipulaci s takovými vzorky se řiďte obecnými bezpečnostními opatřeními. Ředící roztok, Probe mix, Taq polymeráza a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin obsahují zdraví nebezpečné sloţky. Zabraňte kontaktu s kůţí a s očima, likvidaci všech materiálů po pouţití provádějte v souladu s místními nařízeními a předpisy. Více informací naleznete v Bezpečnostním listu (BL). Výsledky získané pomocí těchto souprav nelze pouţít jako jediný základ pro učinění klinických závěrů o stavu pacienta.
C. Pokyny pro uskladnění 1. 2. 3.
Vhodné skladovací teploty naleznete na štítcích umístěných na balení jednotlivých komponent. Probe mix a R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin jsou citlivé na světlo, CHRAŇTE JE PŘED SVĚTLEM a NEZMRAZUJTE. Komponenty nepouţívejte po překročení data exspirace.
D. Purifikace a aplikace Viz „Odběr a příprava vzorků“
E. Indikace nestability 1. 2.
Pokud se z roztoku během přepravy nebo uskladnění vysráţely soli, před pouţitím roztoku je znovu zcela rozpusťte pomocí spirálového pohybu při pokojové teplotě (18 aţ 30 °C). Nepouţívejte R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin, který během přepravy nebo uskladnění prošel bodem mrazu.
POŢADAVKY NA NÁSTROJE 1. 2.
Nástroj Luminex a platforma XY (Výrobky č. 888300 a 888310) Schváleny byly následující termocyklery: 96-jamkový PCR systém 9700 GeneAmp® nastavený na reţim 9600 (základní katalogové č. N8050200, Gold Block kat. č. 4314878), 96-jamkový termocykler Veriti™ nastavený na MAX reţim 9700 (kat. č. 4375786). Eppendorf Mastercycler® Nexus nastavený na reţim SAFE (kat. č. 6333000.014). Maximální povolené rychlosti naleznete v tabulce 2. Upozornění: ostatní termocyklery a rychlosti nebyly schváleny.
ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ a. b. c. d. e. f. g.
Lidskou DNA lze purifikovat z plné krve, z buffy coat a z ústní sliznice pomocí schválených metod splňujících níţe uvedená kritéria. DNA získaná z krve uchované v EDTA a ACD (kyselina citrónová-citrát-dextróza) byla testována a prokázala vlastnosti potřebné pro daný rozbor. DNA získaná z krve a uchovaná v heparinu nemůţe být pro tento rozbor pouţita. Další konzervační látky nebyly testovány. Izolovaná DNA by měla být v 10 mM TRIS, pH 8,0 - 9,0, nebo ve vodě bez obsahu nukleázy. V případě přítomnosti chelatačního činidla jako je EDTA nesmí konečná koncentrace chelatačního činidla překročit 0,5 mM. Přítomnost alkoholu, čistidel a solí můţe nepříznivě ovlivnit amplifikaci DNA. Konečná koncentrace DNA by měla být 10 aţ 200 ng/µl. Měření absorbance vzorku DNA při 260 a 280 nm by mělo dát poměr 1,65 aţ 2,0. Vzorky DNA se mohou pouţít ihned po jejich izolaci nebo uskladnit aţ na 1 rok při teplotě –20 ºC. Vyhněte se opakovanému zmrazování/rozmrazování, mohlo by dojít ke znehodnocení DNA. Strana 3 z 9
LC775TCECS.3 (08/13)
POSTUP Upozornění: Odchylky od doporučeného protokolu a poţadovaných materiálů nebyly schváleny.
A. Dodávané materiály (Více informací viz tabulky v části Sady/Činidla podle katalogového čísla). • • •
Příslušná směs Master Mix (MX) Příslušná směs/směsi Probe Mix (BM) Ředící roztok (ŘR)
• •
Tabulka prahových hodnot, tabulka(y) výsledků detekce sondy Taq polymeráza LIFECODES* (č. v katalogu LIFECODES: 628075)
B. Požadované materiály, ale nedodávané materiály Následující výrobky byly schváleny k pouţití se sadou: • • •
•
Luminex Sheath Fluid (1x, číslo v katalogu Lifecodes: 628005) Voda bez nukleázy, č. v katalogu Lifecodes: 757003, 20 ml) PCR zkumavky a víčka – zkumavkové pásky Corning® Thermowell (č. v katalogu Costar®: 6542, č. v katalogu LIFECODES: 888640) nebo 96-jamkové PCR destičky Corning® Thermowell (katalogové č. CLS6551) nebo 96-jamková PCR destička Themoscientific AB Gene® Superplate (kat. č. AB-2100) Destička Costar® (č. v katalogu Costar®: 6509, č. v katalogu LIFECODES: 888630)
• • •
Polyethylenová páska Thermowell Clear (č. v katalogu Costar®: 6524, č. v katalogu LIFECODES: 888635 ) R-phycoerythrin-konjugovaný streptavidin (SA-PE), 1mg/ml (č. v katalogu LIFECODES: 628511) Kalibrační sady Luminex (kalibrační sada Luminex 100/200, souprava pro kontrolu výkonu Luminex 100/200, čísla v katalogu LIFECODES 628018 a 628019 v daném pořadí)
C. Doplňující materiály, které dodá uţivatel • • • • • • • • •
Míchačka (Vortex) Silikonová těsnící poduška Axygen Scientific, č. CM-FLAT nebo podobný výrobek Sonikační lázeň Špičky s filtrem Microcentrifuge Barrier Pipetovací nástavce, vícekanáloví pipety a špičky (1-20 µl, 20-200 µl, 1000 µl) Software umoţňující analýzu souboru Topný blok 70% isopropanol nebo 20% bělidlo Drţák zásobníku – Applied Biosystems, č. 403081 (pouţití pouze s termocyklerem 9700)
NÁVOD K POUŢITÍ POZNÁMKY: Probe mix a SA-PE jsou citlivé na světlo: chraňte před světlem a nezmrazujte. Zahřívejte kuličky při 55 ºC aţ 60 ºC po dobu alespoň 5-10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela rozpustily. Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozpustily. Při procesu rozpipetování dbejte zvýšené opatrnosti a pouţívejte cejchované pipety. V opačném případě můţe dojít ke ztrátám reakční směsi a zmaření vzorku. Všechny teploty musí být přesně dodrţeny a zachovány. I nízké výkyvy o např. +/- 0,5 °C mohou ovlivnit výsledek. Ve stádiu hybridizace by neměly vzorky zůstávat v rozpuštěném stavu při 56 °C déle neţ 5 minut (viz oddíl Výsledky). Doporučujeme provést rozbor amplifikovaných vzorků co nejrychleji. Pokud není moţné zpracovat vzorky pomocí nástroje Luminex v tentýţ den, je možné uchovat amplifikovaný produkt před použitím po dobu až 3 dnů při teplotě 2-8 ºC. V případě dlouhodobějšího uskladnění uchovávejte do okamžiku použití při teplotě –20 ºC po dobu až jednoho týdne. Amplifikovaný produkt je možné zmrazit a rozmrazit pouze jedenkrát. Opakované zmrazování a rozmrazování způsobí poškození amplifikovaných vzorků a v případě následného rozboru povede ke špatným výsledkům.
A. Purifikace genomové DNA pomocí zvolené metody; konečná koncentrace by měla být 10 aţ 200 ng/µl. V případě potřeby doplňte vodou bez nukleázy. U všech vzorků udrţujte stejnou koncentraci.
B. Amplifikace DNA (PCR) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Nechte Master Mix ohřát na pokojovou teplotu (18 °C aţ 30 °C). Jemně míchejte spirálovým pohybem po dobu cca 10 vteřin. Bude tak zajištěna přítomnost solí v roztoku. Umístěte na krátkou dobu (5 aţ 10 vteřin) na mikrocentrifugu, aby se obsah dostal na dno zkumavky. Podle Tabulky 1 níţe připravte komponenty k amplifikaci pro n+1 reakcí pomocí hodnot určených pro jednotlivé komponenty v rámci reakce (kromě DNA). Pomocí vody bez nukleázy připravte konečný objem 50 µl na reakci. Jemně promíchejte. Pomocí pipety umístěte odpovídající mnoţství genomové DNA (100 aţ 300 ng) do zkumavek PCR. Pomocí pipety umístěte amplifikační směs do PCR zkumavek obsahujících genomovou DNA. (Celkový objem amplifikační směsi a genomové DNA by měl být 50 µl na kaţdou jednotlivou reakci.) Zkumavky pevně uzavřete, aby nedošlo k úniku během PCR. Umístěte vzorky do termocykleru a spusťte program, viz Tabulka 2 a Tabulka 3.
Strana 4 z 9
LC775TCECS.3 (08/13)
Tabulka 1. Reakční komponenty pro amplifikaci
Sloţka
Mnoţství na reakci PCR
LIFECODES Master Mix Genomová DNA 10-200 ng/µl Taq polymeráza LIFECODES Voda bez nukleázy
15µl Celkem ~200 ng 0,5 µl (2,5 U) Aţ 50 µl konečného objemu
Tabulka 2. Podmínky termocykleru pro amplifikaci Termocykler GenAmp® PCR System 9700
Reţim (přechodová rychlost) Reţim 9600 (3,5°C/s)
Termocykler Veriti™ 96-jamkový
Reţim MAX 9700 (3,9°C/s)
Eppendorf Mastercycler® Nexus
Reţim SAFE, MAX přechod (3,0°C/s)
Table 3. Podmínky termocykleru pro amplifikaci Krok
Teplota a inkubační doba
Počet cyklů
1
95ºC po dobu 5 min
1
95ºC po dobu 30 s 2
60ºC po dobu 45 s
8
72ºC po dobu 45 s 95ºC po dobu 30 s 3
63ºC po dobu 45 s
32
72ºC po dobu 45 s 4
72ºC po dobu 15 min
1
5
4ºC stále
1
Poznámka: Informace o amplifikaci vzorku naleznete v sekci Gelová elektroforéza produktu (Příloha A).
C. Hybridizace • •
Ujistěte se, ţe jsou sloţky hybridizačního pufru v LIFECODES probe mixu rozpuštěny a kuličky důkladně rozptýleny. Zapněte nástroj Luminex a platformu XY a nechte je spuštěné po dobu 30 minut na zahřátí.
1.
Zahřívejte probe mix při 55 ºC aţ 60 ºC na termálním bloku po dobu alespoň 5 -10 minut, aby se komponenty ve směsi zcela rozpustily. Krátce sonikujte (~15 vteřin) a poté směs promíchejte spirálovým pohybem (cca 15 vteřin), aby se kuličky zcela rozptýlily. Smíchejte 15 µl směsi s 5 µl PCR pro konkrétní lokus a rozpipetujte do kaţdé jamky 96-jamkové destičky termocykleru (Costar® č. 6509). Pokud rozpipetováváte směs do více neţ 10 jamek, jemně směs promíchejte spirálovým pohybem po kaţdých deseti jamkách. Destičku přelepte polyethylenovou páskou (Costar® č. 6524). Před provedením hybridizace umístěte na destičku silikonovou těsnící podušku. Proveďte hybridizaci vzorků za následujících inkubačních podmínek:
2. 3.
4. 5.
Tabulka 4. Podmínky termocykleru pro hybridizaci
97 ºC po dobu 5 min. 47 ºC po dobu 30 min. 56 ºC po dobu 10 min. 56 ºC HOLD
Strana 5 z 9
LC775TCECS.3 (08/13)
6.
7.
Zatímco probíhá hybridizace vzorků, připravte směs 200:1 ředící roztok/SA-PE. Smíchejte 170 µl ředícího roztoku (ŘR) a 0,85 µl 1 mg/ml SA-PE na vzorek. Doporučujeme připravit dostatečné množství směsi ředícího roztoku pro n+1 vzorků pro případ ztráty při pipetování. (Viz Tabulka 5) Směs ředícího roztoku/SA-PE uchovávejte ve tmě při pokojové teplotě, SA-PE je citlivý na světlo! Ředící roztok je moţné zahřívat na teplotu 45 ºC po dobu 5 minut a promíchat spirálovým pohybem, aby byla zajištěna přítomnost všech komponent v roztoku. Před vytvořením směsi musí mít ředící roztok pokojovou teplotu (18 aţ 30 °C). Připravte vše před pouţitím a zbývající dávku dejte stranou. Počet vzorků Ředící roztok (ŘR) SA-PE 1 170 µl 0,85 µl Tabulka 4. Objemy pro přípravu 5 850 µl 4,25 µl ředícího roztoku 10 1 700 µl 8,5 µl 20 3 400 µl 17 µl 50 8 500 µl 42,5 µl
Poznámka: NEPŘERUŠUJTE PROGRAM HYBRIDIZACE PŘED SEJMUTÍM DESTIČKY Z TERMOCYKLERU! 8. Při kroku 56 ºC HOLD, zatímco je destička na termocykleru, zřeďte kaţdý vzorek pomocí 170 µl předem připravené směsi ředícího roztoku/SA-PE. Všechny vzorky je třeba naředit během 5 minut (po 10 minut trvajícím kroku HOLD při 56 °C). 9. Sejměte destičku z termocykleru a umístěte ji do nástroje Luminex.
D. Analýza pomocí nástroje Luminex* Aby byly získané výsledky co nejlepší, rozbor vzorků pomocí nástroje Luminex proveďte ihned. Rozbor vzorků je moţné provést aţ 30 minut po naředění. Jestliţe nehodláte provést interpretaci vzorků ihned, chraňte je před světlem. 1. Nástroj Luminex zapněte 30 minut aţ 4 hodiny před zahájením rozboru vzorků. 2. Před rozborem vzorků pomocí nástroje Luminex nastavte dávkovací běh (Batch Run) určený k rozboru vzorků. a) Zvolte Create a New Batch (Vytvořit novou dávku) z nabídky File (Soubor). • Např. pokud provádíte rozbor HLA-DPB, přidejte dávku pro HLA-DPB. • Bude vytvořena a pojmenována šablona dávky, v tomto případě HLA-DPB. • Upozornění: verze šablon jsou vytvořeny pro konkrétní čísla sad a odpovídají číslům sad v soupravě. • Podrobný postup vytváření dávek se objeví na obrazovce vytváření dávek. • Při vytváření názvu dávky nepouţívejte čárky, neboť informace následující po čárce zmizí při exportu dat. • Více informací o vytváření dávek a multi-dávek naleznete v uţivatelské příručce Luminex b) Klikněte na ikonu vysunutí, drţák destičky se vysune. Umístěte 96-jamkovou destičku se vzorky určenou pro termocykler do termálního bloku XYP umístěného na drţáku destičky. c) Klikněte na ikonu Zasunout. Vzorky jsou připraveny k rozboru. Před spuštěním cyklu je třeba provést napuštění. d) Po vyjmutí vzorků z nástroje je třeba provést čištění nástroje pomocí 70% isopropanolu nebo 20% bělidla (čistícího přípravku pro domácnost) s následným dvojím omytím. Pokud jiţ nástroj nebudete toho dne pouţívat, můţete jej nyní vypnout. 3. Po dokončení běhu budou data exportována v podobě hodnot oddělených čárkami (csv). Získané soubory mají název ‘OUTPUT.CSV’ a budou uloţeny ve sloţce s názvem dávky. Data jsou poté k dispozici k provedení typizace, jak je popsáno níţe. *Informace o pouţívání nástroje Luminex naleznete v uţivatelské příručce Luminex, která obsahuje pokyny ke spuštění, kalibraci, údrţbě a vypnutí.
VÝSLEDKY Typizaci vzorků lze provést následujícím způsobem: Otevřete vytvořené soubory CSV a získaná data zpracujte pomocí běţných tabulkových procesorů, jako jsou Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro apod. Rozbor probíhá v následujících krocích: 1) Zkontrolujte, zda je počet případů pro kaţdý SSO v kaţdém vzorku alespoň 60. Tuto informaci naleznete v DataType: oddíl Výpočet v souboru CSV. 2) Určete, ţe hodnoty pro konvenční sondy pro jednotlivé vzorky se nacházejí nad minimální hodnotou jejich mediánu intenzity fluorescence (MFI). Minimální prahové hodnoty se liší dle konkrétních sad a je moţné je zjistit z tabulky prahových hodnot. Upozornění: • Abyste získali spolehlivé výsledky, potřebujete zajistit dostatečné množství dat získaných pomocí nástroje Luminex. • Pro každý SSO získejte alespoň 60 případů. 3)
4)
Odečtěte kontrolní hodnotu pozadí pro jednotlivé sondy od hodnot vzorku a získejte tak soubor dat upravený na základě kontrolních hodnot. Kontrolní hodnoty pozadí naleznete v tabulce prahových hodnot po jednotlivé sady. Hodnoty pozadí jsou průměrné hodnoty MFI (mediánu intenzity fluorescence) pro jednotlivé kuličky, určené ke kompenzaci šumu pozadí způsobeného proměnlivostí kuliček. Pro kaţdý vzorek vydělte data upravená na základě pozadí pro jednotlivé sondy hodnotou upravenou na základě pozadí pro odpovídající konvenční sondu a získejte normalizovanou sadu dat. MFI (sonda) – MFI (kontrola pro sondu)
MFI (konvenční) – MFI (kontrola pro konvenční hodnotu) 5) 6)
Získané hodnoty pro jednotlivé sondy zaneste do pracovního listu v tabulce prahových hodnot. Jakmile budou zaneseny všechny hodnoty, je moţné porovnat vzorec výsledků detekce sondy (tj. kombinace všech kladných a záporných zadání pro daný vzorek) s poskytnutou tabulkou (tabulkami) obsahující detekované výsledky
Strana 6 z 9
LC775TCECS.3 (08/13)
Upozornění: • Pro každý lokus a každou směs probe mix existuje zvláštní tabulka prahových hodnot. • Tabulky prahových hodnot jsou určeny pro konkrétní sady, ujistěte se, že číslo sady uvedené v tabulce prahových hodnot je shodné s číslem typizační soupravy. • Pokud se stane, že normalizovaná hodnota pro konkrétní sondu stoupne nad maximální prahovou hodnotu v případě záporného zadání a pod minimální hodnotu v případě kladného zadání, bude vzorek pro tuto sondu považován za neurčitý. Vzorky musejí být typizovány tak, že se nejprve přijme záporná hodnota a poté kladná. • Více informací o prahových hodnotách naleznete v oddíle OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY.
KONTROLA KVALITY Doporučujeme provést jednu zápornou a jednu kladnou kontrolu v rámci kaţdého testu, jako je test pomocí vody a poté pomocí předem typizovaného vzorku. Konvenční sondy SSO uvedené v tabulce prahových hodnot hybridizují s alelami příslušných lokusů. Hodnoty získané s konvenčními SSO z pozitivních kontrol by měly mít vyšší neţ prahové hodnoty pro SSO, jak je uvedeno v pracovním listu tabulky prahových hodnot. Hodnoty získané s konvenčními SSO z kontrol pouţívajících vodu by měly být niţší neţ prahové hodnoty pro SSO, jak je uvedeno v pracovním listu tabulky prahových hodnot. Směsi Probe mix LIFECODES obsahují jednu nebo více konvenčních sond SSO identifikovaných v pracovních listech typizačních souprav. Tyto konvenční sondy hybridizují se všemi alelami a chovají se jako interní kontroly slouţící k ověření amplifikace a potvrzení provedení hybridizací. Jestliţe pro tyto SSO není dosaţeno minimální hodnoty, vzorek nemůţe zajistit správnou typizaci a testování vzorku musí být provedeno znovu. Rozbor je třeba provést podle doporučení uvedených v příbalovém letáku a dále pomocí jiných kontrolních postupů, které jsou v souladu s místními, státními a federálními předpisy a/nebo předpisy institutu pro akreditaci.
OMEZENÍ POSTUPU Podmínky PCR a popsané podmínky rozboru vyţadují přesné dodrţení stanovených podmínek. Nedodrţení těchto parametrů můţe mít za následek chybný vzorek. Všechny nástroje musejí být kalibrovány v souladu s doporučeními výrobce a předepsanými parametry. 1) 2)
3) 4)
5)
Před pouţitím je třeba kuličky předehřát a důkladně rozpustit. Tím je zajištěna přítomnost sloţek hybridizačního pufru v roztoku. Inkubace při 47 ºC a 56 ºC vyţaduje vysoký stupeň přesnosti (+/- 0,5 ºC). Je třeba pouţít termocykler. Teplotu v 96 jamkách destičky termocykleru je třeba kontrolovat pomocí termočlánku (např. Bio-Rad, Model VPT-0300 apod.). Rozdíl teplot v jamkách a mezi jednotlivými jamkami by neměl překročit +/- 0,5 ºC. Celková doba při 56 ºC nesmí překročit 15 minut. To zahrnuje 10-minutovou inkubaci a k tomu max. 5 minut určených k naředění všech vzorků pomocí směsi ředícího roztoku/SA-PE. Po naředění jsou vzorky stabilní při pokojové teplotě (18 aţ 30 °C) po dobu aţ 2 hodin (je třeba je chránit před světlem). Vzhledem k tomu, ţe zpracování plné destičky s 96 jamkami nástrojem Luminex můţe trvat aţ 1,5 hodiny, je třeba zahájit analýzu ne později neţ 30 minut od naředění, aby bylo zajištěno, ţe poslední vzorek bude analyzován v rámci dvouhodinového limitu. Nemíchejte komponenty z jiných souprav a sad.
Z důvodu sloţité povahy typizace HLA je nezbytné, aby kontrolu interpretace dat a typizaci provedl kvalifikovaný personál.
Strana 7 z 9
LC775TCECS.3 (08/13)
ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PROBLÉM Nízký počet kuliček
MOŢNÁ PŘÍČINA Směs Probe Mix nebyla důkladně rozpuštěna Nástroj nefunguje správně
ŘEŠENÍ Probe mix předehřejte, sonikujte a spirálovým pohybem promíchejte a zkoušku opakujte. Proveďte kalibraci nástroje. (Viz uživatelská příručka Luminex IS.) Odstraňte a sonikujte jehlu. Proveďte zpětný proplach. Pokud problém přetrvává, zavolejte Immucor Transplant Diagnostics, Inc. na číslo: (888) 329-0255 Zkontrolujte koncentraci a čistotu DNA.
Chybná kalibrace Cesta toku vzorku je zablokována.
Chyba prahových hodnot CON
Amplifikace vzorku neproběhla, nebo jen slabě*
Nízký obsah DNA Soli ve směsi Master Mix se nerozpustily
Zahřívejte Master Mix při teplotě 37 ºC po dobu 5 minut, jemně promíchejte spirálovým pohybem a nechte krátce ustát. Pouţívejte schválenou Taq polymerázu LIFECODES, katalogové č. 628075. Spusťte tepelný profil na termocykleru a zkontrolujte, zda parametry odpovídají předpisům. Před pouţitím zahřívejte ředící roztok při 45 ºC po dobu 5 minut a promíchejte spirálovým pohybem. Skladujte při pokojové teplotě. Vyměňte R-Phycoerythrin-konjugovaný streptavidin.
Slabá Taq polymeráza Podmínky amplifikace nesplňují dané parametry Nízká hodnota střední intenzity fluorescence (MFI)
Mnoţství špatných SSO nebo vzorek nesplňuje výsledek typizace HLA
Amplifikace konkrétní alely
Podmínky amplifikace nesplňují dané parametry
Vzorek DNA byl kontaminován DNA je částečně poškozena Odpařování během hybridizace
Spusťte tepelný profil na termocykléru a zkontrolujte, zda parametry odpovídají předpisům. Znovu izolujte DNA z krevního vzorku. Pokud nevyuţíváte celou destičku, nechte jednu řadu po kaţdé straně vzorků prázdnou, aby bylo moţné destičku důkladně utěsnit.
*Amplifikaci PCR je moţné ověřit pomocí gelové elektroforézy (viz Příloha A).
OČEKÁVANÉ HODNOTY Hodnoty je moţné hodnotit jako kladné a záporné. Ve vzácných případech můţe být hodnota neurčitá. „Neurčitá hodnota“ představuje rozsah, v jehoţ rámci nebyly sledovány ani kladné, ani záporné hodnoty. V případě, ţe vzorek obsahuje neurčité hodnoty pro konkrétní sondu SSO, je třeba vzorek typizovat sondou jako záporný a poté jako kladný. Mohou nastat tři situace: 1. Jedna z moţností (např. kladná nebo záporná) poskytnou shodu. 2. Obě moţnosti poskytnou shodu. • Vzorky mohou být znovu analyzovány, nebo alely získané z obou typizací mohou být zaznamenány. 3. Ţádná z moţností neposkytne shodu. • V takovém případě pravděpodobně existují jiné sondy, které byly chybně přiřazeny. Takový vzorek musí být znovu analyzován a zřejmě i znovu amplifikován. • Pokud vykazují více neţ dvě sondy neurčitý výsledek, vzorek musí být znovu analyzován. • Pokud vzorec výsledků sondy neposkytne typ HLA, musí být vzorek znovu amplifikován a analyzován. Můţe být také nezbytné znovu izolovat DNA ze vzorku a provést novou amplifikaci a analýzu. • Jak je uvedeno v oddíle Omezení postupu, je nezbytné přesně dodrţovat protokol. Případné odchylky mohou mít za následek špatnou typizaci.
SPECIFICKÉ FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY Pokud jsou typizační soupravy LIFECODES HLA-SSO pouţity v souladu s postupem popsaným v příbalovém letáku, je moţné stanovit typ HLA třídy I a II ve vzorcích DNA. Sady HLA-DPB a HLA-DQA vykazují 100 % shodu (95 % interval spolehlivosti z 91,9-100 %) na 30 vzorků CAP ve srovnání s výsledky CAP.
LITERATURA 1. 2.
Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225 Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163
3. 4.
Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290 Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231
OMEZENÉ LICENCE Taq polymerázu vyrobila pro Immucor Transplant Diagnostics společnost Promega Corp. Maitelem licence na tento produkt je společnost Promega a produkt je chráněn v USA patenty 5,338,671 a 5,587,287, a v ostatních zemích odpovídajícími místními patenty. Zakoupením tohoto výrobku získáte omezenou nepřenosnou licenci zapsanou v USA pod patentovým číslem 5,981,180, nebo její zahraniční obdobu, která je majetkem Luminex Corporation, a která vám umoţní provádět vícenásobné rozbory klinických vzorků za účelem typizace HLA.
Strana 8 z 9
LC775TCECS.3 (08/13)
INFORMACE O VÝROBCI Výrobce: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902 Spojené státy americké Tel.: +1 (203) 328-9500, 888-329-0255 Fax: +1 (203) 328-9599 Autorizovaný zástupce: Emergo Europe, Molenstraat 15, 2513 BH, Den Haag, Nizozemsko Tel.: +(31) (0) 70 345 8570, Fax: +(31) (0) 70 346 7299 Technický servis pro Evropu: Tel.: +32/3 385 4791 Poslední revize a vydání tohoto dokumentu: Rev. 3, 2013-08-29
POUŢITÉ OBCHODNÍ ZNAČKY AB Gene® Costar® Microseal™ IDNA™ Agarose GelStar™
AB Gene House Corning Incorporated Bio-Rad Laboratories, Inc Lonza Group, Ltd. Lonza Group, Ltd.
Luminex® Veriti™ Mastercycler ® LIFECODES®
Luminex Corporation Applied Biosystem Eppendorf Immucor Inc.
PŘÍLOHA A Gelová elektroforéza PCR reakce provedené prostřednictvím typizačních sad LIFECODES HLA-SSO jsou určeny k vytváření jak dvouvláknových, tak i jednovláknových produktů, které představují dominantní produkty hybridizující s SSO. Za účelem zajištění dobré kvality či odstranění problémů můţe být nezbytné provést gelovou elektroforézu s cílem ověření PCR reakce a přítomnosti amplifikované DNA.
Poţadované materiály (viz seznam nebo odpovídající výrobky) • • •
Agaróza pro elektroforézu (Lonza Group, Ltd. IDNA® Agarose č. 50170) Elektroforézní přístroj/zdroj energie Gelový pufr - 1X (40xTAE, Promega č. V4281)
• • •
GelStar® Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. č. 50535) UV transiluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. Model TM36) Fotografický systém
Relativní migrace jednovláknových produktů závisí na koncentraci gelu a pouţitém pufru. Přibliţné migrace pro jednotlivé amplifikace jsou uvedeny níţe pro vzorky v 2% agarovém gelu a pufru 1X TAE.
Podmínky elektroforézy Vyjměte GelStar® Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. č. 50535) z mrazáku a nechte rozmrznout. Uchovávejte ve tmě. Gel pouţitý pro tento postup musí být 2%, tj. na 200 ml gelu pouţijte 4 gramy agarózy a 200 ml 1X TAE (naředit z 40X TAE). Přidejte 10µl GelStar® Nucleic Acid Stain, čímţ agaróza získá tekutou podobu. Při rozlévání gelu je třeba nechat dostatek prostoru pro DNA (2,5 aţ 5 cm). UPOZORNĚNÍ: GelStar ® je potenciální karcinogen. POZNÁMKA: Místo GelStar® Nucleic Acid Stain je moţné pouţít gely s 20 µl ethidium bromidu 10mg/ml. V gelech s ethidium bromidem bude výsledný produkt zastoupen méně výrazně neţ v gelech s GelStar®. UPOZORNĚNÍ: Ethidium bromid je známý karcinogen. 3. Gely uloţte na tmavé místo a nechte je ztuhnout. 4. Pouţijte směs 2,5 µl kaţdého PCR produktu a 2,5 lL 2X pufru se zřejmým zbarvením na vzorek a na amplifikaci. Umístěte gel na tmavé místo při cca 160 voltech na 45 minut, nebo dokud nebude ve vzorku moţné pozorovat oddělené pásky jedno a dvouvláknového produktu (modrý bromofenol nebo jiný marker migruje 2,5 aţ 5 cm od jamek). 5. Vyfotografujte pomocí UV transiluminátoru za pouţití ţlutého fotografického filtru GelStar® (Lonza Group, Ltd. č. 50536). UPOZORNĚNÍ: Při práci s GelStar® Nucleic Acid Stain nebo ethidium bromidem a při fotografování gelu pomocí UV transiluminátoru pouţívejte ochranné pomůcky. 6. Rozbor gelu 1. 2.
Z HLA-DPB
HLA-DQA
Dvě vlákna (bp)
~280
~280,~240
Jedno vlákno (bp)
~180
~180, ~160
Interpretace gelu Amplifikace proběhla
Amplifikace neproběhla
Jamka Dvouvláknová DNA Jednovláknová DNA
---- (jasný výsledek) -------- ( méně jasný výsledek)
Pásmo primeru
Strana 9 z 9
LC775TCECS.3 (08/13)
