OTKA 61030 ZÁRÓJELENTÉS A nitrogén monoxid (NO) egy rövid féléletidejű, számos szabályozó szabályozó funkciót betöltő molekula, immunmoduláns hatása jól ismert. Korábbi eredményeink szerint NO befolyásolja a T limfocita aktivációt (J Immunol 2003;171:5188-5197; Trends Immunol 2004;25:360-367; Free Radical Biology and Medicine 2007;11:1625-1631; Clinical Immunology 2006;2-3:145-151). (A zárójelentésben az eddig közölt adatok szövegesen, az eddig még nem közölt adatok ábrákkal is szerepelnek). 1: Eredményeink szerint a NO szabályozza a TNF-alfa T limfocitákra kifejtett sejt aktiváló és apoptózis indukáló hatását. 10, 50 és 100 ng/ml rekombináns TNF-α előkezelést követően adott NO donor (60, 120, 300 μM NOC-18) jeletősebben fokozta az apoptózist, mint NO donor önmagában (p>0,001 mindhárom esetben).
Az NO befolyásolja a TNF által indukált apoptózist Jurkat sejteken 20
% Annexin pozitív sej tek, 24h kezelés
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
Kontroll
120 μM NOC18
50 ng/ml TNF
50 ng/ml TNF + 120 μM NOC18
2: TNF kezelés NF-κB aktivációt indukál limfocitákban. NF-κB riporter plazmidot tartalmazó Jurkat sejteken vizsgálatuk az NF-κB aktivációt. Eredményeink szerint NO hatékonyan gátolja a TNF kezelésre és CD3 stimulációra mérhető NF-kappa aktivaciót is.
Az NO gátolja a TNF által indukált NF-κB aktivációt β galaktozidáz riporter plazmidot tartalmazó Jurkat sejteken
0,3
100 ng/ml TNF 50 ng /ml TNF
NO donor
0,25
NF-κB aktiváció
10 ng /ml TNF 0,2
10 ng/ml TNF + 120 μM NOC-18
0,15
Kontr oll 0,1
0,05
0
50 ng/ml TNF + 120 μM NOC-18
100 ng/ml TNF + 120 μM NOC-18
3: Vizsgálatuk az NO NF-κB gátló hatásának mechanizmusát is. Eredményeink szerint az NF-kappa aktiváció korai lépéseit képviselő P50, P65, I-kBα és I-kBε nukleáris transzlokáció is független NO donor előkezeléstől. Ezen adataink szerint az NF-kappa útvonal későbbi lépéseit, így a transzkripciót és transzlációt szabályozza NO, míg a nukleáris transzlokáció NO-tól független.
NO nem befolyásolja NF-kB nukleáris transzlokációt Jurkat sejteken Kontroll 0
Blot
2
5
15
NOC18 120 µM o/n 0
2
5
15 :
TNF 50 ng/ml (min)
p65 0.517
0.584
0.793
2.112
0.443
0.032
0.045
0.069
0.509
0.143
0.606
1.114
2.430
p50 0.051
0.048
0.610
actin
4: Eredményeink szerint a TNF által indukált P38 aktiváció szintén nem különbözött szignifikánsan NO donor előkezelést követően és annak hiányában, western blot módszerrel és intracelluláris flow citometriával mérve egyaránt (p=0,4 és p=0,5). Irodalmi adatok szerint rheumatoid arthritisben (RA) csökken a T limfociták CD-ζ lánc expresszója. A TNF alapvető szerepet játszik az RA pathogenézisében, ezért vizsgálatuk a TNF szerepét a CD-ζ lánc expresszójára. Eredményeink szerint TNF (10-50 ng per ml) dózis függően csökkenti a CD-ζ lánc expressziót Jurkat sejteken és frissen szeparált human T limfocitákon is (p<0,001) áramlási citometriával és wetern blot módszerrel mérve egyaránt. Ugyanakkor a foszforilált CD3-ζ lánc expresszió fokozódik TNF kezelés hatására. TNF kezelés dózisfüggő módon csökkenti a CD3 ζ lánc expressziót
J URKAT Kontr oll
TNF-α 5 ng/ml
TNF-α 15 ng /ml
PBMC TNF-α 40 ng /ml
K
CD3
TNF-α 40 ng /ml
K
TNF-α 40 ng /ml
ζ
22 kDa
β-actin 42 kDa
16 h Kontr oll
p-CD3 ζ β-actin
TNF-α 5 ng/ml
TNF-α TNF-α 15 ng /ml 40 ng /ml
24h
5: NO szabályozza a TNF által indukált NF-κB aktivációt és apoptózist, további kísérleteink során vizsgáltuk az NO hatását a TNF által indukált CD3-ζ lánc expresszióra. Eredményeink szerint NO donorral törtenő előkezelés (40 umol NOC 18) gátolta a TNF által okozott CD3-ζ lánc expressziót csökkentő hatását, Jurkat sejteken és frissen szeparált humán limfocitákon egyaránt (p<0,001; p<0,001).
NO donorral történő előkezelés gátolja a TNF kezelés hatására kialakuló ζ lánc csökkenést
Kontr oll
NOC18
TNF-α
NOC18 + TNF-α
Kontr oll
TNF-α
NOC18 + TNF-α
CD3 ζ 16 kDa
β-actin 42 kDa
3 h 180 μM NOC18 előkezelés, 16h inkubáció 40 ng/ml TNF
6: Vizsgáltuk az NO donor és NO termelődést gátló NOS inhibitor hatását a CD3-ζ lánc expressziójára. Eredményeink szerint NO donor, vagy NO gátlás nem befolyásolja a CD3-ζ lánc expressziót.
A NO és az LNMMA önmagában nem befolyásolja a zéta lánc mennyiségét
Kontroll
60 μM NOC18
120 μM NOC18
Kontroll CD3 ζ 16 kDa
Tubulin 55 kDa
Inkubáció: 16 h
10 μM LNMMA
100 μM LNMMA
16 kDa
7: Ugyanakkor TNF kezelés nem befolyásolta a CD3-ε lánc expressziót, mely a CD3-ζ és CD3-ε láncok expressziójának eltérő szabályozására utal.
TNF kezelés hatására nem változik a CD3 ε lánc mennyisége
CD3
NOC18
TNF-α
ε
NOC18 +TNFα
23 kDa
β-actin
Relatív fluoreszcencia
Kontroll
21 16 11 6 1
42 kDa Kontroll
NOC18: 180 μM
előkezelés 3 h
1 ng/ml TNF-α
40 ng/ml TNF-α
20 ng/ml TNF-α
16 h
Inkubáció: 16 h
TNF-α: 40 ng/ml
8: SRC adaptor (SAP) protein irodalmi adatok szerint csökkenti a CD3-ζ expressziót, sajat adataink szerint TNF kezeles SAP expresszió növekedéssel jár, melynek szerepe lehet a TNF CD3-ζ csökentő hatásában is.
TNF hatására megnő SLAP src adaptor protein expressziója Src adaptor protein expressziója TNF kezelés hatására Kontroll
TNF-α 40 ng/ml int a li ern
SLAP
ci ó zá
34 kDa
SLAP c-Cbl
li z
55 kDa
ik rec
Tubulin
ác ió
degradáció
9: Vizsgáltuk a TNF által indukált CD3ζ expresszió csökkenés mechanizmusát is. Eredményeink szerint lizoszóma gátló NH4Cl nem befolyásolja a TNF CD3ζ expressziót csökkentő hatását. Továbbá szelektív NF-κB gátló NBD peptid szintén nem védi ki a TNF CD3ζ lánc csökkentő hatását.
Lizoszómagátlás hatása a TNF által indukált ζ lánc expresszióra TNF + NH4Cl
K
NH4Cl
TNF-α K
CD3 ζ
16 kDa
β-actin
42 kDa
TNF-α
TNF-α + NBD peptid
Szelektív NF-κB gátlás nem védi ki ζ lánc downregulációt
10: A NO TNF hatásait módosíthatja receptorának expresszióján keresztül is, ezért megvizsgáltuk az NO szerepét I és II típusú TNF receptorok kifejeződésére. Eredményeink szerint NO nem befolyásolja szignifikánsan az I és II típusú TNF receptor expressziót.
NO nem befolyásolja a TNF receptor expressziót TNF RII
TNF RI NO donor hat á s á r a
NOS g á tló tlók hat á s á r a
11: Microarray eredményeink alapján a NO számos TNF által indukált protein expresszióját szabályozza, így többek között gátolja a relB protein expressziót human T limfocitákon. Eredményeink az NO számos, a TNF által aktivált gén expresszóját gátolja. Mindezek az eredmények alátámasztják a NO TNF hatásait befolyásoló szerepét.
NO befolyásolja a TNF által indukált génexpressziót
NOC
NOC + TNF
TNF
Megváltozott gének száma
TNF
TNF + NOC
12: Eredményeink szerint szénhidrát antigének processzálását szignifikánsan nem befolyásolja NO donor és NOS inhibitor kezelés. 13: Eredményeink szerint NO szabályozza T limfociták citokin termelését és differenciálódását. Hisztidin dekarboxiláz hiányos (HDC-KO) egér T sejtjeinek IFN-gamma termelése fokozott mRNS és protein szinten (p>0,001, p>0,001) (Koncz A et al J Immunol 2007;10:6613-6619). HDC-KO T limfociták NO termelése szintén fokozott vad típusú kontrollokéhoz képest (p<0,01) és hisztamin szabályozza az NO szintézist, HDC-KO és vad típusú T limfocitákban egyaránt. Eredményeink szerint NO donor kezelés INF-gamma termeléssel jár, mig NOS inhibitorok az IFN-gamma szintézist szignifikánsan gátolták. Hisztamin a NO termelésen keresztül szabályozza az IFN-gamma szintézist. Hisztamin hiány nem véd az aggrekán indukálta artritistől, melynek oka a Th1 citokinek nagyobb aranyú termelése. 14: Eredményeink szerint TNF szabályozza T limfociták nitrogén monoxid (NO) termelését in vivo és in vitro, továbbá NO szabályozza a T limfociták NF-Kappa aktivációját. Rheumatoid arthritises (RA) betegek T limfocitáinak NO termelése fokozott (p<0,001) és TNF blokkoló kezelés mellett az NO termelés csökken (p=0,01). (Nagy G et al. Immunol Lett. 2008 Jun 15;118(1):55-8). Ugyanakkor RA-es betegek T limfocitáinak NO termelése nem korrelál a betegség aktivitásával. RA-es betegek szinoviális mintáiból szeparált fibroblasztok és makrofágok NO termelése nem különbözött arthrosisban szenvedő betegek szinoviális mintáiból szeparált fibroblasztok és makrofágok NO termelésétől. 15: RA-es betegek szérum nitrit és nitrát szintje hasonló egészséges kontrollokéhoz és nem korrelál a betegség aktivitásával és a rheumatoid faktor szintjével.
16: 100nm 1000nm méretű mikropartikulumok egér ízületbe juttatva szinovitist okoznak. B limfocita es monocita eredetű partikulumok mennyisége magasabb SLE-ben es polymyositisben, mig a T limfocita eredetű mikropartikulumok szintje jelentősen emelkedett polymyotitisben de SLE ben az egészseges kontrollokéhoz hasonló.
Mikropartikulák SLE-ben
CD19
CD3
p<0.001
n.s.
B
egészséges kontroll CD19
60 50 40
SLE-s minta CD19
30
CD19-PE
x105 microparticles/ ml serum
p=0.003
CD14
CD19-PE
A 70
20 10
Annexin V-FITC
0
CD14, CD19 hordozó (monocita és B limfocita eredetű) mikropartikulák mennyisége korrelál egymással. Továbbá a CD14 és a CD19 hordozó partikulák mennyisége is szignifikánsan korrelál az SLE aktivitását mutató SLEDAI index értékével.
Mikropartikulák és SLEDAI közötti korreláció CD14
50 40 30 20 10 0
x105 microparticles/ ml serum
80
p<0.0001
60
p = 0.02
70 60 50 40 30 20 10
5
10
15
20
25
30
35
x105 microparticles/ ml serum
0
CD14
5
10
15
20
25
20
25
SLEDAI 160
B sejt eredetű mikropartikulák száma és a C3 / anti-C1q szintek között.
CD19
nincs szignifikáns korreláció a
x105 microparticles/ ml serum
CD19
x105 microparticles/ ml serum
70
p=0.007
140 120 100 80 60 40 20
0
5
10
15
SLEDAI
