OTKA (68734) zárójelentés, 2011. 1. Galanthamin és származékai A 2007,. 2008. évben sikerült olyan mennyiségü spirociklohexenon intermediert (1) előállítanunk, hogy az egy metoxicsoportot tartalmazó vegyületek szintézise során néhány gyűrűzárási kísérletet kipróbálhassunk (1. ábra).
SCH2CH3 c O b
O d
a
O
O
AlCl3, Et2S CH2Cl2 CH3O
N H
2 O O N O
c
H D,L-metionin metánszulfonsav
1
O b
O d
a
N H O
3
1. ábra Bór-tribromidot alkalmazva csak azonosíthatatlan bomlástermékek keverékéhez jutottunk, aluminium(III)-klorid/dietil-szulfid reagens felhasználása azonban már érdekes eredményhez vezetett. A reakció során nem a várt tetraciklusos ketonhoz (3) jutottunk, hanem a 2 vegyület volt kinyerhető. Bár ebben a ketocsoport helyén etiltiocsoport található, de ez az első eset, hogy a galanthamin és származékai kutatásának témakörében sikerült eljutnunk a fontosabb Amaryllidaceae
alkaloidokra
(galanthamin,
lycoramin,
narwedin,
stb.)
jellemző
tetraciklushoz. Ezek után különböző O-demetilezéseket vizsgáltunk. A telítetlen spiroketont (1) reagáltattuk AlCl3-dal szobahőmérsékleten vagy melegen, tiokarbamid vagy dietilszulfid jelenlétében és
anélkül, valamint BF3-éteráttal. A reakciók során többnyire csak a változatlan kiindulási anyagokat kaptuk vissza, vagy bomlás történt. Végül is D,L-metionin és metánszulfonsav szobahőmérsékleten történt reakciója eredményezte a várt 3 tetraciklust. A tiszta terméket 23,5%-os termeléssel állítottuk elő, de már a 92,8%-kal kinyerhető nyerstermék is kellő tisztaságú volt a további reakciókhoz. A hexahidrobenzofuro-benzo[c]azepin tetraciklus sikeres előállítása bizonyítja az általunk kidolgozott, egyszerű reakciólépésekből álló szintézis-stratégia helyességét. NC
CH3O CH3O
O CH2 CH CN
NC
CN
CH3O
CH3O CH3O
O
KOtBu 4
CN
CH3O NaBH4
OH POCl 3 6
5
NC
CN
NC
CH3O
NC
CN
CH3O
CH3O
CH3O
CrO3
CN
CH3O
CH3O
NH2OH.HCl
H2, Pd/C
NaOAc 7
8
NC
O
O
9
NC
CN
CN
CH3OOC CH3O
CH3O
CH3O
CH3O HCl gáz
CH3O
CH3O
SOCl2 dioxán N H 10
COOCH3
NOH
KOtBu benzol
metanol
N H
11 O
12
O
O
O COOCH3 CH3O
CH3O CH3O
CH3O
+ N H
N H O
O 14
13
2. ábra
A
2009.
év
első
félévében
kutatásainkat
kiterjesztettük
a
narwedinhez
vezető
kulcsintermedier, a metoxicsoportot is tartalmazó hexahidrobenzofurobenzo[c]azepin tetraciklushoz vezető reakcióút kidolgozására. Ebben az esetben a szintézis kiinduló anyaga a két metoxicsoporttal helyettesített 7,8-dimetoxi-2-tetralon (4) volt. A reakciókat a korábban
már bemutatott, egyszerű lépésekből álló és olcsó reagenseket felhasználó szintézisúton végeztük (2. ábra). A 7,8-dimetoxi-2-tetralon (4) 1-es helyzetben történt ciánetilezésével kapott bisz(cianoetil)tetralon (5) oxocsoportját redukáltuk nátriumbórhidrid segítségével, majd a kapott hidroxivegyület (6) dehidratálása eredményezte a várt 1,4-dihidronaftalin-származékot (7). Ezt allil-helyzetben króm-trioxiddal oxidáltuk, majd a telítetlen oxoszármazékot (8) csontszenes palládium katalizátor jelenlétében légköri nyomáson hidrogénezve eljutottunk a 4,4-bisz(cianoetil)-5,6-dimetoxi-1-tetralonhoz megkaptuk
a
megfelelő
oximot
(10),
(9).
Ezt
melynek
hidroxil-aminnal
reagáltatva
Beckmann-átrendeződése
a
várt
benzo[c]azepinonszármazékhoz (11) vezetett. A két nitril-csoportot ezután Pinner-reakcióval metil-észterekké alakítottuk és a diészter (12) Dieckmann-kondenzációját kálium-tercierbutilát jelenlétében végrehajtva két különböző terméket kaptunk: a várt β-oxoészter (13) mellett kisebb mennyiségben a már demetoxikarbonileződött spirociklohexanon (14) is izolálható volt. Mindkét spirovegyület (13, 14) a galanthaminhoz illetve prekurzorához, a narwedinhez vezető út fontos intermedierének tekinthető.
OH
O
O
c
c
c
O b
d
N Me
O b
a MeO (-)-15 galanthamin
d a
N Me
O
O b
d a
N H O
MeO (-)-16 narwedin
3
3. ábra Már korábban, a jelen pályázati project-ben bemutattuk azt a retroszintetikus reakcióutat, melyet az Alzheimer kór kezelésére alkalmas alkaloid, a galanthamin (15) (3. ábra) szintézisére kutatócsoportunkban Szántay Csaba akadémikus irányításával kidolgoztunk. Arról is beszámoltunk, hogy a szintézist, melyet egyszerű reakciólépések és könnyen hozzáférhető reagensek alkalmazásával terveztünk megvalósítani, először modelvegyületeken hajtottuk végre. Az eredményes reakciókat ezután már metoxiszubsztituenst is tartalmazó alkalmas intermedierekre is kiterjesztve, leírtuk a galanthamin-típusú Amaryllidaceae
alkaloidokra jellemző hexahidrobenzofurobenzazepin tetraciklus (3) sikeres előállítását, mely igazolta a megtervezett szintézis-stratégia helyességét. A galanthamin irodalomban leírt szintéziseinek többsége a kvaterner szénatom kialakítására a biomimetikus intramolekuláris fenolos oxidációt alkalmazza és ezeknél a kulcsintermedier a narwedin (16), mely egyuttal a galanthamin biogenezisének is fontos közti terméke. Ennek fényében a szintézis során következő feladatunk a 3 tetraciklus azepin nitrogénen metilezett származékának (18) előállítása volt (4. ábra). O O O
O
CH3O
O
N CH3 O
CH3O O N O 1
18
MeI, K2CO3 aceton, reflux
O N
H O
CH 3
17
CH3SO3H, rt D,L-metionin HO
O CH3
O
N
CH3O
4. ábra
O
19
Így először az 1 spiroketont metil-jodiddal kálium-karbonát jelenlétében acetonos reflux körülményei között metilezve 53%-os termeléssel jutottunk a megfelelő N-metilszármazékhoz (17). Az N-metil-spirovegyület (17) metánszulfonsavban metionin jelenlétében végrehajtott reakciója nem a várt metilezett tetraciklust (18) eredményezte, hanem 34%-os termeléssel egy anomális átrendeződéssel keletkezett más jellegű triciklusos vegyületet (9), egy az irodalomban nem ismert ciklopentanoizokinolin-diont sikerült a reakcióelegyből izolálni. Ezután a 3 tetraciklust közvetlenül próbáltuk metilezni az azepin nitrogénen az előző metilezéskor leírt reakciókörülmények között (5. ábra).
O
O O CH3O
O O
O N H
O
MeI, K2CO3
O
N CH3
aceton, reflux
3
H O +
N
CH3O
O
O 18
20
5. ábra
A reakcióban 19%-os termeléssel sikerült a várt N-metil-hexahidrobenzofurobenzazepinon származékhoz (18) eljutni, azonban meglepetésünkre ebben az esetben is ugyanolyan gyűrűrendszert tartalmazó vegyületet (20) izoláltunk 18%-os termeléssel, mint az előző reakcióban (4. ábra: 19). A 19 és 20 anomális termékek keletkezése mechanizmusának vizsgálata jelenleg is folyamatban van. Tekintettel a tapasztalt átrendeződésekre, ezután más módszerrel, a tetraciklus prekurzorának tekinthető spirovegyületből (1) kerülőúton próbáltunk eljutni a célvegyületünkhöz (6. ábra). Így előszőr 1 spiroketont ketállá (21) alakítottuk etilénglikolt alkalmazva különböző módszerekkel, majd a ketállal védett spiroketont az előzőekben már ismertetett egyszerű reakcióban metileztük. A kapott N-metil-spiroketált (22) ezután litium-aluminium-hidriddel redukálva eljutottunk a 23 kulcsintermedierhez, melyről metánszulfonsavban racém metionin jelenlétében sikerült a ketál védőcsoportot eltávolítani és ebben a savas közegben egyúttal lejátszódott a tervezett demetilezési-ciklizálási reakciót. A reakció eredményeképpen a várt racém demetoxi-lycoraminonhoz vagy másképpen demetoxi-dihidro-narwedinhez (24) jutottunk. Ez utóbbi narwedin-származék szintézisével eljutottunk a galanthaminnal kapcsolatos kutatásaink egyik igen fontos céljához.
O O CH3O
O
O
CH3O
CH3O
O ketálképzés
O metilezés
N O
O
O
N H O
1
N H
22
21 O
CH 3
O
O
O
CH3O redukció
1.deketálozás 2.demetilezés, ciklizálás
O
N CH3
N CH 3 23 24 racém demetoxi-lycoraminon vagy demetoxi-narwedin 6. ábra
A kutatásaink során sikerült néhány új galanthamin-származékot előállítanunk, igy pl. galanthamin-hidrobromid (15) füstölgő salétromsavas nitrálása nem a várt nitro-származékot (25), hanem oxidációval a megfelelő bróm-vegyületet (26) eredményezte (7. ábra).
A reakció nyerstermékéből sikerült kimutatni egy további érdekes mellékterméket (27). Diazometánnal reagáltatva megkíséreltünk a kettős kötésre ciklopropángyűrűt kialakítani és így 28 vegyületet előállítani. A reakcióban azonban metilén-beékelődés történt és így az aromás gyűrű helyett cikloheptatrién-gyűtűt tartalmazó galanthamin-számazékhoz (29) jutottunk.
2. Új vindolin és vinblasztin-származékok A másik fő kutatási irány szerint elvégeztük néhány aminosavészterrel összekapcsolt vindolin észtercsoportjának hidrolízisét (9. ábra). N
N
H
H
Br
Br
OH
OH CH3O
N
CH3O
OH H CO
CH3
NH
OH
N H CO
CH3
COOCH3
NH
COOCH3 C
C H
H
30
32 NH
LiOH, 0oC, MeOH/víz
LiOH, 0oC, MeOH/víz
OH
N
N
H
H
Br
Br OH
CH3O
OH
N
OH
CH3O
H CH3
CO
NH
N
OH H
CH3
COOH
CO
NH
C
COOH C
H
H
33 (60%) (Br-Vin-Trp-OH)
31 (39%) OH
NH
9. ábra
A kiindulási új vindolinszármazékokat az aromás A-gyűrü aromás elektrofil szubsztitúciós reakcióival nyertük, mely során a vindolin molekulán azonosítottuk a Reverdin-reakciónak nevezett átrendeződést. A karboxilcsoport kialakítása lehetőséget adott arra, hogy a molekulát azonos aminosavakból álló 4, 6 vagy 8 tagú oligopeptidek N-terminális csoportjához lehessen kötni. Ennek segítségével ezek az u.n. hordozó peptidek (carrier peptidek) el tudják juttatni a rákellenes molekulát közvetlenül a sejtbe, ahol hatásukat kifejthetik. Ezzel a módszerrel csökkenhetnek a rákellenes anyagokra sajnos olyan sok esetben jellemző mérgező mellékhatások. Ennek fényében elvégeztük az ábrán látható két származék, előbb a modelvegyületként alkalmazott 30 tirozinnal és a 32 triptofánnal összekapcsolt vindolin-származék hidrolízisét. A reakciót LiOH-dal 0oC-on metanol-víz elegyében hajtottuk végre és így a 31 valamint a 33 karbonsavakhoz jutottunk.
OH N N
N
H
hidrazin-hidrát
H OH
CH3OOC CH3O
N H CH3
Vlb-16-hidrazid-17-OH (55%)
17 OCOCH3
16
COOCH3
vinblastin (Vlb) 1. NaNO2/HCl 2. NH2-(L)-Trp-OCH3
Vlb-16-Trp-OCH3-17-OH (21%)
LiOH, 0oC MeOH-víz
OH N N
N
H
H OH
CH3OOC CH3O
N H CH3
16 CO
Vlb-16-Trp-OH-17-OH (88%)
17 OH NH
COOH C
H
NH
10. ábra
Hasonló vizsgálatokra a viblastint is összekapcsoltuk triptofán-metilészterrel (10. ábra). A reakciót a savazidos kapcsolás módszerével végeztük el. A hidrolízist is analóg módon elvégezve így olyan viblastin-származékhoz jutottunk, mely szintén hozzákapcsolható a megfelelő hordozó peptidhez. A hordozó-peptidekkel kapcsolatos vizsgálatokat Hudecz Ferenc Professzor Úr és kutatócsoportja (MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport) végezte oligoarginin-peptidek alkalmazásával. A molekulát a vízoldékonyság, a sejtbe jutás és a szelektivitás növelése érdekében oligoarginin N-terminálisához kötötték. A 10-es helyen brómot és a 16-os karbonilcsoporton keresztül triptofánt tartalmazó (33), oligoargininnel kapcsolt vindolin humán leukémia (HL60) sejtvonalon mért IC50 értékekről a következőkben számolhatok be. Maga a 10-bróm-vindolin, mely még nem tartalmazza a triptofán részt, elég magas IC50 értéket mutatott. A 16-os helyre a triptofán bekacsolása már javította a vegyület aktivitását (IC50 89,5µM). A vegyületet az oligoarginin N-terminálisához kötve azonban lényegesen javult a sejtosztódás gátló hatás. A 8 argininegységet tartalmazó származék eredményezte a
legkisebb IC50 (8,7 µM) értéket, tehát ez a legaktívabb. Meg kell jegyezni, hogy a hordozópeptid természetesen önmagában hatástalan. Igen fontos eredmény, hogy a konjugátum a szenzitív és a rezisztens humán leukémia 60 sejtekre egyaránt figyelemreméltó sejtproliferáció gátló hatással rendelkezik, közel azonos IC50 értékekkel (5,5-8,7 µM), ami arra utal, hogy a konjugátummal szemben nem alakul ki ilyen fajta rezisztencia. A vinblasztin-származékok HL-60 humán leukémia sejtvonalon mért tumorellenes hatását is vizsgáltuk. A dezacetil-vinblasztin (IC50 0,004µM) a vinblasztin (IC50 1,26µM) degradációs terméke és aktív származéka a sejtben. Ennek megfelelően a dezacetil-vinblasztin, melyet mi is előállítottunk, gátolta legkisebb koncentrációban a tumorsejtek osztódását. A triptofánnal összekötött vegyület 3 nagyságrenddel nagyobb koncentrációban gátolta csak a sejtek proliferációját; alig volt hatásosabb a vinblasztin-szulfátnál. A molekula oligoarginin láncokkal történő összekapcsolása során azonban sikerült egy olyan új származékhoz jutni, mely az előzetes eredmények szerint szelektíven hat az gyorsabban osztódó molekulákra; ennek vizsgálata jelenleg folyamatban van.
N H
O
H2N 10 OH CH3O
N
COOH
N
OCOCH3
H CH3
DCC
+ H
COOCH3
CH3
O
35
34
O N
N O
H
H CO
HN 10
CH3
OH CH3O
N H CH3
16
17 OCOCH3
COOCH3
36 11. ábra
Miután a 16-os helyzetben aminosavészterekkel kapcsolt vindolin-származékok között, mint ahogy azt azelőzőekben már bemutattuk, több, jelentős citosztatikus hatásu molekulát is találtunk, felmerült a lehetősége annak, hogy a vindolint más pozicióban is kapcsoljuk
aminosavakkal. Erre a korábban bemutatott 10-amino szubsztituens kiépítése adott lehetőséget. Természetesen ebben az esetben a kapcsolás az aminosav C-terminálisán keresztül történik, vagyis a 10-amino-vindolin (34) nitrogénen védett aminosavakkal történő acilezésével. A 2009. év első féléve során a vindolin nitrálásával kapott nitrovegyületet a korábban már ismertetett
módon
modelvegyületként
aminocsoporttá először
redukáltuk
L-ftálimido-alaninnal
és (35)
a
10-amino-vindolint
reagáltattuk
a
(34)
legegyszerübb
módszerrel; DCC jelenlétében diklórmetánban szobahőfokon (11. ábra). A reakció a 10-es helyen aminocsoporthoz kötve ftálimidoalanint tartalmazó vindolint (36) eredményezett. Ebben az esetben a ftálimido-védőcsoport eltávolításától egyenlőre eltekintettünk; hidrazinos deftaloilezés esetén savhidrazid keletkezése, savas hidrolízist alkalmazva pedig a vindolin észtercsoportjainak hidrolízise volt várható az eddig eredmények és az irodalmi adatok alapján. Éppen ezért a további nitrogénen védett aminosavakkal történő reakciók vizsgálata során nem a ftálimido-védőcsoportot alkalmaztuk, hanem más módon eltávolitható védőcsoportokat tartalmazó aminosavakat választottunk. A reakciót először N-benziloxikarbonil-L-prolinnal (37) hajtottuk végre hasonló reakciókörülmények között, mint az N-ftálil-alaninnal. A reakció probléma nélkül a várt terméket (38) eredményezte (12. ábra). A védőcsoportot a már korábban is alkalmazott redukciós módszerrel távolítottuk el; ekkor csontszenes palládium katalizátor jelenlétében metanol-diklórmetán elegyében nátrium-bórhidriddel végeztük a reakciót. Igy a 10-amino-vindolin N-L-prolil-származékához (39) jutottunk. Következő aminosavnak az L-triptofánt választottuk. Az előzőekhez analóg módszerrel a 10amino-vindolint DCC jelenlétében acileztük a nitrogénen benziloxi-karbonil-csoporttal védett triptofánnal és a védőcsoport ismert módszerrel történt eltávolítása után ekkor is a várt termékhez (40) jutottunk. A két új vindolinszármazék (39, 40) az előzetes farmakológiai vizsgálatok szerint nem mutatott jelentős daganatellenes hatást.
N H
H
H2N N
OH CH3O
N
OCOCH3
H CH3
COOH
+ O
O
DCC CH2Cl2, rt
COOCH3
37
34 H N O
N H
CO
HN
Pd/C, NaBH4
OH
O CH3O
N
OCOCH3
MeOH-CH2Cl2
H CH3 COOCH3
38
H N
N H
CO
HN
H
OH CH3O
N
OCOCH3
H CH3
COOCH3
39
N H CO H2N N H
NH OH
H CH3O
N H CH3
OCOCH3 COOCH3
40 12. ábra
Miután a vindolint 10-es helyen is sikerült aminosavakkal kapcsolni, a 12-es hely aminosavakkal történő helyettesítése volt feladatunk. Először folytattuk a vindolin halogénezési reakcióit és a kapott halogénszármazékok nitrálását annak érdekében, hogy a 10es helyzetet halogénatommal védve a molekula a 12-es helyén történjen a nitrálás (13. ábra).
N
N H
H NO2
Br
nitrálás
OH CH3O
N CH3
CH3O
OCOCH3
H
OH
COOCH3
N Br
CH3
N
N H
H Cl
Cl
nitrálás
OH H
OH CH3O
OCOCH3
N CH3
N
OCOCH3
H NO2
COOCH3
COOCH3
CH3
44
43
N
N H
H I
nitrálás
NO2 OH
OH CH3O
COOCH3
42
41
CH3O
OCOCH3
H
N H CH3
CH3O
OCOCH3
N H CH3
COOCH3
OCOCH3 COOCH3
46
45 13. ábra
A 41 brómvegyület – mint már említettük – nitráláskor nem a várt terméket eredményezte, hanem Reverdin-reakcióval a 10-nitro-12-bróm-származék (42) keletkezett. A klórvegyület (43) nitrálása a várt 10-klór-16 nitroszármazékhoz (44) vezetett, a jódvindolin (45) esetén pedig csak az ipso-szubsztitúció termékét, a 10-nitrovindolint (46) izoláltuk. További céljainkra a 44 10-klór-12-nitro-vindolin volt alkalmas. A nitrocsoportot a már korábban ismertetett módszerrel redukáltuk és a 12-es helyzetű aminocsoporton a vindolint nitrogénen védett L-prolinnal reagáltatva, majd a védőcsoportot eltávolítva a várt 46 célvegyülethez jutottunk, mely az aminosavat a tervezett 12-es helyen tartalmazta (14. ábra). Ezidáig azonban olyan redukciós módszert nem sikerült találnunk, amellyel a 10-es klóratomot a vindolin 14,15-helyzetű szén-szén kettős kötésének telítése nélkül el tudtuk volna távolítani.
N Cl
10
Cl
12 NO2
N CH3
10
15 OH
OCOCH3
H
H
redukció
OH CH3O
14
N
H
CH3O
12
COOCH3
NH2
N
OCOCH3
H CH3
44
COOCH3
45 N H Cl
10 OH
CH3O O
N
12
OCOCH3
H CH3
NH
COOCH3
H NH
46 14. ábra
Miután a 10-bróm-17-dezacetilvindolinnak a 16-os észtercsoporton keresztűl L-triptofánnal kapcsolt származéka (32) humán leukémia sejtvonalon jelentős daganatellenes hatást mutatott, felmerült az igénye annak, hogy fenti molekulát D-triptofánnal is összekapcsoljuk.
N
N
H
H
Br
Br OH
CH3O
N
H16 CH3 CO
OH
17 OH NH
CH3O COOCH3
N
17 OH
H16 CH3 CO
C H S
32
NH
COOCH3
C H R NH
NH
47
15. ábra
A reakciót a már korábban is bevált, azidos kapcsolással végeztük. A 16-os észtercsoportot savhidraziddá, utóbbit pedig savaziddá alakítottuk és ezt reagáltatva D-triptofán-metilészterrel jutottunk a 47 kapcsolt észterszármazékhoz (15. ábra). A 47 vegyületet az észtercsoport hidrolízise után Hudecz Ferenc Professzor Úr kutatócsoportjában (MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport) hordozó peptiddel, oktaargininnel konjugálták és a biológiai vizsgálatok során
azt találták, hogy a molekula a L-karbonsavszármazéktól (33) eltérően nem humán leukémia sejteken, hanem emlőtumor sejteken mutat daganatellenes hatást. Végezetül bemutatjuk azokat az új vindolin-származékokat, melyeket az általunk alkalmazott standard módszerekkel állítottunk elő a szerkezet-hatás tanulmányozása céljából (16. ábra). H N
N
H
H
Br
Br
H
OH CH3O
OH
N
OH
CH3O
H CH3
CO
NH
N
OH H
COOCH3
CH3
CO
COOCH3
NH
C
C
H
H
48
49 NH
NH
N
N
H
H
H
H OH
CH3O
OH
N
OH
CH3O
H CH3
CO
N
COOCH3
NH
OH H
CH3
CO
COOCH3
NH
C
C
H
H
50
51 NH
NH
16. ábra
Ezek: a 14,15-helyen telített dihidrovindolin-számazék (48), ugyanebben a helyzetben ciklopropángyűrűvel kondenzált vindolint tartalmazó vegyület (49) és az 50 illetve 51 10-es helyen brómot nem tartalmazó új vindolinszármazékok. Utóbbi vegyületek farmakológiai vizsgálatai jelenleg még folyamatban vannak.
Dr. Hazai László témavezető Budapest, 2012. január 12.
