P ETR T OMEK. školitel: Mgr. Pavel Hrouzek školitel specialista: Ing. Jiří Kopecký, CSc

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH BIOLOGICKÁ FAKULTA

Bakalářská diplomová práce

PETR TOMEK CYTOTOXICITA VLÁKNITÝCH SINIC

V NÁVAZNOSTI NA JEJICH EKOLOGII

školitel: Mgr. Pavel Hrouzek školitel – specialista: Ing. Jiří Kopecký, CSc. České Budějovice

2007

TOMEK, P. Cytotoxicita vláknitých sinic v návaznosti na jejich ekologii. [Cytotoxicity of the filamentous cyanobacteria in relation to its ecology. Bc. Thesis, in Czech, 2007] - 49 p., Faculty of Biological Sciences, The University of South Bohemia, České Budějovice, Czech Republic.

Annotation: The aims of this study was to screen a cytotoxic activity in 53 strains of the genera Nostoc and Anabaena and to compare occurence of active isolates within different ecological groups. Selected cytotoxic strains were subjected to HPLC/MS analysis to identify their extracts composition. Isolates with strong cytotoxic effect containing unknown substances were fractionated to obtain pure fraction of this compound. Finally, the selected strains toxicity dependence on time and concentration was evaluated.

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně pouze s použitím pramenů a referencí uvedených v seznamu citované literatury. Prohlašuji, že v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb. v platném znění souhlasím se zveřejněním své bakalářské práce, a to v nezkrácené podobě, fakultou elektronickou cestou ve veřejně přístupné části databáze STAG provozované Jihočeskou univerzitou v Českých Budějovicích na jejích internetových stránkách.

V Českých Budějovicích, dne 14.5.2007 .......................................... Petr Tomek

Poděkování: …Ze všeho nejdříve a nejvíce bych chtěl poděkovat paní Evě Řezníčkové z Parazitologického ústavu AVČR za cenné rady ohledně kultivace a manipulace s buněčnými kulturami a zejména za její neustávající ochotu a laskavost oživovat nové buněčné linie vždy, když bylo zapotřebí, zejména během rekonstrukce pracoviště v Třeboni. Svému školiteli, Pavlu Hrouzkovi, musím poděkovat za skvělý tým, který jsme vytvořili, nejen co se týče transferu do Třeboně, na obědy …, ale v neposlední řadě také experimentální práce, realizace skvělých nápadů, podporu a finalizace této práce, a těším se, že tato spolupráce bude pokračovat i nadále. Za skvělé odborné rady týkající se hmotnostní spektrometrie, chromatografie a nejen jich, tuny humoru a celkově skvělou atmosféru v laboratoři děkuji Jirkovi Kopeckému. Vše by bylo mnohem strastiplnější nebýt krásných žen Lady Samcové, které mimo jiné vděčím za udržování buněčných kultur v mé nepřítomnosti a všemožnou pomoc, a Jany Tomšíčkové a Lenky Čížkové, které také zajišťovaly pohodlný transfer na pracoviště. Nesmím zapomenout ani na pomoc svého kolegy Dana Hisema. Dík směřuje i všem z „Opaťáku“ , kamarádům, které jsem během práce zanedbával a mým skvělým rodičům. Zejména v posledních týdnech práce vděčím za lásku a pochopení mojí drahé polovičce Ájince.

OBSAH: 1

2

Literární rešerše .............................................................................................. 1 1.A

S E K U N D Á R N Í M E T A B O L I T Y S I N I C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.B

S T U D I U M C Y T O T O X I C I T Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.C

C Y T O T O X I C I T A H E P A T O T O X I N Ů S I N I C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.D

O S T A T N Í S I N I C O V É C Y T O T O X I N Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.E

R O Z Š Í Ř E N Í B I O S Y N T É Z Y S I N I C O V Ý C H T O X I N Ů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0

1.F

C Í L E P R Á C E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1

Materiály a metodika .................................................................................... 12 2.A

S I N I C O V É K M E N Y A E X T R A K C E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2

2.B

B U N Ě Č N É L I N I E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4

2.C

T E S T C Y T O T O X I C I T Y ( M T T T E S T ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4

2.D

S E P A R A Č N Í M E T O D Y : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5

2.D.I

HPLC/ESI/MS/MS (analytická), frakcionace .............................................................................................. 15

2.D.II

HPLC (preparativní), frakcionace .............................................................................................................. 15

2.D.III TLC, frakcionace ........................................................................................................................................ 16

2.E

3

S T A N O V E N Í „ I C 5 0 “ A Z Á V I S L O S T T O X I C K É H O E F E K T U N A D O B Ě E X P O Z I C E . . . . . 1 7

Výsledky ........................................................................................................ 18 3.A

S C R E E N I N G C Y T O T O X I C I T Y S I N I C O V Ý C H K M E N Ů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8

3.B

H P L C / E S I / M S A N A L Ý Z Y C Y T O T O X I C K Ý C H E X T R A K T Ů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0

3.B.I

Extrakty Anabaena affinis 04‐44 a Anabaena eucompacta x reniformis Pěšák 2 .................................... 20

3.B.II

Extrakt Nostoc sp. OBU36SO7 .................................................................................................................. 21

3.B.III

Extrakt Nostoc sp. Cam2SO1 ..................................................................................................................... 23

3.B.IV Extrakty Nostoc sp. NMB25 a NMB26 ....................................................................................................... 24 3.B.V

Extrakt Nostoc muscorum I ....................................................................................................................... 26

3.B.VI Extrakt Nostoc sp. De ................................................................................................................................ 27

3.C

C Y T O T O X I N K M E N E N O S T O C M U S C O R U M I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1

3.D

C Y T O T O X I N Y K M E N E N O S T O C S P . D E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3

3.D.I

Separace látky kmene Nostoc sp. De: frakce 31´ ...................................................................................... 34

3.D.II

Separace látky kmene Nostoc sp. De: frakce 37´ ...................................................................................... 37

3.E

„ I C 5 0 “ A Č A S O V Ý E X P E R I M E N T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9

4

Diskuse .......................................................................................................... 41

5

Literatura ...................................................................................................... 43

Petr Tomek

1

Cytotoxicita vláknitých sinic k liniím savčích buněk

LITERÁRNÍ REŠERŠE

1.A

SEKUNDÁRNÍ

METABOLITY SINIC

S

inice (cyanobakterie) mají schopnost produkovat široké spektrum chemických látek, jejichž syntéza není pro primární metabolizmus nezbytná, avšak jejich geny přetrvávají v genomu miliony let [RANTALA, 2004]. Zatím se můžeme pouze domnívat, jaký je jejich původní význam a úloha v životě těchto “bakterií”. Sekundární metabolity sinic jsou z hlediska chemické struktury a biologické aktivity různorodou skupinou [CARMICHAEL 1992, CODD 1995, SIVONEN 1996, HERFINDAL 2005, NAMIKOSHI 1996]. Na základě jejich působení můžeme rozlišit biotoxiny a cytotoxiny. Zatímco biotoxiny jsou schopny usmrtit vícebuněčné organismy, cytotoxiny indukují smrt jednotlivých buněk či jednobuněčných organismů. Z vlastní definice je však patrné, že je toto rozdělení umělé a obě kategorie se mohou překrývat. Cytotoxiny mohou být kategorizovány jako neurotoxiny, hepatotoxiny, genotoxiny, imunotoxiny a embryotoxiny [MARŠÁLEK, 1996] dle afinity k buňkám specifické tkáně, např. hepatotoxickou látku můžeme považovat za cytotoxickou či ve výsledku biotoxickou. Nicméně většina toxinů sinic vykazuje biologickou aktivitu smíšenou (zejména hepatotoxicita a nefrotoxicita aj.) a je možné, že specifická populace bude syntetizovat více druhů těchto toxinů.

anatoxin – a

(neurotoxin)

[CARMICHAEL, 1979]

homoanatoxin – a

(neurotoxin)

[WONNACOTT, 1992]

acutiphycin

(protinádorová aktivita)

[ABU HENA, 1999]

anatoxin – a(s)

(neurotoxin)

[MAHMOOD, 1986]

tolytoxin (scytophycin B)(protinádorová a fungicidní aktivita)

[CARMELI, 1993]

Obr. 1. Příklady struktur sekundárních metabolitů nepeptidické povahy.

Sinice jsou schopny syntetizovat nesčetné množství těchto metabolitů. Co se týče chemických struktur jedná se především o cyklické a lineární peptidy, alkaloidy, makrolaktony, deriváty nukleosidů a heterocyklické sloučeniny (viz obr. 1.). Z výše uvedených se u sinic nejběžněji vyskytují peptidy. Dodnes je jich známo několik stovek a jsou klasifikovány do osmi tříd [WELKER, 2006] (viz obr. 2.-8.):

1

Literární reš erš e

Petr Tomek


1. aeruginosiny (lineární, 4 aminokyseliny (dále AMK), obecná struktura: Choi = 2karboxy-6-hydroxyoktahydroindol, C-koncový derivát Arg)

spumigin A

aeruginosin 298A

(inhibitor trypsinu a thrombinu)

[OHSHIMA, 2003]

[FUJII, 1997] Obr. 2. Příklady obecných struktur lineárních peptidů aeruginosinů.

2. microgininy (lineární, 4-6 AMK, obecná struktura: Ahda = 3-amino-2-hydroxydekanoová kyselina + 2x C-koncové Tyr)

Nostoginin BN741 Nostoginin BN578 [PLOUTNO, 2002] (inhibitory proteas)

cyanostatin A

(inhbitor leucin aminopeptidasy M)

[SANO, 2005] Obr. 3. Příklady obecných struktur lineárních peptidů microgininů.

3. anabaenopeptiny (cyklické, 6 AMK, obecná struktura: Lys + 4 AMK cyklus, 1 AMK postranní řetězec)

nodulapeptin A [FUJII, 1997]

oscillamide Y

(inhibitor chymotrypsinu)

[SANO, 1995] Obr. 4. Příklady obecných struktur cyklických hexapeptidů anabaenopeptinů.


2

Petr Tomek


4. cyanopeptoliny (smíšené – cyklické a lineární, různý počet AMK, obecná struktura: Ahp = amino-hydroxy piperidon)

aeruginopeptin 228-A cytotoxický)

micropeptin T1

(inhibitor enzymů,

[HARADA, 1996]

(inhibitor chymotripsynu)

[KODANI, 1999] Obr. 5. Příklady obecných struktur cyanopeptolinů.

5. microcystiny a nodulariny (cyklické, 7 a 5 AMK respektive, obecná struktura: viz 1.3) 6. microviridiny (tricyklické, 14 AMK, obecná struktura: hlavní kruh 7 AMK, sekvence Lys-Tyr-Pro-Ser-Asp rozdělující kruh na tři cykly)

microviridin G

(inhibitor elastasy)

[MURAKAMI, 1997]

Obr. 6. Příklad obecné struktury cyklických depsipeptidů microviridinů.

3


Petr Tomek


7. cyclamidy (cyklické, 3 AMK, obecná struktura: thiazolová a oxazolová skupina)

banyascyclamid A

(inhibitor proteas)

[PLOUTNO, 2002]

nostocyclamid M

(alelopatická aktivita – řasy, sinice)

[JÜTTNER, 2001] Obr. 7. Příklady obecných struktur cyklických peptidů cyclamidů.

8. ostatní peptidy… (50% známých peptidů)

A1 A2 A3

puwainaphycin C agens)

nostopeptolid A1, A2, A3 (kardioaktivní

fungicidní, inhibitor proteas)

[MOORE, 1989]

Obr. 8. Příklady obecných struktur ostatních metabolitů.


(cytotoxický,

[TRIMURTULU, 2000]

4

Petr Tomek

1.B


STUDIUM

CYTOTOXICITY

V závislosti na požadavcích našeho studia můžeme ke stanovení cytotoxicity sekundárních metabolitů využít široké spektrum in vitro experimentů s imortalizovanými či nediferenciovanými buněčnými liniemi, primokulturami buněk, tkáňovými řezy či izolovanými orgány. Přičemž dva poslední testovací systémy poskytují zajímavé výsledky nejen exaktní, ale hlavně umožňují sledovat histopatologické změny na kompletně či částečně zachované 3D struktuře studovaného orgánu. Co se týče toxicity k celému organismu, potažmo toxicity pro člověka, nejsou tyto testy schopné nahradit in vivo experimenty např. s menšími obratlovci, bezobratlými (zejména Artemia salina cytotoxicity assay [LINCOLN, 1996], Daphnia test [PERSOONE, 1994]) a hlavně s vyššími živočichy. Avšak rychlost a relativně snadná interpretace výsledků z nich činí ideální experimentální metody. Přestože in vitro systémy nejsou schopny plně reprodukovat vysoce integrované funkce živočichů a mechanismy toxického efektu mohou být diametrálně odlišné [CHONG, 2002], IC50 stanovené testem na buněčných liniích většinou korelují se studiemi toxicity na myších či letálními dávkami pro člověka, [EVANS, 2001]. Zejména v posledních letech jsou buněčné linie využívány jako levné testovací objekty pro vyhledávání protirakovinných látek. Z výše uvedených důvodů je patrné, že práce se savčími buňkami in vitro je nejlepším startem pro studium toxicity sekundárních metabolitů, avšak uspěšné biotechnologické využití se bez in vivo metodiky neobejde.

1.C

CYTOTOXICITA

HEPATOTOXINŮ SINIC

Jednou z nejvíce probádaných sinicových látek je hepatotoxický peptid microcystin. Produkce této slučeniny byla poprvé prokázána u planktonní sinice Microcystis aeruginosa, avšak dnes je již jasné, že tuto látku mohou syntetizovat i sinice jiných rodů. např. Anabaena, Cylindrospermopsis, Aphanizomenon, Planktothrix, Nostoc [CARMICHAEL 1992, SIVONEN 1996]. Jedná se o cyklický heptapeptid o sekvenci cyclo-D-AlaL-X-erytro-bmethyl-D-isoaspartová kyselinaL-Y-ADDA-D-isoglutamalová kyselina-Nmethyl-dehydroalanin s variabilními Obr. 9. Microcystin-LR [HARADA, 1996] aminokyselinami argininem, leucinem a tyrosinem za X a alaninem, argininem, tyrosinem a methioninem na místo Y. Z mnoha možných strukturních variant microcystinu je dnes popsáno cca 70 o různé toxicitě [CHORUS, 2004]. Molekulární váha těchto peptidů se pohybuje v rozmezí 900-1100Da [SIVONEN, 1996] a vzhledem k tomu, že jsou složeny z netypických D a L aminokyselin se jedná o sloučeniny termostabilní.

Obr. 10. Nodularin [RINEHART, 1988]

5

Podobnou strukturu můžeme nalézt u nodularinu syntetizovaného výhradně planktonní sinicí rodu Nodularia [NAMIKOSHI 1996, RINEHART 1988]. Jedná se též o cyklický peptid s Adda v bočním řetězci, ale na rozdíl od microcystinu je cyklus tvořen 5 Literární reš erš e

Petr Tomek


aminokyselinami. Je patrné, že molekula velikosti microcystinu nebude do hepatocytu trasportována pasivní difuzí [ERIKSSON, 1990]. Její přenos probíhá za spotřeby ATP pomocí žlučového transportního systému, což potvrzuje nulová toxicita microcystinu-LR proti buněčným liniím tohoto systému zbavených [CHONG, 2002]. Cílovou organelou microcystinu je mitochondrie, jeden z nejnáchylnějších článků subbuněčné organizace. Jedny z prvotních procesů toxického efektu vedoucí k aktivaci apoptózy jsou depolarizace a alterace funkcí mitochondriální membrány a zejména jejího potenciálu [DING, 2003]. Následkem toho, zatím neobjasněným způsobem, dojde k tvorbě megakanálu umožňujícího nekontrolovaný průnik molekul. Je zřejmé, že změnami membránového potenciálu je ovlivněno buněčné dýchání a s ním spřažená oxidativní fosforylace. PACE A KOL. (1991) dokázali, že inhibice v důsledku působení toxinu činí v průměru až 50%. Vlastní toxický efekt je způsoben nadprodukcí ROS (reactive oxygen species -OH radikály, peroxidy vodíku a další oxidační činidla), které vznikají pravděpodobně v některém z Fe3+ redukčních cyklů, jelikož je jejich produkce při aplikaci desferrioxaminu (membránového antioxidantu) inhibována [DING, 1998A]. Při vysoké koncentraci ROS zřejmě dochází k peroxidaci lipidů a hromadění koncového produktu tohoto děje malondialdehydu v cytosolu buňky. Po 24 hodinách dochází k poškození buněčné membrány a úniku cytosolické laktátdehydrogenasy (LDH) mimo buňku. Dodnes není jasný přesný mechanismus těchto dějů, avšak byla prokázána přímá závislost koncentrace uvolněné MDA a LDH na použité koncentraci microcystinu [DING, 1998A]. Vyjma použití mechanismů redukujících ROS je buňka schopna bránit se toxickému působení microcystinu jeho detoxikací a vyloučením pomocí glutathiontransferasy. Tento detoxifikační enzym je schopen pomocí –SH domény hepatotoxin vázat a vyloučit ho. Již při podprahové koncentraci toxinu dochází v buňce k rapidnímu navýšení koncentrace této látky [BOUAICHA, 2004], které se dá stejně jako LDH s úspěchem využít při stanovování cytotoxicity [BHATTACHARYA, 1996]. Tyto obranné mechanismy jsou teoreticky schopny potlačit apoptózu, nicméně při vysoké expoziční koncentraci k její aktivaci dojde většinou již při depolarizaci membrány mitochondrie [DING, 2003]. V apoptotické buňce dochází k puchýřkatění a externalizaci plasmatické membrány a tudíž i fosfatidylserinu na ní vázaném. Fosfatydilserin můžeme použít k detekci apoptotických buněk, a to pomocí florescenční proby Anexinu V-Flos. Apoptické buňky pak můžeme úspěšně kvantifikovat pomocí průtokové cytometrie [FADOK, 1992]. Při apoptóze buňky jsou uplatňovány stejné mechanismy jako při přirozené smrti buňky (uvolněním cytochromu c a aktivací calpain Ca2+ dependentních proteas a kaspas), avšak šestkrát rychleji [DING, 2003]. Při vysokých koncentracích toxinu je tento čas zkrácen až na 2 minuty [FLADMARK, 1999]. Microcystiny a nodularin jsou na molekulární úrovni mimo jiné silnými inhibitory proteinfosfatas PP1, PP2A a PP3 typu, což vede k hyperfosforylaci proteinů a nekontrolované aktivitě proteinkinas. Tyto enzymy se podílejí na omezení fluidity intermediárních filament a mikrofilament zodpovědných za morfologickou strukturu hepatocytu. Jejich nekontrolovanou fosforylací dochází ke zhroucení cytoskeletu [MATSUHIMA 1990, CARMICHAEL 1992] a následné ztrátě schopnosti regulace homeostase buněčného prostředí [DING, 1998B]. Z klinického hlediska je tento stav charakterizován jako jaterní insuficience a může končit smrtí. Vzhledem k tomu, že jsou tyto děje mnohdy spjaty s proliferací buněčného cyklu jsou microcystiny velmi silnými TPF (tumour promoting factors) [MARŠÁLEK, 2005]. V této funkci se výrazně liší microcystiny a nodularin. Microcystin-LR, ovlivňuje buněčný cyklus kaskádou biochemických dějů, zatímco nodularin je přímo iniciátorem deregulace buněčného cyklu [BOUAICHA, 2004]. Třetím typem sinicových hepatotoxinů je cylindrospermopsin. Jedná se o sloučeninu alkaloidní povahy skládající se z tricyklické guanidinové kostry se substituovaným hydroxymethyluracilem [OHTANI, 1992]. Vzhledem k jeho nízké molekulární váze (415Da) je do buňky transportován aktivně, což bylo potvrzeno aplikací žlučových kyselin cholové a taurocholové Literární reš erš e

6

Petr Tomek


na buňky vystavené cylindrospermopsinu a microcystinu. Zatímco u microcystinu byla vzhledem k typu jeho transportu zaznamenáno výrazné snížení toxického efektu, u cylindrospermopsinu nebyla toxicita pozměněna [CHONG, 2002]. Toxicita cylindrospermopsinu a jeho derivátů vyplývá právě z uracilového zbytku, který in vitro v myších hepatocytech nekompetitivně inhibuje aktivitu UMP (uridin monofosfátsyntetasy, Obr. 11. Cylindrospermopsin [HARADA, 1994] KI = 10 µM) a následně syntézu pyrimidinových nukleotidů [REISNER, 2004]. Dochází k proliferaci buněčné membrány, akumulaci tukových kapének a smrti buňky [RUNNEGAR, 2002]. Co se týče přímého buněčného poškození a následné toxicity k teplokrevným obratlovcům je MCLR nejtoxičtější z výše uvedených látek, následován nodularinem, cylindrospermopsinem a MCRR (viz tab.1). Rozdílné efektivní koncentrace MCLR a MCRR naznačují dle experimentů i odlišný mechanismus působení relativně podobných hepatotoxinů. Zatímco toxicita MCRR se vyznačuje především celkovou změnou obsahu proteinů, MCLR změnou lysosomálních funkcí a aktivitou sukcinátdehydrogenasy [PICHARDO,2005].

1.D

OSTATNÍ

SINICOVÉ CYTOTOXINY

Zejména v posledních letech byla provedena řada studií zaměřených na vyhledávání látek zajímavých z biotechnologického a farmaceutického hlediska [NAMIKOSHI 1996, MOORE 1988, SIVONEN 1990, BERRY 2004, CHEN 2003, BARCHI 1983, PATTERSON 1992, JUNG 1991]. Tyto studie potvrdily v sinicích přítomnost látek s antimikrobiálními, fungicidními, protirakovinnými, antiHIV [ESSER, 1999] aj. aktivitami. Díky těmto screeningovým pracem dnes známe několik desítek látek s cytotoxickým účinkem. Značná diverzita bioaktivních látek byla nalezena u sinice rodu Lyngbya. Kromě sloučenin s hepato- i Obr. 12. Lyngbyatoxin A [MURATAKE, 1987]

neurotoxickými učinky jakou jsou např. lyngbyatoxin A či antillatoxin, byla z této sinice izolována celá řada cytotoxických látek. Toxicita lyngbyatoxinu A, poprvé izolovaného z kmene Lyngbya aerugino-coerulea, je způsobena zablokováním syntézy DNA a stimulací mitózy. Tyto naprosto antagonistické procesy ve svém důsledku ústí buď v proliferaci buňky či její smrt [TENEVA, 2003]. Mezi významné potenciální Obr. 13. nahoře: curacin A [HOEMANN, 1997] dole: kalkitoxin [WHITE, 2004] protirakovinné látky patří curacin A [HOEMANN, 1997], inhibitor mikrotubulů, inhibující nádorové buňky prsu již v nanomolárních koncentracích. Dále byl z Floridských isolátů tohoto rodu identifikován pahayokolide A, pravděpodobně složený z peptidové a nepeptidové části [BERRY, 2004]. Přestože pahayokolide A není tak učinným cytotoxinem jako curacin A, vykazuje značnou cytotoxicitu proti velkému počtu lidských nádorových linií. Nejefektivněji inhibuje buněčné linie

7


Petr Tomek


H460 (plicní adenokarcinom), A498 (ledvinný adenokarcinom), SK-OV-3 (adenokarcinom vaječníků) a CEM (lymfocytická leukémie); zatímco buněčná linie HT29 (tračníkový adenokarcinom, GRIII) je ovlivněna v porovnání s ostatními relativně vysokou koncentrací [BERRY, 2004] (viz tab.1). Proč se působení proti jednotlivým nádorovým buněčným liniím tak markantně odlišuje zbývá objasnit. Stejné vlastnosti byly prokázány u tolytoxinu (6-hydroxy-7-O-methyl-scytophycinu B, viz obr. 1.) syntetizovaného zejména rody Scytonema a Tolypothrix [JUNG, 1991]. Tolytoxin působí cytotoxicky na široké spektrum eukaryotních organismů, zatímco inhibice prolaryot aplikací stejných koncentrací nebyla prokázána [PATTERSON, 1992]. Stejně jako pahayokolid A působí specificky na určité linie, avšak jeho toxicita je výrazně vyšší. Hodnoty IC50 se při 72h inkubaci pohybují v řádech desetin až desítek nM. Zatímco lidské nádorové buněčné linie COLO-201 (tračníkový adenokarcinom) a KATO-III (žaludeční adenokarcinom) jsou k působení tohoto toxinu citlivější, LoVo (adenokarcinom) a KB (epidermoidní karcinom) a HL-60 (promyelocytická leukémie) jsou méně citlivé (viz tab. 1.) [PATTERSON, 1992]. Ze sinice rodu Tolypothrix byssoidea byl izolován další bioaktivní cytotoxin tubercidin (pyrollo[2,3-d]pyrimidin nukleosid). Prostřednictvím interakcí s m-RNA se stává silným Obr. 14. Tubercidin [BARCHI, 1983] inhibitorem syntézy RNA a DNA [BARCHI, 1983]. Takovýto mechanismus působení je logický u většiny derivátů purinových a pyrimidinových bází jakou je i tubercidin. Podobně se chovají i 9-deazaadenosin a jeho 5´-aglucopyranosid izolované z Anabaena affinis VS-1 [NAMIKOSHI, 1996] a deriváty dolastatinu13. Velikým problémem úspěšné farmaceutické aplikace těchto produktů se stává rezistence (multidrug resistance - MDR) nádorových buněk způsobená P-glykoproteiny (P-gp, MDR-1) a MDR-vázanými proteiny MRP-1. Jedná se o transportéry integrované v buněčné membráně. Pokud má substrát (léčivo, toxin) afinitu k tomuto P-gp ATP-dependentnímu „efflux pump“ kanálu, je jeho absorpce inhibována [ENDICOTT 1989, SMITH 1994]. Nejperspektivnější látka z hlediska farmaceutické využitelnosti [MOORE, 1995] byla izolována z terestrické sinice kmene Nostoc sp. 1994]. GSV224 [TRIMURTULU, Jedná se o depsipeptid cryptophycin A o neobvyklé struktuře obsahující epoxidovou funkční skupinu. V dnešní době známe 18 derivátů této látky [TRIMURTULU 1995, PANDA Obr. 15. Cryptophycin 1 (R1 = CH3, R2 = H). Cryptophycin 52 1997] a obdobně jako u jiných velmi (LY355703, R1 = R2 = CH3 [AL-AWAR, 2004] dole: syntetické deriváty cryptophycinu fragmentu A účinných cytotoxinů spočívá mechanismus v destrukci cytoskeletu [SMITH, 1994]. Cryptophyciny neprojevují takovou citlivost vůči resistenčním mechanismům nádorových linií jako doposud užívaná cytostatika Taxol či Adriamycin. Jedním z nejúčinnějších cytostatik ze sinic izolovaných je cryptohophycin52 (LY355703) – synteticky vytvořený derivát lišící se adicí -CH3 skupiny k fragmentu C původní molekuly. Naopak nízké hodnoty inhibice byly zjištěny u cryptophycinu C (viz tab. 1.) [Trimurtulu 1994, Trimurtulu 1995] postrádajícího epoxidovou funkční skupinu. Literární reš erš e

8

Petr Tomek


Snaha získat rozpustnější a účinnější látku vedla k syntéze řady derivátů cryptophycinu52, zejména adicemi na fenylovém jádru fragmentu A zodpovědného za toxický učinek (viz obr. 16.). Prolomení jistých resistenčních mechanismů bylo prokázáno na HL-60 buněčné linii s nadměrně exprimovanými MRP-1 a P-gp. Dobré výsledky byly získány adicemi polárních amino či hydroxy skupin na (ne)hydrochlorované molekule, a naopak nejnižší toxický efekt vykazovaly deriváty adované nepolárními funkčními skupinami jako je např. methyl. Ve výsledku je patrné, že těmito změnami nebyly MDR bariéry překonány, jelikož aminoderiváty a hydroxyderiváty sice úspěšně Obr. 16. Paclitaxel (Taxol) [HARBORNE, 1993] inhibovaly MRP-1 buněčné linie, ale zároveň se stávaly lepším substrátem pro transportní systém P-gp, což je nepřijatelné pro farmaceutické využití jako protirakovinové agens (viz tab.1) [AL-AWAR, 2004]. Stejně jako cryptophyciny se také cryptophycin52 selektivně váže na konce mikrotubulů a Obr. 17. Calothrixin A (1). Calothrixin B (2) [BERNARDO, 2002] potlačuje tím jejich dynamiku, která je nepostradatelná pro život buňky. Tímto se v G2-M fázi přerušuje buněčný cyklus a následuje apoptóza buňky [SMITH, 1994], avšak tento proces je na rozdíl od působení hepatotoxinů značně zpomalen. Aplikace cryptophycinu52 o koncentraci rovné LD90 po dobu 18h vedla u myších linií k nárůstu buněk v časné metafázi. Znaky apoptického jádra byly pozorovány za dalších 36h, což může vysvětlit graduální aktivace kaspasy-3 či neschopnost enzymů navázat se na pozměněnou strukturu DNA [KESSEL, 2000]. Cryptophycin52 je považován za dosud nejúčinnější supresor mikrotubulové dynamiky (k přerušení bunečného cyklu nádorových buněk dostačuje řádově pikomolární množství) [DE MUYS, 1996]. Přerušení buněčného cyklu v G2-M fázi se také stává cílem pentacyklických indolofenantridinů calothrixinu A a calothrixinu B, ovšem narozdíl od cryptophycinu tyto látky neblokují buněčná mikrofilamenta. Obecný mechanismus toxicity chinonových molekul, mezi které mimo jiné patří i menadion (vitaminu K3), spočívá v přímé arylaci gluthathionu, inhibici sulf-hydryl dependentních proteinů [GANT, 1988] či tvorbě ROS [BOLTON, 2000]. Vzhledem k trojnásobné toxicitě calothrixinu A oproti menadionu (vitaminu K3) a neschopnosti přímé arylace, spočívá toxicita calothrixinu zřejmě v interakci chinonové části molekuly s DNA dosud neznámým způsobem [CHEN, 2003]. K utvoření představy o tom, jak různorodé cytotoxiny mohou sinice produkovat, zbývá doplnit schopnost syntézy indolokarbazolových makrocyklů. Tato látka byla nalezena u sinice Obr. 18. Menadion, Nostoc sphaericum (EX-5-1), vykazuje antivirální aktivitu proti Herpes vitamin K3 simplex viru typu 2 a neselektivní cytotoxicitu vůči několika lidským nádorovým liniím [KNÜBEL, 1990].

9


Petr Tomek


Nutno dodat, že výčet cytotoxických látek v této kapitole není úplný, neboť řada sinicových peptidů vykazuje cytotoxické účinky. Inhibice buněčných linií byla prokázána u lineárních aeruginoguanidinů, cyklických aeruginopeptinů a nostopeptolidu A [ISHIDA 2002, SIVONEN 1996, TRIMURTULU 2000]. Ovšem toxicita těchto látek byla vždy výrazně nižší než u výše uvedených látek a mechanismy jejich působení nejsou plně objasněny.

1.E

ROZŠÍŘENÍ

BIOSYNTÉZY SINICOVÝCH TOXINŮ

Obr. 19. 6-cyano-5-methoxy-12methylindolo[2.3-a] karbazol [KNÜBEL, 1990]

Dodnes je předmětem zkoumání to, jaký vliv mají na syntézu sinicových metabolitů podmínky prostředí a k čemu vlastně takové množství energeticky náročných látek sinicím slouží. Bylo prokázáno, že např. microcystiny syntetizují i velmi nepříbuzné sinice z různých geografických oblastí a pravděpodobně tomu tak bude také i u řady jiných látek [RANTALA ET AL., 2004]. A naopak není pravidlem, že sinice určitého rodu nebo druhu syntetizovala pouze daný typ toxinu. Zpravidla určitý organismus syntetizuje peptidy několika tříd společně s jinými látkami. Příkladem, tohoto na první pohled nahodilého uspořádání, je rozšíření Cylindrospermopsinu. I přesto, že byl poprvé izolován ze sinice Cylindrospermopsis raciborskii [OHTANI, 1992], neplatí, že je tento toxin produkovaný tímto druhem kosmopolitně. Dle HPLC-MS analýz kmeny izolované z Německa neobsahují cylindrospermopsin ani microcystin a jsou toxické vůči HEP-G2 (lidský hepatocelulární karcinom) a CACO-2 (lidský střevní adenokarcinom) buněčným liniím [FASTNER, 2003]. Naproti tomu kmen AWT 205, izolovaný z Austrálie, cylindrospermopsin osahuje a vykazuje silný toxický efekt vůči HEP-G2 i myším hepatocytům, které německým kmenem nebyly inhibovány. Je tedy zřejmé, že určité kmeny sinic syntetizují své metabolity v závislosti na ekologických podmínkách. Dalším příkladem produkce různých toxinů v rámci jednoho taxonu může být situace u planktonních a bentických kmenů rodů Anabaena a Nodularia. U planktonních izolátů z Baltického moře, byla prokázána hepatotoxicita způsobená microcystinem a nodularinem [SIVONEN & JONES 1999, LAAMANEN 2001], zatímco bentické isoláty nejsou syntézy microcystinu ani nodularinu schopny. U této skupiny byl naopak prokázán častý výskyt cytotoxických látek [SURAKKA, 2005].

cyanotoxin

testovací objekt

myší hepatocyty myší hepatocyty PLHC-1 (rybí microcystin LR hepatokarcinom) myší hepatocyty RTG-2 (rybí gonády) myší hepatocyty PLHC-1 (rybí microcystin RR hepatokarcinom) RTG-2 (rybí gonády) Literární reš erš e

toxický efekt / koncentrace hepatotoxiny LC50 - 8 ng/ml LC50 - 48 ng/ml EC50 - 12 μM EC50 - 0,5 μM

doba expozice 72h

CHONG, 2002 BOUAICHA, 2004 PICHARDO, 2005

24h

FASTNER,1995

EC50 - 80 μM EC50 - 4,5 μM EC50 - >100 μM

autor

PICHARDO, 2005 FASTNER,1995 PICHARDO, 2005

24h

EC50 - >150 μM

PICHARDO, 2005

10

Petr Tomek


nodularin cylindrospermopsin

myší hepatocyty myší hepatocyty

LC50 - 62 ng/ml LC50 - 40 ng/ml

24h 72h

BOUAICHA, 2004 CHONG, 2002

48h

BERRY, 2004

72h

PATTERSON, 1992

cytotoxiny H460 A498 SK-OV-3 CEM HT29 LoVo KB HL-60 COLO-201 KATO-III

pahayokolide A

tolytoxin

cryptophycin 52 cryptophycin-OH cryptophycin-HClpyrrol cryptophycin 52 cryptophycin-OH cryptophycin-HClpyrrol cryptophycin 52 cryptophycin-OH cryptophycin-HClpyrrol cryptophycin A cryptophycin C (deoxy) calothrixin A

HL-60/S

IC50 - 2,13 μM IC50 - 2,61 μM IC50 - 2,76 μM IC50 - 3,27 μM IC50 - 44,57 μM IC50 - 8,4 nM IC50 - 5,3 nM IC50 - 4,8 nM IC50 - 520 pM IC50 - 780 pM IC50 - 24,8 pM IC50 -7,9 pM

24h

IC50 - 6,4 pM HL-60/MRP-1

IC50 - 19,5 pM IC50 - 9,6 pM

24h

AL-AWAR, 2004

IC50 - 7,6 pM HL-60/P-gp

IC50 - 138 pM IC50 - 214 pM

24h

IC50 - 90 pM KB

IC50 - 5 pM

24h

KB

IC50 – 3 nM

24h

HeLa

IC50 - 1,6 μM

24h

TRIMURTULU, 1994 TRIMURTULU, 1994 RICKARDS, 1999

Tab. 1. Toxické hodnoty uvedených cyanotoxinů

1.F

CÍLE

PRÁCE

Screeningová část - otestovat cytotoxicitu sinicových kmenů vůči savčím buněčným liniím - porovnat cytotoxickou aktivitu sinic z různých biotopů - porovnat účinek vybraných cytotoxických kmenů v závislosti na dávce a době expozice Analytická část - pomocí HPLC-MS určit obsahové látky cytotoxických extraktů - u vybraných kmenů, obsahujících neznámý cytotoxin, získat aktivní frakci a pokusit se látku charakterizovat

11


Petr Tomek

2


MATERIÁLY A METODIKA

2.A

SINICOVÉ

KMENY

A EXTRAKCE

V

předkládané práci byla studována cytotoxicita a obsahové látky u 25 izolátů rodu Nostoc, 7 přírodních sběrů sinice Nostoc commune a 21 izolátů plaktonního rodu Anabaena pocházejících z různých lokalit a biotopů (viz tab. 2.). Pro studium byly záměrně vybrány organismy půdní, symbiotické, planktonní, epifytické a subaerofytické. Sinicové kmeny byly poskytnuty ze sbírek Ing. Aleny Lukešové (ÚPB AVČR), Dr. Stefana Ventury (Consiglio Nationale Richerche, Istitute for Ecosystem studies, Florencie), neoficiální sbírky na Opatovickém Mlýně (MBÚ AVČR) a sbírky Elišky Zapomělové (BF JČU). V případě, že nebyla k dispozici lyofilizovaná biomasa, probíhala kultivace ve 300ml sterilních kultivačních válcích na médiu A-D Anabaena [ARNON, 1974], v prostředí obohaceném 2% CO2 při kontinuální fotoperiodě (70W/m2, OSRAM DULUX Philips L) a teplotě 28°C. Kultury byly sklizeny po dosažení konce exponenciální fáze růstu centrifugací (Hettich Universal 320 – 4500 rpm, 15 min), přeneseny na Petriho misku a uloženy po 1 hodinu v hlubokomrazícím boxu při -80°C. Následně byla biomasa lyofilizací zbavena vody a extrahována disintegrací v hmoždíři za pomoci přečištěných písečných zrn 70% methanolem. Pro porovnatelnost výsledků bylo u každého kmene 200 mg biomasy převedeno do 10 ml extrakčního rozpouštědla. Extrakce probíhala po 1hod bez přístupu světla. Vzniklá směs byla centrifugována (4500 rpm, 15 min) a supernatant převeden do srdcové baňky a odpařen na vakuové odparce (Büchi Rotavapor). Následně byl supernatant zakoncentrován (pokud není uvedeno jinak) na finální surový extrakt o koncentraci 200mg suché biomasy/ml a zbaven případných precipitátů ultrazvukovou sonifikací (Bandolin Sonorex, Bandolin GmbH). kmen

vědecké jméno

rok izolace

lokalita/stát

biotop

De1 Nostoc sp.

1992

skleník, Řím / Itálie

Dioon edule symbiont

OGU36S01 Nostoc sp.

2000

Achill Island / Irsko

Gunnera symbiont

OGU36S02 Nostoc sp.

2000

Achill Island / Irsko

Gunnera symbiont

4AL2 Nostoc sp.

nezn.

botanická zahrada Siena / Italie

Anthoceros laevis symbiont

Cr4 Nostoc sp.

1992

skleník, Florencie / Itálie

Cycas revoluta symbiont

Gm1 Nostoc sp.

1992

skleník, Siena / Itálie

Gunnera manicata symbiont

Mm1 Nostoc sp.

1992

skleník, Řím / Itálie

Macrozamia moorei symbiont

ATCC53789 Nostoc sp.

nezn.

Skotsko

symbiont lišejníku

3SD05S05 Nostoc sp.

2005

Sassendalen / Svalbard Island

černý povlak

SAG3491 Nostoc coeruleum

nezn.

Wilhelmshaven / Německo

jezírko

TH1S01 Nostoc sp.

nezn.

Thajsko

nezatopené rýžové pole

TH2S22 Nostoc sp.

nezn.

Thajsko

nezatopené rýžové pole

NMB-21(poušť) Nostoc sp.

2003

Minia / Egypt

písečná poušť

NMB-25 Nostoc sp.

1999

Německo

výsypka po těžbě uranu

NMB-26 Nostoc sp.

1999

Německo

výsypka po těžbě uranu

Cam2S01 Nostoc sp.

1996

Kambodža

rýžoviště

1991

Nezamyslice / Česká Republika

orné pole

RQII Nostoc sp.

2004

Paranapiacaba / Brazílie

smáčená kůra stronů

Nostoc IIB Nostoc sp.

2004



Nostoc III Nostoc sp.

2004



N. Muscorum I Nostoc muscorum

Materiály a metodika

12

Petr Tomek


Nostoc V Nostoc sp.

2004



NostocVI Nostoc sp.

2004



SAG6179 Nostoc pruniforme

1964

Plön, Německo

bentos

SAG5979 Nostoc muscorum

1952

Francie

bentos

NC1 Nostoc commune

2006

Třeboň / Česká Republika

silážní jáma

NC2 Nostoc commune

2006

Třeboň / Česká Republika

silážní jáma

NC3 Nostoc commune

2006

Nové Hrady / Česká Republika

hráz rybníka u železničního přejezdu

NC4 Nostoc commune

2006

Nové Hrady / Česká Republika

hráz rybníka

NC5 Nostoc commune

2006

tankodrom, České Budějovice / Česká Republika

panelová cesta

NC6 Nostoc commune

2006

České Budějovice / České Republika

betonový nájezd

NC7 Nostoc commune

2006

České Budějovice / České Republika

betonové parkoviště ENTU AV

2000

The Burren, Clare / Irsko

periphyton

Anarenif Pěšák 2 A. eucompacta x reniformis

2006

Pěšák / Česká Republika

Litv II 06 čeleď Rivulariaceae

2006

Litvínovice / Česká Republika

2006

Svět / Česká Republika

04-26 A. circinalis x crassa

2004

Jesenice / Česká Republika

04-17 A. compacta

2004

Dubenský / Česká Republika

04-57 A. flos-aquae

2004

Vajgar / Česká Republika

04-06 A. mendotae x sigmoidea

2004

Březová / Česká Republika

04-24 A. lemmermannii

2004

Husinec / Česká Republika


2004

Hodějovický / Česká Republika

04-45 A. mendotae x sigmoidea

2004



2004

Valcha / Česká Republika

04-51 A. cf. spiroides

2004


2004


04-33 A. lemmermannii

2004

Orlík / Česká Republika

Anaps-Ole 03 Anabaenopsis cf. elenkinii

2003

Oleksovice / Česká Republika


2004

Husinec / Česká Republika

AlemLipno05A. lemmermannii - silná vlákna silná

2005

Lipno / Česká Republika

2004


2004

Skalka / Česká Republika

2004

Černiš / Česká Republika

2006

Pěšák / Česká Republika

OBU36S07 Nostoc sp.

Acom Svět A. compacta

04-43

Aphanizomenon aphanizomenoides

04-44 A. affinis 04-40a A. cf. flos-aquae 04-12 A. mendotae x sigmoidea Anarenif Pěšák 4 A. eucompacta x reniformis

rybník

pozn.: kmeny NC1-NC7 nebyly čistými izoláty

Tab. 2. Testované kmeny sinic

13


Petr Tomek

2.B


BUNĚČNÉ

LINIE

Myší imortalizované buněčné linie (lymfoblastomy) YAC-1 (neadherentní) a Sp/2 (semiadherentní) byly ochotně poskytnuty paní Evou Řezníčkovou a Doc. Janem Kopeckým (Parazitologický ústav Akademie věd v Českých Budějovicích). Kultivace probíhala ve sterilních kultivačních lahvích 25 cm2 (50ml, Cellstar, Greiner Bio-One) v mediu RPMI-1640 [MARTIN, 1994] (SIGMA) s přídavky 5% (v/v) kravského fetálního séra (PAA), 1% (2mM) Lglutaminu (SIGMA), 1% směsi antibiotika/antimykotika (PAA), 0,1% 50 mM merkaptoethanolu v inkubátoru (SANYO MCO-15AC, Schoeller) za stálé teploty 37°C a vysoké relativní vlhkosti. Buněčné linie byly sledovány inverzním mikroskopem (IM-2, MERCI) a pasáže u obou typů kultur probíhaly každé 1-2 dny. Semiadherentní buněčné linie Sp/2 musely být před pasáží uvolněny ze dna kultivační lahve rozfoukáním. Viabilita a koncentrace buněčných linií byla před vlastním testem cytotoxicity měřena exklusním barvením trypanovou modří [BERG, 1972] a koncentrace buněk počítána v Bürkerově komůrce (Cyrus MEOPTA), přičemž pro experiment byly použity pouze kultury s viabilitou větší než 95%.

2.C

TEST

CYTOTOXICITY

(MTT

TEST)

Do sterilní 96-jamkové mikrotitrační destičky (Nunclon delta Surface, NUNC) byly naneseny testované surové extrakty (frakce) a to v triplikátech po 10μl tak, aby krajní jamky zůstaly prázdné. Z důvodu odpaření rozpouštědla byly destičky vloženy cca na 30 min do inkubátoru o nastavené teplotě 37°C. Buněčná suspenze byla centrifugována (Sorvall Evolution RC, Kendro Lab Systems – 1000 rpm, 14 min, 4°C) a rozředěna v médiu RPMI-1640 na požadovanou koncentraci - 7,5x105 buněk/1ml. Do každé pokusné jamky bylo mikropipetou naneseno 200μl buněčné suspenze tak, aby první tři jamky ve sloupci obsahovaly testovaný extrakt a zbývající pouze kontrolní suspenzi. Krajní jamky byly naplněny 200μl destilované vody, aby se omezilo vypařování testovacích jamek. Buněčné linie byly inkubovány s extraktem (frakcí) za teploty 37°C a 4,25 ± 0,75% podílu CO2 ve vzduchu po dobu 12hod. Poté bylo do jamek přidáno 10μl MTT [3-(4´,5´ dimethylthiazol2´-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid; SIGMA] o koncentraci 4mg/ml (přefiltrované přes filtr Millipore express PES Membrane 0,22μm, Millex GP) a destičky vloženy zpět do inkubátoru na 34hod. Použitá metoda je založena na schopnosti mitochondriální succinyldehydrogenasy redukovat rozpustnou kvartérní sůl MTT na nerozpustné fialovo-modré formazanové krystalky. Koncentrace vzniklého formazanu je přímo úměrná počtu živých metabolizujících buněk a porovnáním kontrolních a testovacích jamek lze zjistit výslednou viabilitu [MOSMANN, 1983]. Po stočení mikrotitračních destiček (Hettich Universal 320 – 3000 rpm, 13 min) byl supernatant odstraněn a k rozpuštění formazanu použit dimethylsulfoxid (CHROMSERVIS). Za použití spektrofotometru (Tecan SUNRISE Elisa reader) byly při měřené (λ=590nm) a referenční vlnové délce (λ=640nm) odečteny hodnoty kontrolních a testovacích jamek a zjištěna výsledná cytotoxicita jednotlivých extraktů podle vzorce uvedeného níže. Míra toxicity studovaných kmenů byla rozdělena do tří kategorií dle tab. 3. Viabilita buněk [%] =

průměr – A640 testovacíchxxxxxxx jamek 590 − 640) xxxxxxxxxx průrům((A A590 průměr (A590 – A640) kontrolních jamek

efekt

inhibice [%]

vysoce cytotoxický cytotoxický necytotoxický (mírně cytotoxický)

50-100 25-49 0-24

Tab. 3. Rozřazovací kritéria cytotoxicity sinicových kmenů


14

Petr Tomek

2.D


SEPARAČNÍ

2.D.I

METODY:

HPLC/ESI/MS/MS (analytická), frakcionace

Složení sinicových extraktů bylo stanoveno za užití vysokoúčinné kapalinové chromatografie s propojením na hmotnostní spektrometr (dále HPLC-MS) na přístroji Agilent 1100 series, MSD100 Ion Trap. Dle potřeby byla analýza prováděna s alternujícími polaritami MS a se zaměřením iontové pasti na ionty o velikosti m/z 900 a m/z 1800 na analytické koloně (Zorbax Eclipse XDB-C8; 4,6x150mm, 5μm; průtok 0,6ml/min; nástřik 20μl, teplota 30°C). Analýza probíhala po dobu 35 min. za použití gradientu methanol a voda (viz obr. 20) s přídavky 0,1% HCOOH pro zajištění lepší ionizace látek v ESI/MS. Za účelem zjištění aktivní složky extraktu byla provedena frakcionace s následným testem cytotoxicity (viz odstavec 2.C). Frakcionace probíhala jímáním eluentu během standardní analýzy do baněk dle UV a MS záznamu, přičemž pro dobrou separaci látek byl použit online UV záznam a retenční čas. Frakce byly odpařeny a zakoncentrovány ve výchozím množství nástřiku v 70% methanolu z důvodu zajištění stejného efektu jako při aplikaci surového extraktu. methanol Obr. 20. Separační gradient analytické voda HPLC A1 (methanol:voda)

podíl rozpouštědla [%]

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

A1

0 0

5

10

15

20

25

30

35

t [min]

2.D.II

HPLC (preparativní), frakcionace

Preparativní HPLC byla použita za účelem získání většího objemu extraktů. Práce byla provedena na přístroji LabAlliance (Watrex Praha) při průtoku 3,8ml/min; nástřiku 0,5ml a teplotě 30°C. UV detektor (KNAUER variable wavelength monitor, λ=220nm) byl použit pro přesné odchycení frakcí obsahujících jednu látku. Za účelem lepší separace a možnosti nástřiku většího objemu byly použity kolony: C8 Reprosil100, 250x10mm, 5μm, Watrex a C18 Reprosil100, 250x8mm, 5μm, Dr. Maisch GmbH) a tudíž musely být optimalizovány také separační gradienty. Standardní analytický gradient použitý v analytické HPLC-MS byl vzhledem k nedostatečné separaci nahrazen vhodnějšími (viz obr. 21).

15


Petr Tomek

Cytotoxicita vláknitých sinic k liniím savčích buněk methanol voda

Obr. 21. Separační gradienty preparativní HPLC (methanol:voda)

100

nahoře: B1 separační gradient použit pro kolonu C8, Watrex (viz text)

90 80 70 60 50

uprostřed: B2 separační gradient použit pro kolonu C18, Dr. Maisch (viz text)

40 30 20 10

B1

0 100

dole: C1 separační gradient použit pro kolonu C8, Watrex (viz text)

podíl rozpouštědla [%]

90 80 70 60 50 40 30 20 10

B2

0 100 90 80 70 60 50 40 30 20

C1

10 0 0

10

20

30

40

50

t [min]

2.D.III

TLC, frakcionace

U vybraných frakcí byla ze separačních a analytických důvodů použita tenkovrstevná chromatografie (dále jen TLC). Eluční směs a podmínky byly s drobnými úpravami převzaty z práce EL-THAHER, 1994. Jako mobilní fáze byla použita směs n-butanol - kyselina octová - voda (v poměru 4:1:1). Na TLC desku s fluorescenční značkou (průměrná velikost silikagelových částic 2-25μm, výška 20cm, SIGMA) byly cca 0,5 cm pod okraj koncentrační zóny mikropipetovou špičkou naneseny vzorky v podobě bodů či pásků. Vzorky byly dokonale vysušeny fénem a deska vložena na 3 hodiny do dobře nasycené TLC komory naplněné mobilní fází. Po vytažení byla vysušena fénem, a díky fluorescenční značce byly separované látky patrné pod UV zářivkou (λ=254nm) jako tmavé body. K permanentnímu záznamu a ověření, zda-li frakce obsahuje cyklický Materiály a metodika

16

Petr Tomek


peptid, bylo třeba desku obarvit, a to vložením do 20% (w/v) roztoku kyseliny trichloroctové (TCA) na 10 min, a následně na 5 min do 0,3% (w/v) barviva Serva Blue W. Za pomoci tohoto barviva by se cyklické peptidy měly jevit jako tmavomodré skvrny či pruhy na světlemodrém pozadí desky. TLC frakcionace probíhala ještě před obarvením pomocí Serva Blue W. Po prohlédnutí desky pod UV zářivkou byly skvrny či pruhy opatrně označeny ostrým předmětem. Tyto „frakce“ byly i s vrstvou silikagelu seškrabány do zkumavek, extrahovány do 2ml 70% methanolu a zcentrifugovány (Hettich Universal 320, 4500 rpm, 10 min). Extrakce byla opakována dvakrát. Supernatant byl odpařen a zakoncentrován do původního objemu extraktu (0,5ml). Takto vzniklá frakce byla podrobena testu cytotoxicity a analýze HPLC-MS.

2.E

STANOVENÍ „IC50“ DOBĚ EXPOZICE.

A ZÁVISLOST TOXICKÉHO EFEKTU NA

Jelikož nebyla k dispozici navážka čisté izolované látky, byla hodnota „IC50“ i ostatní koncentrace v tomto experimentu vyjadřovány jako koncentrace lyofilizované biomasy/ml (dále jen LB/ml). K oběma experimentům byly použity extrakty kmenů Nostoc muscorum I a Nostoc sp. De (viz tab. 2.) o koncentracích 80mg/ml pro N. muscorum I a 125mg/ml pro De. Ke stanovení hodnoty „IC50“ pro buněčné linie YAC-1 a Sp/2 bylo použito koncentrační rozpětí 62 μg LB/ml až 10 mg LB/ml připravované ředící řadou v 70% methanolu. Experiment byl následně proveden a vyhodnocen MTT testem. Koncentrační závislost byla konstruována na základě proložení získaných dat sigmoidální křivkou pomocí metody nejmenších čtverců. Hodnota „IC50“ byla vypočtena podle níže uvedeného vzorce,

y=

a−c +d 1 + ( ICx50 ) b

kde a=horní limita, b=sklon funkce, c=spodní limita, d=posun po ose y, x=proměnná. Pro časový experiment byla použita, díky lepším „fotogenickým vlastnostem“ způsobeným adhesí, linie Sp/2. Buňky byly exponovány koncentraci shodné s „IC50“. Extrakty byly naneseny v šesti opakováních a ponechány odpařit v inkubátoru při 37°C a následně byla přidána buněčná suspenze. Jednotlivé jamky byly prohlédnuty a fotodokumentovány v intervalech 0h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h Paralelně k tomu byla viabilita pro jednotlivé expoziční časy hodnocena pomocí trypanové modři. Fotodokumentace byla provedena za použití inverzního mikroskopu IM-2 s modrou clonou a digitálního fotoaparátu NIKON CoolPix 4500.

17


Petr Tomek

3 3.A


VÝSLEDKY SCREENING

CYTOTOXICITY SINICOVÝCH KMENŮ

V

e screeningové části předkládané práce byla testována cytotoxicita celkem 53 kmenů sinic ze 6 různých biotopů (viz graf 2.) Celkem 62% testovaných kmenů vykazovalo jistou míru cytotoxicity alespoň proti jedné buněčné linii a více než třetina z nich vyvolávala silný toxický efekt. Z grafu 1. je také patrné, že větší procento extraktů způsobovalo poškození buňkám linie YAC-1, kde byla inhibice zaznamenána u 32 kmenů a až na vyjímky bylo poškození vždy vyšší než u linie YAC-1. Naproti tomu linii Sp/2 inhibovalo celkem 27 extraktů. Pro detailní porovnání viz grafy 1. a 2. Přesto se nedá říci, že by se ve většině případů jednalo o specifický efekt vůči jedné linii. Pouze u kmene Nostoc sp. TH1SO1 byla nalezena specifická aktivita proti buňkám YAC-1 (inhibice 59℅). Co se týče porovnání izolátů různých ekologických skupin, byly nalezeny pozoruhodné rozdíly ve výskytu cytotoxických kmenů. Zatímco mezi bentickými a epifytickými organismy nebyly nalezeny výrazně pozitivní izoláty, vysoká frekvence výskytu cytotoxických kmenů byla pozorována u planktonních a půdních kmenů. Vysoké hodnoty inhibice byly zaznamenány u 5 z 9 studovaných půdních sinic, přičemž izoláty N. muscorum I, Cam2SO1, NMB-26, NMB-25 a TH1SO1 způsobovaly silný toxický efekt alespoň proti jedné linii. Vyjma sinice Anabaena compacta Svět byla nalezena výrazná cytotoxicita u všech planktonních izolátů. Méně častý výskyt byl nalezen mezi symbiotickými a subaerofytickými kmeny. Nutno dodat, že v obou skupinách byly také zpozorovány velmi aktivní kmeny, avšak zřídka. Většina nezpůsobovala buňkám žádná poškození, anebo jejich aktivita byla podprahová. Silný toxický efekt vyvolával u obou linií extrakt symbiotického kmene Nostoc sp. De (78% vůči YAC-1 a 66% vůči linii Sp/2), dva sběry subaerofytické sinice Nostoc commune NC-1 a NC-4, a perifytonní kmen Nostoc sp. OBU36SO7.

YAC-1

Sp/2 toxických kmenů 27

toxických kmenů 32

silně aktivních 19

70%

40%

49% 51%

netoxických kmenů 26

30%

aktivních 8

60%

netoxických kmenů 21

75%

25%

Graf 1. Srovnání cytotoxicit studovaných extraktů proti buněčným liniím YAC-1 a Sp/2.

Výsledky

silně aktivních 24

18

aktivních 8

Petr Tomek


77,33

17,80

23,09

0,00 0,00

0,00

56,64 65,48

84,46 89,42

72,27 68,39

0,00 0,00

16,35

31,79

53,57

63,63 46,14

78,57 79,00

0,00 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00

83,00 91,89

0,00 0,00

40,69

87,70 82,20

76,96 68,63

88,55 86,86 38,91 28,78

38,81

1,59

13,08

87,29 91,54

0,00 3,54

0,00 5,96

73,54 69,74

26,97

38,74

61,18

68,50 47,83

46,54 52,02 12,27 9,60

83,62 75,71

45,87

80,43 66,65

69,44

46,87

66,93

84,80 77,40 3,39 1,64

0,00

50,45

24,46 17,50

0,00 0,00

0,00

0,00

55,32 0,00

0,00

8,33

0,00

6,08

12,01

65,55

59,86 4,82 0,00

0,00

22,67

0,35

52,77

32,50

47,25 40,22

73,53 69,58

04-59

Anarenif Pěšák 4

04-12

04-40a

04-44

AlemLipno0 5-silná

04-22

Anaps-Ole 03

04-33

04-43

04-51

04-28

04-24

04-06

04-57

04-17

04-26

Acom Svět

Litv II 06

Anarenif Pěšák 2

3SD07SO1

SAG5579

OBU36S07

NC7

NC6

NC5

NC4

NC3

NC2

NC1

04-45

Inhibice [%]

SAG5979 starý

SAG5979

Nostoc VI

SAG6179

Nostoc V

Nostoc III

NMB-21

N.Muscorum I

Cam2SO1

NMB26 starý

0

NMB-26

10

planktonní kmeny

NMB25 starý

20

NMB-25

30

TH22S22

40

TH1SO1

subaerofytické kmeny

SAG3491

3SD05SO5

ATCC53789

Mm1

50

Gm1

60

Cr4

70

4AL2

80

OGU36SO2

90

OGU36SO1

De

100

Sp/2

bentické kmeny

epifytické kmeny

Nostoc II B

0

YAC-1

RQII

10

0,00

20

0,00 0,00

30

5,17

40

24,80

50

0,14

21,60 15,87

60

půdní kmeny

44,02

22,40

70

0,00 0,00

Inhibice [%]

80

7,53 5,37

90

symbiotické kmeny 66,35

100

78,92

Toxicita kmenů sinic proti buněčným liniím YAC-1 a Sp/2

Graf 2. Výsledky celkového screeningu 53 kmenů sinic. Všechny experimenty byly provedeny pro každý kmen minimálně ve dvou opakováních. Hodnoty značí průměrnou inhibici kmene a chybové úsečky znázorňují minimální a maximální hodnotu z celkového souboru hodnot. Záporné hodnoty inhibicí byly převedeny na nulové. Rámované oblasti označují kmeny z jednotlivých biotopů. 19

Výsledky

Petr Tomek

3.B


HPLC/ESI/MS

ANALÝZY CYTOTOXICKÝCH EXTRAKTŮ

Na základě výše uvedené screeningové části práce bylo pro podrobnou HPLC-MS analýzu vybráno 6 silně cytotoxických extraktů. U nejzajímavějších kmenů byla provedena frakcionace a charakterizace aktivní látky. Měření probíhala za použití gradientu A1a byly analyzovány extrakty následujících kmenů: Symbiotický kmen Nostoc sp. De, půdní izoláty Nostoc sp. NMB25, NMB26, Cam2SO1, Nostoc Muscorum I, Nostoc sp. OBU36SO7 a planktonní sinice druhu Anabaena affinis 04-44 a Anabaena eucompacta x reniformis Pěšák 2. U všech extraktů byly v retenčním čase (dále jen RT) 25 min. zaznamenány molekulární ionty 301/579 odpovídající kontaminaci ftalátů z plastových laboratorních pomůcek. V následující části analýzy pak bylo možno nalézt na základě absorpce ve vlnových délkách 440 a 660 nm především pigmenty a jejich degradační produkty [KOPECKÝ, ÚSTNÍ SDĚLENÍ], a proto nebyla tato část chromatogramu podrobněji analyzována. Zvolenou analytickou metodou bylo dosaženo ve většině extraktů dobré ionizace a dostatečné separace pro účely určení molekulárních iontů. Pouze extrakty kmenů NMB-25, 04-44 a Cam2SO1 vykazovaly nedostatečnou ionizaci a intenzita molekulárních iontů se pohybovala na hranici šumu. Vlivem nedostatečné separace mohl být v +MS spektrech některých kmenů pozorován více než jeden molekulární iont.

3.B.I

Extrakty Anabaena affinis 04-44 a Anabaena eucompacta x reniformis Pěšák 2

ntens. x10 8

EXTR2757.D: TIC ±All MS

1.2

pigmenty

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.08

5

10

15

20

25

30

Time [min]

Graf 3. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) kmene Anabaena eucompacta x reniformis Pěšák 2. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů. Svislé čáry znázorňují jednotlivé frakce.

Zatímco u kmene Anabaena affinis 04-44 (viz graf 4.) nebyly v extraktu nalezeny prakticky žádné sloučeniny, chromatogram Anabaena eucompacta x reniformis Pěšák 2 (graf 3.) vykazoval relativně dobře separované píky pro hmoty [M+H]+ 875, 866, 618, 1235,5 a 642. Molekulární iont 1235,5 vypovídá na základě molekulární váhy o přítomnosti puwainaphycinu A, [M+H]+ 1236 [GREGSON, 1992]. Ostatní ionty nemohly být dle dostupných materiálů identifikovány. Vzhledem k silnému cytotoxickému efektu obou kmenů byly jejich extrakty frakcionovány. Extrakt kmene 0444 byl rozdělen na tři frakce pouze na základě RT. Tento postup byl zvolen pro případ, že by extrakt obsahoval špatně ionizovatelné látky, které by v MS záznamu nebyly patrné. Překvapivě u žádné ze získaných frakcí nebyla cytotoxicita pomocí MTT testu prokázána.

Výsledky

20

Petr Tomek


0.0 x10 8


1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00 5

10

15

20

25

30

Time [min]

Graf 4. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) kmene Anabaena affinis 04-44. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů. Svislé čáry znázorňují jednotlivé frakce. Intens. x10 6

+MS, 16.0min (#322)

[M-CH2]+

1.0

861.4

0.8

[M+H]+

0.6 875.3

0.4 0.2 0.0 x10 6

+MS, 19.4min (#398)

[M+H]+

6

866.6

[M+Na]+

4

888.4

2 0 x10 6

+MS, 19.8min (#410)

0.8 640.3 0.6

[M+H]

[M+Na]+

866.5

[M+Na]+

+

618.3

0.4

puwainaphycin A

888.3

0.2 656.4 0.0 x10 5

904.3

846.4

686.2 705.0

968.2

1235.5

1257.4

995.8 +MS, 22.3min (#468)

+ 665.3 [M+Na]

6

4

[M+H]+ 642.3

2

707.3

747.2

797.3

0

600

700

800

841.4 866.3

897.2

900

927.3

997.4

1000

1156.1

1029.0

1100

1200

m/z

Graf 5. +MS spektra kmene Anabaena eucompacta x reniformis Pěšák 2. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů. +MS spektra s intenzitami nižšími než hodnoty šumu nebyly zahrnuty.

3.B.II

Extrakt Nostoc sp. OBU36SO7

Analýza kmene OBU36SO7 dokázala přítomnost několika látek s velmi podobnou retencí, proto můžeme na chromatogramu nalézt překrývající se píky. Na základě přítomnosti sodných aduktů [M+Na]+ byly identifikovány molekulární ionty pro hmoty [M+H]+ 595, 579, 670, 965, 987,

21

Výsledky

Petr Tomek


824 a 838. Téměř ve všech případech se bude jednat o neznámé struktury. V retenčním čase 15.0 min byla identifikována molekula [M+H]+ 579,5 odpovídající Nostogininu BN578, HRFABMS [M+H]+ = 579.3758 [PLOUTNO, 2002]. Intens. x10 8

EXT R2440.D: TIC ±All MS

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 5

10

15

20

25

30

Time [min]

Graf 6. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) kmene Nostoc sp. OBU36SO7. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů. Intens. x106

+MS, 10.9min (#335) 595.5

1.0

[M+H]

+

0.5 0.0 x106 4

617.5 634.8 657.4

568.3

719.2

767.3 787.3

845.4

880.4

914.2

1048.3

987.4

+MS, 15.0min (#457) 579.5

nostoginin BN578

2 601.3

0 x106 4

683.3

[M+Na]+ +MS, 15.0min (#457)

579.5

2 601.3

0 x105

+MS, 15.8min (#485) 692.5

4 2 0 1060

[M+H]

[M+Na]+

+

670.5

579.4 651.4 600

726.0 745.5 700

773.0

811.4827.3 800

856.4 875.8

912.5 933.8 954.4 900

986.5

1015.4

1000

1082.6 1100

+MS 17 9 i (#549)

Graf 7a. +MS spektra kmene Nostoc sp. OBU36SO7. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů.

Výsledky

22

m/z

Petr Tomek


0 x106

+MS, 17.9min (#549)

[M+Na]+

1.5

1001.5

[M+Na]+

1.0

[M+H]+

0.5

965.5 827.7

0.0 x106

[M+H]

0.8

979.5[M+H] 987.5

+

1017.5

849.8

+MS, 19.1min (#587)

+

824.5

0.6

[M+Na]+

0.4

1001.4

846.5

0.2

854.4

0.0 x107

868.4 876.4

970.4 979.6

932.3

900.4

1014.9

1047.1

[M+H]+

0.8

1059.2 1068.5

+MS, 19.6min (#605)

838.7

0.6

[M+Na]+

0.4

860.6

0.2 0.0 825

850

875

900

925

950

975

1000

1025

1050

m/z

Graf 7b. +MS spektra kmene Nostoc sp. OBU36SO7. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů.

3.B.III

Extrakt Nostoc sp. Cam2SO1

Přestože tento kmen vykazoval značnou cytotoxicitu, v HPLC-MS analýze byly nalezeny pouze nepříliš intenzivní chromatografické píky a v jejich +MS spektrech slabé molekularní ionty. Vzhledem k této nízké intenzitě nebylo možné s jistotou určit molekulární iont na základě přítomnosti sodíkových aduktů, a tak byl iont o největší hodnotě m/z a relevantní intenzitě považován za molekulární. Tímto způsobem byly určeny látky o hmotách [M+H]+ 697, 725, 807, 766, 639, 709, 616, 717. Žádná z těchto hmot nebyla identifikována jako známá struktura. Pouze v RT 15.7 min byl nalezen iont [M+H]+ 639, který se shoduje s molekulární vahou cryptophycinu C. Vzhledem k tomuto výsledku a faktu, že velikost cryptophycinů se pohybuje právě v rozmezí 600700, je pravděpodobné, že by za toxický efekt mohly být zodpovědny právě tyto molekuly s cytotoxickým efektem [DE MUYS, 1996]. ntens. x10 8


2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 5

10

15

20

25

30

Time [min]

Graf 8. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) kmene Nostoc sp. Cam2SO1. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů.

23

Výsledky

Petr Tomek


ntens. x106

+MS, 7.8min (#182)

[M+H]+

628.5 0.5

697.3 644.4

0.0 x105

+MS, 10.8min (#246)

[M+H]+ 725.2

1.0

697.2 663.5

0.5 605.1

517.9530.8544.1556.3 570.8

0.0 x105

712.4

755.3

638.1

784.2

810.6824.1 841.3 857.1

807.5 [M+H]+

1.0

0.0 x105

939.1 +MS, 12.2min (#276)

1.5

0.5

885.2 899.2912.2

697.3 549.7

500.4 518.1

623.1

574.1 592.2

638.8

656.5

681.8

726.3

739.1

762.2

846.8 861.6 876.5 892.6

784.9

916.3

953.2 967.1 +MS, 13.6min (#309)

[M+H]+

4

766.3

707.8

2 584.5

527.7

0 x105

657.7

643.5

609.3

683.1 697.3

835.7 812.6 825.9

732.0

864.6

919.2

893.2

+MS, 15.7min (#359)

cryptophycin C

4

639.7

2 578.5 597.9 615.1

534.8

0 x105

682.5 696.7

717.3

744.9

772.4

835.7 794.9

816.9

857.8

890.9

912.6

958.9 +MS, 17.6min (#403)

[M+H]+ 709.7

1.0 0.5 553.4 572.2

506.5

587.5

605.6

631.9

719.2

671.1

751.1 766.9

796.1

823.4 839.7

866.6 881.1

902.3

0.0 x105

928.9

953.7

+MS, 19.2min (#440)

[M+H]+

6 616.4

4 2 529.9

0 x105 6

[M+H]

4

731.3

667.4 684.1 697.9

572.8

+

717.4

793.5

895.2

824.3

+MS, 22.5min (#516)

[M+H]+

553.6

2 569.6

511.7 529.3

0 500

550

597.6 600

617.8

657.1 650

733.3

677.3 700

785.3 750

817.2 800

879.3

838.1 850

912.9 900

950

m/z

Graf 9. +MS spektra kmene Nostoc sp. Cam2SO1. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů.

3.B.IV

Extrakty Nostoc sp. NMB25 a NMB26

Tyto kmeny vykazovaly rozdílnou aktivitu extraktů různého stáří biomasy použité na extrakci, a proto byly analyzovány pouze extrakty aktivní. Je však pravděpodobné, že aktivní látka podléhá degradaci i v lyofilizované biomase. V extraktu kmene NMB-25 se podařilo identifikovat na základě nejvyšších intenzit [M+H]+ ionty 998, 964, 978, 782, 1012, 872 (viz graf 11.). Pík v 17.1 min o [M+H]+ = 998 byl identifikován jako známý cytotoxin aeruginoguanidine 98-C (HRFABMS [M-H]- = 996.3851, [ISHIDA, 2002]), avšak vzhledem k nízkým intenzitám a nízkému rozlišení přístroje není výsledek zcela zaručený.

Výsledky

24

Petr Tomek


Analýza extraktu NMB-26 poskytla chromatogram s vyššími píky a lepšími MS spektry, a proto byly molekulární ionty určeny většinou pomocí sodíkových aduktů. Byly nalezeny ionty spíše polárního charakteru [M+H]+ 913, 927, 1007, 997, 1022, 821, 1050. (viz graf 12.). Intens. x10 8

EXT R2855.D: T IC ±Al l M S

NMB25

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 Intens. x10 8


NMB26

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 5

10

15

20

25

30

T i m e [m i n]

Graf 10. HPLC-MS chromatogramy (Total Ion Currents) kmenů Nostoc sp. NMB25 a NMB26. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů. Intens. x10 5

+MS, 17.1min (#361)

aeruginoguanidine 98-C

1.5

998.2

1.0 0.5 0.0 x10 5 2.5

91.0119.0

180.9

301.4

366.9 413.4

472.3 511.8

640.5

569.7

880.0 925.1 958.1

726.7 767.8 808.3

1069.2 +MS, 18.3min (#389)

[M+H]+

2.0

964.3

1.5 1.0 0.5

413.1 451.5

0.0 x10 5

519.1 553.8 591.2

674.8

750.6

789.5 828.5

886.4 924.1

1161.5 +MS, 19.4min (#414)

4

[M+H]+

3

978.4

2 1

797.8

228.1 362.9

0 x10 5

589.2

417.2 451.0

657.1

841.3

727.0

3

[M+H]

2

782.0

895.1

1145.7

[M+H]+

+

+MS, 19.7min (#422)

1012.3

729.1

1 0 x10 5 8

214.2

409.5

288.4

473.3

536.0 581.4 616.2 652.5

894.8

835.9

978.2 +MS, 22.9min (#497)

[M+H]+ 872.3

6 4 2 225.0

0

284.4 316.5

200

450.2 490.0

365.3

400

553.7

616.4

600

652.8 687.4 730.3 769.2

800

832.2

972.4 1020.7

1000

1200

Graf 11. +MS spektra kmene Nostoc sp. NMB25 s retenčními časy. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů. 25

Výsledky

m/z

Petr Tomek


Intens. x10 6

+MS, 12.7min (#276) 913.5

2

[M+H]+

1

1015.2 993.2

0 x10 6

+MS, 13.7min (#303) 927.5

4

[M+H]+

2

1029.2 1007.2

0 x10 6

+MS, 14.2min (#315)

3

927.4

[M+H]+

[M-H2O]+

2

[M+Na]+ [M+H]+

909.4

1 0 x10 6

1029.2

1007.2

856.7

+MS, 15.5min (#348)

[M+H]

3

+

997.5

2 1

927.4

0 x10 6

+MS, 18.0min (#408)

1.5

[M+H]+

[M-40]+

1022.3

982.4

1.0 0.5

1044.3

0.0 x10 5 4

+MS, 19.1min (#433)

[M+H]+ 821.4

3

[M+Na]+ 843.3

2 1

814.4

0 x10 6

855.8

835.2

877.8

897.0

919.1

1023.1

1010.1

940.2

+MS, 20.2min (#459)

[M+H]+ 1.0

1010.3

0.5 0.0

1050.3

[M-40]+

805.4

817.4

894.3

800

850

900

934.3 950

[M+Na]+ 1020.3

980.3 1000

1072.3 1050

m/z

Graf 12. +MS spektra kmene Nostoc sp. NMB26 s retenčními časy. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů. Odštěpení fragmentu m/z 40 v RT 20.2min a 18.0min bývá v naší laboratoři často pozorováno, ačkoli identifikovat se ho zatím nepodařilo.

3.B.V

Extrakt Nostoc muscorum I

I přesto, že chromatografický záznam (viz graf 13.) naznačuje přítomnost látek s velmi podobnou retencí, MS spektra v maximech píků byla dostatečně čistá a obsahovala vždy jednu hlavní sloučeninu. Dle sodíkových aduktů byly s vysoku spolehlivostí stanoveny molekulární ionty 885, 899, 1097, 1111, 1211. V extraktu byly identifikovány pravděpodobně dvě známé necytotoxické látky - v RT 18.0 min iont [M+H]+ 885,7 odpovídající microgininu 299-A (HRFABMS [M-H]- 885.4512 [ISHIDA, 1997]), a v 20.7 min iont [M+H]+ 1111,9 odpovídající oscillapeptinu G (pozitivní FABMS (glycerol) [M+H]+ 1112, [FUJII, 2000]). Po frakcionaci byla objevena aktivní látka v RT 22.3 min pro hmotu [M+H]+ 1211,9 - [M+Na]+ 1233,8 odpovídající dosud neznámé chemické struktuře (viz graf 12.). Na základě této skutečnosti a silného cytotoxického efektu byla tato látka vybrána pro podrobnější identifikaci (kapitola 3.C).

Výsledky

26

Petr Tomek


ntens. x10 8

15,5%

0%

0%

5,04% 51,2%

0%


11,77%

1.5

1.0

0.5

0.0 5

10

15

20

25

30

T i m e [m i n]

Graf 13. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) kmene Nostoc muscorum I s retenčními časy. Svislé čáry představují jednotlivé frakce a hodnoty v procentech inhibice jednotlivých frakcí proti buněčným liniím Sp/2. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů. ntens. x10 6

microginin 299-A

5

+MS, 18.0min (#514) 885.7

[M+Na]+

4 3

907.6

2 1 0 x10 7 1.50

[M+H]+

1.25

+MS, 18.8min (#535) 899.7

1.00

[M+Na]+

0.75 0.50

921.5

0.25 0.00 x10 7

+MS, 20.7min (#586)

oscillapeptin G

1.2

1111.9

1.0

[M+Na]+

0.8 1133.7

0.6 0.4 0.2 928.6

0.0 x10 6

+MS, 22.3min (#631)

+

8

[M+H] 1211.9 [M+Na]+ neznámý 1233.8 cytotoxin

6 4 2 0 x10 6

+MS, 20.1min (#571) 1119.7

3

[M+Na]+

[M+H]+

2

1097.7 1 885.5 0 600

700

800

913.5

900

952.5

992.6 1000

1151.5 1100

1200

1300

1400

m/z

Graf 14. +MS spektra kmene Nostoc muscorum I s retenčními časy. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů.

3.B.VI

Extrakt Nostoc sp. De

U tohoto kmene nebylo použitou separační metodou dosaženo optimální rozdělení obsahových látek. Chromatogram nasvědčuje přítomnosti velkého množství metabolitů a z důvodu existence série [M+Na]+ aduktů a časté ztrátě molekuly vody [M-H2O]+ (viz graf 17.) lze stanovit molekulární ionty těchto látek. Podle rozdílných retenčních časů stejných iontů a podobných fragmentačních spekter v +MS2 se pravděpodobně jedná o látky chemicky velice příbuzné, pravděpodobně obsahující stejný molekulární základ. Podobnost těchto chemických struktur dokazuje přítomnost iontů m/z 740 a m/z 692,2 obsažených v korelujících +MS2 spektrech studovaných chromatografickych píků. (viz graf 16.) Ionty [M+H]+ 885,5 (RT 21,5min) a [M+Na]+ 871,5 (RT 20,8min) se liší fragmentem –CH2 (m/z 14), a pokud tento štěp odečteme od +MS2 fragmentů iontu 885,5 získáme +MS2 ionty 740 (754-14) a 723 (737-14) shodné s +MS2 štěpy iontu 871,5. Iont [M+H]+ 938,5 (RT 19,4min) štěpí taktéž

27

Výsledky

Petr Tomek


fragment m/z 740, čili iont 885,5 štěpí fragmenty s teoretickou –CH2 skupinou a ionty 871,5 a 938,5 bez ní, z čehož vyplývá hypotetická podobnost v základní struktuře molekuly. Ve svých +MS2 spektrech mají stejný fragment 692,2 m/z i ionty [M+H]+ 892,7 (RT 14,5min) a [M+H]+ 849,6 (RT 20,9min). Ionty [M+H]+ 892,7 (RT 14,5min) a [M+H]+ 942,4 (RT 18,7min) se liší fragmentem 49,7 a ionty [M+H]+ 849,6 (RT 20,9min) a [M+H]+ 942,4 (RT 18,7min) se liší fragmentem 92,4, a pokud tento štěp odečteme od +MS2 fragmentů iontu 942,4 získáme +MS2 iont 831,9 (924,3-92,4) shodný s +MS2 fragmentem iontu 849,6 a 874,6 (924,3-40,7) shodný s +MS2 fragmentem iontu 892,7. Jelikož zmíněné výpočty dávají ucelený výsledek, menší odchylky v hodnotách m/z byly v rámci nepřesnosti přístroje akceptovány. Ačkoli nebyla nalezena korelace mezi hypotetickými základními fragmenty molekul 740 a 692, je možné, že i když se liší zbytkem m/z 48 budou pravděpodobně velice podobné. V +MS spektrech tohoto kmene byly tudíž nalezeny intenzivní ionty o [M+H]+ 849, 892, 928, 942, 962, 956, 976, 990, z nichž žádný nebyl ve shodě s literaturou. Studovaný extrakt byl frakcionován na 11 dílčích frakcí, z nichž dvě vykazovaly silný cytotoxický účinek. Frakce jímaná v RT mezi 21´-22´ vykazovala 92% inhibici a frakce 22´-35´ 90% (viz graf 15.). I přesto, že nebylo dosaženo dobré separace, byl tento kmen, vzhledem k jeho silné aktivitě vybrán pro izolaci a separaci aktivní látky (kapitola 3.D). ntens. x10 8

EXT R2885.D: T IC ±Al l MS

0%

0% 1,9%

0%

0%

0% 9,3%

0% 5,2% 92,4% 90,1%

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 5

10

15

20

25

30

T i me [mi n]

Graf 15. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) kmene Nostoc sp. De. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů. Svislé čáry představují jednotlivé frakce a hodnoty v procentech inhibice jednotlivých frakcí proti buněčné linii Sp/2. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů.

Výsledky

28

Petr Tomek


ntens. x10 6

+MS2(892.7), 14.5min (#316) 692.2

4 3 2 287.0

1

343.0 371.1 399.1

0 0.0 5 100

0.0 x10 5

200

300

442.0

400

675.1

546.0

500.1 500

600

814.3 700

+Na = 740

2 320.2

400.0

356.1

300

448.2

484.2

400

515.1

2.0 1.5

+MS2(938.5), 19.4min (#441) 739.4

(3)

06

1.5 1.0

2.0

740.4

+MS2(871.5), 20.8min (#477) 900

800

885,8(21,5´)-871,5 = 14 (CH2)

0.5

2

(2)

723.3

0.0

06 x106 3

700

1.5

+MS2(885.5), 90021.5min (#495) m/z

800

754.5

657.2674.2

737.3 – 700 1.0

m/z

800

(5) MS3(849 6 692 2) 21 0 i (#481) 900 m/z

EXTR2885.D: TIC ±All MS +MS2(942.4), 18.7min (#423) 924.3

942,4-849,6(20,9´)= 92,4

1.0

0.0 4

804.3

700

725.3 -49,7

700

-92,4 = 831,9 -49,7 = 874,6

= 675,6

(4)

851.4

744.1 800

900

1000

m/z

m/z

(6) (3)

– 14 = 740,5

(4)

1 05

1000

831.4

718.2 736.2

942,4-892,7(14,5´)= 49,7

0.5

2

0.00 x10 7

639.3

600 0.0 x10 5 2.5

1

608.1

556.2

500

ntens. x10 8

2.5

(6) 900

692.2

4

ntens. x10 7 3

800

+MS2(849.6), 20.9min (#480)

6

0 10 4

874.3

(2) (5)

(1)

14 = 723,3 800

900

m/z

(1) 0.5

0.0 5

10

15

20

25

30

Time [min]

Graf 16. Důkaz strukturně podobných látek kmene Nostoc sp. De. HPLC-MS (Total Ion Current) chromatogram a odpovídající +MS spektra a +MS2 fragmentační spektra příslušných píků s retenčními časy a hmotami fragmentovaných +MS iontů v pravém horním rohu každého pole. Čárkované šipky znázorňují korelace mezi fragmenty odpovídající podtrženým hodnotám rozdílů na základě hmot +MS spekter. Na osách X je znázorněn poměr m/z a na osách Y celková intenzita iontů. Pro snažší orientaci korelují čísla jednotlivých píků v závorkách v HPLC-MS (Total Ion Current) chromatogramu se svými +MS2 spektry.

29

Výsledky

Petr Tomek


0.0 x10 7 4

+MS, 14.5min (#315)

[M+H]+ 892.7

3 2 1 0 x10 6 2.5 2.0

+MS, 15.2min (#333)

[M+Na]+

892.6

[M+H]+ 950.4 [M-H2O]+

1.5 1.0 0.5

457.8

0.0 x10 6

910.3

483.8

928.3

[M+H]+ [M+Na]+ [M-H2O]+ 962.5 984.4

6 4

+MS, 16.3min (#362)

944.4

2 745.3

0 x10 6

924.4 +MS, 17.2min (#386)

6

[M-H2O]+ [M+H]+ [M+Na]+ 958.4

4

998.4

976.5

2 759.4 0 500

600

700

800

900

1000

ntens. x10 6 1.5

998.4

1.0

1012.4

976.4

832.0

892.6

859.8

990.4

956.6

938.5

0.5 0.0 x10 7

m/z +MS, 17.9min (#404)

1032.2

924.4

+MS, 18.4min (#416)

[M+Na]+

0.8

[M-H2O]+

0.6 0.4

[M+H]+

964.5

942.5

924.5

0.2

956.4

0.0 x10 6

978.4 990.2 +MS, 18.9min (#428)

6

976.5

998.4

4 958.4

2

991.3 0 x10 7 1.2

1014.2 +MS, 19.4min (#440)

+

1.0

[M-H2O]+

0.8

[M+H]+ [M+Na] 978.5 956.5

938.5

0.6 0.4 0.2 0.0 x10 6

[M-H2O]+

3 2

3

1012.4 990.5

972.4 938.5

1 0 x10 6

+MS, 20.1min (#458)

[M+Na]+

[M+H]+

4

956.3

924.4

[M+H]+ 849.5

1030.3 +MS, 21.0min (#482)

+

[M+Na] 871.4

2 1

978.4 938.4

0 850

900

956.4 950

1012.3 990.3

1028.3 1041.3 1000

1050

1100

1150

m/z

Graf 17. +MS spektra kmene Nostoc sp. De s retenčními časy. Šipky znázorňují retence stejných iontů v různých časech. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů.

Výsledky

30

Petr Tomek

3.C


CYTOTOXIN

KMENE

NOSTOC

MUSCORUM

I

Extrakt tohoto kmene způsoboval silnou inhibici oběma liniím, proto byl tento organismus vybrán pro další charakterizaci. Oproti ostatním testovaným kmenům byla zjištěna jediná aktivní frakce s velmi čistým +MS spektrem. Pro další purifikaci a identifikaci této látky byly zvoleny alternativní separační metody – TLC spojené se specifickým značením Serva Blue W a pro získaní dostatečného množství čisté frakce preparativní systém HPLC. Namísto lineárního gradientu z 0 na 100℅ MeOH byly do metody zavedeny dva kratké časové úseky, kdy byla kolona eluována 70%, a nasledně z 85℅ MeOH právě v části analýzy, kde ležel retenční čas studované látky za použití analytické kolony gradientem A1. Nakonec se nejvíce osvědčil gradient C1 (viz graf 19.). Touto metodou byly odstraněny kontaminace ostatními látkami, především druhým peptidem s podobným RT o MW 1110 a byl získán velice dobře separovaný cytotoxický pík (viz graf.19). Analýza získané frakce vykazuje za použití alternujícího režimu MS dostatečnou čistotu pro další použití. Z pozitivního MS záznamu (viz graf 19.) je také patrná existence molekulárního iontu [M+H]+ 1211,5 a jeho sodného aduktu [M+Na]+ 1233,6 a v negativním MS molekulárního iontu [M-H]1209,6 a jeho aduktu [M+Na]- 1231,6. Tudíž můžeme s naprostou jistotou usuzovat na neznámou látku o MW 1210,5. V chromatogramu je patrná přítomnost běžné kontaminace v podobě iontu 256,2 eluovaného z kolony. Na TLC desce byla po eluci v UV patrná matná skvrna jenž se po použití Serva Blue W obarvila v tmavě modrou (viz obr. 22.). Extrakce neobarvené skvrny do 100% MeOH a její následná analýza dokazuje, že se jedná opravdu o studovanou látku. Tyto výsledky nasvědčují, že aktivním cytotoxinem ve kmeni Nostoc muscorum I je neznámý cyklický peptid, tento výsledek navíc podporuje absorpce látky při vlnové délce 220 nm. nanesený vzorek

koncentrační zóna

chromatografické čelo

Obr. 22. TLC kmene Nostoc Muscorum I . Modrá skvrna znázorňuje cyklický peptid . ntens. x10 7

[M+H]+ 1211,5

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 0

5

10

15

20

25

30

T ime [min]

Graf 18. HPLC-MS chromatogram extrahovaného iontu 1211,5 aktivní TLC frakce kmene Nostoc muscorum I. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů.

31

Výsledky

Petr Tomek


[V]

1.2

1.0

Voltage

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0

10

20

30

40 [min.]

Time ntens. x10 8 ntens. x10 6

2.5

6

[M+H]+

1211.5

4

2.0

MS+

[M+Na]+ 1233.6

2 0 x10 6 6

1.5

M=1211

MS-

[M-H]-

5

1209.6

4

1.0

3 2 1

0.5

1245.2

0

m/z

1200

0.0 0

ntens. x10 8

5

ntens. x10 7 1.25 1.00

10

20

25

30

Time [min]

30

Time [min]

0 x10 6

kontaminace kolony

[M+H]+ [M+Na]+

6

256.2

1211.6 1233.5

4

0.75 0.50 3

15

2

0.25 0.00 06

0 250

1100

500

1200

1300

m/z

2

1

0 0

5

10

15

20

25

Graf 19. nahoře:

HPLC (preparativní) chromatogram kmene Nostoc muscorum I s vyznačenou jímanou frakcí odpovídající cytotoxické látce. Chromatogram vyjadřuje závislost UV absorbce (220nm) na retenčním čase. uprostřed: HPLC±MS chromatogram (Total Ion Current) a příslušná +MS spektra frakce. dole: HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) a +MS spektra příslušných píků frakce. Na ose Y je znázorněna celková intenzita iontů a na ose X poměr m/z či v případě Total ion chromatogramů retenční čas.

Výsledky

32

Petr Tomek

3.D


CYTOTOXINY

KMENE

NOSTOC

SP.

DE

Frakcionací tohoto kmene byly získány dva vysoce aktivní separáty zjevně obsahující pigmenty, jenž ve vysokých koncentracích způsobují mírný toxický efekt proti studovaným liniím [HROUZEK, ÚSTNÍ SDĚLENÍ]. Avšak 90℅ hodnota inhibice mnohonásobně převyšuje toxicitu pigmentové frakce, jenž se pohybuje u extraktu v 70℅ MeOH mezi 10-30℅. [V]

1.2

1.0

Voltage

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0

10

20

30

40 [min.]

Time

Graf 20. HPLC chromatogram (preparativní) kmene Nostoc sp. De získaný použitím gradientu A1. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y UV absorpce při 220 nm. ntens. x10 8

EXT R2799.D: T IC ±Al l MS

1.5

1.0

0.5

0.0 5

10

15

20

25

30

T i me [m i n]

Graf 21. HPLC-MS (Total Ion Current) chromatogram frakce 21´ -22´ kmene Nostoc sp. De. získané použitím gradientu A1. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y celková intenzita iontů.

Jelikož aktivní frakce analytické HPLC-MS (21´-22´) nevykazovala dostatečnou čistotu (viz graf 21.), nebylo možné stanovit molekulární iont odpovídající cytotoxické látce. Gradienty A1 ani B1 (kolona C8) neposkytovaly dobré výsledky, co se týče dostatečného rozdělení oblasti, ve které se aktivní látka nachází. Za použití gradientu B1 byly v extraktu charakterizovány dvě aktivní frakce ve shodě s frakcionací na analytické koloně (viz graf 22.). Frakce mezi 28´- 32´ vykazovala 89.6℅ inhibici a frakce 32´-35´ 78℅ inhibici. Z důvodu silného šumu a nedostatečné separace byla použita pro další frakcionaci kolona C18 a gradient B2. Stejně jako v předešlých dvou metodách byly frakcionací a následným testem cytotoxicity získány dvě frakce. Frakce jímaná mezi 31´ - 32´ byla letální téměř pro všechny pokusné buňky (inhibice 96℅), zatímco frakce mezi 37´ - 38´ způsobovala mírnější tox. efekt (inhibice 58℅). Získané frakce vykazovaly lepší vlastnosti než předešlé, a proto byly použity jako výchozí pro další analýzy (viz graf 23.). Dalším dělením získané frakce 31´ pomocí TLC byly obdrženy tři jasně definované pruhy nasvědčující přítomnosti tří látek (viz obr. 23.), přičemž pouze jedna z těchto látek byla zodpovědná za inhibici. Po vymytí prostředního pruhu 100% MeOH byla pomocí MTT testu prokázána inhibice YAC-1 buněk ve výši 45℅. Snížená toxicita této frakce vůči původní, obdržené z preparativní HPLC, může být vysvětlena rozmytím a ztrátami látky v proceduře TLC, což bylo v naší laboratoři prokázáno u jiných látek [HROUZEK, ÚSTNÍ SDĚLENÍ].

33

Výsledky

Petr Tomek


[V]

0% 0%

1.2

78% 89,6%

0%

1.0

0%

Voltage

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

10

0

20

30

40

50 [min.]

Time

Graf 22. HPLC chromatogram (preparativní) kmene Nostoc sp. De za použití gradientu B1. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y UV absorpce při 220 nm. Svislé čáry představují jednotlivé frakce a hodnoty v procentech jejich inhibici proti buněčným liniím YAC-1. [V]

1.2

0%

1.0

0%

frakce 31´ 95,8%

frakce 37´ 58,6 %

Voltage

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0

10

20

30

40

50 [min.]

Time

Graf 23. HPLC chromatogram (preparativní) kmene Nostoc sp. De za použití gradientu B2. Na ose X je znázorněn retenční čas a na ose Y UV absorpce při 220 nm. Svislé čáry oddělují 4 separované frakce a hodnoty v procentech udávají jejich inhibici proti buněčným liniím YAC-1.

3.D.I

Separace látky kmene Nostoc sp. De: frakce 31´

Po podrobení frakce 31´ detailní HPLC-MS analýze nebyly v chromatogramu nalezeny téměř žádné intenzivní píky, avšak +MS spektra vykazovala přítomnost málo intenzivních (řádově 103) iontů >1500. Jelikož chromatogram obsahoval rovněž ionty o přibližně polovičních m/z, u kterých byla prokázána distribuce izotopomerů o rozdilu 0.5 Da, jenž by mohli hypoteticky odpovídatdvakrát nabitým iontům, byla na základě tohoto výsledku provedena analýza se zaměřením iontové pasti na ionty o velikosti m/z = 1800. Toto nastavení poskytlo „vizuálně“ zcela odlišný chromatogram a umožnilo naprosto odlišnou interpretaci látek obsažených v této frakci. Byl nalezen intenzivní pík a iont o m/z = 1850 (viz graf 24.), ovšem žádná hmota v tomto +MS spektru neodpovídala [M+H]2+ či [M+Na]2+ ani dimerní struktuře [2M+2H]+ či [2M+H]+. Jasnější výsledky poskytla analýza frakce získané z TLC. V HPLC-MS byl identifikován iont [M+Na]2+ = 920,4 (viz graf 25.) o rozdílu izotopomerů 0.5, který by mohl odpovídat dvakrát nabitému sodnému aduktu [M+Na]+ 1840, čili molekulárnímu iontu [M+H]+ 1818,5. Vzhledem k přítomnosti málo intenzivního iontu pro hmotu m/z 1850, však iont 1818.5 mohl být fragmentem 1850 po odštěpení methoxyskupiny –OCH3. Pro definitivní odhalení molekulové hmotnosti této látky bude nutné dalších postupů. Také barvení pomocí Serva Blue W neposkytuje jednoznačné výsledky, po srovnání s aktivní látkou kmene N. muscorum I je odstín modré méně výrazný, a proto není jednoznačné, zda se jedná Výsledky

34

Petr Tomek


o cyklický peptid. V absorpčních spektrech této látky mohou být nalezeny dvě maxima při λ = 220nm a 280nm, které naznačují, že se v molekule vyskytují aromatické funkční skupiny.

4,2 %

44,5 %

0%

Obr. 23. TLC výřez frakce 31´. Tmavé skvrny odpovídají separovaným látkám a hodnoty v procentech vyjadřují inhibici proužku proti buněčným liniím YAC-1 Intens. x10 8

EXTR2898.D: TIC +All MS

3

2

1

0 5

10

15

Intens. x10 6 1.5

20

25

30

Time [min] +MS, 21.9min (#691)

rozdíl izotopomerů je <= 0,5

Δ=0,4

920.4 1.0 920.8

921.2 0.5 918.2

921.8

919.3

925.8

922.8

928.1

929.3

929.8

0.0 918

920

922

924

926

928

Intens. x10 6

m/z +MS, 21.9min (#691)

[M+H]+

3

1818.5

2

[M+Na]2+

[M+Na]+

920.4

1 256.3

0 200

1072.9 400

600

800

1000

1482.5

1300.4 1200

1400

1592.4 1600

1839,5

1694.9 1800

2000

m/z

Graf 25. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) TLC 2. pruhu frakce 31´ kmene Nostoc sp. De při zaměření iontové pasti na m/z = 1800 a +MS spektra RT 21,9 min. Na ose Y je znázorněna celková intenzita iontů a na ose X poměr m/z, či v případě Total Ion Current chromatogramu nejvýše retenční čas.

35

Výsledky

Petr Tomek ntens. x10 8

Cytotoxicita vláknitých sinic k liniím savčích buněk EXTR2883.D: TIC ±All MS

0 x10 5 936.3

2.5 2.0 1.5

933.2

1.0

2.0

925.3 905.2

0.5

917.6

0.0 x10 4 8

1.5

920.6 917.2

6

936.2 933.3

4

2

893.2

944.3

909.2

900.1

0 x10 4 8

1.0

937.2 6 920.3

4

0.5 917.4

2

0 900

920

940

m/z

0.0 5

10

15

20

25

ntens. x10 6

30

Time [min]

+MS, 21.8min (#689)

4

1850.4

- OCH3 = 1818,5

3

2 936.8 1

997.8 1414.1

1205.3

835.2

1514.6

1626.5

0

ntens. x10 8

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

m/z

EXTR2897.D: TIC +All

2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 00 0

mAu

5

10

15

20

25

30

0.0

Time [min]

EXTR2897.D: UV Chromatogram, 280.4 nm

10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 EXTR2897.D: UV Chromatogram, 220.4 nm

400 300 200 100 0 -100

0

5

10

15

20

25

30

Time [min]

Graf 24. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) frakce 31´ kmene Nostoc sp. De při zaměření iontové pasti na m/z = 900 (nahoře), m/z = 1800 s UV chromatogramy (dole). Vlnové délky UV chromatogramů v pravém horním rohu příslušných polí. Na ose Y je znázorněna celková intenzita iontů a na ose X poměr m/z, či v případě Total Ion Current chromatogramů retenční čas. UV chromatogramy vyjadřují závislost absorpce při 220 a 280 nm na retenčním čase.

Výsledky

36

Petr Tomek

3.D.II


Separace látky kmene Nostoc sp. De: frakce 37´

Analýzou HPLC-MS se zaměřením na ionty m/z 1800 byla určena trojice iontů s největší intenzitou: m/z = 781, 1540, 1562 a iont s menší intenzitou 1578. Dle izotopomerové distribuce iontu 781, která je téměř rovna 1 Da, půjde o jednou nabitý sodný adukt [M+Na]+ molekulárního iontu [M+H]+ = 759 (viz graf 26.). V případě iontů 1540, 1562 a 1578 půjde o dvakrát protonované dimerní struktury. U iontu 1540 jde o dimer se sodíkovým aduktem na jednom monomeru [2M+2H+Na]+ = 1540. Dále se pak ve spektru vyskytují dimer se sodíkovým aduktem na obou monomerech [2M+2H+2Na]+ = 1562 a dimer s draselným a sodným aduktem [2M+2H+Na+K]+ = 1578. Toto tvrzení potvrzuje i štěpení molekulárního iontu m/z 781 v +MS2 na 721 a v +MS3 na 571, které je shodné v +MS2 se spektry dimerních struktur. V těchto spektrech je navíc patrný fragment monomeru se sodíkovým aduktem 743. Štěpením dimerního iontu 1540 na iont [M+Na]+ 781 se toto tvrzení upřesňuje (viz graf 27.). ntens. x10 8

ntens. x10 6 4

ntens. x10 6

rozdíl izotopomerů limituje k 1

EXTR2900.D: T IC ±All MS

[2M+2H+2Na]+ 1561.8

781.6 3

[2M+2H+Na]+

1.5 3

1539.9

Δ = 0,7 1.0

2

782.3

1

[2M+2H+Na+K]+

Δ=1

2

0.5 1578.5

783.3 0

0.0

780.0

782.5

785.0

m/z

1550

m/z

1600

1

0 5

10

15

20

25

30

ntens. x10 6

Ti me [min] +MS, 23.8mi n (#508)

[M+Na]+ 781.6

4

3

[2M+2H+2Na]+ 2

1561.8

1 549.4

843.4

1158.0

1294.6

0

mAu0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

m/z

EXTR2912.D: UV Chromatogram, 220.4 nm

400 200 0 -200 EXTR2912.D: UV Chromatogram, 280.4 nm 15 10 5 0 0

5

10

15

20

25

30

Time [min]

Graf 26. HPLC-MS chromatogram (Total Ion Current) frakce 37´ kmene Nostoc sp. De při zaměření iontové pasti na m/z = 1800 a příslušná +MS spektra. Na ose Y je znázorněna celková intenzita iontů a na ose X poměr m/z, či v případě Total Ion Current chromatogramu retenční čas. UV chromatogramy vyjadřují závislost absorpce při 220 a 280 nm na retenčním čase.

37

Výsledky

Petr Tomek


ntens. x10 6

+MS2(781.6), 23.9min (#487) 721.3

1.5 1.0 0.5 571.2 0.0 x10 5

+MS3(781.6->721.3), 23.9min (#488)

1.25 571.3

1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

ntens. x10 4

2000

m/z

+MS2(1561.8), 23.9min (#509) 721.2

6

743.3

4 593.3 2

0

+MS3(1561.8->721.2), 23.9min (#510)

6000 571.0 4000

2000 703.0 0

+MS2(1539.7), 24.0min (#512)

6000

781.3

4000

2000 979.3

1105.4

1151.6

0 600

700

800

900

1000

1100

1200

Graf 27. Fragmentační spektra +MS2 a +MS3 frakce 37´ kmene Nostoc sp. De pro vybrané ionty 781, 1562 a 1540. Iont vybraný pro fragmentaci je vyznačen v pravém horním rohu příslušných polí. Na ose X je znázorněn poměr m/z a na ose Y celková intenzita iontů.

Výsledky

38

m/z

Petr Tomek

3.E

„IC50“

Cytotoxicita vláknitých sinic k liniím savčích buněk A ČASOVÝ EXPERIMENT

Aby mohla být porovnána toxicita kmenů De a Nostoc muscorum I a vyjádřena jejich účinnost, byly provedeny měření závislosti toxického efektu na koncentraci látky s následným stanovením „IC50“ a závislosti toxického efektu na expozičním čase. Testovaný koncentrační rozsah se pohyboval mezi 1,25 – 200 mg LB/ml. Koncentrační závislost je patrná z grafu 28. „IC50“ kmene Nostoc muscorum I byla regresní metodou stanovena na 4.8mg LB/ml (SS = 46,356) pro buňky YAC-1 a 2.8 mg LB/ml (SS = 95,375) pro buňky Sp/2. V porovnání s tímto výsledkem byla toxicita kmene De o řád větší, kde hodnoty „IC50“ byly shodné pro YAC-1 (SS = 65,8) i Sp/2 (SS = 65,8), a to 0.6mg LB/ml.

Graf 28. Stanovení „IC50“ pro extrakty kmene Nostoc sp. De a Nostoc muscorum I. Na ose Y je vynesena procentuální inhibice buněčných linií YAC-1 a Sp/2 vůči kontrolním buňkám při 12h expozici a na ose Y koncentračnírozsah použitých extraktů 1,25-200 mg/ml.

Graf 29. Časová závislost viability buněčné linie Sp/2 exponované „IC50“ koncentraci extraktů kmenů Nostoc sp. De a Nostoc muscorum I. 39

Z hodnot „IC50“ a grafu 28 je patrná více než 6-ti násobná toxicita kmene De oproti Nostoc muscorum I, což může být ovšem způsobeno přítomností dvou cytotoxicky aktivních látek v extraktu De. Ačkoliv je zřejmé, že tímto způsobem nelze hodnotit aktivitu zkoumaných látek , je patrné, že symbiont Nostoc sp. De je ve srovnání s kmenem Nostoc muscorum I cytotoxičtější. Rozdílné působení obou extraktů je též patrné ze závislosti toxicity na době expozice. Extrakt sinice Nostoc muscorum I způsoboval toxický efekt v kratším expozičním čase. Již mezi 2-4 hodinami klesla viabilita buněk z 60 na 30 ℅ a dále se již výrazně neměnila (mezi 8-24 hodinou již zůstávala stabilně na 20℅). Výsledky

Petr Tomek


Zatímco aplikace extraktu kmene Nostoc sp. De vedla po 2 hodinách k poklesu o pouhých 15℅ a hlavní toxický efekt se dostavil mezi 4-8 hodinami, kdy viabilita klesla na 15℅. Následujících 24 hodin vedlo ke smrti všech buněk. Také morfologie buněk vystavených působení obou extraktů se výrazně liší. Celkové zmenšení objemu a perforace membrány bylo zaznamenáno u buněk vystavených extraktu Nostoc muscorum I. Morfologie linie Sp/2 postižené extraktem De vykazovala odlišné změny. Bylo pozorované časté zvětšování a zakulacování buněk a kondenzace granulí uvnitř až po destrukci organel. Z výše uvedeného se lze domnívat, že zatímco Nostoc muscorum I způsobuje nekrotickou smrt buněk, extrakt De vyvolává uvnitř buňky změny podobné apoptóze [DING 2003, DING 1998A]

0h

0h

4h

2h

8h

4h

100 μm Obr. 24. Fotodokumentace stavu Sp/2 buněk po expozici sinicových extraktů Nostoc sp. De a Nostoc muscorum I. Pravý sloupec odpovídá extraktu Nostoc Muscorum I, levý extraktu Nostoc sp. De. Časy odpovídající snímkům jsou vyznačeny v levém horním rohu, expoziční koncentrace byla rovna „IC50“ studovaných extraktů.

Výsledky

40

Petr Tomek

4


DISKUSE

A

čkoli byla cytotoxicita zaznamenána u 62% testovaných kmenů, není možné tvrdit, že každý z těchto kmenů syntetizuje sloučeniny se specifickým cytotoxickým účinkem. Jak potvrzuje frakcionace extraktů planktonních kmenů Anabaena affinis 04-44 a Anabaena eucompacta x reniformis Pěšák 2, toxický efekt může být způsoben přítomností produktů degradace chlorofylu, lipopolysacharidů, či jiných obsahových látek. Tyto látky mohou působit synergicky, anebo jejich koncentrace může být v extraktu natolik vysoká, že změnami v kultivačním médiu zapříčiní mortalitu buněk. Právě planktonní sinice rodu Anabaena vykazovaly téměř bez vyjímky cytotoxický účinek zprvu přisuzovaný microcystinu-LR, jenž je často u těchto sinic hlavním toxinem [SIVONEN & JONES, 1999]. Ovšem analýzy HPLC-MS přítomnost MC-LR neprokázaly. Naopak byly v extraktech nalezeny zpravidla látky o neznámých molekulárních hmotnostech a pouze u kmene Anabaena affinis 04-44 se dá usuzovat na přítomnost puwainaphycinu A. Také u ostatních ekologických skupin je zastoupení neznámých látek zarážející. U čtyř studovaných půdních kmenů bylo pouze pět látek z 24 určeno jako známé struktury. Ačkoli se patrně ve většině případů jedná o varianty známých skupin peptidů, je patrné, že sinice jsou stále dobrým zdrojem nových struktur. Významným výsledkem je časté zastoupení cytotoxických kmenů mezi půdními izoláty. Navíc dva ze čtyř cytotoxických půdních izolátů obsahovali neznámý cytotoxin. Ze známých látek byl u půdního kmene Cam2SO1 s vysokou pravděpodobností identifikován cryptophycin C. Tato strukturní varianta cryptophycinu bez funkční deoxy skupiny je charakteristická nižším inhibičním efektem vůči buněčným liniím, a 53% inhibiční efekt vůči buněčným liniím YAC-1 by tomuto předpokladu odpovídal. Známý cytotoxin byl identifikován též u sinice Nostoc sp. NMB25 z oblastí uranových výsypek, jedná se o aeruginoguanidine 98-C poprvé isolovaný z planktonní sinice Microcystis aeruginosa [ISHIDA, 2002]. U nejaktivnějšího půdního kmene v této práci, Nostoc muscorum I, byly nalezeny hned dvě známé necytotoxické struktury a jeden neznámý cytotoxin způsobující velmi rychlé, pravděpodobně nekrotické poškození. Na základě výše uvedených výsledků se domnívám, že půdní izoláty jsou nejvýhodnější skupinou pro vyhledávání cytotoxických látek, což potvrzuje i fakt, že nejsilnější sinicová cytostatika cryptophyciny byly izolovány z půdních sinic. Některé ze subearofytických sběrů sinice Nostoc commune vykazovaly výraznou cytotoxicitu, ovšem v tomto případě si nemůžeme být jisti, jestli se jedná o toxicitu způsobenou samotnými sinicemi, jelikož jde o přírodní materiál obsahující bakterie a jiné kontaminace. Kmen Nostoc sp. OBU36SO7 je vyjímkou v této skupině a je jediným čistým izolátem s cytotoxickým účinkem. Vzhledem k silné toxicitě nalezené u subaerofytických sinic, bude izolace čistých kultur a jejich testování objektem dalšího studia. Kmeny symbiotické by teoreticky neměly vykazovat vysoké toxické účinky, jelikož symbióza je výhodná pro oba partnery. Tomuto předpokladu však odporuje svou vysokou (v některých měřeních téměř 100%) cytotoxicitou cykasový symbiont Nostoc sp. De, jenž indukuje u savčích buněk apoptózu. Vyšší rostliny ovšem disponují mnohými biochemickými drahami rozkladu škodlivin a je možné, že tento toxin specificky odbourávají. Navíc je zřejmé, že rostlinné buňky jsou morfologicky i strukturně natolik odlišné od testovaných buněčných linií, a tak je možné, že jim toxické látky nebudou působit žádná poškození. Ačkoli je vyhledávání a studium sekundárních metabolitů významné především jako možnost izolace potenciálně biotechnologicky využitelných látek, poskytuje také zajímavé výsledky ekologického charakteru. Pokud přijmeme hypotézu, že sinice produkují cytotoxiny jako obranu proti herbivornímu či konkurenčnímu tlaku ze strany hub, roztočů a jiných mikroorganismů, pak by naše výsledky nasvědčovaly, že sinice jsou jednoznačně pod nejvyšším konkurenčním tlakem v půdním prostředí. Dalším zajímavým faktem je, že kmeny NMB25 a NMB26 izolované ze stejné lokality, vykazovaly vysokou míru cytotoxicity, avšak jejich extrakty nesdílely jedinou shodnou látku. Zatímco u kmene NMB25 byla nalezena přítomnost cytotoxického aeruginoguanidinu 98-C,

41

Diskuse

Petr Tomek


tato látka nebyla u NMB26 přítomna, a tudíž je u obou kmenů zodpovědná za toxicitu struktura jiná. Podobné výsledky byly získány v naší laboratoři u jiných kmenů izolovaných ze stejných lokalit. U kmene Nostoc muscorum I byla v této práci nalezena produkce neznámého cytotoxického peptidu o hmotě 1211 Da. Tento kmen byl izolován společně s organismem Nostoc ellipsosporum z obhospodařovaných polí u Nezamyslic (Česká Republika). Také v tomto případě se u obou kmenů výsledky analýzy naprosto liší a kmen Nostoc ellipsosporum výše zmíněnou látku neobsahuje [HROUZEK, ÚSTNÍ SDĚLENÍ]. Tento výsledek by mohl nasvědčovat tomu, že produkce cytotoxických látek je skutečně ekologicky podmíněna. Proto dva rozdílné organismy pocházející ze stejného prostředí syntetizují funkčně podobné látky, ale jejich struktury se liší z důvodu přítomnosti jiných syntetáz. Jsme si však vědomi, že na potvrzení této hypotézy bude potřeba ucelenější studie.

Diskuse

42

Petr Tomek

5


LITERATURA

ABU HENA MOSTAFA, KIM CHUL-SA, HORIIKE MICHIO, KIYOOKA SYUN-ICHI. Toward a practical synthesis of acutiphycin. Highly stereoselective synthesis of C10-epi seco acid derivative via reaction paths shortened by using a series of chiral oxazaborolidinone-promoted aldol reactions. Tetrahedron Letters 40 (1999): 1161-1164 AL-AWAR RIMA S., CORBETT THOMAS H., RAY JAMES E., POLIN LISA, KENNEDY JOSEPH H., WAGNER MARGARET M., WILLIAMS DANIEL C. Biological evaluation of cryptophycin 52 fragment A analogues: Effect of the multidrug resistance ATP binding cassette transporters on antitumor activity. Molecular Cancer Therapeutics 3 (2004): 1061-1067 ARNON DANIEL I., MCSWAIN BERAH D., TSUJIMOTO HARRY Y., WADA KEISHIRO. Photochemical activity and components of membrane preparations from blue-green algae. I. Coexistence of two photosystems in relation to chlorophyll a and removal of phycocyanin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics 357 (1974): 231-245 BARCHI JOSEPH J., NORTON TED R., FURUSAWA EIICHI, PATTERSON GREGORY M. L., MOORE RICHARD E. Identification of a cytotoxin from Tolypothrix byssoidea as tubercidin. Phytochemistry 22 (1983): 2851-2852 BERG T., BOMAN D., SEGLEN P.O. Induction of tryptophan oxygenase in primary rat liver cell suspensions by glucocorticoid hormone. Experimental Cell Research 72 (1972): 571–574 CHEN XINXIN, SMITH GEOFFREY D., WARING PAUL. Human cancer cells (Jurkat) killing by the cyanobacterial metabolite calothrixin A. Journal of Applied Phycology 15 (2003): 269-277 BERNARDO PAUL H., CHAI CHRISTINA L. L., ELIX JOHN A. A simple and concise route to calothrixin B (short communication). Tetrahedron Letters 43 (2002): 2939-2940 BERRY JOHN P., GANTAR MIROSLAV, GAWLEY ROBERT E., WANG MINGLEI, REIN KATHLEEN S. Pharmacology and toxicology of pahayokolide A, a bioactive metabolite from a freshwater species of Lyngbya isolated from the Florida Everglades. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 139 (2004): 231-238 BHATTACHARYA R., RAO P.V. LAKSHMANA, BHASKAR A.S.B., PANT S.C., DUBE S.N. Liver slice culture for assessing hepatotoxicity of freshwater cyanobacteria. Human & Experimental Toxicology 15 (1996): 105-110 BOLTON J.L., TRUSH M.A., PENNING T.M., DRYHURST G., MONKS T.J. Role of quinones in toxicology. Chemical Research in Toxicology 13 (2000): 135-160 BOUAICHA NOUREDDINE, MAATOUK IMED. Microcystin-LR and nodularin induce intracellular glutathione alteration, reactive oxygen species production and lipid peroxidation in primary cultured rat hepatocytes. Toxicology Letters 148 (2004): 53-63 CARMELI SHMUEL, MOORE RICHARD E.,PATTERSON GREGORY M.L., YOSHIDA WESLEY Y. Biosynthesis of tolytoxin (scytophycin B). Origin of the carbons and heteroatoms. Tetrahedron Letters 34 (1993): 5571-5574

43

Literatura

Petr Tomek


CARMICHAEL W.W. Cyanobacteria secondary metabolites – the cyanotoxins. Journal of Applied Bacteriology 72 (1992): 445-459 CARMICHAEL W.W., BIGGS DAVID F., PETERSON MARGE A. Pharmacology of Anatoxin-a, produced by the freshwater cyanophyte Anabaena flos-aquae NRC-44-1. Toxicon 17 (1979): 229-236 CODD G.A. Cyanobacterial toxins: Occurence, properties and biological significance. Water Science and Technology 32 (1995): 149-156 DE MUYS JEAN-MARC, REJ RABINDRA, NGUYEN DIEU, GO BRIAN, FORTIN SAMUEL, LAVALLÉE JEANFRANCOIS. Synthesis and in vitro cytotoxicity of cryptophycins and related analogs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 6 (1996): 1111-1116

DING WEN-XING, ONG CHOON NAM. Role of oxidative stress and mitochondrial changes in cyanobacteria-induced apoptosis and hepatotoxicity. FEMS Microbiology Letters 220 (2003): 17 DING WEN-XING, SHEN HAN-MING, SHEN YI, ZHU HUI-GANG, ONG CHOON-NAM. Microcystic cyanobacteria causes mitochondrial membrane potential alteration and reactive oxygen species formation in primary rat hepatocytes. Environmental Health Perspectives 106 (1998B): 409-413 DING WEN-XING, SHEN HAN-MING, ZHU HUI-GANG, ONG CHOON-NAM. Studies on oxidative damage induced by cyanobacteria extract in primary cultured rat hepatocytes. Environmental research, section A 78 (1998A): 12-18 EL-THAHER TALEL S., BAILEY GRAHAM S. A new staining metod for cylic peptides after Thinlayer chromatography. Analytical biochemistry 217 (1994): 335-337 ENDICOTT J.A., LING V. The biochemistry of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance. Annual Review of Biochemistry 58 (1989): 137-171 ERIKSSON J.E., GRONBERG L., NYGARD S., SLOTTE J.P., MERILUOTO J.A.O. Hepatocellular uptake of 3H-dihydromicrocystin-LR, a cyclic peptide toxin. Biochimica et Biophysica Acta 1025 (1990): 60-66 ESSER M.T., MORI T., MONDOR I, SATTENTAU Q.J., DEY B., BERGER E.A., BOYD M.R., LIFSON J.D. Cyanovirin-N binds to gp120 to interfere with CD4-dependent human immunodeficiency virus type 1 virion binding, fusion, and infectivity but does not affect the CD4 binding site on gp120 or soluble CD4-induced conformational changes in gp120. Journal of Virology 73 (1999): 4360-4371 EVANS S. M., CASARTELLI A., HERREROS E., MINNICK D. T., DAY C., GEORGE E., WESTMORELAND C. Development of a high throughput in vitro toxicity screen predictive of high acute in vivo toxic potential. Toxicology in Vitro 15 (2001): 579-584 FADOK V.A., VOELKER D.R., CAMPBELL P.A., COHEN J.J., BRATTON D.L., HENSON P.M. Exposure of phosphatydilserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. The Journal of Imunology 148 (1992): 2207-2216

Literatura

44

Petr Tomek


FASTNER JUTTA, HEINZE RITA, CHORUS INGRID. Microcystin-content, hepatotoxicity and cytotoxicity of cyanobacteria in some German water bodies. Water Science and Technology 32(1995): 165-170 FASTNER J., HEINZE R., HUMPAGE A. R., MISCHKE U., EAGLESHAM G. K., CHORUS I. Cylindrospermopsin occurrence in two German lakes and preliminary assessment of toxicity and toxin production of Cylindrospermopsis raciborskii (Cyanobacteria) isolates. Toxicon 42 (2003): 313-321 FLADMARK K.E., BRUSTUGUN O.T., HOVLAND R., BOE R., GJERTSEN B.T., ZHIVOTOVSKY B., DØSKELAND S.O. Ultrarapid caspase-3 dependent apoptosis induction by serine/threonine phosphatase inhibitors. Cell Death & Differentiation 6 (1999): 1099-1108 FUJII KIYONAGA, SIVONEN KAARINA, ADACHI KYOKO, KAZUYOSHI NOGUCHI, SANO HIROSHI, HIRAYAMA KAZUO, SUZUKI MAKOTO, HARADA KEN-ICHI. Comparative study of toxic and nontoxic cyanobacterial products: Novel peptides from toxic Nodularia spumigena AV1. Tetrahedron Letters 38 (1997): 5525-5528 FUJII KIYONAGA, SIVONEN KAARINA, NAGANAWA EMIKO, HARADA KEN-ICHI. Non-toxic peptides from toxic cyanobacteria, Oscillatoria agardhii. Tetrahedron 56 (2000): 725-733 GANT T.W., RAO D.N., MASON R.P., COHEN G.M. Redox cycling and sulphydryl arylation; their relative importance in the mechanism of quinone cytotoxicity to isolated hepatocytes. Chemico-Biological Interactions 65 (1988): 157-173 GREGSON JOHN M., CHEN JIAN-LU, PATTERSON GREGORY M.L., MOORE RICHARD E. Structures of puwainaphycins A-E. Tetrahedron 48 (1992): 3727-3734 HARADA KEN-ICHI, FUJII KIYONAGA, HAYASHI KAYO, SUZUKI MAKOTO, IKAI YOSHITOMO, OKA HISAO. Application of -FDLA derivatization to determination of absolute configuration of constituent amino acids in peptide by advanced Marfey's method. Tetrahedron Letters 37 (1996): 3001-3004 HARADA KEN-ICHI, MURATA HIDEAKI, QIANG ZHANG, SUZUKI MAKOTO, KONDO FUMIO. Mass spectrometric screening method for microcystins in cyanobacteria. Toxicon 34 (1996): 701-710 CHORUS I. A new WHO approach called „Water Safety Plans“: how does it work for cyanotoxins? In 6th Conference On Toxic Cyanobacteria (2004), p.30, Bergen, Norway HARADA KEN-ICHI, OHTANI IKUKO, IWAMOTO KAYOKO, SUZUKI MAKOTO, WATANABE MARIYO F., WATANABE MASAYUKI, TERAO KIYOSHI. Isolation of cylindrospermopsin from a cyanobacterium Umezakia natans and its screening method. Toxicon 32 (1994): 73-84 HARBORNE J.B. & BAXTER H. Phytochemical dictionary - a handbook of bioactive compounds from plants. Taylor And Francis Limited, London (1993). HERFINDAL LARS, OFTEDAL LINN, SELHEIM FRODE, WAHLSTEN MATTI, SIVONEN KAARINA, DØSKELAND STEIN OVE. A high proportion of Baltic Sea benthic cyanobacterial isolates contain apoptogens able to induce rapid death of isolated rat hepatocytes. Toxicon 46 (2005): 252-260

45

Literatura

Petr Tomek


HOEMANN M.Z., AGRIOS K.A., AUBÉ J. Total synthesis of (+)-curacin A, a marine cytotoxic agent. Tetrahedron 53 (1997): 11087-11098 CHONG M.W.K., WONG B.S.F., LAM P.K.S., SHAW G.R., SEAWRIGHT A.A. Toxicity and uptake mechanism of cylindrospermopsin and lophyrotomin in primary rat hepatocytes. Toxicon 40 (2002): 205-211 ISHIDA KEISHI, MATSUDA HISASHI, MURAKAMI MASAHIRO, YAMAGUCHI KATSUMI. Microginins 299-A and -B, leucine aminopeptidase inhibitors from the cyanobacterium Microcystis aeruginosa (NIES-299). Tetrahedron 53 (1997): 10281-10288 ISHIDA KEISHI, MATSUDA HISASHI, OKITA YUJI, MURAKAMI MASAHIRO. Aeruginoguanidines 98A–98-C: cytotoxic unusual peptides from the cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Tetrahedron 58 (2002): 7645-7652 JUNG JEE H., MOORE RICHARD E., PATTERSON GREGORY M.L. Scytophycins from a blue-green alga belonging to the Nostocaceae. Phytochemistry 30 (1991): 3615-3616 JÜTTNER FRIEDRICH, TODOROVA ALBENA K., WALCH NADJA, VON PHILIPSBORN WOLFGANG. Nostocyclamide M: a cyanobacterial cyclic peptide with allelopathic activity from Nostoc 31. Phytochemistry 57 (2001): 613-619 KESSEL DAVID, LUO YU. Cells in cryptophycin-induced cell-cycle arrest are susceptible to apoptosis. Cancer Letters 151 (2000): 25-29 KNÜBEL GEORG, LARSEN LINDA K., MOORE RICHARD E., LEVINE IRA A., PATTERSON GREGORY M.L. Cytotoxic, antiviral indolocarbazoles from a blue-green alga belonging to the Nostocaceae. The Journal of Antibiotics (1990): 1236-1239 KODANI SHINYA, SUZUKI SHINGO, ISHIDA KEISHI, MURAKAMI MASAHIRO. Five new cyanobacterial peptides from water bloom materials of lake Teganuma (Japan). FEMS Microbiology Letters 178 (1999): 343-348 LAAMANEN M.J., GUGGER M.F., LEHTIMÄKI J.M., HAUKKA K., SIVONEN K. Diversity of toxic and nontoxic Nodularia isolates (cyanobacteria) and filaments from the Baltic sea. Applied and Environmental Microbiology 67 (2001): 4638-4647 LINCOLN R.A., STRUPINSKY K., WALKER J.M. The use of Artemia nauplii (Brine shrimp larvae) to detect toxic compounds from microalgal cultures. Pharmaceutical Biology 34 (1996): 384389 MAHMOOD N.A., CARMICHAEL W.W. The pharmacology of anatoxin-a(s), a neurotoxin produced by the freshwater cyanobacterium Anabaena flos-aquae NRC 525-17. Toxicon 24 (1986): 425-434 MARŠÁLEK BLAHOSLAV, BLÁHA LUDĚK, KRMENČÍK PAVEL, OSTRÝ VLADIMÍR. Biotoxiny – učební texty pro přednášku „Ekotoxikologické aspekty biotoxinů“. (2005) Duben, Brno MARŠÁLEK BLAHOSLAV, KERŠNER VLADIMÍR, MARVAN PETR. Vodní květy sinic. Nadatio flosaquae (1996)

Literatura

46

Petr Tomek


MARTIN B.R. Tissue culture techniques – an introduction. Boston. USA: 1-243 MATSUHIMA R., YOSHIZAWA S., WATANABE F.M., HARADA F.M., FURUSAWA M., CARMICHAEL W.W. In vitro and in vivo effects of protein phosphatase inhibitors, microcystins and nodularin on mouse skin and fibroblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications 171 (1990): 867-874 MOORE RICHARD E., BORNEMANN V., NIEMCZURA W.P., GREGSON J.M., CHEN J.L., NORTON T.R., PATTERSON G.M.L., HELMS G.L. Puwainaphycin-C, a cardioactive cyclic peptide from the blugreen alga Anabaena BQ-16-1 – Use of two-dimensional C-13-C-13 and C-13-N-15 correlation spectroscopy in sequencing the amino-acid units. Journal of the American Chemical Society 111 (1989): 6128-6132 MOORE RICHARD E., PATTERSON G.M.L., CARMICHAEL W.W. New pharmaceuticals from cultured blue-green algae. In Fautin DG (ed.), Biomedical Importance of Marine Organisms 13 (1988): 143-150 MOORE RICHARD E., SMITH CHARLES D., PATTERSON GREGORY M.L., MOOBERRY SUSAN L., CORBETT THOMAS H., VALERIOTE FREDERICK A., TRIMURTULU GOLAKOTI. Cryptophycins U.S.Patent 5952298 (1995) MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival – application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65 (1983): 55-63 MURAKAMI MASAHIRO, SUN QI, ISHIDA KEISHI, MATSUDA HISAHI, OKINO TATSUFUMI, YAMAGUCHI KATSUMI. Microviridins, elastase inhibitors from the cyanobacterium Nostoc minutum (NIES26). Phytochemistry 45 (1997): 1197-1202 MURATAKE HIDEAKI, NATSUME MITSUTAKA. Total synthesis of lyngbyatoxin A (teleocidin A-1) and teleocidin A-2. Tetrahedron Letters 28 (1987): 2265-2268 NAMIKOSHI M., RINEHART K.L. Bioactive compounds produced by cyanobacteria. Journal of Industrial Microbiology 17 (1996): 373-384 OHSHIMA T., GNANADESKIAN V., SHIBUGUCHI T., FUKUTA Y., NEMOTO T., SHIBASAKI M. Enantioselective syntheses of aeruginosin 298-A and its analogues using a catalytic asymmetric phase-transfer reaction and epoxidation. Journal of the American Chemical Society 125 (2003): 11206-11207 OHTANI I., MOORE RICHARD E., RUNNEGAR M.T.C. Cylindrospermopsin, a potent hepatotoxin from the blue-green alga Cylindrospermopsis raciborskii. Journal of the American Chemical Society 114 (1992): 7941-7942 PACE J.G., ROBINSON N.A., MIURA G.A., MATSON C.F., GEISBERT T.W., WHITE J.D. Toxicity and kinetics of [3H] microcystin-LR in isolated perfused rat livers. Toxicology and Applied Pharmacology 107 (1991): 391-401 PANDA D., HIMES R.H., MOORE RICHARD E., WILSON L., JORDAN M.A. Mechanism of action of the unusually potent microtubule inhibitor cryptophycin 1. Biochemistry 36 (1997): 1294812953

47

Literatura

Petr Tomek


PATTERSON GREGORY M.L., CARMELI SHMUEL. Biological effects of tolytoxin (6-hydroxy-7-Omethyl-scytophycin b), a potent bioactive metabolite from cyanobacteria. Archives of Microbiology 157 (1992): 406-410 PERSOONE GUIDO, JANSSEN COLIN, DE COEN WIM. Cyst-based toxicity tests X: comparison of the sensitivity of the acute Daphnia magna test and two crustacean microbiotests for chemicals and wastes. Chemosphere 29 (1994): 2701-2710 PICHARDO S., JOS A., ZURITA J.L., SALGUERO M., CAMEAN A.M., REPETTO G. The use of the fish cell lines RTG-2 and PLHC-1 to compare the toxic effects produced by microcystins LR and RR. Toxicology in Vitro 19 (2005): 865-873 PLOUTNO ALEXEI, CARMELI SHMUEL. Modified peptides from a water bloom of the cyanobacterium Nostoc sp. Tetrahedron 58 (2002): 9949-9957 RANTALA ANNE, FEWER DAVID P., HISBERGUES MICHAEL, ROUHIAINEN LEO, VAITOMAA JAANA, BÖRNER THOMAS, SIVONEN KAARINA. Phylogenetic evidence for the early evolution of microcystin synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101 (2004): 568-573 REISNER M., CARMELI S., WERMAN M., SUKENIK A. The cyanobacterial toxin cylindrospermopsin inhibits pyrimidine nucleotide synthesis and alters cholesterol distribution in mice. Toxicological Sciences 82 (2004): 620-627 RICKARDS R.W., ROTHSCHILD J.M., WILLIS A.C., DE CHAZAL N.M., KIRK J., KIRK K., SALIBA K.J., SMITH G.D. Calothrixins A and B, novel pentacyclic metabolites from Calothrix cyanobacteria with potent activity against malaria parasites and human cancer cells. Tetrahedron 55 (1999): 13513-13520 RINEHART K.L., HARADA K.I., NAMIKOSHI M., CHEN C., HARVIS C.A., MUNRO M.H.O., BLUNT J.W., MULLIGAN P.E., BEASLEY V.R., DAHLEM A.M., CARMICHAEL W.W. Nodularin, microcystin, and the configuration of Adda. Journal of the American Chemical Society 110 (1988): 8557-8558 RUNNEGAR M.T., XIE C., SNIDER B.B., WALLACE G.A., WEINREB S.M., KUHLENKAMP J. In vitro hepatotoxicity of the cyanobacterial alkaloid cylindrospermopsin and related synthetic analogues. Toxicological Sciences 67 (2002), 81 – 87. SANO TOMOHARU, KAYA KUNIMITSU. Oscillamide Y, a chymotrypsin inhibitor from toxic Oscillatoria agardhii. Tetrahedron Letters 36 (1995): 5933-5936 SANO TOMOHARU, TAKAGI HIROO, MORRISON LOUISE F., METCALF JAMES S., CODD GEOFFREY A., KAYA KUNIMITSU. Leucine aminopeptidase M inhibitors, cyanostatin A and B, isolated from cyanobacterial water blooms in Scotland. Phytochemistry 66 (2005): 543-548 SIVONEN K., CARMICHAEL W.W., NAMIKOSHI M., RINEHART K.L., DAHLEM A.M., NIEMELA S.I. Isolation and characterization of hepatotoxic microcystin homologs from the filamentous freshwater cyanobacterium Nostoc sp. strain 152. Applied Environmental Microbiology 56 (1990): 2650-2657

Literatura

48

Petr Tomek


SIVONEN KAARINA, JONES G. Cyanobacterial toxins. In Chorus I., Bartram J., editors. Toxic cyanobacteria in water: A guide to their public health consequences, monitoring, and management. London: E & FN Spoon. p 41-111 SIVONEN KAARINA. Cyanobacteria toxins and toxin production. Phycologia 35 (1996): 12-24 SMITH CHARLES D., ZHANG XINQUN, MOOBERRY SUSAN L., PATTERSON GREGORY M.L., MOORE RICHARD E. Cryptophycin: A new antimicrotubule agent active against arug-resistant cells. Cancer Research 54 (1994): 3779-3784 SURAKKA ANU, SIHVONEN LEILA M., LEHTIMÄKI JAANA M., WAHLSTEN MATI, VUORELA PIA, SIVONEN KAARINA. Benthic cyanobacteria from the Baltic sea contain cytotoxic Anabaena, Nodularia, and Nostoc strains and an apoptosis-inducing Phormidium strain. Environmental Toxicology 20 (2005): 285-292 TENEVA IVANKA, ASPARUHOVA DAFINKA, DZHAMBAZOV BALIK, MLADENOV RUMEN, SCHIRMER KRISTIN. The freshwater cyanobacterium Lyngbya aerugino-corulea produces compunds toxic to mice and to mammalian and fish cells. Environmental Toxicology 18 (2003): 9-20 TRIMURTULU G., OGINO J., HELTZEL C.E., LE HUSEBO TRANG, JENSEN CRAIG M., LARSEN LINDA K., PATTERSON GREGORY M. L., MOORE RICHARD E., MOOBERRY SUSAN L., AND ET AL. Structure determination, conformational analysis, chemical stability studies, and antitumor evaluation of the cryptophycins. Isolation of 18 new analogs from Nostoc sp. strain GSV 224. Journal of the American Chemical Society 117 (1995): 12030-12049 TRIMURTULU GOLAKOTI, OHTANI IKUKO, PATTERSON GREGORY M. L., MOORE RICHARD E., CORBETT THOMAS H., VALERIOTE FREDERICK A., DEMCHIK LISA. Total Structures of Cryptophycins, Potent Antitumor Depsipeptides from the Blue-Green Alga Nostoc sp. Strain GSV 224. Journal of the American Chemical Society 116 (1994): 4729-4737 TRIMURTULU GOLAKOTI, YOSHIDA WESLEY Y., CHAGANTY SREEDHARA, MOORE RICHARD E. Isolation and Structures of Nostopeptolides A1, A2 and A3 from the Cyanobacterium Nostoc sp. GSV224. Tetrahedron 56 (2000): 9093-9102 WELKER MARTIN, VON DÖHREN HANS. Cyanobacterial peptides – Nature´s own combinatorial biosynthesis. FEMS Microbiology Reviews 30 (2006): 530-563 WHITE JAMES D., XU QING, LEE CHANG-SUN, VALERIOTE FREDERICK A. Total synthesis and biological evaluation of (+)-kalkitoxin, a cytotoxic metabolite of the cyanobacterium Lyngbya majuscula. Organic and Biomolecular Chemistry 2 (2004): 2092 WONACOTT S., SWANSON K.L., ALBUQUERQUE E.X., HUBY N.J., THOMPSON P., GALLAGHER T. Homoanatoxin: a potent analogue of anatoxin-A. Biochemical Pharmacology 43 (1992): 419423

49

Literatura

P ETR T OMEK. školitel: Mgr. Pavel Hrouzek školitel specialista: Ing. Jiří Kopecký, CSc

Recommend Documents